Understanding the transcriptional control of EIF4E and its dysregulation in acute myeloid leukemia: role of NF-κB

EIF4E, le facteur d’initiation de la traduction chez les eucaryotes est un oncogène puissant et qui se trouve induit dans plusieurs types de cancers, parmi lesquels les sous-types M4 et M5 de la leucémie aiguë myéloblastique (LAM). EIF4E est régulé à plusieurs niveaux cependant, la régulation transcriptionnelle de ce gène est peu connue. Mes résultats montrent que EIF4E est une cible transcriptionnelle directe du facteur nucléaire « kappa-light- chain- enhancer of activated B cells » (NF-κB).Dans les cellules hématopoïétiques primaires et les lignées cellulaires, les niveaux de EIF4E sont induits par des inducteurs de NF-κB. En effet, l’inactivation pharmaceutique ou génétique de NF-κB réprime l’activation de EIF4E. En effet, suite à l’activation de NF-κB chez l’humain, le promoteur endogène de EIF4E recrute p65 (RelA) et c-Rel aux sites évolutionnaires conservés κB in vitro et in vivo en même temps que p300 ainsi que la forme phosphorylée de Pol II. De plus, p65 est sélectivement associé au promoteur de EIF4E dans les sous-types LAM M4/M5 mais non pas dans les autres sous-types LAM ou dans les cellules hématopoïétiques primaires normales. Ceci indique que ce processus représente un facteur essentiel qui détermine l’expression différentielle de EIF4E dans la LAM. Les analyses de données d’expressions par séquençage de l’ARN provenant du « Cancer Genome Atlas » (TCGA) suggèrent que les niveaux d’ARNm de EIF4E et RELA se trouvent augmentés dans les cas LAM à pronostic intermédiaire ou faible mais non pas dans les groupes cytogénétiquement favorables. De plus, des niveaux élevés d’ARNm de EIF4E et RELA sont significativement associés avec un taux de survie relativement bas chez les patients. En effet, les sites uniques κB se trouvant dans le promoteur de EIF4E recrutent le régulateur de transcription NF-κB p65 dans 47 nouvelles cibles prévues. Finalement, 6 nouveaux facteurs de transcription potentiellement impliqués dans la régulation du gène EIF4E ont été prédits par des analyses de données ChIP-Seq provenant de l’encyclopédie des éléments d’ADN (ENCODE). Collectivement, ces résultats fournissent de nouveaux aperçus sur le control transcriptionnel de EIF4E et offrent une nouvelle base moléculaire pour sa dérégulation dans au moins un sous-groupe de spécimens de LAM. L’étude et la compréhension de ce niveau de régulation dans le contexte de spécimens de patients s’avère important pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques ciblant l’expression du gène EIF4E moyennant des inhibiteurs de NF-κB en combinaison avec la ribavirine.

Identification de nouvelles cibles transcriptionnelles d’ETV6, un facteur de transcription fréquemment altéré dans la leucémie aiguë lymphoblastique

La leucémie aiguë lymphoblastique (LAL) est le cancer pédiatrique le plus fréquent. Plusieurs réarrangements chromosomiques ont été associés à cette maladie, dont la translocation t(12;21), qui est observée dans 25% des cas de LAL de type pré-B. Cette translocation engendre l’expression de la protéine de fusion ETV6-AML1. Toutefois, celle-ci n’est pas suffisante pour initier seule une leucémie, ce qui suggère que des mutations additionnelles sont nécessaires à la transformation oncogénique. Or, on observe que l’allèle non-réarrangé d’ETV6 est perdu dans 75% des cas de t(12;21). Cette délétion entraîne l’inactivation complète du facteur de transcription ETV6 et l’abolition de sa fonction biologique. Puisqu’ETV6 semble jouer un rôle de suppresseur de tumeurs, nous croyons que son inactivation favoriserait le développement de la leucémie via la dérégulation de ses gènes cibles. Ce projet visait donc à identifier de nouvelles cibles transcriptionnelles d’ETV6, afin d’élucider son implication dans la leucémie. Une expérience de RNA-Seq a permis d’identifier plus de 200 gènes dont l’expression est corrélée avec celle d’ETV6 dans des cellules souches hématopoïétiques CD34+. Parmi ceux-ci, plusieurs gènes sont impliqués dans la réponse immunitaire et inflammatoire, la migration cellulaire, l’homéostasie ionique et la signalisation intracellulaire. Nous avons également mis en place une approche d’immunoprécipitation de la chromatine afin d’identifier les régions auxquelles le facteur de transcription ETV6 peut se lier. À l’aide de cette méthode, nous avons démontré une interaction entre ETV6 et SLCO2B1, un gène dont l’expression est également co-régulée avec ETV6. Finalement, notre étude suggère qu’ETV6 contribuerait à la leucémogenèse en dérégulant l’expression de certains gènes ayant des propriétés oncogéniques.

