La voie de régulation de la traduction de l’ARNm ASH1 : une concertation entre Khd1, Puf6 et Loc1

La localisation des ARNm par transport dirigé joue un rôle dans le développement, la motilité cellulaire, la plasticité synaptique et la division cellulaire asymétrique. Chez la levure Saccharomyces cerevisiæ, la localisation d’ARNm est un phénomène dont les mécanismes de régulation sont conservés auprès de nombreux autres organismes. Lors de la division de la levure, plus d’une trentaine de transcrits sont localisés par transport actif à l’extrémité du bourgeon de la cellule-fille. Parmi ceux-ci, l’ARNm ASH1 est le mieux caractérisé et constitue le modèle utilisé dans cette étude. Pour exercer sa fonction, la protéine Ash1 doit être produite uniquement après la localisation de l’ARNm ASH1. Pour ce faire, les mécanismes de régulation de la traduction de l’ARNm ASH1 empêchent son expression durant le transport. Ce projet de recherche vise à étudier les mécanismes de régulation de la traduction de l’ARNm ASH1 par les répresseurs traductionnels connus, soit Khd1, Puf6 et Loc1. Les études antérieures se sont penchées sur ces facteurs de manière individuelle. Cependant, dans cette étude, nous avons exploré la présence d’une collaboration entre ceux-ci. Ainsi, nous avons voulu déterminer si les répresseurs traductionnels peuvent être intégrés en une seule voie de régulation de la traduction de l’ARNm ASH1. De plus, nous avons cherché à identifier le mécanisme de recrutement des répresseurs traductionnels sur l’ARNm ASH1, qui correspond au point initial des voies de régulations de l’ARNm ASH1. Nos résultats montrent que les répresseurs traductionnels de l’ARNm ASH1, soit Khd1 et Puf6, font partie d’une même voie de régulation de la traduction. Le rôle du facteur nucléaire Loc1 dans la voie de régulation de la traduction, quant à elle, a été examinée à partir d’expériences permettant l’étude du mécanisme de recrutement des répresseurs traductionnels dans le noyau. Ainsi, nos travaux montrent que Puf6 et Loc1 sont associés de manière ARN-dépendant avec la machinerie de transcription, notamment au facteur d’élongation de la transcription Spt4-Spt5/DSIF. Par ailleurs, notre laboratoire a précédemment montré que la localisation nucléaire de la protéine de liaison à l’ARN She2 est essentielle au recrutement des facteurs Loc1 et Puf6 sur l’ARNm ASH1. Des expériences d’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) supportent l’hypothèse que le recrutement de Loc1 est essentiel à celui de Puf6, qui s’effectue ultérieurement. Ainsi, à partir des résultats de cette étude et des résultats publiés précédemment dans notre laboratoire, nous avons élaboré un modèle de recrutement coordonné des facteurs She2, Loc1 et Puf6 sur l’ARNm ASH1 naissant. De manière générale, cette étude a permis d’établir la présence d’une seule voie de régulation de la traduction de l’ARNm ASH1 et une meilleure connaissance du recrutement des facteurs de répression traductionnelle sur celui-ci.

Interpretation of the centromere epigenetic mark to maintain genome stability

Le centromère est la région chromosomique où le kinétochore s'assemble en mitose. Contrairement à certaines caractéristiques géniques, la séquence centromérique n'est ni conservée entre les espèces ni suffisante à la fonction centromérique. Il est donc bien accepté dans la littérature que le centromère est régulé épigénétiquement par une variante de l'histone H3, CENP-A. KNL-2, aussi connu sous le nom de M18BP1, ainsi que ces partenaires Mis18α et Mis18β sont des protéines essentielles pour l'incorporation de CENP-A nouvellement synthétisé aux centromères. Des évidences expérimentales démontrent que KNL-2, ayant un domaine de liaison à l'ADN nommé Myb, est la protéine la plus en amont pour l'incorporation de CENP-A aux centromères en phase G1. Par contre, sa fonction dans le processus d'incorporation de CENP-A aux centromères n'est pas bien comprise et ces partenaires de liaison ne sont pas tous connus. De nouveaux partenaires de liaison de KNL-2 ont été identifiés par des expériences d'immunoprécipitation suivies d'une analyse en spectrométrie de masse. Un rôle dans l'incorporation de CENP-A nouvellement synthétisé aux centromères a été attribué à MgcRacGAP, une des 60 protéines identifiées par l'essai. MgcRacGAP ainsi que les protéines ECT-2 (GEF) et la petite GTPase Cdc42 ont été démontrées comme étant requises pour la stabilité de CENP-A incorporé aux centromères. Ces différentes observations ont mené à l'identification d'une troisième étape au niveau moléculaire pour l'incorporation de CENP-A nouvellement synthétisé en phase G1, celle de la stabilité de CENP-A nouvellement incorporé aux centromères. Cette étape est importante pour le maintien de l'identité centromérique à chaque division cellulaire. Pour caractériser la fonction de KNL-2 lors de l'incorporation de CENP-A nouvellement synthétisé aux centromères, une technique de microscopie à haute résolution couplée à une quantification d'image a été utilisée. Les résultats générés démontrent que le recrutement de KNL-2 au centromère est rapide, environ 5 minutes après la sortie de la mitose. De plus, la structure du domaine Myb de KNL-2 provenant du nématode C. elegans a été résolue par RMN et celle-ci démontre un motif hélice-tour-hélice, une structure connue pour les domaines de liaison à l'ADN de la famille Myb. De plus, les domaines humain (HsMyb) et C. elegans (CeMyb) Myb lient l'ADN in vitro, mais aucune séquence n'est reconnue spécifiquement par ces domaines. Cependant, il a été possible de démontrer que ces deux domaines lient préférentiellement la chromatine CENP-A-YFP comparativement à la chromatine H2B-GFP par un essai modifié de SIMPull sous le microscope TIRF. Donc, le domaine Myb de KNL-2 est suffisant pour reconnaître de façon spécifique la chromatine centromérique. Finalement, l'élément reconnu par les domaines Myb in vitro a potentiellement été identifié. En effet, il a été démontré que les domaines HsMyb et CeMyb lient l'ADN simple brin in vitro. De plus, les domaines HsMyb et CeMyb ne colocalisent pas avec CENP-A lorsqu'exprimés dans les cellules HeLa, mais plutôt avec les corps nucléaires PML, des structures nucléaires composées d'ARN. Donc, en liant potentiellement les transcrits centromériques, les domaines Myb de KNL-2 pourraient spécifier l'incorporation de CENP-A nouvellement synthétisé uniquement aux régions centromériques.

