922 resultados para Oryza sativa
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本论文以无融合生殖的大黍(Panicum maximum Jacp.)作为无融合生殖基因的供体,试图通过体细胞杂交方法向水稻(Oryza sativa L.)导入无融合生殖基因。结果如下:采用PEG融合法,诱导水稻原生质体与大黍原生质体融合,经过融合体筛选、培养,成功地获得了再生水稻植株。在融合前,水稻原生质体经过2.5 mM碘乙酰胺(IOA)在室温(22~25℃)条件下处理15分钟,大黍原生质体经过60Kr软x射线照射或不做任何处理。经双亲处理选择系统获得移栽成活的25株再生植株;经水稻单亲处理选择系统获得移栽成活再生植株3株。这两类融合再生植株(经双亲处理选择系统获得的25株和经单亲处理选择系统的3株)在花器官形态、结构及生殖特性上与对照亲本水稻植株有显著的差异,出现多花药(一朵颖花具7至11枚,甚至13枚花药)、多胚珠(一个子房内2~3个胚珠)及多胚囊(一个胚珠中2个以上胚囊)等现象;雌、雄性育性显著降低或完全消失,仅有5株能够少量结实,I-KI溶液着色的花粉从0至68%不等;胚胎学检查表明不能结实的植株雌性均不育,即不能分化出正常的胚囊结构。进一步的检查正在进行中。
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本文以光敏色素A (phyA)的特异性基因片段RPA3为探针,利用RNA斑点杂交的方法对光敏核不育水稻农垦58S及对照农垦58叶片中phyA mRNA的丰度进行了分析。结果显示:在育性转换敏感期,光周期处理O天时,农垦58S (NK 58S) phyA mR-NA的丰度比农垦58 (NK 58) phyA mRNA的高。光周期处理5天(雌雄蕊原基形成期)及10天(花粉母细胞形成期)时,短日照条件下(SD),NK 58S phyA mRNA的丰度均比NK58高。进一步比较3天龄NK58S及NK58黄化苗中phyA基因表达的差异,发现NK58S phyA mRNA的丰度比NK58高,并且两品种均符合黄化苗中phyA对其mRNA丰度的负调控作用。这一结果进一步证实:甲基化水平低的NK58S phyA基因比NK58 phyA基因更活跃地表达,进而导致转录水平与翻译水平上的差异,最终参与调节NK 58S的育性转换。 另外,通过持续远红光和红光照射黄化水稻幼苗诱导叶绿素合成的实验,分析了NK58S与NK58之间光敏色素生物功能的差异。持续远红光高辐照度反应(FR-HIR)由phyA负责调节,持续红光高辐照度反应(R-HIR)由phyB负责调节。实验结果显示:持续FR使NK58S与NK58合成叶绿素的含量在12 h时达到最高,并且NK58中叶绿素合成的相对效应比NK585高。持续R使NK58S及NK58中叶绿素的含量在24小时连续处理下持续增加,而且在此时间进程中,NK58中叶绿素合成的相对效应也都比NK58S高。这些结果说明在NK58S和NK58中phyA和phyB均参与了叶绿素合成的调节,并且phyA,phyB在NK58S和NK58黄化苗转绿过程中的作用存在差异。
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本论文为国家自然科学基金重大项目“中国陆地生态系统对全球变化的反应模式研究”的部分研究内容。 本文对C02正常浓度(350ppm)和C02倍增(700ppm)条件下,小麦(Triticum, aestivum)、半野生小麦(Triticum aestivum spp.tibeticumShao)、大麦(Hordeum vulgare)、野大麦(Hordeum brevisubulalum)、水稻(Oryza sativa,)、野生稻(Or7za sativa ssp.)、谷子(Setaria italica)、狗尾草(Setaria viridis)、高粱(Sorghum vulgare)、玉米(Zea mays)、旱雀麦(Bromus tectorum)、旱麦草(Eremopyrum triticeum)等12种禾本科植物幼苗的叶片厚度、叶肉细胞密度、维管束鞘细胞中的叶绿体数、叶肉细胞中的叶绿体数、表皮细胞密度、气孔密度、气孔指数、气孔长度、气孔阻抗及平均株高、鲜重、茎秆直径、根的直径、种子的萌发率及叶绿体超微结构等进行了比较研究。 结果表明,C02倍增使不同种类、不同测试项目反应不一。总体上看,CO2浓度倍增,使10种禾本科植物(野大麦、玉米外)的吐片厚度普遍增加。除个别种类外,C4种类的平均株高、鲜重、根直径倍增组比对照组减小;气孔平均密度增加,而C3种类则呈相反趋势o C4种类比C3种类的叶片气孔开度对C02倍增反应更为敏感。在高浓度C02条件下,C4种类的叶绿体超微结构变化较明显,淀粉粒显著增加。野生种类的表皮细胞密度,叶肉细胞密度,维管束鞘细胞中的叶绿体数及茎秆直径,C02倍增组比对照组减少,栽培种类则显著增加。气孔密度与气孔指数基本呈正相关;而气孔长度与气孔密度则大体上呈负相关。 文中对高浓度C02条件下,供试植物形态结构的变化和规律,及全球大气变化对未来农业可能产生的影响进行了讨论。
