Caractérisation des structures de septines hautement organisées chez la drosophile et leur interaction avec le cytosquelette d’actine

Les septines sont des GTPases conservées dérégulées dans le cancer et les maladies neurodégénératives. Elles servent de protéines d’échafaudage et forment une barrière de diffusion à la membrane plasmique et au corps central lors de la cytokinèse. Elles interagissent avec l’actine et s’organisent en complexes qui polymérisent et forment des structures hautement organisées (anneaux et filaments). Leur dynamique d’assemblage et leur rôle dans la cellule restent à être élucidés. La Drosophile est un modèle simple pour l’étude des septines puisqu’on n’y retrouve que 5 gènes (sep1, sep2, sep4, sep5, peanut) comparativement aux 13 gènes chez l’humain. À l’aide d’un anticorps contre Pnut, nous avons identifié des structures tubulaires dans 30% des cellules S2 de Drosophile. Mon projet a comme but de caractériser ces tubes en élucidant leurs constituants, leur comportement et leurs propriétés pour mieux clarifier le mécanisme par lequel les septines forment des structures hautement organisées et interagissent avec le cytosquelette d’actine. Par immunofluorescence, j’ai pu démontrer que ces tubes sont cytoplasmiques, en mitose ou interphase, ce qui suggère qu’ils ne sont pas régulés par le cycle cellulaire. Pour investiguer la composition et les propriétés dynamiques de ces tubes, j’ai généré une lignée cellulaire exprimant Sep2-GFP qui se localise aux tubes et des ARNi contre les cinq septines. Trois septines sont importantes pour la formation de ces tubes et anneaux notamment Sep1, Sep2 et Pnut. La déplétion de Sep1 cause la dispersion du signal GFP en flocons, tandis que la déplétion de Sep2 ou de Pnut mène à la dispersion du signal GFP uniformément dans la cellule. Des expériences de FRAP sur la lignée Sep2-GFP révèlent un signal de retour très lent, ce qui indique que ces structures sont très stables. J’ai aussi démontré une relation entre l’actine et les septines. Le traitement avec la Latrunculin A (un inhibiteur de la polymérisation de l’actine) ou la Jasplakinolide (un stabilisateur des filaments d’actine) mène à la dépolymérisation rapide (< 30 min) des tubes en anneaux flottants dans le cytoplasme, même si ces tubes ne sont pas reconnus suite à un marquage de la F-actine. L’Actin05C-mCherry se localise aux tubes, tandis que le mutant déficient de la polymérisation, Actin05C-R62D-mCherry perd cette localisation. On observe aussi que la déplétion de la Cofiline et de l’AIP1 (ce qui déstabilise l’actine) mène au même phénotype que le traitement avec la Latrunculine A ou la Jasplakinolide. Alors on peut conclure qu’un cytosquelette d’actine dynamique est nécessaire pour la formation et le maintien des tubes de septines. Les futures études auront comme but de mieux comprendre l’organisation des septines en structures hautement organisées et leur relation avec l’actine. Ceci sera utile pour l’élaboration du réseau d’interactions des septines qui pourra servir à expliquer leur dérégulation dans le cancer et les maladies neurodégénératives.

Caractérisation des structures de septines hautement organisées chez la drosophile et leur interaction avec le cytosquelette d’actine

Les septines sont des GTPases conservées dérégulées dans le cancer et les maladies neurodégénératives. Elles servent de protéines d’échafaudage et forment une barrière de diffusion à la membrane plasmique et au corps central lors de la cytokinèse. Elles interagissent avec l’actine et s’organisent en complexes qui polymérisent et forment des structures hautement organisées (anneaux et filaments). Leur dynamique d’assemblage et leur rôle dans la cellule restent à être élucidés. La Drosophile est un modèle simple pour l’étude des septines puisqu’on n’y retrouve que 5 gènes (sep1, sep2, sep4, sep5, peanut) comparativement aux 13 gènes chez l’humain. À l’aide d’un anticorps contre Pnut, nous avons identifié des structures tubulaires dans 30% des cellules S2 de Drosophile. Mon projet a comme but de caractériser ces tubes en élucidant leurs constituants, leur comportement et leurs propriétés pour mieux clarifier le mécanisme par lequel les septines forment des structures hautement organisées et interagissent avec le cytosquelette d’actine. Par immunofluorescence, j’ai pu démontrer que ces tubes sont cytoplasmiques, en mitose ou interphase, ce qui suggère qu’ils ne sont pas régulés par le cycle cellulaire. Pour investiguer la composition et les propriétés dynamiques de ces tubes, j’ai généré une lignée cellulaire exprimant Sep2-GFP qui se localise aux tubes et des ARNi contre les cinq septines. Trois septines sont importantes pour la formation de ces tubes et anneaux notamment Sep1, Sep2 et Pnut. La déplétion de Sep1 cause la dispersion du signal GFP en flocons, tandis que la déplétion de Sep2 ou de Pnut mène à la dispersion du signal GFP uniformément dans la cellule. Des expériences de FRAP sur la lignée Sep2-GFP révèlent un signal de retour très lent, ce qui indique que ces structures sont très stables. J’ai aussi démontré une relation entre l’actine et les septines. Le traitement avec la Latrunculin A (un inhibiteur de la polymérisation de l’actine) ou la Jasplakinolide (un stabilisateur des filaments d’actine) mène à la dépolymérisation rapide (< 30 min) des tubes en anneaux flottants dans le cytoplasme, même si ces tubes ne sont pas reconnus suite à un marquage de la F-actine. L’Actin05C-mCherry se localise aux tubes, tandis que le mutant déficient de la polymérisation, Actin05C-R62D-mCherry perd cette localisation. On observe aussi que la déplétion de la Cofiline et de l’AIP1 (ce qui déstabilise l’actine) mène au même phénotype que le traitement avec la Latrunculine A ou la Jasplakinolide. Alors on peut conclure qu’un cytosquelette d’actine dynamique est nécessaire pour la formation et le maintien des tubes de septines. Les futures études auront comme but de mieux comprendre l’organisation des septines en structures hautement organisées et leur relation avec l’actine. Ceci sera utile pour l’élaboration du réseau d’interactions des septines qui pourra servir à expliquer leur dérégulation dans le cancer et les maladies neurodégénératives.