Déterminants moléculaires de la scoliose idiopathique de l'adolescent

La scoliose est la déformation de la colonne vertébrale la plus répandue. Elle atteint 3 à 4% de la population pédiatrique et dans 85% des cas, aucune cause n’a été identifiée. Ces cas sont appelés idiopathiques et les symptômes apparaissent durant la puberté; d’où le terme de ‘scoliose idiopathique de l’adolescent (SIA). Cette pathologie atteint le plus souvent les jeunes filles, en nombre et en sévérité. Ces dernières années, plusieurs hypothèses ont été proposées afin d’élucider l’étiologie de cette pathologie. Celles-ci ont mis de l’avant différents facteurs génétiques, biochimiques, mécaniques, neurologiques, musculaires ou hormonaux. Plusieurs études ont rapporté des formes familiales de scoliose, soutenant la thèse d’une prédisposition génétique. Nous avons démontré que les patients souffrant de SIA présentent un défaut de signalisation cellulaire médiée par les protéines Gi et un taux élevé d’ostéopontine (OPN) circulante. En utilisant une approche de type ‘gène candidat’, nous avons montré que la protéine tyrosine phosphatase μ (PTPμ) régule l’activité du complexe d’intégrines α5/β1 (récepteur de l’OPN) via la protéine kinase PIPKIγ. Dans ce but, nous avons utilisé des cultures primaires d’ostéoblastes issues de biopsies de patients et de cas traumatiques comme sujets contrôles. Les biopsies osseuses de patients ont été obtenues lors de l’intervention chirurgicale à partir des vertèbres T3 à L4, selon les différentes procédures. Les biopsies issues de cas traumatiques proviennent d’autres types d’os (tibia, crête iliaque, fémur). Les profils d’expression du gène PTPRM (codant pour la protéine PTPμ) ont été étudiés par PCR quantitative (qPCR). Les taux de protéines PTPμ ont été analysés par immunoprécipitation suivi d’un western blot. Pour évaluer le rôle de cette protéine, nous avons bénéficié d’un modèle murin. Machida et al. ont démontré qu’il existe un taux plus élevé de scoliose parmi les souris C57Bl/6 bipèdes obtenues suite à l’amputation des membres supérieurs, sous anesthésie, cinq semaines après la naissance. Nous avons utilisé des cultures primaires d’ostéoblastes issues de la colonne ii vertébrale de souris C57Bl/6 bipèdes, délétées du gène PTPRM (souris dites ‘KO’), afin d’évaluer le niveau de signalisation cellulaire spécifique des protéines Gi par un test fonctionnel: la technique de spectroscopie cellulaire di-électrique (SCD). Selon nos données, 85% des souris bipédales ‘KO’ pour le géne PTPRM développent une scoliose (modérée à sévère) contre 55% des souris contrôles C57Bl6 bipèdes. De plus, les niveaux de PTPμ exprimée par les ostéoblastes de 34 patients SIA se trouvent diminués par comparaison à 17 sujets contrôles. Nos études de souris bipèdes ont montré que l’inactivation du gène PTPRM augmente l’incidence et la sévérité de la scoliose, sans pour autant affecter les taux circulant d’OPN ou l’expression de ses récepteurs. Par ailleurs, dans ce même contexte, nous avons remarqué une augmentation de l’interaction entre l’OPN et l’intégrine β1 en l’absence du gène PTPRM. Les cellules issues de ces souris bipèdes KO montrent une réduction dans leurs niveaux de signalisation cellulaire médiée par les protéines Gi après stimulation par l’OPN. Cette diminution est en grande partie récupérée après traitement des cellules par un siRNA spécifique de la protéine PIPK1γ, substrat de PTPμ qui favorise la fixation de ligands aux intégrines. Ces études apportent les premières indications que la perte d’expression de PTPμ est impliquée dans le développement de la SIA, en amplifiant probablement l’effet inhibiteur de l’OPN sur la signalisation cellulaire médiée par les protéines Gi. Ces études permettent une meilleure compréhension de l’étiologie de la SIA. Elles pourraient avoir une contribution importante dans le développement futur de méthodes diagnostique et thérapeuthique dans le but d'arrete l’apparition et l’évolution de la maladie chez les enfants atteints.

The orphan nuclear receptor, liver receptor homolog-1 (LRH-1, NR5A2) regulates decidualization

