Improving photofermentative hydrogen production through metabolic engineering and DOE (Design of Experiments)

A l’heure actuelle, les biocarburants renouvelables et qui ne nuit pas à l'environnement sont à l'étude intensive en raison de l'augmentation des problèmes de santé et de la diminution des combustibles fossiles. H2 est l'un des candidats les plus prometteurs en raison de ses caractéristiques uniques, telles que la densité d'énergie élevée et la génération faible ou inexistante de polluants. Une façon attrayante pour produire la H2 est par les bactéries photosynthétiques qui peuvent capter l'énergie lumineuse pour actionner la production H2 avec leur système de nitrogénase. L'objectif principal de cette étude était d'améliorer le rendement de H2 des bactéries photosynthétiques pourpres non sulfureuses utilisant une combinaison de génie métabolique et le plan des expériences. Une hypothèse est que le rendement en H2 pourrait être améliorée par la redirection de flux de cycle du Calvin-Benson-Bassham envers du système de nitrogénase qui catalyse la réduction des protons en H2. Ainsi, un PRK, phosphoribulose kinase, mutant « knock-out » de Rhodobacter capsulatus JP91 a été créé. L’analyse de la croissance sur des différentes sources de carbone a montré que ce mutant ne peut croître qu’avec l’acétate, sans toutefois produire d' H2. Un mutant spontané, YL1, a été récupéré qui a retenu l'cbbP (codant pour PRK) mutation d'origine, mais qui avait acquis la capacité de se développer sur le glucose et produire H2. Une étude de la production H2 sous différents niveaux d'éclairage a montré que le rendement d’YL1 était de 20-40% supérieure à la souche type sauvage JP91. Cependant, il n'y avait pas d'amélioration notable du taux de production de H2. Une étude cinétique a montré que la croissance et la production d'hydrogène sont fortement liées avec des électrons à partir du glucose principalement dirigés vers la production de H2 et la formation de la biomasse. Sous des intensités lumineuses faibles à intermédiaires, la production d'acides organiques est importante, ce qui suggère une nouvelle amélioration additionnel du rendement H2 pourrait être possible grâce à l'optimisation des processus. Dans une série d'expériences associées, un autre mutant spontané, YL2, qui a un phénotype similaire à YL1, a été testé pour la croissance dans un milieu contenant de l'ammonium. Les résultats ont montré que YL2 ne peut croître que avec de l'acétate comme source de carbone, encore une fois, sans produire de H2. Une incubation prolongée dans les milieux qui ne supportent pas la croissance de YL2 a permis l'isolement de deux mutants spontanés secondaires intéressants, YL3 et YL4. L'analyse par empreint du pied Western a montré que les deux souches ont, dans une gamme de concentrations d'ammonium, l'expression constitutive de la nitrogénase. Les génomes d’YL2, YL3 et YL4 ont été séquencés afin de trouver les mutations responsables de ce phénomène. Fait intéressant, les mutations de nifA1 et nifA2 ont été trouvés dans les deux YL3 et YL4. Il est probable qu'un changement conformationnel de NifA modifie l'interaction protéine-protéine entre NifA et PII protéines (telles que GlnB ou GlnK), lui permettant d'échapper à la régulation par l'ammonium, et donc d'être capable d'activer la transcription de la nitrogénase en présence d'ammonium. On ignore comment le nitrogénase synthétisé est capable de maintenir son activité parce qu’en théorie, il devrait également être soumis à une régulation post-traductionnelle par ammonium. Une autre preuve pourrait être obtenue par l'étude du transcriptome d’YL3 et YL4. Une première étude sur la production d’ H2 par YL3 et YL4 ont montré qu'ils sont capables d’une beaucoup plus grande production d'hydrogène que JP91 en milieu d'ammonium, qui ouvre la porte pour les études futures avec ces souches en utilisant des déchets contenant de l'ammonium en tant que substrats. Enfin, le reformage biologique de l'éthanol à H2 avec la bactérie photosynthétique, Rhodopseudomonas palustris CGA009 a été examiné. La production d'éthanol avec fermentation utilisant des ressources renouvelables microbiennes a été traitée comme une technique mature. Cependant, la plupart des études du reformage de l'éthanol à H2 se sont concentrés sur le reformage chimique à la vapeur, ce qui nécessite généralement une haute charge énergetique et résultats dans les émissions de gaz toxiques. Ainsi le reformage biologique de l'éthanol à H2 avec des bactéries photosynthétiques, qui peuvent capturer la lumière pour répondre aux besoins énergétiques de cette réaction, semble d’être plus prometteuse. Une étude précédente a démontré la production d'hydrogène à partir d'éthanol, toutefois, le rendement ou la durée de cette réaction n'a pas été examiné. Une analyse RSM (méthode de surface de réponse) a été réalisée dans laquelle les concentrations de trois facteurs principaux, l'intensité lumineuse, de l'éthanol et du glutamate ont été variés. Nos résultats ont montré que près de 2 moles de H2 peuvent être obtenus à partir d'une mole d'éthanol, 33% de ce qui est théoriquement possible.