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从内蒙流沙地先锋植物沙竹(Psammochloa mongokca)内分离到一株内生细菌,经鉴定定名为Klebsiella oxytoca SA-2 K.oxytoca SA-2兼性厌氧固氮,NH4+抑制其固氮酶合成。部分抑制固氮酶活性;N03 -抑制其固氮酶的合成和活性。 60℃灭活K.oxytoca SA-2整体菌免疫兔子得到抗血清。免疫印迹表明此抗血清具K.oxytoca SA-2种特异性。石蜡切片免疫金银染色结合显微观察发现K.oxytoca SA-2定殖于沙竹叶鞘薄壁细胞和叶片的薄壁细胞内。 K.oxytoca SA-2在半固体培养基中接种水稻幼苗,限菌培养21天,根内重新分离的数量达l06 cfu/g.FWroot,但K.oxytoca SA-2在富养的土壤中生长良好,表现为兼性内生菌。 限菌培养水稻(Oryza sativa)幼苗,石蜡切片免疫金银染色结合显微观察研究了的K.oxytoca SA-2的侵染特性.K.oxytoca SA-2可以通过侧根发生处和表皮细胞胞间层进入根内,在皮层薄壁细胞间隙大量定殖,在解体和看似完整的薄壁细胞内也有定殖,在根和茎中柱内K.oxytoca SA-2进入了木质部导管。在根基,K.oxytoca SA-2大量侵入了已解体的内皮层和中柱鞘细胞,植物细胞在K.oxytoca SA-2侵入后解体,可能表现为严格的局部超敏反应。 接种K.oxytoca SA-2 21天,水稻地上苗部分没有发现肉眼和显微可见的病症。与对照相比,接种K.oxytoca SA-2显著促进限氮培养水稻幼苗的生长。由于K.oxytoca SA-2在限碳限氮培养基和水稻幼苗共培养时能分泌NH4+和植物激素,它可能通过向水稻幼苗提供氮素和分泌植物激素促进植物生长。而且用固氮酶铁蛋白抗血清进行免疫金银染色发现定殖在根基皮层薄壁细胞胞间层和细胞间隙,木质部导管和茎基木质部导管的K.oxytoca SA-2可以表达固氮酶,固氮参与了K.oxytoca SA-2在水稻幼苗中的内生。 培养基内碳源(苹果酸)和培养温度对K.oxytoca SA-2和水稻幼苗相互作用的影响也进行了研究。 研究表明,K.oxytoca SA-2作为兼性内生固氮菌,能够和植物紧密联合,并在植物体内开拓一个有利的生态位固氮,而且K.oxytoca SA-2可以分泌NH4+和植物激素,在和植物相互作用中使植物受益。
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本文中以水稻为实验材料,用共聚焦扫描显微镜检术(CLSM)和酶法分离技术观察其胚囊取得好的效果,主要实验结果如下: 1.水稻子房分别用FAA和4%戊二醛固定液固定,经乙醇脱水,然后用冬青油整体透明及丁香油封片。在共聚焦扫描显微镜下,发育中的水稻胚囊显示自发荧光,可分辨出胚囊内部结构。FAA和4%戊二醛两种固定液效果不同,后者效果更佳。用上述实验程序进一步观察拟南芥菜胚囊及水稻和拟南芥菜花粉表明,CLSM可用于快速观察分析水稻和拟南芥菜胚囊发育过程以及水稻胚囊败育情况,但不适用于观察分析其花粉发育过程。 2.水稻子房用FAA、FPA或卡诺氏固定液固定,经乙醇转至蒸镏水,然后置于由纤维素酶和果胶酶组成的酶液中,在37℃保温条件下进行连续振荡酶解,在振荡过程中辅以手工显微操作,由此即可分离出水稻固定胚珠的胚囊。用相差显微镜观察分离的胚囊表明,胚囊整体性及立体感强,观察效果好。在成功分离水稻固定材料胚囊的基础上,初步尝试了水稻新鲜材料胚囊的分离。