La période de réceptivité endométriale chez l’humain coïncide avec la différentiation des cellules stromales de l’endomètre en cellules hautement spécifiques, les cellules déciduales, durant le processus dit de décidualisation. Or, on sait qu’une transformation anormale des cellules endométriales peut être à l’origine de pertes récurrentes de grossesses. LRH-1 est un récepteur nucléaire orphelin et un facteur de transcription régulant de nombreux évènements relatif à la reproduction et comme tout récepteur, son activation promouvoit l’activité transcriptionnelle de ses gènes cibles. Nous avons déjà montré que LRH-1 et son activité sont essentiels pour la décidualisation au niveau de l’utérus chez la souris et nous savons qu’il est présent dans l’utérus chez l’humain au moment de la phase de prolifération mais aussi de sécrétion du cycle menstruel, et que son expression augmente dans des conditions de décidualisation in vitro. Notre hypothèse est alors la suivante : LRH-1 est indispensable à la décidualisation du stroma endométrial, agissant par le biais de la régulation transcriptionnelle de gènes requis pour la transformation de cellules stromales en cellules déciduales. Afin d’explorer le mécanisme moléculaire impliqué dans la régulation transcriptionnelle effectuée par l’intermédiaire de ce récepteur, nous avons mis en place un modèle de décidualisation in vitro utilisant une lignée de cellules stromales de l’endomètre, cellules humaines et immortelles (hESC). Notre modèle de surexpression développé en transfectant les dites cellules avec un plasmide exprimant LRH-1, résulte en l’augmentation, d’un facteur 5, de l’abondance du transcriptome de gènes marqueurs de la décidualisation que sont la prolactine (PRL) et l’insulin-like growth factor binding protein-1 (IGFBP-1). En outre, la sous-régulation de ce récepteur par l’intermédiaire de petits ARN interférents (shRNA) abolit la réaction déciduale, d’un point de vue morphologique mais aussi en terme d’expression des deux gènes marqueurs cités ci-dessus. Une analyse par Chromatin ImmunoPrécipitation (ou ChIP) a démontré que LRH-1 se lie à des régions génomiques se trouvant en aval de certains gènes importants pour la décidualisation comme PRL, WNT 4, WNT 5, CDKN1A ou encore IL-24, et dans chacun de ces cas cités, cette capacité de liaison augmente dans le cadre de la décidualisation in vitro. Par ailleurs, des études structurelles ont identifié les phospholipides comme des ligands potentiels pour LRH-1. Nous avons donc choisi d’orienter notre travail de façon à explorer les effets sur les ligands liés à LRH-1 de traitements impliquant des agonistes et antagonistes à notre récepteur nucléaire. Les analyses par q-PCR et Western blot ont montré que la modulation de l’activité de LRH-1 par ses ligands influait aussi sur la réaction déciduale. Enfin, des études récentes de Salker et al (Salker, Teklenburg et al. 2010) ont mis en évidence que les cellules stromales humaines décidualisées sont de véritables biocapteurs de la qualité embryonnaire et qu’elles ont la capacité de migrer en direction de l’embryon. La série d’expériences que nous avons réalisée à l’aide de cellules hESC placées en co-culture avec des embryons de souris confirme que la migration cellulaire est bien dirigée vers les embryons. Cette propriété quant à l’orientation de la migration cellulaire est notoirement diminuée dans le cas où l’expression de LRH-1 est déplétée par shRNA dans les hESC. Nos données prouvent donc que LRH-1 régule non seulement la transcription d’un ensemble de gènes impliqués dans le processus de décidualisation mais agit aussi sur la motilité directionnelle de ces cellules hESC décidualisées in vitro.

Identification de nouvelles cibles transcriptionnelles d’ETV6, un facteur de transcription fréquemment altéré dans la leucémie aiguë lymphoblastique

La leucémie aiguë lymphoblastique (LAL) est le cancer pédiatrique le plus fréquent. Plusieurs réarrangements chromosomiques ont été associés à cette maladie, dont la translocation t(12;21), qui est observée dans 25% des cas de LAL de type pré-B. Cette translocation engendre l’expression de la protéine de fusion ETV6-AML1. Toutefois, celle-ci n’est pas suffisante pour initier seule une leucémie, ce qui suggère que des mutations additionnelles sont nécessaires à la transformation oncogénique. Or, on observe que l’allèle non-réarrangé d’ETV6 est perdu dans 75% des cas de t(12;21). Cette délétion entraîne l’inactivation complète du facteur de transcription ETV6 et l’abolition de sa fonction biologique. Puisqu’ETV6 semble jouer un rôle de suppresseur de tumeurs, nous croyons que son inactivation favoriserait le développement de la leucémie via la dérégulation de ses gènes cibles. Ce projet visait donc à identifier de nouvelles cibles transcriptionnelles d’ETV6, afin d’élucider son implication dans la leucémie. Une expérience de RNA-Seq a permis d’identifier plus de 200 gènes dont l’expression est corrélée avec celle d’ETV6 dans des cellules souches hématopoïétiques CD34+. Parmi ceux-ci, plusieurs gènes sont impliqués dans la réponse immunitaire et inflammatoire, la migration cellulaire, l’homéostasie ionique et la signalisation intracellulaire. Nous avons également mis en place une approche d’immunoprécipitation de la chromatine afin d’identifier les régions auxquelles le facteur de transcription ETV6 peut se lier. À l’aide de cette méthode, nous avons démontré une interaction entre ETV6 et SLCO2B1, un gène dont l’expression est également co-régulée avec ETV6. Finalement, notre étude suggère qu’ETV6 contribuerait à la leucémogenèse en dérégulant l’expression de certains gènes ayant des propriétés oncogéniques.

Étude du rôle des régions variables 4 et 5 dans les changements de conformation de la gp120 du VIH-1

Le VIH infecte les cellules par fusion de sa membrane avec la membrane de la cellule cible. Cette fusion est effectuée par les glycoprotéines de l'enveloppe (Env) qui sont synthétisées en tant que précurseur, gp160, qui est ensuite clivé en gp120 et gp41. La protéine gp41 est la partie transmembranaire du complexe de l'enveloppe et l’ancre à la particule virale alors que la gp120 assure la liaison au récepteur cellulaire CD4 et corécepteur CCR5 ou CXCR4. Ces interactions successives induisent des changements de conformation d’Env qui alimentent le processus d'entrée du virus conduisant finalement à l'insertion du peptide de fusion de la gp41 dans la membrane de la cellule cible. La sous-unité extérieure gp120 contient cinq régions variables (V1 à V5), dont trois (V1, V2 et V3) étant capables d’empêcher l’adoption spontanée de la conformation liée à CD4. Cependant, le rôle de régions variables V4 et V5 vis-à-vis de ces changements de conformation reste inconnu. Pour étudier leur effet, des mutants de l'isolat primaire de clade B YU2, comprenant une délétion de la V5 ou une mutation au niveau de tous les sites potentiels de N-glycosylation de la V4 (PNGS), ont été générés. L'effet des mutations sur la conformation des glycoprotéines d'enveloppe a été analysé par immunoprécipitation et résonance de plasmon de surface avec des anticorps dont la liaison dépend de la conformation adopté par la gp120. Ni le retrait des PNGS de la V4 ni la délétion de V5 n’a affecté les changements conformationnels d’Env tels que mesurés par ces techniques, ce qui suggère que les régions variables V1, V2 et V3 sont les principaux acteurs dans la prévention de l’adoption de la conformation lié de CD4 d’Env.

