Conception et évaluation d’un nouveau système de transfection ciblée, basé sur l’utilisation du système E/Kcoil

Actuellement le polyéthylènimine (PEI) est l’agent de transfection transitoire le plus utilisé par l’industrie pharmaceutique pour la production de protéines recombinantes à grande échelle par les cellules de mammifères. Il permet la condensation de l’ADN plasmidique (ADNp) en formant spontanément des nanoparticules positives appelées polyplexes, lui procurant la possibilité de s’attacher sur la membrane cellulaire afin d’être internalisé, ainsi qu’une protection face aux nucléases intracellulaires. Cependant, alors que les polyplexes s’attachent sur la quasi-totalité des cellules seulement 5 à 10 % de l’ADNp internalisé atteint leur noyau, ce qui indique que la majorité des polyplexes ne participent pas à l’expression du transgène. Ceci contraste avec l’efficacité des vecteurs viraux où une seule particule virale par cellule peut être suffisante. Les virus ont évolués afin d’exploiter les voies d’internalisation et de routage cellulaire pour exprimer efficacement leur matériel génétique. Nous avons donc supposé que l’exploitation des voies d’internalisation et de routage cellulaire d’un récepteur pourrait, de façon similaire à plusieurs virus, permettre d’optimiser le processus de transfection en réduisant les quantités d’ADNp et d’agent de transfection nécessaires. Une alternative au PEI pour transfecter les cellules de mammifèreest l’utilisation de protéines possédant un domaine de liaison à l’ADNp. Toutefois, leur utilisation reste marginale à cause de la grande quantité requise pour atteindre l’expression du transgène. Dans cette étude, nous avons utilisé le système E/Kcoil afin de cibler un récepteur membranaire dans le but de délivrer l’ADNp dans des cellules de mammifères. Le Ecoil et le Kcoil sont des heptapeptides répétés qui peuvent interagir ensemble avec une grande affinité et spécificité afin de former des structures coiled-coil. Nous avons fusionné le Ecoil avec des protéines capables d’interagir avec l’ADNp et le Kcoil avec un récepteur membranaire que nous avons surexprimé dans les cellules HEK293 de manière stable. Nous avons découvert que la réduction de la sulfatation de la surface cellulaire permettait l’attachement ciblé sur les cellules par l’intermédiaire du système E/Kcoil. Nous démontrons dans cette étude comment utiliser le système E/Kcoil et une protéine interagissant avec l’ADNp pour délivrer un transgène de manière ciblée. Cette nouvelle méthode de transfection permet de réduire les quantités de protéines nécessaires pour l’expression du transgène.

Rôle des cellules dendritiques dans la modulation de la réponse immunitaire de l'hôte contre Streptococcus suis