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叶绿素突变泛指能导致叶绿素代谢失调的核基因或叶绿体基因突变。发生叶绿素突变的植物个体普遍表现为叶色的变化,目前已报道的多数叶绿素突变体为人工诱变产物。叶绿素缺失突变导致的叶结素代谢缺陷实际上反映了叶绿体发育过程的缺陷,研究叶绿素突变更重要的意义是在于阐明叶绿体发育过程。 本研究所用材料1103s是一类特殊的叶绿素突变体,为籼性光敏核不育水稻(Oryza sativa L.)8902s群体中发现的自发突变体。该突本所具有的失绿特性为特定温度条件下才表现出来的瞬时性状,在环境温度恢复后,失绿组织可复发。遗传分析表明该突变由隐性核基因控制。本文不1103s所具有的温度敏感和失绿复绿特性,在亚细胞水平和生理化水平进行了详细的探讨。 叶绿素含量的检测表明,诱导后表现失绿的叶片组织内叶绿素含量明显降低,叶绿素a/b比值升高,原脱植基叶绿素含量低于绿色组织。失绿组织中的这种原脱植基叶绿素在失绿组织中含量的减少是由两方面因素造成的,其一是叶绿素合成过程中原脱植基叶绿素合成之前的某一步过程反应受阻;其二是原脱植基叶绿素向叶绿素转化的过程是正常进行的。 对1103s叶绿体内部的超微结构观察表明:1.控制叶绿素缺失性状的是一多效基因。该基因在特定温度条件下表达时,不仅影响到叶绿体的发育,也对细胞质中的其他细胞器产生重要的影响,其结果是细胞质中的高度有序的内膜系统被大量形状不规则的泡状结构所取代。放大后发现,这类泡状结构由(1)线粒体(2)功能未知的泡状结构I,其内部含颗粒状物质泡结构被膜内还有数层不连续的膜残片(3)功能未知的泡状结构II,其内部含大颗粒状物质。2.该突变体表达失绿和复绿过程中,叶绿体内部膜结构的变化伴随叶绿素含量的变化也有退脂和恢复的过程,但与已报道的其他突体有两个明显的不同:首先,在退化细胞的叶绿体内未观察到前片层体的存在。前片层体是叶绿体发育过程中黄化体阶段常见的非常明显的特殊结构,在电镜下为有规律的晶格状结构。已有研究表明,前片层体的形成与原脱植基叶绿素的积累有密切关系。与组培白化苗中检测到的结果不同,失绿组织中原脱植基叶绿素的含量不但没有积累,反而少于绿色组织中的含量,而造成该突变体在失绿过程中质体内无前片层体形成。其次,1103s在叶绿体退化过程中类囊体膜的变化不同于其化温敏的转绿型叶绿素突变体,尤其是在失绿过程中,其类囊体膜不是以直接解体的方式减少而是以单类囊体膜紧靠为主要特征。 对野生型 8902s与1103s类囊体膜结构的冰冻蚀刻分析表明,1103s失绿叶片上的失绿组织和绿色组织中,EFs面的大颗粒结构均异常。其异常之处表现在每个颗粒明显解离成两个亚单位(上面观),而在野生型8902s中则无上述现象出现。亚单位的解离程度在失绿组织中更明显。有间接证据研究表明,EFs面上的大颗粒代表PS II。如果该推论正确,那么失绿叶片的失绿组织和绿色组织中,PS II都可能是异常的。 另外,通过对失绿组织和绿色组织全叶蛋白双向电泳图谱的比较,得到了一个特异缺失的叶蛋白组分,该蛋白的分子量为51kd。此蛋白在失绿叶片上的失绿组织和绿色组织之间存在组织差异性。通过对该蛋白在不同温度处理和不同遗传背景下的变化规律分析,发现该蛋白是一存在于许多水稻品系叶片中的高含量组分,此蛋白表达本身不受变温诱导过程的影响,而是受另一感温过程的调控。初步分析表明该蛋白为一失绿相关蛋白。 综上所述,1103s所具有的失绿和复绿特性是核基因多效表达的结果,有一感温过程调控下游蛋白表达的复杂过程。此外,该突变特性很可能与PS II的结构异常有关。
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水稻(Oryza sativa L.) 颖花开裂 (split rice spikelet,SRS) 突变体是从水稻品系 8902s 花药培养得到的双单倍体群体中筛选出的同源异型突变体。以窄叶青8号为母本,SRS突变体为父本配制杂交组合,其F2群体中正常植株和突变植株的分离比例符合3:1,说明颖花突变性状是由单隐性基因决定的。 利用扫描电镜观察 SRS突变体花器官形态发生过程。其性状表现为内外稃变软变长,不抱合,在外稃基部又着生一朵花,两浆片基部融合,质地呈稃片状,雄蕊和雌蕊形态正常,且可育。该突变体的突变性状与拟南芥APETALA1的突变表现相似,说明两者在形态建成方面具有相似之处。由于 SRS 突变体第一轮和第二轮花器官发生了变化,根据 ABC 模型,srs-l基因应属于同源异型 A 组基因。 采用BSA法在F2群体中建立DNA正常池和突变池,利用RAPD技术筛选与突变基因srs-l连锁的分子标记。从520条随机引物中筛选出了引物S465能在两池间扩增出分子量为900 bp的差异片段,并证明其在F2群体中表现共分离。将此DNA片段克隆后作为RFLP探针pS465A,该探针与srs-l基因紧密连锁,在DH群体的RFLP分子连锁图谱上成功地将它们定位于第三染色体上。 本研究是利用水稻同源异型突变体为材料,研究水稻花器官发育基因的首例报道。