Quantitative proteomics methods for the analysis of histone post-translational modifications

Les histones sont des protéines nucléaires hautement conservées chez les cellules des eucaryotes. Elles permettent d’organiser et de compacter l’ADN sous la forme de nucléosomes, ceux-ci representant les sous unités de base de la chromatine. Les histones peuvent être modifiées par de nombreuses modifications post-traductionnelles (PTMs) telles que l’acétylation, la méthylation et la phosphorylation. Ces modifications jouent un rôle essentiel dans la réplication de l’ADN, la transcription et l’assemblage de la chromatine. L’abondance de ces modifications peut varier de facon significative lors du developpement des maladies incluant plusieurs types de cancer. Par exemple, la perte totale de la triméthylation sur H4K20 ainsi que l’acétylation sur H4K16 sont des marqueurs tumoraux spécifiques a certains types de cancer chez l’humain. Par conséquent, l’étude de ces modifications et des événements determinant la dynamique des leurs changements d’abondance sont des atouts importants pour mieux comprendre les fonctions cellulaires et moléculaires lors du développement de la maladie. De manière générale, les modifications des histones sont étudiées par des approches biochimiques telles que les immuno-buvardage de type Western ou les méthodes d’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP). Cependant, ces approches présentent plusieurs inconvénients telles que le manque de spécificité ou la disponibilité des anticorps, leur coût ou encore la difficulté de les produire et de les valider. Au cours des dernières décennies, la spectrométrie de masse (MS) s’est avérée être une méthode performante pour la caractérisation et la quantification des modifications d’histones. La MS offre de nombreux avantages par rapport aux techniques traditionnelles. Entre autre, elle permet d’effectuer des analyses reproductibles, spécifiques et facilite l’etude d’un large spectre de PTMs en une seule analyse. Dans cette thèse, nous présenterons le développement et l’application de nouveaux outils analytiques pour l’identification et à la quantification des PTMs modifiant les histones. Dans un premier temps, une méthode a été développée pour mesurer les changements d’acétylation spécifiques à certains sites des histones. Cette méthode combine l’analyse des histones intactes et les méthodes de séquençage peptidique afin de déterminer les changements d’acétylation suite à la réaction in vitro par l’histone acétyltransférase (HAT) de levure Rtt109 en présence de ses chaperonnes (Asf1 ou Vps75). Dans un second temps, nous avons développé une méthode d’analyse des peptides isomériques des histones. Cette méthode combine la LC-MS/MS à haute résolution et un nouvel outil informatique appelé Iso-PeptidAce qui permet de déconvoluer les spectres mixtes de peptides isomériques. Nous avons évalué Iso-PeptidAce avec un mélange de peptides synthétiques isomériques. Nous avons également validé les performances de cette approche avec des histones isolées de cellules humaines érythroleucémiques (K562) traitées avec des inhibiteurs d’histones désacétylases (HDACi) utilisés en clinique, et des histones de Saccharomyces cerevisiae liées au facteur d’assemblage de la chromatine (CAF-1) purifiées par chromatographie d’affinité. Enfin, en utilisant la méthode présentée précédemment, nous avons fait une analyse approfondie de la spécificité de plusieurs HATs et HDACs chez Schizosaccharomyces pombe. Nous avons donc déterminé les niveaux d’acétylation d’histones purifiées à partir de cellules contrôles ou de souches mutantes auxquelles il manque une HAT ou HDAC. Notre analyse nous a permis de valider plusieurs cibles connues des HATs et HDACs et d’en identifier de nouvelles. Nos données ont également permis de définir le rôle des différentes HATs et HDACs dans le maintien de l’équilibre d’acétylation des histones. Dans l’ensemble, nous anticipons que les méthodes décrites dans cette thèse permettront de résoudre certains défis rencontrés dans l’étude de la chromatine. De plus, ces données apportent de nouvelles connaissances pour l’élaboration d’études génétiques et biochimiques utilisant S. pombe.

Heterochromatin und epigenetische Kontrolle der Centromere in Dictyostelium discoideum

