Produção de antígenos recombinantes do vírus da doença de Newcastle para aplicação no imunodiagnóstico

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Método imunocromatográfico para pesquisa do anticorpo em triagem ou diagnóstico da hepatite C: desenvolvimento e aplicação clínica

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Arbovírus Morumbi (Phlebovirus : Bunnyaviridae) - estudo histopatológico e imuno-histoquímico do fígado na infecção experimental em camundongos: comparação entre as vias cerebral, intraperitoneal e subcutânea

O vírus Morumbi é membro do sorogrupo Phlebotomus fever (família Bunyavírídae: gênero Phlebovírus) nativo da Região Amazônica. Seu vetor é desconhecido, mas supõem-se ser transmitido por flebotomíneos. Foi isolado em 1988 de ser humano apresentando quadro febril agudo. Este arbovírus, quando inoculado em camundongo por via cerebral, demonstrou viscerotropismo, induzindo inclusive lesões no fígado do animal inoculado. Com os objetivos de: i) estabelecer as características anátomo-patológicas e imuno-histoquímicas em fígado de camundongos albinos Swíss recém-nascidos experimentalmente infectados pelo vírus Morumbi; ii) verificar se o vírus apresenta hepatotropismo diferenciado na dependência de inoculação pelas vias cerebral, peritoneal ou subcutânea; iii) caracterizar detalhadamente os padrões anátomo-patológicos sequenciais no fígado; iv) demonstrar a localização do antígeno viral no tecido hepático ao longo da infecção experimental; v) estudar possíveis inter-relações entre os achados anátomo-patológicos e os imuno-histoquímicos. Foram estudados experimentalmente 71 camundongos Swíss recém-nascidos (dois e três dias), distribuídos ao final do experimento como segue: 21 animais inoculados por via intracerebral (IC), 21 por via intraperitoneal (IP) e 29 animais inoculados por via subcutânea (SC). Utilizou-se a dose infectante 5,0DL 50 /0,02ml de suspensão de vírus. Outros trinta, animais que não receberam inóculos, foram utilizados como grupo controle. Subgrupos de oito animais (seis inoculados e dois do grupo controle) foram sacrificados diariamente a intervalos de 24 em 24 horas, até 96 horas para os grupos IC e IP e até 120 horas para o grupo SC. Fragmentos de fígado de todos os animais foram fixados em solução de formalina neutra a 10%, incluídos em parafina, de onde foram obtidos cortes de 5 mm que foram corados pela técnica de hematoxilina-eosina para análise morfológica e, cortes adicionais, foram submetidos à técnica de imuno-histoquímica (Sistema Envision, DAKO, USA), utilizando a fosfatase alcalina e soro hiperimune do vírus Morumbi preparado em camundongos jovens, para detecção de antígeno viral. Foram estudados seis parâmetros de lesão em áreas portais e nove outros nos lóbulos, que foram semiquantificados numa escala que variou de zero (0) a três cruzes (+++), onde zero significou ausência de lesão e três cruzes lesão intensa. À microscopia óptica, ficou evidente que o vírus Morumbi inoculado em camundongos por três diferentes vias induz lesões em áreas portais e lobulares, caracterizando uma hepatite aguda com presença de corpúsculos acidófilos, semelhantes aos corpúsculos de Councilman -Rocha Lima, de distribuição irregular nos lóbulos, cujo aparecimento foi observado 24 horas pós-inoculação (p.i.) e atingiu o máximo de intensidade às 72 horas p.i. em animais inoculados por via IP. O exame imuno-histoquímico mostrou presença leve de antígeno viral a partir de 24 horas p.i. no grupo IC e a partir de 48 horas p.i. nos grupos IP e SC, havendo certo paralelismo em relação a intensidade de lesão morfológica, tendo- se observado o máximo de detecção de antígeno viral em animais inoculados por via IP e sacrificados às 72 horas p.i. A distribuição geral de antígeno foi observada especificamente nos lóbulos hepáticos, no citoplasma de hepatócitos íntegros e necrosados e no interior de células de Kupffer, não havendo preferência por nenhuma das três zonas do lóbulo. Concluiu-se que: i) o modelo de infecção experimental em camundongos foi excelente para o estudo das lesões causadas pelo vírus Morumbi, podendo ser selecionada a via IP como referencial; ii) em todas as vias utilizadas (IP, IC e SC) se confirmou a infecção pelo vírus Morumbi com marcante detecção de seu antígeno, no tecido hepático de camundongos Swiss; iii) a presença de antígeno do vírus Morumbi no fígado desses camundongos associou-se ao aparecimento de hepatite aguda, com necrose focal; iv)hepatite intensa pôde ser observada em fígado de camundongos sacrificados 72 h p.i. com o vírus Morumbi por via IP, o que não foi verificado com as outras duas vias; v) a hepatite aguda mostrou-se limitada, neste experimento, tendendo a desaparecer na maioria dos camundongos inoculados, com avançar das horas; vi) colestase não alteração freqüente na hepatite experimental pelo vírus Morumbi, quando inoculada por via IC, IP e SC; vii) o antígeno do vírus Morumbi teve predominância pela localização intracitoplasmática, padrão granular, nos hepatócitos e células de Kupffer; viii) antígeno viral foi detectado em fragmento hepático de animais experimentalmente inoculados com o vírus Morumbi, a partir das 24 horas via IC e a partir de 48 horas nas vias IP e SC.