Homéostasie des histones en réponse au dommage à l’ADN et étude d’inhibiteurs de désacétylases d’importance clinique

La chromatine possède une plasticité complexe et essentielle pour répondre à différents mécanismes cellulaires fondamentaux tels la réplication, la transcription et la réparation de l’ADN. Les histones sont les constituants essentiels de la formation des nucléosomes qui assurent le bon fonctionnement cellulaire d’où l’intérêt de cette thèse d’y porter une attention particulière. Un dysfonctionnement de la chromatine est souvent associé à l’émergence du cancer. Le chapitre II de cette thèse focalise sur la répression transcriptionnelle des gènes d’histones par le complexe HIR (HIstone gene Repressor) en réponse au dommage à l'ADN chez Saccharomyces cerevisiae. Lors de dommage à l’ADN en début de phase S, les kinases du point de contrôle Mec1, Tel1 et Rad53 s’assurent de bloquer les origines tardives de réplication pour limiter le nombre de collisions potentiellement mutagéniques ou cytotoxiques entre les ADN polymérases et les lésions persistantes dans l'ADN. Lorsque la synthèse totale d’ADN est soudainement ralentie par le point de contrôle, l’accumulation d'un excès d'histones nouvellement synthétisées est néfaste pour les cellules car les histones libres se lient de manière non-spécifique aux acides nucléiques. L'un des mécanismes mis en place afin de minimiser la quantité d’histones libres consiste à réprimer la transcription des gènes d'histones lors d'une chute rapide de la synthèse d'ADN, mais les bases moléculaires de ce mécanisme étaient très mal connues. Notre étude sur la répression des gènes d’histones en réponse aux agents génotoxiques nous a permis d’identifier que les kinases du point de contrôle jouent un rôle dans la répression des gènes d’histones. Avant le début de mon projet, il était déjà connu que le complexe HIR est requis pour la répression des gènes d’histones en phase G1, G2/M et lors de dommage à l’ADN en phase S. Par contre, la régulation du complexe HIR en réponse au dommage à l'ADN n'était pas connue. Nous avons démontré par des essais de spectrométrie de masse (SM) que Rad53 régule le complexe HIR en phosphorylant directement une de ses sous-unités, Hpc2, à de multiples résidus in vivo et in vitro. La phosphorylation d’Hpc2 est essentielle pour le recrutement aux promoteurs de gènes d’histones du complexe RSC (Remodels the Structure of Chromatin) dont la présence sur les promoteurs des gènes d'histones corrèle avec leur répression. De plus, nous avons mis à jour un nouveau mécanisme de régulation du complexe HIR durant la progression normale à travers le cycle cellulaire ainsi qu'en réponse aux agents génotoxiques. En effet, durant le cycle cellulaire normal, la protéine Hpc2 est très instable durant la transition G1/S afin de permettre la transcription des gènes d’histones et la production d'un pool d'histones néo-synthétisées juste avant l'initiation de la réplication de l’ADN. Toutefois, Hpc2 n'est instable que pour une brève période de temps durant la phase S. Ces résultats suggèrent qu'Hpc2 est une protéine clef pour la régulation de l'activité du complexe HIR et la répression des gènes d’histones lors du cycle cellulaire normal ainsi qu'en réponse au dommage à l’ADN. Dans le but de poursuivre notre étude sur la régulation des histones, le chapitre III de ma thèse concerne l’analyse globale de l’acétylation des histones induite par les inhibiteurs d’histone désacétylases (HDACi) dans les cellules normales et cancéreuses. Les histones désacétylases (HDACs) sont les enzymes qui enlèvent l’acétylation sur les lysines des histones. Dans plusieurs types de cancers, les HDACs contribuent à l’oncogenèse par leur fusion aberrante avec des complexes protéiques oncogéniques. Les perturbations causées mènent souvent à un état silencieux anormal des suppresseurs de tumeurs. Les HDACs sont donc une cible de choix dans le traitement des cancers engendrés par ces protéines de fusion. Notre étude de l’effet sur l’acétylation des histones de deux inhibiteurs d'HDACs de relevance clinique, le vorinostat (SAHA) et l’entinostat (MS-275), a permis de démontrer une augmentation élevée de l’acétylation globale des histones H3 et H4, contrairement à H2A et H2B, et ce, autant chez les cellules normales que cancéreuses. Notre quantification en SM de l'acétylation des histones a révélé de façon inattendue que la stœchiométrie d'acétylation sur la lysine 56 de l’histone H3 (H3K56Ac) est de seulement 0,03% et, de manière surprenante, cette stœchiométrie n'augmente pas dans des cellules traitées avec différents HDACi. Plusieurs études de H3K56Ac chez l’humain présentes dans la littérature ont rapporté des résultats irréconciliables. Qui plus est, H3K56Ac était considéré comme un biomarqueur potentiel dans le diagnostic et pronostic de plusieurs types de cancers. C’est pourquoi nous avons porté notre attention sur la spécificité des anticorps utilisés et avons déterminé qu’une grande majorité d’anticorps utilisés dans la littérature reconnaissent d’autres sites d'acétylation de l’histone H3, notamment H3K9Ac dont la stœchiométrie d'acétylation in vivo est beaucoup plus élevée que celle d'H3K56Ac. De plus, le chapitre IV fait suite à notre étude sur l’acétylation des histones et consiste en un rapport spécial de recherche décrivant la fonction de H3K56Ac chez la levure et l’homme et comporte également une évaluation d’un anticorps supposément spécifique d'H3K56Ac en tant qu'outil diagnostic du cancer chez l’humain.