Role and modulation of maternal transcripts during the first cleavage divisions in bovine embryos

Ce travail porte sur l’identification, la fonction et la régulation des molécules maternelles d’ARNm qui dirigent la compétence développementale juste après la fécondation chez les bovins. Tout d’abord, en utilisant le modèle du temps écoulé jusqu’au premier clivage zygotique et à travers l’évaluation du transcriptome des embryons à 2-cellules, il fut possible de déterminer la signature moléculaire des niveaux extrêmes de compétence au développement et sélectionner des molécules candidates pour des études postérieures. Les résultats ont montré que les embryons de capacité développementale variable diffèrent dans certaines fonctions comme la réparation de l’ADN, le traitement de l’ARN, la synthèse de protéines et l’expression génique définies par des ARNm synthétisés par l’ovocyte. Pour obtenir une confirmation fonctionnelle, une paire de transcrits maternels (l’un détecté dans notre sondage précédent et l’autre étant une molécule reliée) ont été inhibés par « knock-down » dans des ovocytes. Les effets du knock-down de ces facteurs de transcription sont apparus avant la formation des blastocystes dû à une diminution de la capacité au clivage et celle à progresser après le stage de 8-cellules. L’analyse moléculaire des embryons knock-down survivants suggère qu’un de ces facteurs de transcription est un contrôleur crucial de l’activation du génome embryonnaire, qui représente une fenêtre développementale dans l’embryogenèse précoce. Dans la dernièr étude, nous avons testé si les facteurs de transcription d’intérêt sont modulés au niveau traductionnel. Des ARNm rapporteurs couplés à la GFP (Protéine fluorescente) contenant soit la version courte ou la version longue de la séquence 3’-UTR des deux molécules furent injectées dans des zygotes pour évaluer leur dynamique traductionnelle. Les résultats ont montré que les éléments cis-régulateurs localisés dans les 3’-UTRs contrôlent leur synchronisation traductionnelle et suggèrent une association entre la compétence développementale et la capacité de synthèse de ces protéines. Ceci conduit à l’idée que ces facteurs de transcription cruciaux sont aussi contrôlés au niveau traductionnel chez les embryons précoces. Les connaissances acquises ont joué un rôle essentiel pour définir le contrôle potentiel des molécules maternelles sur les embryons au début de leur développement. Cette étude nous montre aussi une utilisation potentielle de cette information ainsi que les nouveaux défis présents dans le secteur des technologies reproductives.

Development and application of sensitive genome-wide platforms to study the genetic and epigenetic (DNA methylation) makeup of gametes and early bovine embryos

Pour ce projet, nous avons développé une plateforme pour l’analyse pangénomique de la méthylation de l’ADN chez le bovin qui est compatible avec des échantillons de petites tailles. Cet outil est utilisé pour étudier les caractéristiques génétiques et épigénétiques (méthylation de l’ADN) des gamètes soumis aux procédures de procréation médicalement assisitée et des embryons précoces. Dans un premier temps, une plateforme d’analyse de biopuces spécifiques pour l’étude de la méthylation de l’ADN chez l’espèce bovine a été développée. Cette plateforme a ensuite été optimisée pour produire des analyses pangénomiques de méthylation de l’ADN fiables et reproductibles à partir d’échantillons de très petites tailles telle que les embryons précoces (≥ 10 ng d’ADN a été utilisé, ce qui correspond à 10 blastocystes en expansion). En outre, cet outil a permis d’évaluer de façon simultanée la méthylation de l’ADN et le transcriptome dans le même échantillon, fournissant ainsi une image complète des profils génétiques et épigénétiques (méthylation de l’ADN). Comme preuve de concept, les profils comparatifs de méthylation de l’ADN spermatique et de blastocystes bovins ont été analysés au niveau de l’ensemble du génome. Dans un deuxième temps, grâce à cette plateforme, les profils globaux de méthylation de l’ADN de taureaux jumeaux monozygotes (MZ) ont été analysés. Malgré qu’ils sont génétiquement identiques, les taureaux jumeaux MZ ont des descendants avec des performances différentes. Par conséquent, l’hypothèse que le profil de méthylation de l’ADN spermatique de taureaux jumeaux MZ est différent a été émise. Dans notre étude, des différences significatives entre les jumeaux MZ au niveau des caractéristiques de la semence ainsi que de la méthylation de l’ADN ont été trouvées, chacune pouvant contribuer à l’obtention de performances divergentes incongrues des filles engendrées par ces jumeaux MZ. Dans la troisième partie de ce projet, la même plateforme a été utilisée pour découvrir les impacts d’une supplémentation à forte concentration en donneur de méthyle universel sur les embryons précoces bovins. La supplémentation avec de grandes quantités d’acide folique (AF) a été largement utilisée et recommandée chez les femmes enceintes pour sa capacité bien établie à prévenir les malformations du tube neural chez les enfants. Cependant, plus récemment, plusieurs études ont rapporté des effets indésirables de l’AF utilisé à des concentrations élevées, non seulement sur le développement de l’embryon, mais aussi chez les adultes. Au niveau cellulaire, l’AF entre dans le métabolisme monocarboné, la seule voie de production de S-adénosyl méthionine (SAM), un donneur universel de groupements méthyles pour une grande variété de biomolécules, y compris l’ADN. Par conséquent, pour résoudre cette controverse, une forte dose de SAM a été utilisée pour traiter des embryons produits in vitro chez le bovin. Ceci a non seulement permis d’influencer le phénotype des embryons précoces, mais aussi d’avoir un impact sur le transcriptome et le méthylome de l’ADN. En somme, le projet en cours a permis le développement d’une plateforme d’analyse de la méthylation de l’ADN à l’échelle du génome entier chez le bovin à coût raisonnable et facile à utiliser qui est compatible avec les embryons précoces. De plus, puisque c’est l’une des premières études de ce genre en biologie de la reproduction bovine, ce projet avait trois objectifs qui a donné plusieurs nouveaux résultats, incluant les profils comparatifs de méthylation de l’ADN au niveau : i) blastocystes versus spermatozoïdes ; ii) semence de taureaux jumeaux MZ et iii) embryons précoces traités à de fortes doses de SAM versus des embryons précoces non traités.