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豆科植物凝集素基因和血红蛋白基因在对根瘤菌的识别作用和类菌体在低氧分压下的共生固氮中起重要作用。本文的目的是试图将这两个基因转移到非豆料植物烟草和水稻,使其能识别根瘤菌,探讨非豆科植物的共生和联合固氮的可能性。 构建了含有豌豆凝集素(P-Lec)基因、Parasponia andersonii血红蛋白基因、gus基因及植物选择标记潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)的两个植物表达载体pCBHL和pCBHUL;同时,还构建了含有P-Lec基因、gus基因及植物选择标记PPT乙酰转移酶基因(bar)的植物表达载体pBBUL。在pCBHL中,CaMV35S启动子调控P-Lec基因的表达,而在pCBHUL和pBBUL中,该基因由玉米Ubiquitin 1启动子调控。 用农杆菌法将pCBHL导入烟草,得到53株再生植株,PCR检测表明转化频率为88%。用基因枪法分别将pCBHUL和pBBUL导入水稻幼胚或幼胚诱导的愈伤组织。转pCBHUL的材料共得到40株再生植株,经分子检测有18株分转基因植株,转化频率为0.9%。转pBBUL的幼胚愈伤组织经PPT筛选,只得到能分化出小芽的抗性愈伤组织。 PCR检测、Southern杂交表明P-Lec基因和Paraspoina血红蛋白基因都已经整合到转基因烟草及水稻的基因组中,转基因水稻植株中两个外源目的基因的拷贝数较高。Western杂交分析转基因植物中P-Lec基因的表达情况,结果表明该基因在转基因的烟草和水稻叶片中得到正确地表达。同时,GUS组织化学染色表明转基因烟草的嫩茎和幼根,转基因水稻的嫩叶和幼根中都有gus基因的表达。转基因烟草中外源基因的表达频率高于转基因水稻。T1代转基因烟草幼根的蛋白原位免疫杂交显示P-Lec正确定位于正在生长的幼根根毛的顶端,与对照豌豆中的P-Lec基因表达部位相一致。关于Parasponia血红蛋白基因,以前本实验室对转基因烟草和水稻的研究表明有转录水平的表达,国外实验室证实转基因烟草中有转译表达。 上述结果有可能为进一步研究转基因非豆科植物与根瘤菌的相互作用奠定一定的基础。
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过氧化氢(Hydrogen peroxide,H2O2)是植物和病原微生物互作中快速合成的一种早期活性氧类(reactive oxygen species, ROS ),它在植物受到病原微生物侵染后引发的一系列防御反应中起着非常重要的作用,因此通过外源基因导入提高植物体内过氧化氢的含量,可以增强植物的广谱抗病性。葡萄糖氧化酶(glucose oxidase, GO)可以催化β-D-葡萄糖氧化生成过氧化氢和葡萄糖酸,此酶已在数种细菌和真菌中检测到,但在植物和动物中仍未发现。为了尝试将此酶应用于水稻广谱抗病基因工程,本研究将葡萄糖氧化酶基因插入具有潮霉素抗性选择标记的双元载体pCAMBIA1301,新构建为水稻高效表达载体pCAG1301。将此质粒导入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens )菌株LBA4404后,转化粳稻(Oryza sativa )品种日本晴(Nipponbare)成熟胚来源的愈伤组织和幼胚,并由筛选出的潮霉素抗性愈伤组织分化再生植株。对所得到的潮霉素抗性植株的Southern杂交分析表明GO基因已整合到受体基因组,为单拷贝或双拷贝插入。利用过氧化氢与淀粉-碘化钾反应显蓝色的特性检测到了转基因植株产生的过氧化氢,证实GO基因表达产生的葡萄糖氧化酶已经在水稻中发挥功能,这是将GO基因转入单子叶植物的首例报道。 基于过氧化氢诱导的植物防御反应没有种属专一性的优点,可以预期所得转基因水稻植株很可能对水稻的多种病原菌具有良好的抗性。已完成的抗病性鉴定表明,所得转基因水稻植株对稻瘟病具有良好的抗性。
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FPF1(flowering promoting factor1)蛋白最早在白芥中研究发现是开花促进因子, 可能参与了赤霉素的信号传导途径。它可以和AP1和LFY蛋白协同作用,促进茎顶端分生组织向花分生组织转化。本论文将AtFPF1基因转化水稻,转基因水稻抽穗时间只有微弱的提前。然而异源表达AtFPF1却抑制了转基因水稻根的生长,促进了成苗根系的发达。这些表型类似于我们克隆的水稻OsRAA1 (Oryza sativa Root Architecture Associated 1)的功能。