Streptococcus suis est un important pathogène porcin et agent zoonotique responsable de méningites et de septicémies. À ce jour, les mécanismes impliqués dans la réponse immunitaire de l’hôte lors de l’infection par S. suis sont peu connus; et il en est de même pour les stratégies utilisées par S. suis afin de déjouer cette réponse. L’augmentation de l’incidence et de la sévérité des cas humains souligne le besoin d’une meilleure compréhension des interactions entre S. suis et le système immunitaire afin de générer une réponse immunitaire efficace contre ce pathogène. Les cellules dendritiques (DCs) sont de puissantes cellules présentatrices d’antigènes qui stimulent les lymphocytes T et B, assurant la liaison entre l’immunité innée et l’immunité adaptative. L’objectif principal de ce projet était d’évaluer le rôle joué par différents facteurs de virulence de S. suis sur la modulation de la fonction des DCs et de la réponse T-dépendante. Nous avons examiné l’effet des facteurs clés pour la virulence de S. suis, dont la capsule polysaccharidique (CPS), les modifications de la paroi cellulaire (D-alanylation de l’acide lipotéichoïque et N-déacétylation du peptidoglycane) et la toxine suilysine, sur l’activation et la maturation de DCs murines dérivées de la moelle osseuse (bmDCs). Suite à l’infection par S. suis, les bmDCs sont activées et subissent un processus de maturation caractérisé par l’augmentation de l’expression de molécules de co-stimulation et la production de cytokines pro-inflammatoires. La CPS est le principal facteur interférant avec la production de cytokines, même si les modifications de la paroi cellulaire et la suilysine peuvent également moduler la production de certaines cytokines. Enfin, la CPS, les modifications de la paroi cellulaire et la suilysine interfèrent avec la déposition du complément à la surface des bactéries et, en conséquence, avec le « killing » dépendant du complément. Les résultats ont été confirmés à l’aide de bmDCs porcines. Nous avons aussi voulu identifier les récepteurs cellulaires impliqués dans la reconnaissance de S. suis par les DCs. Nous avons démontré que la production de cytokines et l’expression des molécules de co-stimulation par les DCs sont fortement dépendantes de la signalisation par MyD88, suggérant que les DCs reconnaissent S. suis et deviennent activées majoritairement via la signalisation par les récepteurs de type Toll (TLRs). En effet, on remarque une diminution de la production de plusieurs cytokines ainsi que de l’expression de certaines molécules de co-stimulation chez les DCs TLR2-/- ou TLR2-/- et TLR9-/- double négatives. Finalement, le récepteur NOD2 semblait jouer un rôle partiel dans l’activation des DCs suite à une infection par S. suis.Enfin, nous avons évalué les conséquences de la modulation des fonctions des DCs sur le développement de la réponse T-dépendante. Les splénocytes totaux produisent plusieurs cytokines en réponse à S. suis. Des analyses in vivo et ex vivo ont permis d’observer l’implication des cellules T CD4+ et le développement d’une réponse de type « T helper » 1 (TH1) bien que la quantité de cytokines TH1 produites lors de l’infection in vivo par S. suis demeure assez basse. La CPS de S. suis interfère avec la production de plusieurs cytokines par les cellules T in vitro. Expérimentalement, l’infection induite par S. suis résulte en de faibles niveaux de production d’anticorps anti-S. suis, mais aussi d’anticorps dirigés contre l’ovalbumine utilisée comme antigène rapporteur. Cette interférence est corrélée avec la sévérité des signes cliniques, suggérant que S. suis interfère avec le développement d’une réponse immunitaire adaptative appropriée qui serait requise pour contrôler la progression de l’infection. Les résultats de cette étude mèneront à une meilleure compréhension de la réponse immunitaire de l’hôte lors de l’infection par S. suis.

Le rôle du récepteur B1 des kinines dans l'insulite et dans les complications du diabète de type 1 dans un modèle de choc spectique

Les kinines sont des peptides vasoactifs et des neuromédiateurs centraux impliqués dans le contrôle cardiovasculaire, la douleur et l’inflammation. Leurs actions sont relayées par deux types de récepteurs couplés aux protéines G : le récepteur B2 (RB2), constitutif, et le récepteur B1 (RB1), inductible en présence de lésions tissulaires, de cytokines pro-inflammatoires, d’endotoxines bactériennes et dans certaines pathologies tel que le diabète. Le diabète sucré augmente à l’échelle mondiale et son étiologie est complexe; il aggrave les infections sévères et augmente la mortalité par hyperbactériémie résistante à un contrôle thérapeutique et une prise en charge en soins intensifs. Les décès surviennent dans la grande majorité des cas à la suite de l'apparition d'une coagulation intra- vasculaire disséminée (CIVD). Ce projet a pour but d’étudier le rôle du RB1 dans la CIVD dans un modèle de diabète de type 1 induit par la streptozotocine (STZ) (Article 1) et dans l’insulite (Article 2). La CIVD est produite par l’injection de lipopolysaccharide (LPS, 2 mg/kg, i.p.), 4 jours après le traitement à la STZ (65 mg/kg, i.p.). Dans le premier article, nous avons montré une augmentation significative de l'œdème et de la perméabilité vasculaire par le bleu d’Évans dans le rein, le poumon, le coeur et le foie chez les rats traités au LPS et/ou à la STZ, une situation qui favorise une hémoconcentration et le développement d'un état d'hypercoagulabilité. Nous avons aussi montré la présence d'indices de thrombus et de lésions tissulaires dans l'étude histologique ainsi qu’une augmentation de l'expression du RB1 dans le coeur, le rein et les plaquettes sanguines. Un traitement avec l’antagoniste du RB1, le SSR240612, a corrigé l’apparition de ces anomalies et a rendu normale la glycémie chez les rats STZ et l’hyperthermie induite par le LPS. De même, le SSR240612 a nettement amélioré la survie des animaux. Les bénéfices du SSR240612 ont été reproduits par l’inhibition de la iNOS avec le 1400W et de la COX-2 avec l’acide niflumique, suggérant que les médiateurs de ces enzymes pro-inflammatoires agissent en aval du RB1.Dans le deuxième article, le rat STZ est traité du jour 4 au jour 7 avec le SSR240612 (10 mg/kg/jr per os). Cet antagoniste du RB1 bloque l’infiltration du pancréas par les macrophages et les lymphocytes TCD4+ qui sont porteurs du RB1. L’antagoniste prévient aussi l’augmentation de l’expression de la iNOS, du TNF-α, du RB1 et du TRPV1 dans le pancréas des rats diabétiques. Le traitement avec l’antagoniste du RB1 a limité la perte des cellules β des îlots de Langerhans et a corrigé l’hypoinsulinémie et l’hyperglycémie. Ces deux études mettent en lumière un rôle important du RB1 dans la létalité associée au choc septique, à la thrombose et à l’insulite. Par conséquent, le RB1 représente une cible thérapeutique prometteuse dans le traitement du diabète et de ses complications.