La génomique évolutive mitochondriale révèle des échanges génétiques et la ségrégation chez les Gloméromycètes

Les champignons mycorhiziens à arbuscules (CMA) sont des organismes microscopiques du sol qui jouent un rôle crucial dans les écosystèmes naturels et que l’on retrouve dans tous les habitats de la planète. Ils vivent en relation symbiotique avec la vaste majorité des plantes terrestres. Ils sont des biotrophes obligatoires, c'est-à-dire qu'ils ne peuvent croître qu'en présence d'une plante hôte. Cette symbiose permet entre autres à la plante d'acquérir des nutriments supplémentaires, en particulier du phosphore et du nitrate. Malgré le fait que cette symbiose apporte des services importants aux écosystèmes, la richesse des espèces, la structure des communautés, ainsi que la diversité fonctionnelle des CMA sont mal connues et l'approfondissement des connaissances dans ces domaines dépend d’outils de diagnostic moléculaire. Cependant, la présence de polymorphisme nucléaire intra-isolat combiné à un manque de données génomiques dans différents groupes phylogénétique de ces champignons complique le développement de marqueurs moléculaires et la détermination de l'affiliation évolutive à hauts niveaux de résolution (c.a.d. entre espèces génétiquement similaires et/ou isolats de la même espèce). . Pour ces raisons, il semble une bonne alternative d’utiliser un système génétique différent en ciblant le génome mitochondrial, qui a été démontré homogène au sein d'un même isolat de CMA. Cependant, étant donné le mode de vie particulier de ces organismes, une meilleure compréhension des processus évolutifs mitochondriaux est nécessaire afin de valoriser l'utilisation de tels marqueurs dans des études de diversité et en génétique des populations. En ce sens, mon projet de doctorat consistait à investiguerétudier: i) les vecteurs de divergences inter-isolats et -espèces génétiquement rapprochéesphylogénétiquement apparentées, ii) la plasticité des génomes mitochondriaux, iii) l'héritabilité mitochondriale et les mécanismes potentiels de ségrégation, ainsi que iv) la diversité mitochondriale intra-isolat in situ. À l'aide de la génomique mitochondriale comparative, en utilisant le séquençage nouvelle génération, on a démontré la présence de variation génétique substantielle inter-isolats et -espèces, engendrées par l'invasion d'éléments mobiles dans les génomes mitochondriaux des CMA, donnant lieu à une évolution moléculaire rapide des régions intergéniques. Cette variation permettait de développer des marqueurs spécifiques à des isolats de la même espèce. Ensuite, à l'aide d'une approche analytique par réseaux de gènes sur des éléments mobiles, on a été en mesure de démontrer des évènements de recombinaisons homologues entre des haplotypes mitochondriaux distincts, menant à des réarrangements génomiques. Cela a permis d'ouvrir les perspectives sur la dynamique mitochondriale et l'hétéroplasmie dans un même isolatsuggère une coexistence de différents haplotypes mitochondriaux dans les populations naturelles et que les cultures monosporales pourraient induirent une sous-estimation de la diversité allélique mitochondriale. Cette apparente contradiction avec l'homogénéité mitochondriale intra-isolat généralement observée, a amené à investiguer étudier les échanges génétiques à l'aide de croisements d'isolats génétiquement distincts. Malgré l'observation de quelques spores filles hétéroplasmiques, l'homoplasmie était le statut par défaut dans toutes les cultures monosporales, avec un biais en faveur de l'un des haplotypes parentaux. Ces résultats suggèrent que la ségrégation opère durant la formation de la spore et/ou le développement de la coloniedu mycélium. De plus, ils supportent la présence d'une machinerie protéique de ségrégation mitochondriale chez les CMAAMF, où l'ensemble des gènes impliqués dans ce mécanisme ont été retrouvé et sont orthologues aux autres champignons. Finalement, on est revenue aux sources avecon a étudié le polymorphisme mitochondrial intra-isolat à l'aide d'une approche conventionnelle de PCR en utilisant une Taq polymérase de haute fidélité, suivie de clonage et de séquençage Sanger, sur deux isolats de R. irregularis. Cela a permis l'observation d'hétéroplasmie in situ, ainsi que la co-expression de variantes de variantes de protéines'ARNm dans une souche in vitro. Les résultats suggèrent que d'autres études basées sur le séquençage nouvelle génération aurait potentiellement ignorée cette variation, offrant ainsi plusieurs nouveaux arguments permettant de considérer les CMA comme des organismes possédant une population de génomes mitochondriaux et nucléaires distincts.