Heterochromatin Protein 1 (HP1) is an evolutionarily conserved protein required for formation of a higher-order chromatin structures and epigenetic gene silencing. The objective of the present work was to functionally characterise HP1-like proteins in Dictyostelium discoideum, and to investigate their function in heterochromatin formation and transcriptional gene silencing. The Dictyostelium genome encodes three HP1-like proteins (hcpA, hcpB, hcpC), from which only two, hcpA and hcpB, but not hcpC were found to be expressed during vegetative growth and under developmental conditions. Therefore, hcpC, albeit no obvious pseudogene, was excluded from this study. Both HcpA and HcpB show the characteristic conserved domain structure of HP1 proteins, consisting of an N-terminal chromo domain and a C-terminal chromo shadow domain, which are separated by a hinge. Both proteins show all biochemical activities characteristic for HP1 proteins, such as homo- and heterodimerisation in vitro and in vivo, and DNA binding activtity. HcpA furthermore seems to bind to K9-methylated histone H3 in vitro. The proteins thus appear to be structurally and functionally conserved in Dictyostelium. The proteins display largely identical subnuclear distribution in several minor foci and concentration in one major cluster at the nuclear periphery. The localisation of this cluster adjacent to the nucleus-associated centrosome and its mitotic behaviour strongly suggest that it represents centromeric heterochromatin. Furthermore, it is characterised by histone H3 lysine-9 dimethylation (H3K9me2), which is another hallmark of Dictyostelium heterochromatin. Therefore, one important aspect of the work was to characterise the so-far largely unknown structural organisation of centromeric heterochromatin. The Dictyostelium homologue of inner centromere protein INCENP (DdINCENP), co-localized with both HcpA and H3K9me2 during metaphase, providing further evidence that H3K9me2 and HcpA/B localisation represent centromeric heterochromatin. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) showed that two types of high-copy number retrotransposons (DIRS-1 and skipper), which form large irregular arrays at the chromosome ends, which are thought to contain the Dictyostelium centromeres, are characterised by H3K9me2. Neither overexpression of full-length HcpA or HcpB, nor deletion of single Hcp isoforms resulted in changes in retrotransposon transcript levels. However, overexpression of a C-terminally truncated HcpA protein, assumed to display a dominant negative effect, lead to an increase in skipper retrotransposon transcript levels. Furthermore, overexpression of this protein lead to severe growth defects in axenic suspension culture and reduced cell viability. In order to elucidate the proteins functions in centromeric heterochromatin formation, gene knock-outs for both hcpA and hcpB were generated. Both genes could be successfully targeted and disrupted by homologous recombination. Surprisingly, the degree of functional redundancy of the two isoforms was, although not unexpected, very high. Both single knock-out mutants did not show any obvious phenotypes under standard laboratory conditions and only deletion of hcpA resulted in subtle growth phenotypes when grown at low temperature. All attempts to generate a double null mutant failed. However, both endogenous genes could be disrupted in cells in which a rescue construct that ectopically expressed one of the isoforms either with N-terminal 6xHis- or GFP-tag had been introduced. The data imply that the presence of at least one Hcp isoform is essential in Dictyostelium. The lethality of the hcpA/hcpB double mutant thus greatly hampered functional analysis of the two genes. However, the experiment provided genetic evidence that the GFP-HcpA fusion protein, because of its ability to compensate the loss of the endogenous HcpA protein, was a functional protein. The proteins displayed quantitative differences in dimerisation behaviour, which are conferred by the slightly different hinge and chromo shadow domains at the C-termini. Dimerisation preferences in increasing order were HcpA-HcpA << HcpA-HcpB << HcpB-HcpB. Overexpression of GFP-HcpA or a chimeric protein containing the HcpA C-terminus (GFP-HcpBNAC), but not overexpression of GFP-HcpB or GFP-HcpANBC, lead to increased frequencies of anaphase bridges in late mitotic cells, which are thought to be caused by telomere-telomere fusions. Chromatin targeting of the two proteins is achieved by at least two distinct mechanisms. The N-terminal chromo domain and hinge of the proteins are required for targeting to centromeric heterochromatin, while the C-terminal portion encoding the CSD is required for targeting to several other chromatin regions at the nuclear periphery that are characterised by H3K9me2. Targeting to centromeric heterochromatin likely involves direct binding to DNA. The Dictyostelium genome encodes for all subunits of the origin recognition complex (ORC), which is a possible upstream component of HP1 targeting to chromatin. Overexpression of GFP-tagged OrcB, the Dictyostelium Orc2 homologue, showed a distinct nuclear localisation that partially overlapped with the HcpA distribution. Furthermore, GFP-OrcB localized to the centrosome during the entire cell cycle, indicating an involvement in centrosome function. DnmA is the sole DNA methyltransferase in Dictyostelium required for all DNA(cytosine-)methylation. To test for its in vivo activity, two different cell lines were established that ectopically expressed DnmA-myc or DnmA-GFP. It was assumed that overexpression of these proteins might cause an increase in the 5-methyl-cytosine(5-mC)-levels in the genomic DNA due to genomic hypermethylation. Although DnmA-GFP showed preferential localisation in the nucleus, no changes in the 5-mC-levels in the genomic DNA could be detected by capillary electrophoresis.

Nuclear organisation and epigenetic regulation of gene expression in Dictyostelium discoideum

A series of vectors for the over-expression of tagged proteins in Dictyostelium were designed, constructed and tested. These vectors allow the addition of an N- or C-terminal tag (GFP, RFP, 3xFLAG, 3xHA, 6xMYC and TAP) with an optimized polylinker sequence and no additional amino acid residues at the N or C terminus. Different selectable markers (Blasticidin and gentamicin) are available as well as an extra chromosomal version; these allow copy number and thus expression level to be controlled, as well as allowing for more options with regard to complementation, co- and super-transformation. Finally, the vectors share standardized cloning sites, allowing a gene of interest to be easily transfered between the different versions of the vectors as experimental requirements evolve. The organisation and dynamics of the Dictyostelium nucleus during the cell cycle was investigated. The centromeric histone H3 (CenH3) variant serves to target the kinetochore to the centromeres and thus ensures correct chromosome segregation during mitosis and meiosis. A number of Dictyostelium histone H3-domain containing proteins as GFP-tagged fusions were expressed and it was found that one of them functions as CenH3 in this species. Like CenH3 from some other species, Dictyostelium CenH3 has an extended N-terminal domain with no similarity to any other known proteins. The targeting domain, comprising α-helix 2 and loop 1 of the histone fold is required for targeting CenH3 to centromeres. Compared to the targeting domain of other known and putative CenH3 species, Dictyostelium CenH3 has a shorter loop 1 region. The localisation of a variety of histone modifications and histone modifying enzymes was examined. Using fluorescence in situ hybridisation (FISH) and CenH3 chromatin-immunoprecipitation (ChIP) it was shown that the six telocentric centromeres contain all of the DIRS-1 and most of the DDT-A and skipper transposons. During interphase the centromeres remain attached to the centrosome resulting in a single CenH3 cluster which also contains the putative histone H3K9 methyltransferase SuvA, H3K9me3 and HP1 (heterochromatin protein 1). Except for the centromere cluster and a number of small foci at the nuclear periphery opposite the centromeres, the rest of the nucleus is largely devoid of transposons and heterochromatin associated histone modifications. At least some of the small foci correspond to the distal telomeres, suggesting that the chromosomes are organised in a Rabl-like manner. It was found that in contrast to metazoans, loading of CenH3 onto Dictyostelium centromeres occurs in late G2 phase. Transformation of Dictyostelium with vectors carrying the G418 resistance cassette typically results in the vector integrating into the genome in one or a few tandem arrays of approximately a hundred copies. In contrast, plasmids containing a Blasticidin resistance cassette integrate as single or a few copies. The behaviour of transgenes in the nucleus was examined by FISH, and it was found that low copy transgenes show apparently random distribution within the nucleus, while transgenes with more than approximately 10 copies cluster at or immediately adjacent to the centromeres in interphase cells regardless of the actual integration site along the chromosome. During mitosis the transgenes show centromere-like behaviour, and ChIP experiments show that transgenes contain the heterochromatin marker H3K9me2 and the centromeric histone variant H3v1. This clustering, and centromere-like behaviour was not observed on extrachromosomal transgenes, nor on a line where the transgene had integrated into the extrachromosomal rDNA palindrome. This suggests that it is the repetitive nature of the transgenes that causes the centromere-like behaviour. A Dictyostelium homolog of DET1, a protein largely restricted to multicellular eukaryotes where it has a role in developmental regulation was identified. As in other species Dictyostelium DET1 is nuclear localised. In ChIP experiments DET1 was found to bind the promoters of a number of developmentally regulated loci. In contrast to other species where it is an essential protein, loss of DET1 is not lethal in Dictyostelium, although viability is greatly reduced. Loss of DET1 results in delayed and abnormal development with enlarged aggregation territories. Mutant slugs displayed apparent cell type patterning with a bias towards pre-stalk cell types.