Rôle de la PKC delta dans la fonction plaquettaire en réponse à la thrombine via le récepteur GPIb alpha

La famille des protéines kinases C (PKC) est essentielle pour la fonction plaquettaire en réponse à la thrombine qui signale et active les plaquettes via les proteases activated receptors (PAR-1 et PAR-4) et le GPIbα. Ces derniers constituent les récepteurs de moyenne/faible et de hautes affinités pour la thrombine, respectivement. L’isoforme PKCδ régule positivement ou négativement la fonction des plaquettes tout dépendamment de la nature du stimulus. Cependant, son importance dans la fonction plaquettaire en réponse à la thrombine en aval de la GPIbα reste inconnue. L’objectif principal de ce projet de doctorat était de déterminer l'implication de l'axe thrombine/GPIbα/PKCδ dans la fonction plaquettaire et d’évaluer le rôle de cet axe dans la régulation de la thrombose. Dans les plaquettes humaines, le prétraitement avec l'inhibiteur spécifique de la PKCδ δ(V1-1)TAT, a significativement potentialisé l'activation et l’agrégation des plaquettes en réponse à de faibles concentrations de α-thrombine, mais pas en réponse à la γ-thrombine ou aux agonistes des PARs. Ce phénomène de potentialisation a été associé à une sécrétion accrue de granules, de génération de thromboxane A2 (TXA2) et une phosphorylation de la PKCδ sur la Tyr311, qui ont toutes été prévenues par l’inhibition spécifique du GPIbα à l’aide d’un anticorps monoclonal bloquant. En outre, l'inhibition de la p38 MAPK, ERK1/2 et le TXA2 a inversé ce processus de potentialisation. Les plaquettes murines déficientes en PKCδ étaient aussi plus réactives à la thrombine et ont montré une augmentation significative de l'agrégation, alors qu’une étude menée in vivo chez la souris PKCδ- /- a montré, suite à une stimulation par α-thrombine, une réaction thrombotique accrue caractérisée par une diminution significative du temps de saignement ainsi qu’une formation de thrombo-embolies pulmonaires. En bloquant le GPIbα, ces effets ont été renversés. Cette étude ouvre de nouvelles perspectives quant au rôle de la PKCδ dans les plaquettes en aval de GPIbα, où elle régule négativement la fonction plaquettaire en réponse à la thrombine. Ainsi, l'axe thrombine/GPIbα/PKCδ dans les plaquettes pourrait représenter un régulateur critique de la fonction plaquettaire et l'hémostase, et le dysfonctionnement de cette voie pourrait conduire à des événements thrombotiques.