Caracterização morfológica e antigênica do vírus Juruaçá, isolado de morcego no estado do Pará

O vírus Juruaçá (AN 401933) foi isolado a partir de um lote de vísceras de um morcego capturado na região de Porto Trombetas, município de Oriximiná, Estado do Pará, em 1982, sendo considerado um vírus não grupado/ não classificado. O objetivo deste trabalho foi classificar o vírus Juruaçá em um táxon viral, baseando-se nas suas propriedades morfológicas, físico-químicas, antigênicas e moleculares, bem como descrever as alterações anatomo-patológicas associadas à infecção experimental. Camundongos recém-nascidos mostraram suscetibilidade à infecção pelo vírus Juruaçá por inoculação i.c., iniciando os sintomas com quatro dias p.i. e culminando com morte dos animais oito dias p.i.. O vírus não é sensível à ação do DCA e consegue aglutinar hemácias de ganso em pH 5,75. Pelos testes de IH e FC, o vírus não se relaciona com nenhum arbovírus ou outros vírus de vertebrados conhecidos testados, reagindo apenas com o seu soro homólogo. O vírus não causa ECP em linhagens de células Vero e C6/36, e IFI destas células também foi negativa. Entretanto, o vírus Juruaçá replica em cultivo primário de células do SNC de camundongo (astrócitos e microglias), confirmada por IFI com dupla marcação. Cultivos de neurônios não se mostraram susceptíveis à infecção pelo vírus Juruaçá, porém a presença do antígeno viral nestas células foi confirmada por imunohistoquímica. A microscopia eletrônica de transmissão revelou a presença de partículas esféricas, com um diâmetro médio de 23-30nm. Alterações anatomo-patológicas foram observadas principalmente no SNC de camundongos infectados experimentalmente com o vírus Juruaçá. O resultado do RT-PCR sugere que o vírus Juruaçá pode ser um novo vírus pertencente à família Picornaviridae, gênero Enterovirus.

Detecção sorológica e caracterização moleculares de agentes anaplasmataceae, micoplasmas hemotróficos, piroplasmas e Hepatozoon sp. em carnívoros selvagens mantidos em cativeiro no Brasil

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Leptospira spp. e Brucella spp. em tartarugas-da-Amazônia (Podocnemis expansa) do Vale do Rio Araguaia - GO

Pós-graduação em Medicina Veterinária - FCAV

Avaliação de testes sorológicos no diagnóstico da brucelose suína em amostras provenientes de um frigorífico e de um rebanho naturalmente infectado do Estado de São Paulo

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Leptospira spp. e Brucella spp. em feitos e oócitos colhidos de vacas no momento do abate

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Epidemiologia da brucelose bovina nos municípios de Altinópolis e Santo Antônio da Alegria, Estado de São Paulo: prevalência, fatores de risco e métodos de diagnóstico

Pós-graduação em Medicina Veterinária - FCAV

Associação do polimorfismo do gene humano NRAMP1 na susceptibilidade/resistência para hanseníase em áreas endêmicas do estado do Pará

Hanseníase é um problema de saúde pública no estado do Pará e um desafio para os Programas de Controle que almejam o estabelecimento de estratégias para minimização do agravo da doença. O entendimento do mecanismo genético e imunológico para explicar a manutenção da endemia pode ser uma das alternativas para melhoria da abordagem do problema na nossa região. O gene humano de resistência natural associada à proteína macrofágica – NRAMP1 é expresso em macrógfagos e parece estar envolvido com a influência no padrão de resposta imune à infecção com Mycobcaterium leprae. Nós avaliamos associação do polimorfismo deste gene, já descrito por BUU et al, 1995 com a hanseníase “per se” e com os tipos da doença, segundo os níveis de anticorpos anti-PGL-1 na população estudada. Um total de 122 pacientes com hanseníase e 110 não doentes procedentes de municípios endêmicos do estado do Pará, foram genotipados para o polimorfismo deste gene e analisados segundo os níveis de anticorpos anti-PGL-1 desta micobactéria. Observou-se associação com a hanseníase “per se” (p=0.0087), e o polimorfismo da região 3ۥ não traduzida do gene NRAMP1 com inserção/deleção de 4 pares de bases foi fortemente associado com a forma multibacilar (p= 0.025) comparado aos contatos não cosanguíneos. Heterozigotos e portadores do alelo com a deleção (159pb) foram mais freqüentes entre os casos multibacilares do que nos paucibacilares. Os haplótipos do gene NRAMP1 parecem exercer influência importante na apresentação clínica da hanseníase, revelada também pela positividade ao antígeno PGL-1 do mycobacterium leprae.