这是首次报道AtFPF1/OsRAA1在水稻中具有控制根系发育的功能 生物信息学分析表明水稻OsRAA1基因定位于水稻1号染色体,它编码的蛋白推测分子量为12kD和AtFPF1有58%的同源。通过RNA原位杂交和OsRAA1基因启动子调控GUS基因表达的模式,证实OsRAA1基因主要在根尖的顶端分生区和伸长区,根尖分支区和幼侧根的中柱,侧根的原基表达。同时在幼穗分支顶端,根茎结合区的边周维管束,稃片,花药与花丝的结合区也有表达。OsRAA1在玉米泛素启动子驱动下组成型表达,可以抑制水稻初生根的生长,促进不定根的形成,部分植物形成不同程度螺旋状的初生根。这些表型和野生型水稻用生长素处理的表型类似。OsRAA1组成型表达,在成苗阶段,特别是孕穗前,大大促进叶片伸长,并导致部分小花败育。光学镜检表明OsRAA1组成型表达的水稻的花丝伸长过快,部分小花花药萎缩败育。剑叶表面细胞电镜扫描表明,OsRAA1组成型表达的水稻剑叶的硅化细胞比对照植株要长。野生型水稻根系生长素处理的Northern杂交和OsRAA1基因启动子调控GUS基因表达的水稻生长素处理后GUS活性染色表明,OsRAA1基因的转录受生长素诱导。而且OsRAA1组成型表达的水稻根的向地性反应减缓。这些结果表明,OsRAA1可能参与了生长素的信号转导途径。 与此同时,从基因序列数据库中,在很多植物中寻找到很多表达片段和FPF1/OsRAA1基因同源。从已有报道和我们的结果表明,在植物中可能普遍存在一个受赤霉素和生长素调控FPF1/OsRAA1基因家族,调控着植物各个器官的发育。
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木质素是一类酚类次生代谢产物,在植物体内行使重要的生理功能,但它却是形成造纸污染的主要来源。利用基因工程手段,在分子水平调节木质素的生物合成,降低木质素的含量或改变组分以培育适合造纸的植物原料树种具有较大的应用价值和环保效益。本研究利用反义RNA技术,主要围绕木质素合成三种相关酶咖啡酸-O-甲基转移酶(COMT)、咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶(CCoAOMT)、4-香豆酸:辅酶A连接酶(4CL)的基因对植物木质素生物合成途径调节的研究,取得如下进展: 1.农杆菌介导法将COMT和CCoAOMT基因的单价和双价的反义表达载体导入烟草,比较了两个甲基化酶的功能。PCR-Southern和Northern点杂交结果表明反义基因已整合到烟草基因组DNA上,并在转录水平表达。两种反义基因对木质素生物合成调节的效果显示,CCoAOMT能更有效地调节木质素生物总量的合成,COMT仅特异调节S木质素的合成。表达反义CCoAOMT基因的转基因毛白杨,内源CCoAOMT基因的表达在转录和蛋白水平均受到抑制,最终引起转基因植株木质素含量普遍降低,最多降低达26.20%,筛选出木质素含量下降10%以上的转基因毛白杨株系8个,为源头治理造纸废水污染奠定了基础。 2. 对克隆的4CL基因进行了表达特性分析, RT-PCR分析表明,分离的毛白杨4CL基因主要在木质部丰富表达,叶中表达量较少,树皮中不表达。在毛白杨的一个生长季,该基因表达显示明显的双锋特征,该表达模式与木材早材和晚材的发育时期相吻合,表明分离的毛白杨4CL基因与木质素的生物合成密切相关。农杆菌介导法将反义4CL基因导入烟草和毛白杨,利用分子生物学检测手段对转化植株进行筛选,获得批量转基因植株。Klason木质素含量测定分析表明,抑制内源4CL基因表达,能有效降低转基因植物中的木质素含量,且不影响植株正常生长和发育以及碳水化合物的合成。转基因毛白杨的茎杆上一些区域呈红棕色,颜色的深度与转基因毛白杨木质素含量的下降幅度呈一定的正相关性,颜色变化可作为转基因植株筛选的一个辅助指标。现已获得木质素含量下降10%以上的转基因株系3个,最多下降达41.73%,可供中试与制浆实验,为培育低木质素环保型毛白杨提供理论与实践依据。 3.为了优化现有的表达框架,使目的基因更有效地调节木质素的生物合成,应用PCR技术从毛白杨基因组中分离得到C4H(肉桂酸4—羟基化酶)基因启动子片段(GenBank注册号:AY351673)。GUS荧光活性分析和组织化学染色显示,该启动子在一些木质化的组织和器官中特异表达,随着组织成熟度和木质化程度的增加,表达活性逐渐增强,并且该启动子受伤诱导。反义CCoAOMT基因在C4H启动子的调控下,会引起转基因烟草木质素均有不同程度的减少,但不影响碳向碳水化合物的转换合成,对植物的生长发育也无明显负效应。这些结果证明了从毛白杨中分离的C4H 启动子可以应用于造纸原料树种材性改良的遗传工程操作。 4.首次从水稻中华10号(Oryza sativa L. ssp. japonica)分离了CCoAOMT基因家族的三个成员,对其基因结构及表达特性的分析表明,该基因家族的三个成员与水稻的木质化进程关系密切,研究结果有助于了解单子叶植物中的甲基化途径发生机制,为高产水稻抗倒伏和茎杆饲料作物的遗传改良奠定了基础。