Identification des résidus essentiels à l’interaction du récepteur CXCR7 avec ses ligands SDF-1 et ITAC

Les chimiokines sont des petites protéines secrétées dont la fonction principale est la stimulation de la migration de cellules immunitaires vers différents organes et tissus. Elles sont souvent impliquées lors des maladies inflammatoires, auto-immunes et des cancers. Ainsi, les chimiokines et leurs récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) sont la cible pharmacologique de plusieurs molécules, actuellement testées en essais cliniques. Nous avons pris comme modèle, lors de notre étude, le récepteur atypique CXCR7. Ce récepteur est dit atypique, car il ne signalise pas via la voie classique des protéines G, mais plutôt via la voie de la β-arrestine. CXCR7 est impliqué dans de nombreux cancers, favorise la progression métastatique et est un co-récepteur pour le virus de l’immunodéficience humaine (VIH). Cependant, aucune donnée sur son mode de liaison avec ses ligands CXCL11/ITAC et CXCL12/SDF-1 n’existe à date. Nous pensons que cette information est essentielle pour le développement efficace d’agonistes et d’antagonistes, et nous nous sommes intéressés à identifier les résidus essentiels à la liaison des deux ligands de CXCR7 et à son activation par ces derniers. Pour cela, nous avons créé une série de mutants par substitution ou délétion d’acides aminés de la partie N-terminale, des boucles extracellulaires et des domaines transmembranaires du récepteur. Nous avons testé leur marquage en surface cellulaire par cytométrie en flux, leur liaison des deux ligands par expériences de radio-liaison, et leur capacité à recruter la β-arrestine en réponse aux ligands par essais BRET. Les résultats obtenus ont permis d’identifier des résidus importants à l’interaction des systèmes CXCR7/SDF-1 et CXCR7-ITAC et suggèrent des modes de liaison à CXCR7 différents entre ITAC et SDF-1. Tout comme la liaison d’ITAC à son autre récepteur CXCR3, sa liaison à CXCR7 suivrait le mode conventionnel de liaison en deux étapes des récepteurs de chimiokines. Cependant, la liaison de SDF-1 à CXCR7 suivrait un autre mode de liaison, contrairement à sa liaison à son autre récepteur, CXCR4.

Étude du rôle des régions variables 4 et 5 dans les changements de conformation de la gp120 du VIH-1

Le VIH infecte les cellules par fusion de sa membrane avec la membrane de la cellule cible. Cette fusion est effectuée par les glycoprotéines de l'enveloppe (Env) qui sont synthétisées en tant que précurseur, gp160, qui est ensuite clivé en gp120 et gp41. La protéine gp41 est la partie transmembranaire du complexe de l'enveloppe et l’ancre à la particule virale alors que la gp120 assure la liaison au récepteur cellulaire CD4 et corécepteur CCR5 ou CXCR4. Ces interactions successives induisent des changements de conformation d’Env qui alimentent le processus d'entrée du virus conduisant finalement à l'insertion du peptide de fusion de la gp41 dans la membrane de la cellule cible. La sous-unité extérieure gp120 contient cinq régions variables (V1 à V5), dont trois (V1, V2 et V3) étant capables d’empêcher l’adoption spontanée de la conformation liée à CD4. Cependant, le rôle de régions variables V4 et V5 vis-à-vis de ces changements de conformation reste inconnu. Pour étudier leur effet, des mutants de l'isolat primaire de clade B YU2, comprenant une délétion de la V5 ou une mutation au niveau de tous les sites potentiels de N-glycosylation de la V4 (PNGS), ont été générés. L'effet des mutations sur la conformation des glycoprotéines d'enveloppe a été analysé par immunoprécipitation et résonance de plasmon de surface avec des anticorps dont la liaison dépend de la conformation adopté par la gp120. Ni le retrait des PNGS de la V4 ni la délétion de V5 n’a affecté les changements conformationnels d’Env tels que mesurés par ces techniques, ce qui suggère que les régions variables V1, V2 et V3 sont les principaux acteurs dans la prévention de l’adoption de la conformation lié de CD4 d’Env.

Mécanismes impliqués dans les effets du récepteur à la (pro)rénine sur le développement de l'obésité et de ses complications cardiométaboliques associées

