A novel regeneration system for a wild passion fruit species (Passiflora cincinnata Mast.) based on somatic embryogenesis from mature zygotic embryos

The objective of the present work was to induce somatic embryogenesis from zygotic embryos of Passiflora cincinnata Masters. Zygotic embryos formed calli on media with different concentrations of 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) and 4.5 mu M benzyladenine (BA) after 30 days of in vitro culture. A concentration of 18.1 mu M 2,4-D resulted in the largest number of somatic embryos. Embryogenic calli were yellowish and friable, forming whitish proembryogenic masses. Morphologically, embryogenic cells were small and had large nuclei and dense cytoplasm, whereas non-embryogenic cells were elongated, with small nuclei and less dense cytoplasm. Calli cultured under white light on basal Murashige and Skoog`s medium with activated charcoal produced embryos in all developmental stages. There were differences among the treatments, with some leading to the production of calli with embryos and some only to callus formation. Some abnormalities were associated with somatic embryos, including fused axes, fused cotyledons and polycotyledonary embryos. Production of secondary somatic embryos occurred in the first cycle of primary embryo development. Secondary embryos differentiated from the surface of the protodermal layer of primary embryos with intense cell proliferation, successive mitotic divisions in the initial phase of embryoid development, and a vascular system formed with no connection to the parental tissue. This secondary embryogenic system of P. cincinnata is characterized by intense proliferation and maintenance of embryogenic competence after successive subcultures. This reproducible protocol opens new prospects for massive propagation and is an alternative to the current organogenesis-based transformation protocol.

In vitro morphogenesis and cell suspension culture establishment in Piper solmsianum C. DC. (Piperaceae)

In vitro morphogenesis and cell suspension culture establishment in Piper solmsianum C. DC. (Piperaceae)). Piper solmsianum is a shrub from Southeast Brazil in which many biologically active compounds were identified. The aim of this work was to establish a cell suspension culture system for this species. With this in mind, petiole and leaf explants obtained from in vitro plantlets were cultured in the presence of different plant growth regulator combinations (IAA, NAA, 2,4-D and BA). Root and indirect shoot adventitious formation, detected by histological analysis, was observed. Besides the different combinations of plant growth regulators, light regime and the supplement of activated charcoal (1.5 mg.l(-1)) were tested for callus induction and growth. Cultures maintained in light, on a 0.2 mg.l(-1) 2,4-D and 2 mg.l(-1) BA supplemented medium, and in the absence of activated charcoal, showed the highest calli fresh matter increment. From a callus culture, cell suspension cultures were established and their growth and metabolite accumulation studied. The achieved results may be useful for further characterization of the activated secondary metabolites pathways in in vitro systems of P. solmsianum.

Transformação genética em cevada por bombardeamento de partículas

A presente Tese de Doutorado objetivou: (1) definir um método eficiente de transformação genética, por bombardeamento de partículas, para a obtenção de plantas transgênicas de cultivares brasileiras de cevada e (2) identificar gene(s) codificante(s) de quitinase(s) potencialmente capaz(es) de conferir resistência ao fungo patogênico de cevada Bipolaris sorokiniana. Culturas de calos obtidos a partir de escutelos imaturos das cultivares Brasileiras de cevada MN-599 e MN-698 (Cia. de Bebidas das Américas, AMBEV) foram bombardeadas com partículas de tungstênio e avaliadas quanto à expressão do gene repórter gusA através de ensaios histoquímicos de GUS e quanto ao efeito dos bombardeamentos na indução estruturas embriogênicas e regeneração de plantas. As condições de biobalística analisadas incluíram a região promotora regulando a expressão de gusA, tipo e pressão de gás hélio de dois aparelhos de bombardeamento, distância de migração das partículas, número de tiros e a realização de pré e pós-tratamento osmótico dos tecidos-alvo. No presente trabalho foram obtidos um número bastante alto de pontos azuis por calo, a indução de calos embriogênicos e embriões somáticos em uma freqüência de até 58,3% e a regeneração de 60 plantas, sendo 43 de calos bombardeados. As melhores condições observadas foram o promotor e primeiro íntron do gene Adh de milho (plasmídeo pNGI), o aparelho de bombardeamento “ Particle Inflow Gun” (PIG) utilizando-se a distância de migração de partículas de 14,8 cm, dois tiros disparados por placa e a realização de tratamento osmótico dos explantes com 0,2 M de manitol e 0,2 M de sorbitol 4-5 horas antes e 17-19 horas depois dos bombardeamentos. Das 43 plantas obtidas de calos bombardeadas, 3 apresentaram atividade de GUS na base das suas folhas. A utilização de primers sintéticos definidos a partir de genes de quitinases descritos na literatura em PCRs resultou na amplificação de dois fragmentos de aproximadamente 700 e 500 pb a partir de DNA total das cvs. MN-599 e MN-698 de cevada e um fragmento, com aproximadamente 500 pb, a partir do DNA total do isolado A4c de Trichoderma sp. Estes fragmentos foram purificados dos géis de agarose e diretamente seqüenciados de forma manual e automática. Os fragmentos de 700 e 500 pb amplificados do genoma da cultivar MN-599 foram identificados como genes de quitinases de cevada e o fragmento de 500 pb do isolado A4c de Trichoderma sp. não apresentou homologia com seqüências conhecidas de quitinases depositadas no EMBL/GenBank. A utilização de novos pares de primers, representando seqüências conservadas de quitinases do fungo Metarhizium anisopliae, resultou na amplificação de 3 fragmentos a partir do DNA total do isolado A4b de Trichoderma sp., que estão sendo purificados para realização de seqüenciamento.