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小G蛋白作为信号转导中重要的分子开关, 进化相当保守,与许多不同的调控因子和效应器分子相互作用,产生细胞功能的多样性。近年来,人们不断发现植物中小G蛋白家族的新成员,也不断揭示小G蛋白的新功能,许多植物特有的信号途径和功能需要小G蛋白这个重要的分子开关来完成,使它越来越成为人们研究的热点问题。但是,有关植物中Ran GTPase及其编码基因的研究工作报道很少,对与之相互作用的调控蛋白研究进展也刚刚开始。 TaRAN1 (AF488730) 是小麦来源的Ran同源蛋白编码基因,全长1055 bp, 编码221个氨基酸,它在植物发育过程中的功能还没有任何报道。本论文在验证了它是小G蛋白Ran家族的成员后,从分子水平上还发现它在植物细胞周期调控、对生长素以及胁迫应答信号转导过程中都起着重要作用,这也说明了它可能作为信号转导过程中重要的转换因子,参与了很多细胞的基本生理过程。 利用原核表达系统及亲和色谱的方法纯化了TaRAN1融合蛋白,并用放射性标记的GTP和竞争实验证实了它具有特异的GTP结合活性。TaRAN1的转录产物在小麦幼茎和花芽等分生组织活动旺盛的器官表达较多,而在老叶中表达较少。利用洋葱表皮瞬时表达系统分析表现,TaRAN1蛋白主要定位于细胞核,但其没有典型的核定位信号。 细胞周期一直是生物学领域中的热门问题,人们虽然在动物细胞中取得了很大进展,但在植物细胞中的研究远落后于动物。裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)是研究细胞形态和细胞周期的良好系统,利用此系统发现超表达TaRAN1的酵母细胞表现出许多新的细胞学表型,例如G2细胞周期延滞、染色体对紫外线敏感、细胞超长或多隔细胞的出现等;反义表达TaRAN1的酵母细胞呈近圆型、具有高度凝集的核并且生长速度缓慢、核质混合和无核细胞的数目明显增加。流式细胞仪检测实验也证实其细胞周期的异常。这些结果推测TaRAN1蛋白可能参与细胞周期的有丝分裂过程和发育的调控机制,并且在维持染色体结构稳定和完整性方面起着重要的作用。通过免疫荧光实验观察表明,超表达转基因酵母的微管多呈异常的狭小扇形结构,反义表达TaRAN1的酵母微管不能形成丝状结构,推测TaRAN1还可能参与微管(包括纺锤体)的结构形成过程。最后,我们用超表达TaRAN1的转基因拟南芥和水稻也证实了它的功能,其生长点表现出分生组织增多的原基、根生长点的有丝分裂指数有所改变、出现异常的细胞分裂时相等有关细胞周期异常的现象,更进一步说明了TaRAN1确实参与着细胞周期的调控过程,推测其与细胞周期从G2期进入M期的过程有关。 TaRAN1基因受IAA的诱导表达,且随着浓度的增加表达量增强。超表达的TaRAN1植株(包括拟南芥和水稻)的根表现出对外源生长素异常敏感,侧根显著变少,地上部分表现出生长素过量的表现型,顶端优势减弱,分蘖增多,生长周期延长等。HPLC测定转基因植物的IAA含量,明显高于对照。所以,TaRAN1可能还参与了复杂的生长素信号转导过程。TaRAN1基因还受各种胁迫处理的诱导表达,并且超表达植株对胁迫的忍受能力有明显提高,这说明TaRAN1还参与了胁迫信号应答的相应机制。Ran蛋白这些新功能目前还未见到其它报道。
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植物络合素(phytochelatins,PCs)是含有γ-Glu-Cys重复结构的小分子多肽,其结构通式为:(γ-Glu-Cys)n-Gly(n=2-11)。植物络合素(PCs)由植物络合素合酶(PCS)催化谷胱甘肽(GSH)聚合而成,能够络合重金属离子而具有解毒功能,这是植物解毒重金属胁迫的重要机制之一。本文克隆了来源于重金属抗性植物绊根草(Cynodon dactylon cv Goldensun)的植物络合素合酶基因,通过基因工程手段使其在烟草中过量表达,得到了一些有望用于植物修复(phytoremediation)的工程植株。同时,在水稻(Oryza sativa)种子中利用RNAi技术抑制植物络合素合酶基因的表达,以降低重金属离子在人类最重要的粮食作物水稻的籽粒中的积累。 1. 