L'obésité est une maladie associée à de nombreuses complications comme le diabète de type 2, l'hypertension et le cancer. De nos jours, les modifications au mode de vie, tels l’alimentation et le niveau d’activité physique, ne sont pas suffisants pour combattre les effets délétères de l'obésité. La pharmacothérapie est un traitement alternatif bien que les effets bénéfiques soient temporaires et ne peuvent être maintenus à long terme. Le besoin pour un traitement bénéfique à long terme sans effet secondaire n'est pas comblé. Mieux connu pour son rôle dans la régulation de la pression artérielle, le système rénine-angiotensine favorise l'entreposage du gras. Le récepteur à la prorénine et à la rénine est une composante du système rénine-angiotensine. Ainsi, le récepteur qui amplifie l'activation de celui-ci pourrait avoir un rôle clé dans le gain de masse grasse. Le but de ce projet de thèse est d'évaluer le rôle du récepteur à la prorénine et à la rénine dans le développement de l'obésité et de ses complications chez la souris et ce, en utilisant une combinaison de diète riche en gras et en hydrates de carbone et du handle region peptide, un bloqueur du récepteur à la prorénine à la rénine. Après une période de 10 semaines, nous avons constaté que l'expression et la protéine du récepteur à la prorénine et à la rénine augmentent spécifiquement dans le tissu adipeux sous-cutané et viscéral des souris obèses. Lorsqu'administré en concomitance avec une diète riche en gras et en hydrates de carbone, le handle region peptide favorise chez la souris des diminutions des gains des masses corporelles et adipeuses viscérales. Une diminution de l'expression de l'enzyme catalysant la dernière étape de la lipogenèse pourrait être responsable de la réduction de gras viscéral. Chez les mêmes animaux, l'expression de plusieurs adipokines est également diminuée dans le tissu adipeux suggérant une réduction de la résistance à l'insuline, de l'inflammation et de l'infiltration des macrophages localement dans le gras sous-cutané et viscéral. L'augmentation de l'expression d’un marqueur de l'adipogenèse dans le tissu adipeux sous-cutané pourrait suggérer un plus grand nombre d'adipocytes. Cela pourrait tamponner l'excès d'acides gras libres circulants puisque nous avons constaté une diminution de ce paramètre chez les souris ayant une diète riche en gras et en hydrates de carbone et traitées avec le peptide. Nous avons émis l'hypothèse qu'un cycle futile pourrait être activé dans le gras sous-cutané car nous avons observé une augmentation de l'expression de plusieurs enzymes impliquées dans la lipogenèse et dans la lipolyse. Le ''brunissement'' du tissu adipeux est la présence de cellules similaires aux adipocytes bruns dans le tissu adipeux qui sont caractérisés par une grande densité mitochondriale et la thermogenèse. L'augmentation de l'expression des marqueurs de ''brunissement'' et de biogenèse de mitochondrie dans le gras sous-cutané suggère que le ''brunissement'' pourrait également être activé dans ce dépôt de gras. La sensibilité à l'insuline chez ces animaux pourrait être améliorée telle que suggérée en circulation par la diminution de l'insuline, par le glucose qui change peu, par l'augmentation du ratio glucose sur insuline ainsi que par un changement potentiel dans la corrélation entre le poids corporel de la souris et les niveaux d’adiponectine circulante. Nos travaux suggèrent que le handle region peptide pourrait augmenter la capacité du tissu adipeux sous-cutané à métaboliser les lipides circulants avec l'activation potentielle d'un cycle futile et le ''brunissement''. Cela préviendrait le dépôt ectopique de lipides vers les compartiments viscéraux comme le suggère la réduction de masse adipeuse viscérale chez les souris ayant une diète riche en gras et en hydrates de carbone et traitées avec le peptide. Utilisant un modèle de souris, cette étude démontre le potentiel pharmacologique du handle region peptide comme un nouveau traitement pour prévenir l'obésité.