Caracterização da mutagênese por inserção do retrotransposon Tos17 em genótipos de arroz

O aumento do potencial produtivo da cultura de arroz via melhoramento genético está principalmente relacionado ao rendimento, a qualidade de grãos e a obtenção de plantas resistentes a doenças e pragas. Neste caso, deve ser explorada a variabilidade genética natural ou induzida através de agentes mutagênicos físicos, químicos ou biológicos. A vantagem do uso de mutagênicos biológicos, como os transposons e os retrotransposons, é que ao serem inseridos podem interrompem um gene causando uma mutação. Esta retrotransposição deixa uma marca que possibilita a identificação molecular do local de inserção. No presente trabalho, foi utilizada a estratégia de mutagênese insercional através de eventos de transposição do retrotransposon Tos17, induzido por cultura in vitro. A análise de diferentes genótipos de arroz é muito importante para avaliar se a transposição ocorre de forma similar em genótipos distintos. Foram avaliados calos embriogênicos de cultivares que têm um histórico de variabilidade genética em homozigose, linhagens obtidas através de cruzamentos com espécies silvestres e ecótipos de arroz vermelho, submetidos a 6 meses de cultura in vitro. O método escolhido para avaliar o número de cópias de Tos17 em calos embriogênicos foi a quantificação relativa por PCR em tempo real. A identificação dos genes mutados pela inserção do retrotransposon foi feita através do isolamento e amplificação das seqüências que flanqueiam os insertos de Tos17. O resultado deste experimento indica um aumento no número de cópias de Tos17 em 8 dos 21 genótipos avaliados. O seqüenciamento dos fragmentos de DNA que flanqueiam os insertos do retrotransposon Tos17, indicaram alta similaridade com seqüências genômicas não codificantes de arroz.

Propagação de Camellia sinensis: efeito do genótipo, estaca, substrato, recipiente e ácido indolbutírico

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Enraizamento de estacas de Camellia sinensis L. em função da época de coleta de ramos, genótipos e ácido indolbutírico

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Indução de calos embriogênicos em explantes de cupuaçuzeiro

Objetivou-se a indução de calos embriogênicos em cupuaçuzeiro, em função do tipo de explante e meio de cultura. Foram testados como explantes, segmentos cotiledonares e eixos embrionários divididos em três partes: região da plúmula, radícula e hipocótilo. Os explantes foram cultivados em 2 diferentes meios de cultura: 1) MS suplementado com 2,4-D (1 mg L-1) e Cinetina (0,25 mg L-1); 2) MS acrescido de ANA (5 mg L-1) e Cinetina (0,25 mg L-1). Constatou-se que a região do hipocótilo foi a parte mais responsiva do eixo embrionário, formando calos com aspecto branco e friável. As auxinas testadas nos meios não estimularam o processo embriogênico em calos de cupuaçuzeiro.

Implante de biomateriais e a consolidação óssea em cadelas submetidas à ovariossalpingo-histerectomia

Avaliou-se a hidroxiapatita com alandronato e hidroxiapatita com colágeno na aceleração da consolidação óssea do rádio de cadelas adultas submetidas à ovariossalpingo-histerectomia (OSH). Utilizaram-se 14 cadelas adultas, distribuídas aleatoriamente em dois grupos: grupo-controle e grupo OSH (submetidas à OSH). Quatro meses após a OSH, as cadelas dos dois grupos foram submetidas à cirurgia para produção de uma falha óssea de 4mm de diâmetro nos terços distal e proximal do rádio. No terço distal do membro direito, foi utilizada a hidroxiapatita com alandronato e, no membro esquerdo, a hidroxiapatita com colágeno; no terço proximal, não se utilizou nenhum biomaterial. Houve retardo na consolidação das falhas ósseas nas cadelas submetidas à OSH comparadas com as não submetidas. A hidroxiapatita com alandronato acelerou o processo de reparação e, em todos os animais dos dois grupos, a densidade óssea foi significativamente maior no terço distal onde foi implantada. Os dois biomateriais apresentaram biocompatibilidade, constatada pela ausência de reação inflamatória ou outra reação indesejável.