Biologische Funktionsanalyse und Identifizierung neuer Substrate der Methyltransferase Dnmt2

Obwohl die DNA Methyltransferase 2 (Dnmt2) hoch konserviert ist und zu der am weitesten verbreiteten eukaryotischen MTase-Familie gehört, ist ihre biologische Funktion nach wie vor unklar. Nachdem lange Zeit keine DNA Methylierungsaktivität nachgewiesen werden konnte, wurde vor einigen Jahren über geringe Mengen an 5-Methylcytosin (5mC) in Retroelementen der “Dnmt2-only”-Organismen D. melanogaster, D. discoideum und E. histolytica berichtet (Kunert et al. 2003; Fisher et al. 2004; Kuhlmann et al. 2005; Phalke et al. 2009). Als kurze Zeit später robuste Methylierung der tRNAAsp durch humane Dnmt2 gezeigt wurde (Goll et al. 2006), wurde zunächst eine Dualspezifität des Enzyms vorgeschlagen (Jeltsch et al. 2006). Neuere Daten zum 5mC-Status verschiedener „Dnmt2-only“-Organismen bilden Anlass für kontroverse Diskussionen über Ausmaß und Bedeutung der DNA Methyltransferaseaktivität von Dnmt2 (Schaefer et al. 2010a; Krauss et al. 2011). Die vorliegende Arbeit konzentriert sich auf die Identifizierung neuer RNA Substrate des Dnmt2-Homologs DnmA aus D. discoideum sowie die biologische Bedeutung der tRNA-Methylierung durch Dnmt2. Wie in anderen Organismen beschrieben, fungiert auch DnmA als tRNAAsp(GUC) MTase in vitro und in vivo. Zusätzlich konnte in vitro tRNAGlu(UUC) als neues Substrat der Dnmt2-Homologe aus D. discoideum und dem Menschen identifiziert werden. In einem Kooperationsprojekt wurde außerdem auch tRNAAsp-Methylierungsaktivität für das Dnmt2-Homolog aus S. pombe (Pmt1) nachgewiesen. Crosslink-RNA-Immunopräzipitationen (RNA-CLIP) mit anschließender Next-Generation-Sequenzierung der mit DnmA assoziierten RNAs zeigen, dass DnmA mit tRNA Fragmenten interagiert, die sich vom Anticodonloop bis in den T-loop erstrecken. Neben der tRNAAsp(GUC) und tRNAGlu(UUC/CUC) sind Fragmente der tRNAGly(GCC) verstärkt angereichert. Inwiefern diese Fragmente eine biologische Funktion haben oder spezifische Degradationsprodukte darstellen, ist noch ungeklärt. Interessanterweise sind von einigen tRNAs wenige Sequenzen von antisense-Fragmenten in den RNA-CLIP Daten zu finden, die etwas kürzer, jedoch exakt komplementär zu den genannten sense-Fragmenten sind. Besonders stark sind diese Fragmente der tRNAGlu(UUC) vertreten. In einem weiteren RNA-CLIP Experiment wurden U-snRNAs, snoRNA und intergenische Sequenzen mit DnmA angereichert. Bei nachfolgenden in vitro Methylierungsstudien konnte ausschließlich die U2-snRNA als potentielles Nicht-tRNA-Substrat der hDnmt2 und DnmA identifiziert werden. Da tRNA Modifikationen im Anticodonloop die Codonerkennung beeinflussen können, wurde ein System etabliert um die Translationseffizienz eines GFP-Reportergens in Wildtyp- und dnmAKO-Zellen zu messen. In D. discoideum wird das Aspartat-Codon GAU ca. zehnmal häufiger genutzt als das GAC Codon, allerdings ist nur eine tRNAAsp(GUC) im Genom der Amöbe kodiert. Aus diesem Grund wurde zusätzlich die Frage adressiert, inwiefern die DnmA-abhängige Methylierung dieser tRNA das „Wobbling“ beeinflusst. Dazu wurde dem Reportergen jeweils eine (GAU)5- und (GAC)5-Leadersequenz vorgeschaltet. Entgegen der Annahme wurde der (GAC)5-Leader in beiden Stämmen etwas effizienter translatiert. Insgesamt zeigte der dnmAKO-Stamm eine leicht erhöhte Translationseffizienz der Reportergene. Vergleichende Analysen zur Aufnahme von Fremd-DNA zeigten signifikant reduzierte Transformationseffizienzen mit einem integrierenden Plasmid in dnmAKO-Zellen. Ein weiterer dnmAKO-Stamm zeigte diesen Effekt jedoch nicht, wobei bei derselben Mutante eine deutlich reduzierte Aufnahme eines extrachromosomalen Plasmids zu verzeichnen war. Untersuchungen zum Einfluss von DnmA auf die Regulation des Retroelements skipper ergaben keinen Zusammenhang zwischen der Generierung kleiner RNAs und der erhöhten Transkription des Retrotransposons in dnmAKO-Zellen (Kuhlmann et al. 2005). Durch Kompensationsversuche sowie Experimente mit einer weiteren dnmAKO-Mutante konnte die Mobilisierung des Retrotransposons nicht eindeutig als DnmA-Funktion eingeordnet werden. In einem weiteren Projekt wurden die Bindung des m5C-bindenden Proteins EhMLBP aus E. histolytica an DNA mittels Rasterkraftmikroskopie abgebildet (Lavi et al. 2006). Neben vermutlich unspezifischen Endbindungsereignissen konnte eine bevorzugte Bindungsstelle des Proteins an LINE DNA (long intersperesed nuclear element) identifiziert werden. Möglicherweise fällt diese mit einem von zwei A/T-reichen Bereichen der LINE DNA zusammen, von denen vermutet wird, dass diese für die Bindung von EhMLBP an DNA von Bedeutung sind. Insgesamt bestätigen die Ergebnisse dieser Arbeit die tRNAAsp Methylierungsaktivität als konservierte Dnmt2-Funktion. Darüber hinaus erweitern sie das Substratspektrum der Dnmt2-Methyltransferasen im Bereich der tRNA. Außerdem wird erstmals ein potentielles Nicht-tRNA Substrat vorgeschlagen. Zusätzlich geben neu entdeckte Phänotypen Hinweise auf vielfältige zelluläre Dnmt2-Funktionen.