Modulation allostérique du récepteur FP dans le cancer colorectal

Les prostaglandines modulent d’importants rôles physiologiques. Elles sont aussi impliquées dans le développement d’une variété de conditions pathologiques telles l’inflammation, la douleur et le cancer. La prostaglandine PGF2α et son récepteur (récepteur FP) se trouvent impliqué dans la modulation de nombreuses pathologies tels lors de l’accouchement préterme et le cancer colorectal. Récemment, nous avons fait partie d’un groupe de recherche ayant développé des modulateurs allostériques du récepteur FP. Dans une première étude, l’action du PGF2α sur le déclenchement des contractions myométriales a été évaluée, car peu d’information est connue sur la signalisation de cette prostaglandine lors de l’accouchement. Ainsi, nous avons utilisé un peptidomimétique de la deuxième boucle extracellulaire, dénommée PDC113.824. Nos résultats ont démontré que le PDC113.824 permettait de retarder la mise bas chez des souris gestantes, mais agissait de manière différente sur les multiples voies de signalisation de la PGF2α. Ainsi, le PDC113.824 inhibait la voie RhoA-ROCK, dépendante de l’activation de la protéine Gα12 par le. Les protéines RhoA-ROCK sont des acteurs clés dans le remodelage du cytosquelette d’actine et des contractions myométriales lors de l’accouchement. De plus, le PDC113.824 en présence de PGF2α agit comme un modulateur positif sur la voie dépendante de l’activation de la protéine Gαq. Le PDC113.824 serait donc un modulateur allostérique non compétitif possédant des actions à la fois de modulateurs positifs et négatifs sur la signalisation du récepteur FP Dans une seconde étude, des analogues du PDC113.824 ont été conçus et analysés dans un second modèle pathologique, le cancer colorectal. Ce cancer possède de hauts niveaux de récepteur FP. Nous avons donc étudié le rôle du récepteur FP dans le développement et la progression du cancer colorectal et l’effet de modulateurs allostériques. Il est généralement accepté que dans le cancer colorectal, la prostaglandine PGE2 permet la croissance et l’invasion tumorale, ainsi que l’angiogenèse. Toutefois, peu d’informations sont connues sur le rôle du PGF2α dans le cancer colorectal. C’est dans ce contexte que nous avons décidé d’examiner la contribution de ce récepteur dans la progression du cancer colorectal et cherché à déterminer si la modulation des fonctions du récepteur FP a un impact sur la croissance de tumeurs colorectales. Nos recherches ont révélé que l’activation du récepteur FP permet la migration et la prolifération de plusieurs lignées cellulaires humaines et murines d’adénocarcinomes colorectaux. Dans ce contexte, nos expériences ont démontré que la migration des cellules cancéreuses était dépendante de l’activation de la voie Rho. Nos résultats démontrent qu’en effet, l’activation de RhoA, une petite GTPase clé de la voie Gα12, est inhibée de façon sélective par nos composés. De plus, nos molécules allostériques sont également efficaces pour inhiber la voie de signalisation de la ß-caténine, une protéine impliquée dans la genèse du cancer colorectal. In vivo, le traitement de souris avec un des ces modulateurs a permis une inhibition effective de la croissance tumorale. Dans l’ensemble, nos résultats suggèrent donc que les modulateurs allostériques des récepteurs FP pourraient constituer une nouvelle classe de médicaments utilisés pour le traitement du cancer colorectal.

L’importance de la coopération de TRAF1 et LSP1 en aval du récepteur 4-1BB(CD137) pour la survie des lymphocytes

4-1BB (CD137) est un membre de la superfamille TNFR qui est impliqué dans la transmission des signaux de survie aux lymphocytes. TRAF1 est une protéine adaptatrice qui est recrutée par 4-1BB et autres TNFRs et est caractérisée par une expression très restreinte aux lymphocytes, cellules dendritiques et certaines cellules épithéliales. TRAF1 est nécessaire pour l’expansion et la survie des cellules T mémoire en présence d'agonistes anti-4-1BB in vivo. De plus, TRAF1 est requise en aval de 4-1BB pour activer (phosphoryler) la MAP kinase Erk impliquée dans la régulation de la molécule pro-apoptotique Bim. Suite à l’activation du récepteur 4-1BB, TRAF1 et ERK sont impliqués dans la phosphorylation de Bim et la modulation de son expression. L’activation et la régulation de TRAF1 et Bim ont un rôle important dans la survie des cellules T CD8 mémoires. Dans cette étude, nous avons utilisé une approche protéomique afin de pouvoir identifier de nouveaux partenaires de liaison de TRAF1. Utilisant cette stratégie, nous avons identifié que LSP1 (Leukocyte Specific Protein 1) est recruté dans le complexe de signalisation 4-1BB de manière TRAF1 dépendante. Une caractérisation plus poussée de l’interaction entre TRAF1 et LSP1 a montré que LSP1 lie la région unique N-terminal de TRAF1 de façon indépendante de la région conservée C-terminal. À l’instar des cellules T déficientes en TRAF1, les cellules T déficientes en LSP1 ne sont pas capables d’activer ERK en aval de 4-1BB et par conséquent ne peuvent pas réguler Bim. Ainsi, TRAF1 et LSP1 coopèrent en aval de 4-1BB dans le but d’activer ERK et réguler en aval les niveaux de Bim dans les cellules T CD8. Selon la littérature, le récepteur 4-1BB n’est pas exprimé à la surface des cellules B murines, mais le récepteur 4-1BB favorise la prolifération et la survie des cellules B humaines. Cependant, il est important d'étudier l'expression du récepteur 4-1BB dans les cellules B murines afin de disposer d'un modèle murin et de prédire la réponse clinique à la manipulation de 4-1BB. En utilisant différentes stimulations de cellules B murines primaires, nous avons identifié que le récepteur 4-1BB est exprimé à la surface des cellules B de souris suite à une stimulation avec le LPS (Lipopolysaccharides). Une caractérisation plus poussée a montré que le récepteur 4-1BB est induit dans les cellules B murines d'une manière dépendante de TLR4 (Toll Like Receptor 4). Collectivement, notre travail a démontré que la stimulation avec le LPS induit l’expression du récepteur 4-1BB à la surface des cellules B murines, menant ainsi à l'induction de TRAF1. De plus, TRAF1 et LSP1 coopèrent en aval de 4-1BB pour activer la signalisation de la Map kinase ERK dans les cellules B murines de manière similaire aux cellules T. Les cellules B déficientes en TRAF1 et les cellules B déficientes en LSP1 ne sont pas en mesure d'activer la voie ERK en aval de 4-1BB et montrent un niveau d’expression du récepteur significativement diminué comparé aux cellules B d’une souris WT. Ainsi, TRAF1 et LSP1 sont nécessaires pour une expression maximale du récepteur 4-1BB à la surface cellulaire de cellules B murines et coopèrent en aval de 4-1BB afin d'activer la cascade ERK dans les cellules B murines.