APRIN(PDS5B) et PALB2, deux protéines impliquées dans la réparation de l’ADN par recombinaison homologue et l’apparition de cancers

Au Canada, en 2015, il était estimé que 78 000 personnes allaient mourir d’un cancer, représentant 30 % de tous les décès et faisant de celui-ci la première cause de mortalité. De plus, 196 900 nouveaux cas de cancers seraient découverts au cours de cette même année (Canadian Cancer Society’s Advisory Committee on Cancer Statistics. Canadian Cancer Statistics 2015. Toronto, ON : Canadian Cancer Society; 2015). L’intégrité du génome est chaque jour menacée par des conditions environnementales qui endommagent l’ADN (ultraviolets, produits chimiques divers, etc.). Parmi les différents types de lésions, l’un des plus délétères et pouvant mener au cancer est la cassure double-brin (CDB). Celle-ci peut être réparée suivant deux mécanismes majeurs : la jonction des extrémités non homologues (Non-Homologous End-Joining ou NHEJ) ou la Recombinaison Homologue (RH). Cette dernière, prépondérante pendant les phases S/G2, consiste en la réparation d’une CDB grâce à l’utilisation d’une chromatide soeur comme modèle, permettant une réparation fidèle du dommage. La RH est sous la dépendance de diverses protéines, dont RAD51, PALB2 et BRCA2. Ces deux dernières sont connues pour être mutées dans les cancers du sein et des ovaires. Ainsi, la compréhension de l’implication de chaque acteur dans la RH est un objectif fondamental dans la lutte contre le cancer et constitue l’objectif général de cette thèse. En 2012, une étude a montré qu’une nouvelle protéine, APRIN (Androgen-induced PRoliferation INhibitor), appartenant au complexe cohésine, interagissait avec BRCA2 et jouait un rôle dans la RH. Les rôles précis d’APRIN dans ce mécanisme restaient toutefois à être définis. Le projet principal de cette thèse repose sur la caractérisation fonctionnelle d’APRIN dans la réparation par RH. Nous révélons qu’APRIN aurait un rôle spécifique et indépendant de celui de la cohésine dans la RH, et pourrait agir à diverses étapes cruciales de ce mécanisme. De plus, nos données montrent que le niveau d’expression d’APRIN pourrait être un marqueur de prédiction dans le cancer ovarien. Étant donné qu’APRIN interagit aussi avec PALB2, autre partenaire essentiel de BRCA2, nous avons également étudié et caractérisé les fonctions de divers mutants de PALB2. Nous faisons ainsi la découverte inattendue d’un nouveau phénotype induit par une troncation de cette protéine associée à certains cancers agressifs. Ainsi, cette thèse apporte des informations supplémentaires et indispensables à la compréhension de la réparation de l’ADN par RH et de la survenue de certains cancers.