通过RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)方法从抗性植物绊根草中克隆了植物络合素合酶基因CdPCS1,其1515 bp的读码框编码一个含505个氨基酸的蛋白质,蛋白质序列分析表明它具有植物络合素合酶的结构特征,同时还具有磷酸化位点和亮氨酸拉链结构。 2. CdPCS1基因可以互补对铜和镉离子敏感的酵母突变株ABDE-1(cup1Δ)中缺失的金属硫蛋白基因CUP1的功能,也可以互补对砷离子敏感的酵母突变体FD236-6A(acr-3Δ)中的离子外排载体基因ARC3的缺失。 3. 将CdPCS1转入烟草,共获得过表达CdPCS1的烟草44个株系,其中融合GFP的株系16个。对T0代的转基因植株的PCs含量以及重金属抗性和吸收能力进行了分析,其中抗性实验表明,在300μmol/L 的Cd2+离子胁迫11天之后,野生型植株的叶片出现斑点状坏死,而两个转基因烟草株系S6和K49的植株没有出现受伤害症状。在100μmol/L的CdSO4处理一周后,转基因植株中的PCs含量比对照有不同程度的提高,最多提高了2.88倍。当用300μmol/L Cd2+处理9天再用600μmol/L Cd2+处理2天后,Cd的积累量比野生型植株增加了2倍多;用50μmol/L As3+处理7天再用100μmol/L As3+处理2天后,转基因植株对As的积累量最多增加了3倍多。说明转入绊根草PC合酶基因的烟草增加了植物络合素的合成,并由此增加了对镉离子的抗性以及对镉离子和砷离子的积累。 4. 对转基因烟草中的CdPCS1进行了亚细胞定位研究。在激光共聚焦显微镜和荧光显微镜下分别用转基因烟草叶片组织和叶肉细胞原生质体观察融合GFP的CdPCS1,结果表明融合蛋白定位于细胞核中。 5. .利用RNAi技术抑制水稻种子中植物络合素合酶基因的表达,共获得39个转基因株系。其中35个株系为种子特异性ZMM1启动子驱动OsPCS1基因的RNAi,其余4个株系由组成型的Ubiquitin启动子驱动。RT-PCR的分析结果表明:一个由ZMM1启动子驱动的RNAi转基因水稻株系的种子中,OsPCS1的mRNA水平比对照中的下降了一半。
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实验室前期工作证明OsRAA1在玉米泛素启动子驱动下组成型表达,可以抑制水稻初生根的生长,促进不定根的形成,形成不同程度螺旋状的初生根,根的向地性反应减缓,这些表型和野生型水稻用生长素处理的表型类似,而且OsRAA1基因的转录受生长素诱导,这些结果表明OsRAA1可能参与了生长素的信号转导途径。但这些表型产生的机理还不是很清楚。在水稻中,茉莉酸在根发育过程中的作用多为生理实验的报道;拟南芥中的研究表明生长素信号转导和茉莉酸信号转导可能都受26S蛋白酶体的调控。由此我们推测茉莉酸在根的发育过程中可能也起着同样的促进作用。本论文在超表达OsRAA1水稻基础上旨在克隆新基因,并对新基因功能进行研究,以探讨茉莉酸在水稻根发育过程中的分子机理,并对生长素和茉莉酸信号转导的关系进行探讨。 首先运用双向电泳技术结合质谱分析技术,在超表达OsRAA1水稻背景下发现了受体激酶家族DUF26的一个成员明显下调,我们命名为OsRMC(Oryza sativa Root Meander and Curling,AAL87185),Western杂交进一步证明了这个结果。 OsRMC位于4号染色体,信息学分析表明只有一个拷贝,没有内含子,ORF阅读框为777bp,编码的蛋白分子量为27.9 kDa,等电点(pI)为5.01。对该蛋白进行同源性比较发现,其含有2个C-X8-C-X2-C基序(Cys-rich repeat, CRR)即半胱氨酸富集区,其中第四个半胱氨酸残基不保守,该基序会形成二硫键,编码两个未知功能的DUF26(Domain Unknown Function 26)结构域。OsRMC由一个信号肽和两个CRR区组成,但没有跨膜区和激酶区。RT-PCR显示OsRMC可能是组成型表达的基因;亚细胞实验表明OsRMC是膜定位的蛋白。Western blot显示OsRMC受茉莉酸诱导表达,受生长素的抑制。 RNAiOsRMC转基因水稻在暗处培养时,抑制了初生根的生长,使侧根数目减少,但促进了不定根的生长和数目的增加;第二叶鞘变短,这些表型和前人报道的外源茉莉酸处理野生型的表型一致。转基因对生长素信号转导和合成没有影响,但初生根和第二叶鞘对外源茉莉酸更加敏感,说明RNAiOsRMC转基因水稻可能增强了茉莉酸信号转导途径。分析转基因水稻的茉莉酸信号转导途径部分相关基因的表达变化,根中受茉莉酸信号转导特异诱导的病原相关基因RSOsPR10的表达明显增多,而JAmyb和OsNDPK1的表达没有变化,证实转基因增强了茉莉酸信号转导其中的一个路径;进一步分析茉莉酸合成途径12-OXO-PDA(12-氧代-顺,顺-10,15-植物二烯酸)还原酶基因OsOPR的表达发现与野生型没有明显差别,说明转基因可能没有影响体内的茉莉酸合成途径。