Frequency of antibodies to Babesia bigemina, B. bovis, Anaplasma marginale, Trypanosoma vivax and Borrelia burdgorferi in cattle from the northeastern region of the state of Pará, Brazil

A babesiose, a anaplasmose e a tripanossomose são enfermidades relevantes, potencialmente causadoras de morbidade em bovinos, levando a perdas econômicas. A borreliose assume importância como zoonose potencial. O objetivo desse estudo foi determinar, por meio do ensaio de imunoadsorção enzimática (ELISA), a freqüência de anticorpos para Babesia bigemina, B. bovis, Anaplasma marginale, Trypanosoma vivax e Borrelia burgdorferi em bovinos da região nordeste do Estado do Pará, Brasil. Amostras de soro de 246 vacas dos municípios de Castanhal e São Miguel do Guamá foram usadas. ELISAs com antígeno bruto foram utilizados para detector anticorpos contra todos os agentes, exceto para A. marginale, para o qual um ELISA indireto com proteína principal de superfície 1a (MSP1a) foi usado. As freqüências de bovinos soropositivos foram: B. bigemina - 99,2%; B. bovis - 98,8%; A. marginale - 68,3%; T. vivax - 93,1% and B. burgdorferi -54,9% As freqüências de bovinos soropositivos para B. bovis e B. bigemina sugerem uma alta taxa de transmissão desses organismos por carrapatos, na região estudada, a qual pode ser classificada com sendo de estabilidade enzoótica para os hemoparasitos. A baixa freqüência de bovinos soropositivos para A. marginale pode ser atribuída a uma menor sensibilidade do ELISA com antígeno recombinante, ou uma menor taxa de inoculação da riquétsia pelos carrapatos, quando comparada àquelas observadas para Babesia sp. A alta freqüência de bovinos soropositivos para T. vivax indica que esse hemoprotozoário é prevalente em rebanhos do nordeste do Estado do Pará. O percentual de animais com anticorpos homólogos para B. burgdorferi indica a presenças deste espiroquetídeo transmitido por carrapatos na população de bovinos da região estudada.

Frequency of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria in patients attended in Belém, Pará, Brazil

ABSTRACT: Paroxysmal nocturnal hemoglobinuria is a hematological disease with complex physiopathology. It is genetically characterized by a somatic mutation in the PIG-A gene (phosphatidylinositol glycan anchor biosynthesis, class A), in which the best known antigens are DAF (decay accelerating factor or CD55) and MIRL (membrane inhibitor of reactive lysis or CD59). OBJECTIVE: To determine the frequency of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria in patients attended at the HEMOPA foundation from November 2008 to July 2009. METHOD: Thirty patients, with ages ranging from two to 79 years old and suspected of having paroxysmal nocturnal hemoglobinuria were examined. All patients were immunophenotyped by flow cytometry for the CD5, CD59, CD16 and CD45 antigens. RESULTS: Paroxysmal nocturnal hemoglobinuria was identified in nine of the thirty patients investigated. Another 3 cases had inconclusive results with CD59-negative labeling only for neutrophils. The highest frequency of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria patients (7/9) and inconclusive cases (2/3) were between 19 years old and 48 years old, with a median of 28 years. CONCLUSION: These results show the importance of flow cytometry to identify cases in which patients are deficient in only one antigen (CD59).

Estudo soroepidemiológico de Brucella abortus, Toxoplasma gondii e vírus da artrite encefalite caprina em rebanhos caprinos nas unidades produtoras dos estados do Pará e Maranhão