L'influence des proches dans la demande d'aide formelle des hommes en difficulté

La majorité des écrits scientifiques concernant la demande d’aide chez les hommes fait état de l’importance des proches dans la demande d’aide, puisqu’une majorité d’hommes aurait de la difficulté à consulter sans le soutien de leurs proches, qui font souvent office de référents lors de la demande d’aide. Par contre, il semble y avoir peu d’information disponible concernant la manière avec laquelle les proches arrivent à influencer l’homme à demander de l’aide et sur la nature des interactions entre le proche et la personne aidée. Devant ce constat, cette recherche qualitative a pour objectif d’approfondir le point de vue des proches dans le processus de demande d’aide chez les hommes. Il s’agit d’une étude exploratoire dans laquelle huit personnes ayant influencé un homme de leur entourage à consulter un professionnel ont été rencontrées dans le cadre d’entretiens semi-dirigés. Les résultats révèlent que le proche intervient souvent peu après l’apparition des premiers signaux de détresse chez l’homme de son entourage, étant particulièrement sensible aux changements dans l’humeur de l’homme ainsi qu’au risque suicidaire. Ils tentent alors d’utiliser les moyens à leur disposition – les ressources informelles - jusqu’à ce que cela ne fonctionne plus. Les proches se tournent alors vers des ressources formelles et ce sont eux, la plupart du temps, qui transmettent l’information à l’homme quant à la nature des services professionnels disponibles. Les membres du réseau social sont également très actifs tout au long du processus de demande d’aide, utilisant plusieurs types de soutien social afin d’amener l’homme à modifier ses comportements problématiques sous forme d’échange de ressources instrumentales, de ressources émotionnelles et d’information. Les proches semblent également adapter leurs interventions aux besoins de l’homme, privilégiant des interventions axées davantage sur le maintien du lien de confiance au début du processus de changement, en intégrant progressivement des interventions plus informatives, pour finalement y aller de démarches instrumentales, peu avant la demande d’aide formelle. L’influence des proches est également présente après la demande d’aide afin de maintenir la motivation de l’homme à l’égard de l’intervention. Les entrevues menées auprès des proches mettent également en lumière un autre constat, soit que la demande d’aide peut amener une certaine détresse chez la personne aidante en étant témoin de la souffrance d’une personne de son entourage. De soutenir un homme dans ce processus peut amener le proche à ressentir un sentiment d’impuissance et s’accompagne d’une responsabilité importante quant au bien-être et à la sécurité de ce dernier. Cela fait en sorte que plusieurs répondants ressentent le besoin d’obtenir de l’aide durant ou après le processus de demande d’aide, que ce soit auprès de professionnels de la santé ou de membres de leur réseau informel. Somme toute, bien que cela constitue une expérience éprouvante, plusieurs répondants vivent toutefois positivement le fait de venir en aide à un homme de leur entourage.

Regulation of mitotic BubR1 phosphorylation by the BubR1 pseudokinase domain

BubR1 est une protéine importante dans le point de contrôle de la mitose pour la stabilisation des interactions entre kinétochores et microtubules (KT-MT). Ces fonctions protègent de la ségrégation anormale des chromosomes et de l’instabilité du génome. BubR1 possède des sites de phosphorylation mitotique hautement conservés dans le domaine régulant l’attachement des kinétochores (KARD), où S676 et S670 sont phosphorylées respectivement par la kinase polo-like 1 (Plk1) et par la kinase cycline-dépendante 1 (Cdk1). Ces sites de phosphorylation sont essentiels pour le recrutement de la phosphatase PP2A-B56, qui stabilise les interactions KT-MT. Nos résultats montrent que la délétion entière ou des mutations qui déstabilisent le domaine pseudokinase de BubR1, causent la perte de phosphorylation des résidus S676 et S670 en mitose. Notre hypothèse est que le domaine pseudokinase de BubR1 peut jouer un rôle essentiel dans la régulation de la phosphorylation du KARD et donc dans la stabilisation des interactions KT-MT.

Étude de la réparation des lésions induites par les UVs dans les extrémités chromosomiques de la levure Saccharomyces cerevisiae