Untersuchungen zur Rolle von Isoformen katalytischer Untereinheiten der PKA

ZUSAMMENFASSUNG: Proteinkinasen übernehmen zentrale Aufgaben in der Signaltransduktion höherer Zellen. Dabei ist die cAMP-abhängige Proteinkinase (PKA) bezüglich ihrer Struktur und Funktion eine der am besten charakterisierten Proteinkinasen. Trotzdem ist wenig über direkte Interaktionspartner der katalytischen Untereinheiten (PKA-C) bekannt. In einem Split-Ubiquitin basiertem Yeast Two Hybrid- (Y2H-)System wurden potenzielle Interaktionspartner der PKA-C identifiziert. Als Bait wurden sowohl die humane Hauptisoform Cα (hCα) als auch die Proteinkinase X (PrKX) eingesetzt. Nach der Bestätigung der Funktionalität der PKA-C-Baitproteine, dem Nachweis der Expression und der Interaktion mit dem bekannten Interaktionspartner PKI wurde ein Y2H-Screen gegen eine Mausembryo-cDNA-Expressionsbibliothek durchgeführt. Von 2*10^6 Klonen wurden 76 Kolonien isoliert, die ein mit PrKX interagierendes Preyprotein exprimierten. Über die Sequenzierung der enthaltenen Prey-Vektoren wurden 25 unterschiedliche, potenzielle Interaktionspartner identifiziert. Für hCα wurden über 2*10^6 S. cerevisiae-Kolonien untersucht, von denen 1.959 positiv waren (1.663 unter erhöhter Stringenz). Über die Sequenzierung von ca. 10% der Klone (168) konnten Sequenzen für 67 verschiedene, potenzielle Interaktionspartner der hCα identifiziert werden. 15 der Preyproteine wurden in beiden Screens identifiziert. Die PKA-C-spezifische Wechselwirkung der insgesamt 77 Preyproteine wurde im Bait Dependency Test gegen largeT, ein Protein ohne Bezug zum PKA-System, untersucht. Aus den PKA-C-spezifischen Bindern wurden die löslichen Preyproteine AMY-1, Bax72-192, Fabp3, Gng11, MiF, Nm23-M1, Nm23-M2, Sssca1 und VASP256-375 für die weitere in vitro-Validierung ausgewählt. Die Interaktion von FLAG-Strep-Strep-hCα (FSS-hCα) mit den über Strep-Tactin aus der rekombinanten Expression in E. coli gereinigten One-STrEP-HA-Proteinen (SSHA-Proteine) wurde über Koimmunpräzipitation für SSHA-Fabp3, -Nm23-M1, -Nm23-M2, -Sssca1 und -VASP256-375 bestätigt. In SPR-Untersuchungen, für die hCα kovalent an die Oberfläche eines CM5-Sensorchips gekoppelt wurde, wurden die ATP/Mg2+-Abhängigkeit der Bindungen sowie differentielle Effekte der ATP-kompetitiven Inhibitoren H89 und HA-1077 untersucht. Freie hCα, die vor der Injektion zu den SSHA-Proteinen gegeben wurde, kompetierte im Gegensatz zu FSS-PrKX die Bindung an die hCα-Oberfläche. Erste kinetische Analysen lieferten Gleichgewichtsdissoziationskonstanten im µM- (SSHA-Fabp3, -Sssca1), nM- (SSHA-Nm23-M1, –M2) bzw. pM- (SSHA-VASP256-375) Bereich. In funktionellen Analysen konnte eine Phosphorylierung von SSHA-Sssca1 und VASP256-375 durch hCα und FSS-PrKX im Autoradiogramm nachgewiesen werden. SSHA-VASP256-375 zeigte zudem eine starke Inhibition von hCα im Mobility Shift-Assay. Dieser inhibitorische Effekt sowie die hohe Affinität konnten jedoch auf eine Kombination aus der Linkersequenz des Vektors und dem N-Terminus von VASP256-375 zurückgeführt werden. Über die Wechselwirkungen der hier identifizierten Interaktionspartner Fabp3, Nm23-M1 und Nm23-M2 mit hCα können in Folgeuntersuchungen neue PKA-Funktionen insbesondere im Herzen sowie während der Zellmigration aufgedeckt werden. Sssca1 stellt dagegen ein neues, näher zu charakterisierendes PKA-Substrat dar.

El virus de l'hepatitis C i la ribonucleasa Phumana: aspectes biològics i terapèutics