RNAiOsRMC转基因水稻的初生根比野生型的更容易发生弯曲,实验表明培养过程中茉莉酸和背触反应(negative thigmotropism)共同作用使转基因的初生根更容易发生卷曲,而光信号会增强卷曲程度。但RNAiOsRMC转基因水稻并没有影响根的向地性,暗示RNAiOsRMC转基因可能增强了根的回旋运动或(和)背触反应,从而促进了根的弯曲和卷曲。这些结果证明OsRMC参与的茉莉酸信号转导过程在水稻根的发育、弯曲和卷曲过程中起着重要的促进作用。通过对超表达OsRAA1和RNAiOsRMC转基因水稻的分析,说明水稻中存在着生长素信号转导促进茉莉酸信号转导的途径。 综合以上实验结果认为,OsRAA1调控了受体激酶家族DUF26的一个成员OsRMC,使其表达量降低,该过程增强了茉莉酸信号转导途径;确认了受体激酶家族DUF26的基因具有重要的生物学功能,证实了OsRMC调控的茉莉酸信号转导在水稻根系发育、根弯曲和卷曲过程中具有重要的促进作用;证明水稻中存在着生长素信号转导促进茉莉酸信号转导的途径,为完善各种植物激素调控水稻根系发育的网络提供了新的实验证据。
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OsPRP1是水稻中特有的,编码一类富含脯氨酸蛋白(proline-rich protein, PRP)的基因家族,该家族有4个成员。在GenBank中,仅找到了一个结构相对接近的玉米PRP蛋白,但是对它的研究仅限于序列上的某些描述,而且在序列上,仍然与这4个OsPRP1蛋白有明显的差别。OsPRP1蛋白明显有别于前人(1999)所描述的4类PRP蛋白。它们是植物中一类新的小分子量的PRP蛋白,仅有一个保守结构域而属于DUF1210蛋白超家族的成员。 四个OsPRP1基因在基因组中紧密串联排列,而且编码区高度保守,基因结构也高度一致,证明它们来源于同一个祖先基因,是通过基因复制的方式产生的。PAML分析也证明它们在进化时间上的相互距离并不远。而在进化过程中由于执行生理功能上的某种重要性,在编码区表现出很的保守性,因而很难在RNA水平和蛋白水平上研究四个OsPRP1基因的表达差异。但是它们在表达调节区(如启动子区)显示出明显的差异。在克隆启动子的基础上,用GUS报告基因的策略,没有检测到它们在拟南芥中的表达活性,说明它们具有一定的种属特异性。而在水稻中,这四个基因的表达显示出了明显的时序和空间差异,既表现出在组织器官及其发育阶段上的特异性和变化,又在一定程度上表现出交叉,出现了功能上的分化和重叠。根据启动子区上的顺式元件,检测了这些基因对6种植物生长调节物质和3种非生物胁迫因子的应答反应,证明它们的表达调节也表现出显著的差异和分化。因此,四个基因的进化出现了功能退化、亚功能化和产生新功能等多种命运,比理论模型预期的要复杂得多,可能在执行生理功能和对环境反应上具有各自的生物学意义。 植物细胞壁是多种碳水化合物和蛋白质相互交织在一起的亲水性网络。在保护和支撑原生质、细胞通信、细胞分化、细胞对生物的和非生物胁迫的抗性等方面发挥着重要作用。目前已知的大多数植物PRP蛋白被描述成细胞壁结构性蛋白。OsPRP1基因家族编码的蛋白质都有一个N-端信号肽,暗示它们可能是一类分泌蛋白。我们用OsPRP1.1::GFP融合蛋白进行了亚细胞定位,证明了OsPRP1蛋白的确也是细胞壁相关蛋白。用原核表达体系表达了GST-融合蛋白,制备抗体,通过免疫印迹证明这些蛋白不溶于温和的提取缓冲溶液中,但可以被高盐和强碱溶液溶解,且分子量增加了三倍。证明在体内可能出现修饰、与细胞壁其它组分相交联的现象。 在这四个基因中,只有OsPRP1.2能够在水稻根中特异表达。根的原位杂交实验证明,OsPRP1在分化成熟程度低的细胞中大量表达,而在分化成熟程度高的细胞中几乎不表达。GUS染色的结果同样发现,基因在维管柱特别是中柱鞘附近的薄壁细胞的表达比别的细胞要强得多,而且在根的生长方向上表现出与发育相关的表达特征。说明OsPRP1基因可能参与了这些细胞的分化、发育过程。而基因表达的组织器官特异性的差异和对不同刺激因素的不同反应意味着它们可能参与了多种生理过程。为此构建了一个RNAi的表达载体,转化水稻,Southern杂交实验得到9个单位点插入的T2代独立株系,其中有6个株系与野生型对照相比,主根的早期伸长受到显著抑制,主根的一级侧根地数量减少,根尖分生区的细胞在轴向上的伸长受到了抑制。结合表达定位和原位杂交的结果,我们对它们在植物生长发育中的功能进行了深入探讨。