Résumé : Les télomères sont des structures nucléoprotéiques spécialisées qui assurent la stabilité du génome en protégeant les extrémités chromosomiques. Afin d’empêcher des activités indésirables, la réparation des dommages à l’ADN doit être convenablement régulée au niveau des télomères. Pourtant, il existe peu d’études de la réparation des dommages induits par les ultraviolets (UVs) dans un contexte télomérique. Le mécanisme de réparation par excision de nucléotides (NER pour « Nucleotide Excision Repair ») permet d’éliminer les photoproduits. La NER est un mécanisme très bien conservé de la levure à l’humain. Elle est divisée en deux sous voies : une réparation globale du génome (GG-NER) et une réparation couplée à la transcription (TC-NER) plus rapide et plus efficace. Dans notre modèle d’étude, la levure Saccharomyces cerevisiae, une forme compactée de la chromatine nommée plus fréquemment « hétérochromatine » a été décrite. Cette structure particulière est présente entre autres, au niveau des régions sous-télomériques des extrémités chromosomiques. La formation de cette chromatine particulière implique quatre protéines nommées Sir (« Silent Information Regulator »). Elle présente différentes marques épigénétiques dont l’effet est de réprimer la transcription. L’accès aux dommages par la machinerie de réparation est-il limité par cette chromatine compacte ? Nous avons donc étudié la réparation des lésions induites par les UVs dans différentes régions associées aux télomères, en absence ou en présence de protéines Sir. Nos données ont démontré une modulation de la NER par la chromatine, dépendante des nucléosomes stabilisés par les Sir, dans les régions sous-télomériques. La NER était moins efficace dans les extrémités chromosomiques que dans les régions plus proches du centromère. Cet effet était dépendant du complexe YKu de la coiffe télomérique, mais pas dépendant des protéines Sir. La transcription télomériques pourrait aider la réparation des photoproduits, par l’intermédiaire de la sous-voie de TC-NER, prévenant ainsi la formation de mutations dans les extrémités chromosomiques. Des ARN non codants nommés TERRA sont produits mais leur rôle n’est pas encore clair. Par nos analyses, nous avons confirmé que la transcription des TERRA faciliterait la NER dans les différentes régions sous-télomériques.

Improving photofermentative hydrogen production through metabolic engineering and DOE (Design of Experiments)

A l’heure actuelle, les biocarburants renouvelables et qui ne nuit pas à l'environnement sont à l'étude intensive en raison de l'augmentation des problèmes de santé et de la diminution des combustibles fossiles. H2 est l'un des candidats les plus prometteurs en raison de ses caractéristiques uniques, telles que la densité d'énergie élevée et la génération faible ou inexistante de polluants. Une façon attrayante pour produire la H2 est par les bactéries photosynthétiques qui peuvent capter l'énergie lumineuse pour actionner la production H2 avec leur système de nitrogénase. L'objectif principal de cette étude était d'améliorer le rendement de H2 des bactéries photosynthétiques pourpres non sulfureuses utilisant une combinaison de génie métabolique et le plan des expériences. Une hypothèse est que le rendement en H2 pourrait être améliorée par la redirection de flux de cycle du Calvin-Benson-Bassham envers du système de nitrogénase qui catalyse la réduction des protons en H2. Ainsi, un PRK, phosphoribulose kinase, mutant « knock-out » de Rhodobacter capsulatus JP91 a été créé. L’analyse de la croissance sur des différentes sources de carbone a montré que ce mutant ne peut croître qu’avec l’acétate, sans toutefois produire d' H2. Un mutant spontané, YL1, a été récupéré qui a retenu l'cbbP (codant pour PRK) mutation d'origine, mais qui avait acquis la capacité de se développer sur le glucose et produire H2. Une étude de la production H2 sous différents niveaux d'éclairage a montré que le rendement d’YL1 était de 20-40% supérieure à la souche type sauvage JP91. Cependant, il n'y avait pas d'amélioration notable du taux de production de H2. Une étude cinétique a montré que la croissance et la production d'hydrogène sont fortement liées avec des électrons à partir du glucose principalement dirigés vers la production de H2 et la formation de la biomasse. Sous des intensités lumineuses faibles à intermédiaires, la production d'acides organiques est importante, ce qui suggère une nouvelle amélioration additionnel du rendement H2 pourrait être possible grâce à l'optimisation des processus. Dans une série d'expériences associées, un autre mutant spontané, YL2, qui a un phénotype similaire à YL1, a été testé pour la croissance dans un milieu contenant de l'ammonium. Les résultats ont montré que YL2 ne peut croître que avec de l'acétate comme source de carbone, encore une fois, sans produire de H2. Une incubation prolongée dans les milieux qui ne supportent pas la croissance de YL2 a permis l'isolement de deux mutants spontanés secondaires intéressants, YL3 et YL4. L'analyse par empreint du pied Western a montré que les deux souches ont, dans une gamme de concentrations d'ammonium, l'expression constitutive de la nitrogénase. Les génomes d’YL2, YL3 et YL4 ont été séquencés afin de trouver les mutations responsables de ce phénomène. Fait intéressant, les mutations de nifA1 et nifA2 ont été trouvés dans les deux YL3 et YL4. Il est probable qu'un changement conformationnel de NifA modifie l'interaction protéine-protéine entre NifA et PII protéines (telles que GlnB ou GlnK), lui permettant d'échapper à la régulation par l'ammonium, et donc d'être capable d'activer la transcription de la nitrogénase en présence d'ammonium. On ignore comment le nitrogénase synthétisé est capable de maintenir son activité parce qu’en théorie, il devrait également être soumis à une régulation post-traductionnelle par ammonium. Une autre preuve pourrait être obtenue par l'étude du transcriptome d’YL3 et YL4. Une première étude sur la production d’ H2 par YL3 et YL4 ont montré qu'ils sont capables d’une beaucoup plus grande production d'hydrogène que JP91 en milieu d'ammonium, qui ouvre la porte pour les études futures avec ces souches en utilisant des déchets contenant de l'ammonium en tant que substrats. Enfin, le reformage biologique de l'éthanol à H2 avec la bactérie photosynthétique, Rhodopseudomonas palustris CGA009 a été examiné. La production d'éthanol avec fermentation utilisant des ressources renouvelables microbiennes a été traitée comme une technique mature. Cependant, la plupart des études du reformage de l'éthanol à H2 se sont concentrés sur le reformage chimique à la vapeur, ce qui nécessite généralement une haute charge énergetique et résultats dans les émissions de gaz toxiques. Ainsi le reformage biologique de l'éthanol à H2 avec des bactéries photosynthétiques, qui peuvent capturer la lumière pour répondre aux besoins énergétiques de cette réaction, semble d’être plus prometteuse. Une étude précédente a démontré la production d'hydrogène à partir d'éthanol, toutefois, le rendement ou la durée de cette réaction n'a pas été examiné. Une analyse RSM (méthode de surface de réponse) a été réalisée dans laquelle les concentrations de trois facteurs principaux, l'intensité lumineuse, de l'éthanol et du glutamate ont été variés. Nos résultats ont montré que près de 2 moles de H2 peuvent être obtenus à partir d'une mole d'éthanol, 33% de ce qui est théoriquement possible.