Synthesis and structure-activity relationship studies of CD4 down-modulating cyclotriazadisulfonamide (CADA) analogues

HIV attachment via the CD4 receptor is an important target for developing novel approaches to HIV chemotherapy. Cyclotriazadisulfonamide (CADA) inhibits HIV at submicromolar levels by specifically down-modulating cell-surface and intracellular CD4. An effective five-step synthesis of CADA in 30% overall yield is reported. This synthesis has also been modified to produce more than 50 analogues. Many tail-group analogues have been made by removing the benzyl tail of CADA and replacing it with various alkyl, acyl, alkoxycarbonyl and aminocarbonyl substituents. A series of sidearm analogues, including two unsymmetrical compounds, have also been prepared by modifying the CADA synthesis, replacing the toluenesulfonyl sidearms with other sulfonyl groups. Testing 30 of these compounds in MT-4 cells shows a wide range of CD4 down-modulation potency, which correlates with ability to inhibit HIV-1. Three-dimensional quantitative structure-activity relationship (3D-QSAR) models were constructed using comparative molecular field analysis (CoMFA) and comparative molecular similarity indices analysis (CoMSIA) approaches. The X-ray crystal structures of four compounds, including CADA, show the same major conformation of the central 12-membered ring. The solid-state structure of CADA was energy minimized and used to generate the remaining 29 structures, which were similarly minimized and aligned to produce the 3D-QSAR models. Both models indicate that steric bulk of the tail group, and, to a lesser extent, the sidearms mainly determine CD4 down-modulation potency in this series of compounds.

DC-SIGN increases the affinity of HIV-1 envelope glycoprotein interaction with CD4

Mannose-binding C-type lectin receptors, expressed on Langerhans cells and subepithelial dendritic cells (DCs) of cervico-vaginal tissues, play an important role in HIV-1 capture and subsequent dissemination to lymph nodes. DC-SIGN has been implicated in both productive infection of DCs and the DC-mediated trans infection of CD4(+) T cells that occurs in the absence of replication. However, the molecular events that underlie this efficient transmission have not been fully defined. In this study, we have examined the effect of the extracellular domains of DC-SIGN and Langerin on the stability of the interaction of the HIV-1 envelope glycoprotein with CD4 and also on replication in permissive cells. Surface plasmon resonance analysis showed that DC-SIGN increases the binding affinity of trimeric gp140 envelope glycoproteins to CD4. In contrast, Langerin had no effect on the stability of the gp140:CD4 complex. In vitro infection experiments to compare DC-SIGN enhancement of CD4-dependent and CD4-independent strains demonstrated significantly lower enhancement of the CD4-independent strain. In addition DC-SIGN increased the relative rate of infection of the CD4-dependent strain but had no effect on the CD4-independent strain. DC-SIGN binding to the HIV envelope protein effectively increases exposure of the CD4 binding site, which in turn contributes to enhancement of infection.