Pesquisou-se a frequência da ocorrência de anticorpos anti-Brucella abortus, Toxoplasma gondii e vírus da artrite encefalite caprina (CAEV) em caprinos de 14 unidades produtoras localizadas dos Estados do Pará e Maranhão. No Estado do Pará foram analisados animais dos municípios de Benevides, Castanhal, Santa Izabel do Pará e Moju e no Estado do Maranhão, o município de Chapadinha. Os testes sorológicos realizados para o diagnóstico da brucelose foi o teste do Antígeno Acidificado Tamponado (AAT), como teste de triagem, e o 2- Mercaptoetanol (2-Me), como teste confirmatório. Para as análises de toxoplasmose foi utilizado a Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI) e para CAEV Imunodifusão de Gel de Agarose (IDGA). O resultado das análises de brucelose mostrou-se negativo para 100,0% das amostras analisadas. Para toxoplasmose e CAEV a frequência obtida foi 23,5% (97/412) e 21,6% (85/393), respectivamente. Foi observada diferença estatística na relação entre a ocorrência de anticorpos anti-Toxoplasma gondii e a faixa etária dos caprinos, mostrando que animais com idade superior a 24 meses tiveram mais risco de estarem infectados quando comparados com animais mais novos OR= 2,15 (IC 95% 1,19 – 3,88). Já os fatores de risco encontrados para CAEV foram: falta de conhecimento da doença OR=6,45 (IC 95% 2,88-14,47); a não utilização de material descartável, OR=10,85 (IC 95% 4,85-24,28); sistema de criação extensivo OR=10,85 (IC 95% 4,85-24,28); sistema de criação semi-extensivo OR=3,71(IC 95% 1,64-8,39) e manejo OR=11,4 (IC 95% 5,51-23,60). Conclui-se que as unidades produtoras de caprinos dos Estados do Pará e Maranhão apresentam positividade em seus rebanhos para toxoplasmose e CAEV.

Estudo do Paracoccidioides brasiliensis no município de Buriticupu, Amazônia maranhense

O objetivo deste trabalho foi o de verificar a presença do Paracoccidioides brasiliensis no município de Buriticupu, localizado na Amazônia Maranhense. Foram realizados testes intradérmicos com paracoccidioidina em 491 indivíduos, havendo 60 intradermorreações positivas ao antígeno. Observou-se não haver diferença estatística significante na amostra em relação à positividade ao teste e as variáveis sexo, hábitos sócio-culturais e nível de escolaridade, embora, descritivamente, o sexo feminino tenha sido o mais freqüente, totalizando 33 pacientes, e que positivo-reagentes possuíam hábitos que propiciavam o contato com o patógeno e, ainda, constatou-se serem os níveis de escolaridade predominantes o analfabetismo (18 testados) e o 1º grau incompleto (26 testados). Cinqüenta e um pacientes positivos aos testes intradérmicos à paracoccidoidina (85%) eram naturais do Estado do Maranhão. Ao analisarem-se os dados clínicos e laboratoriais gerais nos prontuários dos seis pacientes diagnosticados com a doença paracoccidioidomicose, constatou-se que todos eram lavradores com mais de 10 anos de residência em Buriticupu, possuindo a presença do fungo em raspado de mucosa bucal à coloração do PAS e Gomori-Groccot, com exceção de dois pacientes: um com 36 meses de tratamento e outro com 12 meses de terapêutica, e sem lesão bucal inicial ou posterior, ambos sem relatos de abandono de tratamento. Verificou-se, portanto, que a citologia esfoliativa é um método fácil e de baixo custo no auxílio do controle terapêutico dos pacientes.

Avaliação do teste de aglutinação com partículas de látex sensibilizadas com exoantígeno bruto de Paracoccidioides brasiliensis no sorodiagnóstico da Paracoccidioidomicose

Paracoccidioidomicose (PCM), uma micose sistêmica granulomatosa causada pelo fungo dimórfico Paracoccidioides brasiliensis, é endêmica na América do Sul. Conídios provavelmente agem como propágulos infectantes e são inalados para os pulmões, onde ocorre a transformação à forma leveduriforme patogênica. Duas principais formas clínicas são consideradas: a forma aguda ou subaguda (tipo juvenil) e a forma crônica (tipo adulto). O diagnóstico definitivo da PCM inclui a observação direta da levedura multibrotante característica em fluidos biológicos e secções teciduais ou isolamento do fungo de materiais clínicos. Na PCM, testes sorológicos, além de auxílio diagnóstico, têm a função de acompanhamento durante e pós-tratamento. Portanto, a técnica utilizada precisa aliar sensibilidade e especificidade, para que o valor preditivo seja máximo e reprodutível. O propósito deste estudo foi avaliar um teste de aglutinação com látex (LA) para detectar anticorpos anti-P.brasiliensis contra antígeno bruto do fungo. Cinqüenta e uma (51) amostras de soro de pacientes com PCM foram testadas. Positividade foi observada em 84,31% (43/51), cujos padrões de aglutinação variaram de 1+ a 4+. Reatividade dessas amostras foi verificada em títulos variando entre 1:2 e 1:64. Reatividade cruzada foi observada com outras doenças fúngicas (aspergilose e histoplasmose), e com doenças não fúngicas. Amostras de soro humano normal não foram reativas. A sensibilidade, especificidade e valores preditivos, positivo e negativo, produzidos pelo teste LA foram 84,31%, 81,05%, 70,49% e 90,59%, respectivamente. Em conclusão, estes resultados mostram que o teste LA é instrumento útil no sorodiagnóstico da PCM, além de vantagens como baixo custo e rápida execução, a despeito de outros testes, tais como ID e Western blotting.