Die Rolle von gamma2-Adaptin im endo-lysosomalen Proteintransport von Säuger-Zellen

Ziel der Arbeit war es, die physiologische Funktion von 2-Adaptin zu charakterisieren. 2 Adaptin wurde 1998 erstmals von Takatsu et al. und Lewin et al. als mögliches Mitglied der Clathrin-Adapter-Proteinfamilie beschrieben. Seine genaue physiologische Funktion ist aber bis heute noch unklar. Bisherige Ergebnisse deuten darauf hin, das 2-Adaptin unabhängig von den AP-Komplexen wirkt. rnIn der HBV-Morphogenese ist eine spezielle Funktion von 2-Adaptin bekannt, da es dort nach seiner Ubiquitinierung durch Nedd4 als Adapter zwischen dem HBV L- und Core-Protein fungiert und Änderungen in der 2 Konzentration die HBV-Freisetzung blockieren.rn2-Adaptin besitzt neben den für die Clathrin-Adapter Proteine typischen Clathrin-bindenden Eigenschaften auch die Fähigkeit, Ubiquitin über sein UIM zu binden. Darüberhinaus wird 2-Adaptin durch seine Interaktion mit der Ubiquitin-Ligase Nedd4 selbst ubiquitiniert. Damit besitzt 2-Adaptin typische Eigenschaften eines Ubiquitin-Adapters. 2-Adaptin ist an MVBs lokalisiert und Abweichungen in der 2 Konzentration verändern die MVB-Morphologie. Zudem führt die Überexpression von 2-Adaptin zur Blockade der Freisetzung retroviraler VLPs und die 2 Depletion blockiert den lysosomalen Abbau von EGF, einem Substrat des endo-lysosomalen Proteintransports. Dies alles deutet auf eine mögliche Funktion von 2-Adaptin in diesem Transportsystem hin, welche in dieser Arbeit näher untersucht wurde.rnEs konnte gezeigt werden, dass die Depletion von 2-Adaptin den Abbau von endogenen (z.B. EGF, ubiquitinierte Proteine) und exogenen (z.B. das retrovirale MLV.gag-Polyprotein) Substraten des endo-lysosomalen Weges inhibiert, während sie bei 2 Überexpression verstärkt abgebaut werden. Alle bisher identifizierten „Substrate“ von 2 Adaptin, also Proteine, die durch überschüssiges 2-Adaptin abgebaut werden, besitzen eine Verbindung zum endo-lysosomalen System und / oder zur Ubiquitin-Maschinerie der Zelle. Weitere Hinweise auf eine Rolle von 2 Adaptin im MVB-Weg lieferte die Identifikation von Vps28 und Chmp2A als spezifische Interaktionspartner von 2-Adaptin. Über Vps28 erhält -Adaptin direkten Zugang zum ESCRT-I- und über Chmp2A zum ESCRT-III-Komplex. rnZudem konnte neben dem UIM eine PH-Domäne in 2-Adaptin als wichtige funktionelle Domäne identifiziert werden. Sie stellt das Modul für die Interaktion mit Rab7 dar, welche erstmals gezeigt werden konnte. Auch die Interaktion mit Rab7 deutet auf eine Rolle von 2 Adaptin im endo-lysosomalen Transportsystem hin, da Rab7 an späten Endosomen lokalisiert ist und u.a. die Fusion der MVBs mit den Lysosomen vermittelt. Da die Auswirkungen der Rab7-Überexpression und Depletion auf MLV.gag denen der 2 Überexpression bzw. Depletion entsprechen, liegt die Vermutung nahe, dass 2-Adaptin an einem ähnlich späten Schritt im endo-lysosomalen Transportsystem wirkt wie Rab7. Jedoch blockiert überschüssiges 2 Adaptin die