Dendritic cells interact with CD4 T cells in intestinal mucosa

Absence of lymph nodes in nonmammalian species, expression of MHCII by APCs in the periphery, and the recent findings that T cells can change their polarization status after presentation in the lymph nodes imply a role for MHCII-mediated presentation outside the organized lymphoid tissue. This study shows that MHCII+ ECs and DCs from the intestinal mucosa of the pig can present antigen to T cells in vitro. In vivo, APCs colocalize with T cells in pig and mouse intestinal mucosa. In the pig, endothelium is involved in these interactions in neonates but not in adults, indicating different roles for stromal and professional APCs in the neonate compared with the adult. The ratio of expression of DQ and DR MHCII locus products was lower on ECs than on other mucosal APCs, indicating that the two types of cells present different peptide sets. Adult nonendothelial APCs expressed a higher ratio of DQ/DR than in neonates. These results suggest that mucosal DCs can present antigen locally to primed T cells and that stromal APCs are recruited to these interactions in some cases. This raises the possibility that local presentation may influence T cell responses at the effector stage after initial presentation in the lymph node.

Low CD4(+) T-Cell Levels and B-Cell Apoptosis in Vertically HIV-exposed Noninfected Children and Adolescents

Lymphocyte subsets, activation markers and apoptosis were assessed in 20 HIV-exposed noninfected (ENI) children born to HIV-infected women who were or not exposed to antiretroviral (ARV) drugs during pregnancy and early infancy. ENI children and adolescents were aged 6-18 years and they were compared to 25 age-matched healthy non-HIV-exposed children and adolescents (Control). ENI individuals presented lower CD4(+) T cells/mm(3) than Control group (control: 1120.3 vs. ENI: 876.3; t-test, p=0.030). ENI individuals had higher B-cell apoptosis than Control group (Control: 36.6%, ARV exposed: 82.3%, ARV nonexposed: 68.5%; Kruskal-Wallis, p < 0.05), but no statistical difference was noticed between those exposed and not exposed to ARV. Immune activation in CD4(+) T, CD8(+) T and in B cells was comparable in ENI and in Control children and adolescents. Subtle long-term immune alterations might persist among ENI individuals, but the clinical consequences if any are unknown, and these children require continued monitoring.

PAS-1, an Ascaris suum Protein, Modulates Allergic Airway Inflammation via CD8(+) gamma delta TCR(+) and CD4(+) CD25(+) FoxP3(+) T Cells

We have previously demonstrated that PAS-1, a 200 kDa protein from Ascaris suum, has a potent immunomodulatory effect on humoral and cell-mediated responses induced by APAS-3 (an allergenic protein from A. suum) or unrelated antigens. In this study, we investigated the mechanisms by which PAS-1 is able to induce this effect on an allergic airway inflammation induced by OVA in mice. C57BL/6 mice were adoptively transferred on day 0 with seven different PAS-1-primed cell populations: PAS-1-primed CD19(+) or B220(+) or CD3(+) or CD4(+) or CD8(+) or CD4(+) CD25) or CD4(+) CD25(+) lymphocytes. These mice were immunized twice with OVA and alum by intraperitoneal route (days 0 and 7) and challenged twice by intranasal route (days 14 and 21). Two days after the last challenge, the airway inflammation was evaluated by antibody levels, cellular migration, eosinophil peroxidase levels, cytokine and eotaxin production, and pulmonary mechanical parameters. Among the adoptively transferred primed lymphocytes, only CD4(+) CD25(+), CD8(+) or the combination of both T cells impaired the production of total IgE and OVA-specific IgE and IgG1 antibodies, eosinophilic airway inflammation, Th2-type cytokines (IL-4, IL-5 and IL-13), eotaxin release and airway hyperreactivity. Moreover, airway recruited cells from CD4(+) CD25(+) and CD8(+) T-cell recipient secreted more IL-10/TGF-beta and IFN-gamma, respectively. Moreover, we found that PAS-1 expands significantly the number of CD4(+) CD25(+) FoxP3(+) and CD8(+) gamma delta TCR(+) cells. In conclusion, these findings demonstrate that the immunomodulatory effect of PAS-1 is mediated by these T-cell subsets.