Functional analysis of Arabidopsis thaliana lesion mimic mutant cfs1 in ESCRT complex-related protein trafficking

The Endosomal Sorting Complex Required for Transport (ESCRT)-complex is composed of four complexes, ESCRT-0-III. They sequentially act on a late endosome to sort mono-ubiquitinated transmembrane proteins into the intralumenal vesicle, forming of a multivesicular body(MVB) that is delivered to vacuole for degradation. In Arabidopsis thaliana, the loss of an ESCRT-I component, elch displays a cytokinesis defect; while a dominant negative expression of an ESCRT-III component results in cell death due to vacuolar loss. In this work, the function of a plant-specific ELCH-interactor, CELL DEATH RELATED FYVE/SYLF DOMAIN CONTAINING 1 (CFS1) and its influences on the ESCRT-complex function are investigated. CFS1 is a phosphatidylinositol-3-phosphate- and actin-binding protein. The cfs1 mutants mimic lesions in the first eldest leaf that propagate to the next eldest one. Genetic analyses have demonstrated that cell death in cfs1 does not require a functional ESCRT-I component; nevertheless, the loss of CFS1 alleviates elchcytokinesis defect, suggesting its influence on the ESCRT-I function. Further analyses reveal that cfs1 accumulates autophagosomes throughout its lifespan due to a decrease in autophagosome degradation, suggesting that as the plant ages, the cumulated autophagosomes falsely trigger effectors-triggered immunity that executes cell death in cfs1. As the ESCRT-complex has been demonstrated to be involved in the delivery of autophagosomes to vacuole and CFS1 homolog, CFS2 reportedly interacts with ATG8, it can be postulated from the results of this work that CFS1 alone or together with CFS2 function in sequestering mature autophagosomes onto MVBs. At the MVBs, the ESCRT-complex then mediates the fusion of autophagosome and MVB for subsequent delivery to vacuole.

tRNA anticodon loop modifications ensure protein homeostasis and cell morphogenesis in yeast

Using budding yeast, we investigated a negative interaction network among genes for tRNA modifications previously implicated in anticodon-codon interaction: 5-methoxy-carbonyl-methyl-2-thio-uridine (mcm5s2U34: ELP3, URM1), pseudouridine (Ψ38/39: DEG1) and cyclic N6-threonyl-carbamoyl-adenosine (ct6A37: TCD1). In line with functional cross talk between these modifications, we find that combined removal of either ct6A37 or Ψ38/39 and mcm5U34 or s2U34 results in morphologically altered cells with synthetic growth defects. Phenotypic suppression by tRNA overexpression suggests that these defects are caused by malfunction of tRNALysUUU or tRNAGlnUUG, respectively. Indeed, mRNA translation and synthesis of the Gln-rich prion Rnq1 are severely impaired in the absence of Ψ38/39 and mcm5U34 or s2U34, and this defect can be rescued by overexpression of tRNAGlnUUG. Surprisingly, we find that combined modification defects in the anticodon loops of different tRNAs induce similar cell polarity- and nuclear segregation defects that are accompanied by increased aggregation of cellular proteins. Since conditional expression of an artificial aggregation-prone protein triggered similar cytological aberrancies, protein aggregation is likely responsible for loss of morphogenesis and cytokinesis control in mutants with inappropriate tRNA anticodon loop modifications.