Création de mutants cdc5 en vue de l’identification des substrats de PLK/Cdc5 lors de la réponse d’adaptation aux dommages à l’ADN.

Les kinases de la famille Polo (PLK) jouent un rôle majeur durant le cycle cellulaire, notamment en promouvant des processus essentiels tels que l’entrée en phase M et la sortie du cycle cellulaire. Elles sont également impliquées dans plusieurs cancers et ont un fort pouvoir tumorigène. Notre laboratoire a récemment montré que Cdc5 (la kinase PLK chez Saccharomyces cerevisiae) est également nécessaire pour l'adaptation aux dommages à l'ADN, et que la cible critique de Cdc5 au cours de ce processus pourrait être une cible peu conventionnelle localisée aux centrosomes de levures. Dans le but d’identifier ce substrat, une analyse intégrale du phosphoprotéome de PLK/Cdc5 par spectrométrie de masse devra être réalisée. Pour ce faire, un allèle CDC5 sensible à la température, c’est-à-dire une version mutante qui devient inactive à température élevée, devra être utilisée. Cet allèle devra être thermosensible à 30°C, afin de s’assurer qu’il sera le seul à être inactivé à cette température et que, par conséquent, seuls les substrats de Cdc5 seront identifiés. À cet effet, nous avons généré deux allèles cdc5 thermosensibles à 30°C : cdc5-17 et cdc5-18, puis analysé leur cycle cellulaire à 32°C. Les résultats de cette analyse ont montré que l’exposition des cellules à 32°C résulte en leur blocage en fin de mitose sous la forme bourgeonnée, témoignant d’un défaut dans la promotion de la sortie de la mitose. Ce défaut est causé par la mutation du gène CDC5 dont la protéine favorise la sortie de la mitose via deux voies : la voie du MEN (Mitotic Exit Network) et la voie du FEAR (Cdc Fourteen Early Anaphase Release). cdc5-17 et cdc5-18 représentent des outils biologiques précieux qui permettront de mieux analyser le phosphoprotéome de PLK/Cdc5 et de mener à l’identification des cibles de Cdc5 lors de la réponse d’adaptation aux dommages à l’ADN. Étant donné que l’adaptation aux dommages à l’ADN causés par des chimiothérapies représente l’un des facteurs permettant la prolifération des tumeurs cancéreuses, cette découverte serait un grand pas dans la lutte contre le cancer.