ESCRT-abhängige VLP-Ausschleusung an der Plasmamembran und fungiert daher möglicherweise als negativer Regulator der ESCRT-Kaskade. Da die Überexpression von -Adaptin aber gleichzeitig zum vermehrten lysosomalen Abbau führt, ist eine Funktion von 2-Adaptin bei der MVB-Lysosomen-Fusion wenig wahrscheinlich. Einer solchen Funktion widerspricht auch, dass die intrazelluläre Konzentration von Rab7 und Vps28 durch überschüssiges 2-Adaptin reduziert werden. rnAls dritte funktionell wichtige Domäne in 2-Adaptin konnte ein LIR-Motiv identifiziert werden, über welches -Adaptin mit dem Autophagie-Markerprotein LC3 interagieren kann. Die Interaktion mit LC3, und damit die Verbindung zur Autophagie-Machinerie, liefert eine mögliche Erklärung für den vermehrten Abbau bei 2-Überexpression und den Abbau von Proteinen auf der MVB-Oberfläche. Dabei induziert 2-Adaptin nicht die Autophagie per se, sondern scheint als Autophagie-Adapter zu wirken, der seine Substrate, z.B. MVBs, selektiv dem Abbau durch Autophagie zuführt. rnrnEine mögliche Rolle von 2-Adaptin im zum Lysosom hin gerichteten zellulären Transport konnte bestätigt werden, wobei 2-Adaptin dabei verschiedene Funktionen übernimmt: rn als Ubiquitin-Adapter im endo-lysosomalen System, rn als negativer Regulator der ESCRT-Kaskadern und / oder als Autophagie-Adapter.rn

Identification de la sumoylation de ZNF74 et de l'interaction de cette protéine à multidoigt de zinc avec UBC9 et PIAS1

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Étude du promoteur de ZNF74 et des séquences d'ADN reconnues par ce répresseur transcriptionnel

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Identification des ARNm liés par les protéines Staufen de mammifères et caractérisation des déterminants structuraux à la base de l'interaction

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Régulation épigénétique au locus humain de la [bêta]-globine lors de la différenciation de cellules ES

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Évaluation du rôle de p53 dans la régulation de la recombinaison homologue et la stabilité génomique

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Identification de la sumoylation de ZNF74 et de l'interaction de cette protéine à multidoigt de zinc avec UBC9 et PIAS1

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Étude du promoteur de ZNF74 et des séquences d'ADN reconnues par ce répresseur transcriptionnel

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Identification des ARNm liés par les protéines Staufen de mammifères et caractérisation des déterminants structuraux à la base de l'interaction

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Régulation épigénétique au locus humain de la [bêta]-globine lors de la différenciation de cellules ES

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Évaluation du rôle de p53 dans la régulation de la recombinaison homologue et la stabilité génomique

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.