PROPAGAÇÃO do UMEZEIRO (Prunus mume Sieb & Zucc.) POR ESTAQUIA HERBÁCEA

A utilização do umezeiro ou damasqueiro-japonês (Prunus mume Sieb & Zucc.) como porta-enxerto de Prunus sp. vem despertando grande interesse em função de sua rusticidade, resistência a pragas e doenças, adaptação e, principalmente, por reduzir o porte de pessegueiros e nectarineiras. Este trabalho foi conduzido no Departamento de Produção Vegetal da FCAV/UNESP, Câmpus de Jaboticabal-SP, e teve por objetivo estudar a propagação vegetativa desta espécie. Para tanto, utilizaram-se estacas herbáceas com 12cm de comprimento dos Clones 02; 05; 10 e 15, provenientes do Programa de Melhoramento Genético do Instituto Agronômico de Campinas, submetidas às concentrações de 0 e 2000mg.L-1 de AIB, por cinco segundos. O experimento foi conduzido em delineamento experimental inteiramente casualizado, com 4 repetições de 20 estacas por parcela, esquema fatorial 4 x 2, sendo o fator clone em 4 níveis (Clones 02; 05; 10 e 15) e AIB em 2 níveis (0 e 2000mg.L-1). de acordo com os resultados, verificou-se diferença entre os clones quanto à porcentagem de enraizamento, sendo o Clone 15 significativamente superior ao Clone 02 (93,75% e 78,13%, respectivamente). Os Clones 05 (85,0%) e 10 (83,13%) comportaram-se como intermediários, não diferindo dos demais. Não houve diferença entre os clones testados quanto à formação de calo, raízes por estaca, comprimento de raízes e porcentagem de estacas brotadas. O ácido indolbutírico na concentração de 2000mg.L-1 favoreceu a emissão de raízes adventícias e aumentou o comprimento das raízes, mas não teve influência na brotação das estacas. Não houve efeito da interação entre os fatores testados para as variáveis analisadas.

Enraizamento de estacas herbáceas de quatro clones de umezeiro (Prunus mume Sieb. et Zucc.) durante o inverno ameno, em Jaboticabal-SP

Estudos realizados no Brasil com o umezeiro (Prunus mume Sieb. et Zucc.) relatam promissoras perspectivas de utilização desta espécie como porta-enxerto para pessegueiro e nectarineira, em função de sua rusticidade, adaptação ao inverno brando, compatibilidade com Prunus persica, redução do vigor das plantas e melhoria da qualidade dos frutos. Entretanto, em função da propagação por sementes, tem sido observadas diferenças de vigor entre as plantas, resultando em pomares muito heterogêneos. Assim, o presente estudo teve por objetivo estudar o enraizamento de estacas herbáceas de quatro clones de umezeiro (Clones 02, 05, 10 e 15) durante o inverno ameno, em Jaboticabal-SP. O experimento foi conduzido entre os meses de junho e agosto, sendo avaliado aos 70 dias após a estaquia. Pelos resultados obtidos, foi possível concluir que é viável a propagação dos clones estudados por enraizamento de estacas herbáceas durante o inverno. Foram observadas diferenças entre os clones quanto à porcentagem de enraizamento, porcentagem de estacas com calo, número e comprimento das raízes. No conjunto das variáveis analisadas, os melhores resultados foram obtidos com os Clones 10 e 15.

Indol-butyric acid levels on cashew cloning by air-layering process

Um estudo foi conduzido com a finalidade de determinar a possibilidade de clonagem do cajueiro (Anacardium occidentale) por alporquia e a influência do AIB (ácido indolbutírico) nesse processo. Adotou-se delineamento experimental inteiramente casualizado, com 4 tratamentos, 10 alporques por parcela, repetidos por 4 vezes, num total de 160 alporques. Os tratamentos constaram das concentrações de AIB: 0 (testemunha), 1.000, 3.000 e 5.000 mg.kg-1. Foram avaliadas as percentagens de sobrevivência, calejamento e enraizamento, bem como número e comprimento médio de raízes. A maior percentagem de sobrevivência (67,5%) foi observada para a testemunha e concentração de 1.000 mg.kg-1, enquanto a melhor percentagem de enraizamento (82%) foi relacionada com o nível de 1.000 mg.kg-1. Para o número e comprimento médio de raízes, os melhores resultados foram concernentes à dose de 5.000 mg.kg-1. Não houve influência do AIB na clonagem do cajueiro por alporquia.

Micropropagation of fig (Ficus carica L.) 'Roxo de Valinhos' plants

An in vitro protocol for Ficus carica cv. 'Roxo de Valinhos' was optimized. Nodal explants containing two buds were excised from field-grown mature plants, and transferred to different proliferation media consisting of combinations of distinct concentrations of activated charcoal with benzyladenine (BA), kinetin with gibberellic acid (GA(3)), and WPM (woody plant medium) with kinetin. The regular strength of WPM in combination with 0.5 mg l(-1) kinetin was the best condition for shoot proliferation of Ficus carica 'Roxo de Valinhos' plants. The addition of activated charcoal in the medium completely inhibited shoot proliferation. The inclusion of BA in the medium induced excessive callus formation as well as small and vitrified shoots, while GA(3) induced excessive elongation associated with vitrification, chlorosis, and tip-burned shoots.