Studies of MHC class I antigen presentation & the origins of the immunopeptidome

La présentation d'antigène par les molécules d'histocompatibilité majeure de classe I (CMHI) permet au système immunitaire adaptatif de détecter et éliminer les agents pathogènes intracellulaires et des cellules anormales. La surveillance immunitaire est effectuée par les lymphocytes T CD8 qui interagissent avec le répertoire de peptides associés au CMHI présentés à la surface de toutes cellules nucléées. Les principaux gènes humains de CMHI, HLA-A et HLA-B, sont très polymorphes et par conséquent montrent des différences dans la présentation des antigènes. Nous avons étudié les différences qualitatives et quantitatives dans l'expression et la liaison peptidique de plusieurs allotypes HLA. Utilisant la technique de cytométrie de flux quantitative nous avons établi une hiérarchie d'expression pour les quatre HLA-A, B allotypes enquête. Nos résultats sont compatibles avec une corrélation inverse entre l'expression allotypique et la diversité des peptides bien que d'autres études soient nécessaires pour consolider cette hypothèse. Les origines mondiales du répertoire de peptides associés au CMHI restent une question centrale à la fois fondamentalement et dans la recherche de cibles immunothérapeutiques. Utilisant des techniques protéogénomiques, nous avons identifié et analysé 25,172 peptides CMHI isolées à partir des lymphocytes B de 18 personnes qui exprime collectivement 27 allotypes HLA-A,B. Alors que 58% des gènes ont été la source de 1-64 peptides CMHI par gène, 42% des gènes ne sont pas représentés dans l'immunopeptidome. Dans l'ensemble, l’immunopeptidome présenté par 27 allotypes HLA-A,B ne couvrent que 17% des séquences exomiques exprimées dans les cellules des sujets. Nous avons identifié plusieurs caractéristiques des transcrits et des protéines qui améliorent la production des peptides CMHI. Avec ces données, nous avons construit un modèle de régression logistique qui prédit avec une grande précision si un gène de notre ensemble de données ou à partir d'ensembles de données indépendants génèrerait des peptides CMHI. Nos résultats montrent la sélection préférentielle des peptides CMHI à partir d'un répertoire limité de produits de gènes avec des caractéristiques distinctes. L'idée que le système immunitaire peut surveiller des peptides CMHI couvrant seulement une fraction du génome codant des protéines a des implications profondes dans l'auto-immunité et l'immunologie du cancer.

Création de mutants cdc5 en vue de l’identification des substrats de PLK/Cdc5 lors de la réponse d’adaptation aux dommages à l’ADN

Les kinases de la famille Polo (PLK) jouent un rôle majeur durant le cycle cellulaire, notamment en promouvant des processus essentiels tels que l’entrée en phase M et la sortie du cycle cellulaire. Elles sont également impliquées dans plusieurs cancers et ont un fort pouvoir tumorigène. Notre laboratoire a récemment montré que Cdc5 (la kinase PLK chez Saccharomyces cerevisiae) est également nécessaire pour l'adaptation aux dommages à l'ADN, et que la cible critique de Cdc5 au cours de ce processus pourrait être une cible peu conventionnelle localisée aux centrosomes de levures. Dans le but d’identifier ce substrat, une analyse intégrale du phosphoprotéome de PLK/Cdc5 par spectrométrie de masse devra être réalisée. Pour ce faire, un allèle CDC5 sensible à la température, c’est-à-dire une version mutante qui devient inactive à température élevée, devra être utilisée. Cet allèle devra être thermosensible à 30°C, afin de s’assurer qu’il sera le seul à être inactivé à cette température et que, par conséquent, seuls les substrats de Cdc5 seront identifiés. À cet effet, nous avons généré deux allèles cdc5 thermosensibles à 30°C : cdc5-17 et cdc5-18, puis analysé leur cycle cellulaire à 32°C. Les résultats de cette analyse ont montré que l’exposition des cellules à 32°C résulte en leur blocage en fin de mitose sous la forme bourgeonnée, témoignant d’un défaut dans la promotion de la sortie de la mitose. Ce défaut est causé par la mutation du gène CDC5 dont la protéine favorise la sortie de la mitose via deux voies : la voie du MEN (Mitotic Exit Network) et la voie du FEAR (Cdc Fourteen Early Anaphase Release). cdc5-17 et cdc5-18 représentent des outils biologiques précieux qui permettront de mieux analyser le phosphoprotéome de PLK/Cdc5 et de mener à l’identification des cibles de Cdc5 lors de la réponse d’adaptation aux dommages à l’ADN. Étant donné que l’adaptation aux dommages à l’ADN causés par des chimiothérapies représente l’un des facteurs permettant la prolifération des tumeurs cancéreuses, cette découverte serait un grand pas dans la lutte contre le cancer.

Studies of MHC class I antigen presentation & the origins of the immunopeptidome

La présentation d'antigène par les molécules d'histocompatibilité majeure de classe I (CMHI) permet au système immunitaire adaptatif de détecter et éliminer les agents pathogènes intracellulaires et des cellules anormales. La surveillance immunitaire est effectuée par les lymphocytes T CD8 qui interagissent avec le répertoire de peptides associés au CMHI présentés à la surface de toutes cellules nucléées. Les principaux gènes humains de CMHI, HLA-A et HLA-B, sont très polymorphes et par conséquent montrent des différences dans la présentation des antigènes. Nous avons étudié les différences qualitatives et quantitatives dans l'expression et la liaison peptidique de plusieurs allotypes HLA. Utilisant la technique de cytométrie de flux quantitative nous avons établi une hiérarchie d'expression pour les quatre HLA-A, B allotypes enquête. Nos résultats sont compatibles avec une corrélation inverse entre l'expression allotypique et la diversité des peptides bien que d'autres études soient nécessaires pour consolider cette hypothèse. Les origines mondiales du répertoire de peptides associés au CMHI restent une question centrale à la fois fondamentalement et dans la recherche de cibles immunothérapeutiques. Utilisant des techniques protéogénomiques, nous avons identifié et analysé 25,172 peptides CMHI isolées à partir des lymphocytes B de 18 personnes qui exprime collectivement 27 allotypes HLA-A,B. Alors que 58% des gènes ont été la source de 1-64 peptides CMHI par gène, 42% des gènes ne sont pas représentés dans l'immunopeptidome. Dans l'ensemble, l’immunopeptidome présenté par 27 allotypes HLA-A,B ne couvrent que 17% des séquences exomiques exprimées dans les cellules des sujets. Nous avons identifié plusieurs caractéristiques des transcrits et des protéines qui améliorent la production des peptides CMHI. Avec ces données, nous avons construit un modèle de régression logistique qui prédit avec une grande précision si un gène de notre ensemble de données ou à partir d'ensembles de données indépendants génèrerait des peptides CMHI. Nos résultats montrent la sélection préférentielle des peptides CMHI à partir d'un répertoire limité de produits de gènes avec des caractéristiques distinctes. L'idée que le système immunitaire peut surveiller des peptides CMHI couvrant seulement une fraction du génome codant des protéines a des implications profondes dans l'auto-immunité et l'immunologie du cancer.

Caractérisation d’un effecteur de phosphoinositides chez le parasite de la malaria "Plasmodium falciparum"

La malaria est une maladie infectieuse causant plus de 500 000 morts chaque année. La maladie est causée par un protozoaire de la famille Plasmodium. L’apparition de souches résistantes aux traitements actuels et l’absence de vaccin efficace rendent la découverte de nouvelles cibles thérapeutiques urgente. Le parasite possède un complexe apical, un groupement de vacuoles sécrétoires spécialisées contenant les protéines responsables de l’invasion du globule rouge. Nous nous intéressons aux mécanismes gouvernant le transport intracellulaire de ces protéines et à la biogenèse du complexe apical lors de la formation des nouveaux parasites. Plus particulièrement, nous nous intéressons au rôle des phosphoinositides dans le recrutement des protéines à la membrane de l’appareil de Golgi. Par analyse bio-informatique du génome de P. falciparum, nous avons identifié plusieurs protéines effectrices liant potentiellement les phosphoinositides. Les travaux présentés dans ce mémoire concernent Mal13P1.188, une protéine possédant un domaine Pleckstrin homology. Nous proposons que Mal13P1.188 ait un rôle dans la génération du complexe apical en recrutant les protéines le constituant à la membrane du Golgi par la liaison avec les phosphoinositides. Afin de vérifier nos hypothèses, nous avons généré une lignée de parasite dont le gène de Mal13P1.188 est fusionné avec une GFP et une hémagglutinine. À l’aide de cette lignée de parasite, nous avons pu identifier Mal13P1.188 à proximité de l’appareil de Golgi lorsque les parasites étaient sous la forme schizont du cycle érythrocytaire. D’autres expériences ont permis de confirmer que le domaine Pleckstrin homology de Mal13P1.188 était capable de reconnaître les différentes formes de phosphoinositides. Finalement, d’autres travaux devront être faits sur Mal13P1.188 afin de déterminer si elle est essentielle à la survie du parasite.

Déterminants génétiques de la variabilité des triglycérides plasmatiques en réponse à une supplémentation en acides gras oméga-3 d’origine marine

Il est reconnu que la consommation d’acides gras (AG) oméga-3 (n-3) d’origine marine est bénéfique pour la prévention des maladies cardiovasculaires (MCV), notamment en raison de leurs effets hypotriglycéridémiants. Toutefois, il existe une importante hétérogénéité dans la réponse des triglycérides (TG) plasmatiques à une supplémentation en AG n-3 et ce phénomène est en partie attribuable à des facteurs génétiques. Notre groupe de recherche a récemment réalisé une étude d’association à l’échelle du génome (GWAS) sur les participants de l’étude Fatty Acid Sensor (FAS), qui a permis d’identifier plusieurs loci associés à la réponse des TG suite à une supplémentation de 3g d’AG n-3 par jour. La plupart de ces loci sont localisés dans les gènes IQCJ, NXPH1, PHF17 et MYB. Des effets du génotype ainsi que des interactions gène-diète ont été observés avec plusieurs polymorphismes nucléotidiques simples (SNPs) des quatre gènes candidats. Ces résultats suggèrent que des variations génétiques à l’intérieur de gènes identifiés par GWAS peuvent expliquer en partie la variabilité de la réponse des TG plasmatiques à une supplémentation en AG n-3 d’origine marine.