El virus de l'hepatitis C (VHC) provoca una hepatitis crònica que afecta a més de 170 milions de persones d'arreu del món. És un virus petit que es classifica dins de la família Flaviviridae i és un virus d'RNA de cadena positiva amb un genoma d'aproximadament 9.600 nucleòtids. A l'extrem 5' del genoma viral s'hi troba una regió no codificant (5'NCR) que comprèn els primers 341 nucleòtids i la seva funció està relaciona amb la traducció. Immediatament després hi ha una pauta de lectura oberta ORF que acaba en un únic codó d'aturada i codifica una poliproteïna de 3.010 aminoàcids. A continuació l'extrem 3' no codificant (3'NCR), que malgrat es desconeixen les seves funcions exactes, s'ha demostrat que és essencial per a la replicació vírica. La única poliproteïna generada és processada co- i postraduccionalment mitjançant proteases de l'hoste i víriques, donant lloc a les proteïnes estructurals (Core, E1 i E2-p7) i no estructurals (NS2-NS5B). Igual que la majoria de virus RNA, el VHC es caracteritza per tenir una taxa de mutació elevada. De fet, el genoma del virus no es pot definir com una única seqüència sinó per una població de variants molt relacionades entre sí. A aquesta manera d'organitzar la informació genètica se l'anomena quasiespècie viral i una de les seves implicacions principals és la facilitat amb què sorgeixen resistents al tractament. Els tractaments disponibles són llargs, cars, provoquen efectes secundaris considerables i només es resolen completament el 40% dels casos. Per aquesta raó es busquen altres solucions terapèutiques per combatre el virus entre les quals s'hi inclouen diferents estratègies. Una de les més innovadores i prometedores és la utilització de ribozims dirigits directament contra el genoma del virus. Aquest treball es centra en l'estudi de les noves estratègies terapèutiques basades en ribozims, concretament la ribonucleasa P. La ribonucleasa P és un ribozim que està present en tots els organismes ja que és l'enzim responsable de la maduració dels precursors d'RNA de transferència. El més interessant a nivell terapèutic és que s'ha demostrat que es pot dirigir la seva activitat cap a qualsevol RNA utilitzant una seqüència guia d'RNA que quan hibrida amb l'RNA diana, l'híbrid imita l'estructura secundària del substrat natural. En el cas del VHC, s'han estudiat ribozims dependents de seqüència (ribozims derivats d'RNAs satèl·lits i de viroides de plantes), sempre dirigits contra la regió més conservada del virus per evitar una disminució de l'eficiència del ribozim deguda a la variació de la diana. La ribonucleasa P és una endonucleasa d'activitat molt específica i es diferencia dels altres ribozims naturals en el sistema de reconeixement del substrat, reconeix elements estructurals i no de seqüència. L'objectiu final del treball és tallar in vitro l'RNA del VHC aprofitant la propietat que presenta aquest ribozim de reconèixer elements estructurals i no de seqüència ja que per a un mateix nombre de seqüències, el nombre d'estructures viables que pot adoptar l'RNA genòmic és molt més petit i per tant la variabilitat de la diana disminueix. S'han estudiat dos models d'RNasa P, la RNasa P humana guiada per seqüència guia externa (EGS) i l'RNA M1 de l'RNasa P d'E.coli unit a la seqüència guia per l'extrem 3' (ribozim M1GS). Abans però de dirigir el ribozim, s'han estudiat l'estructura i la variabilitat d'una regió del genoma del virus ja que s'ha descrit que són factors que poden limitar l'eficiència de qualsevol ribozim. Derivat d'aquests estudis s'aporten dades sobre accessibilitat i variabilitat d'una regió interna del genoma del virus de l'hepatitis C, la zona d'unió de la regió E2/NS2 (regió 2658-2869). L'estudi d'accessibilitat revela que la regió 2658-2869 del genoma del virus conté dominis oberts i tancats i que la transició entre uns i altres no és brusca si es compara amb altres regions d'estructura coneguda (regió 5' no codificant). Els resultats dels assajos in vitro amb els dos models de RNasa P mostren que s'ha aconseguit dirigir tant la ribonucleasa P humana com el ribozim M1GS cap a una zona, predeterminada segons l'estudi d'accessibilitat, com a poc estructurada i tallar l'RNA del virus. De l'anàlisi de mutacions, però, es dedueix que la regió estudiada és variable. Tot i dirigir el ribozim cap a la zona més accessible, la variació de la diana podria afectar la interacció amb la seqüència guia i per tant disminuir l'eficiència de tall. Si es proposés una estratègia terapèutica consistiria en un atac simultani de vàries dianes.D'altra banda i derivat d'un resultat inesperat on s'ha observat en els experiments control que l'extracte de RNasa P humana tallava l'RNA viral en absència de seqüències guia externes, s'ha caracteritzat una nova interacció entre l'RNA del VHC i la RNasa P humana. Per a la identificació de l'enzim responsable dels talls s'han aplicat diferents tècniques que es poden dividir en mètodes directes (RNA fingerprinting) i indirectes (immunoprecipitació i inhibicions competitives). Els resultats demostren que la ribonucleasa P humana, i no un altre enzim contaminant de l'extracte purificat, és la responsable dels dos talls específics observats i que es localitzen, un a l'entrada interna al ribosoma (IRES) i molt a prop del codó AUG d'inici de la traducció i l'altre entre la regió codificant estructural i no estructural. La ribonucleasa P és un dels enzims del metabolisme del tRNA que s'utilitza per identificar estructures similars al tRNA en substrats diferents del substrat natural. Així doncs, el fet que la ribonucleasa P reconegui i talli el genoma del VHC en dues posicions determinades suggereix que, a les zones de tall, el virus conté estructures semblants al substrat natural, és a dir estructures tipus tRNA. A més, tot i que el VHC és molt variable, els resultats indiquen que aquestes estructures poden ser importants per el virus, ja que es mantenen en totes les variants naturals analitzades. Creiem que la seva presència podria permetre al genoma interaccionar amb factors cel·lulars que intervenen en la biologia del tRNA,particularment en el cas de l'estructura tipus tRNA que es localitza a l'element IRES. Independentment però de la seva funció, es converteixen en unes noves dianes terapèutiques per a la RNasa P. S'ha de replantejar però l'estratègia inicial ja que la similitud amb el tRNA les fa susceptibles a l'atac de la ribonucleasa P, directament, en absència de seqüències guia externes.

The four major N- and C-terminal splice variants of the excitatory amino acid transporter GLT-1 form cell surface homomeric and heteromeric assemblies

The L-glutamate transporter GLT-1 is an abundant CNS membrane protein of the excitatory amino acid transporter (EAAT) family which controls extracellular L-glutamate levels and is important in limiting excitotoxic neuronal death. Using RT-PCR, we have determined that four mRNAs encoding GLT-1 exist in mouse brain, with the potential to encode four GLT-1 isoforms that differ in their N- and C-termini. We expressed all four isoforms (termed MAST-KREK, MPK-KREK, MAST-DIETCI and MPK-DIETCI according to amino acid sequence) in a range of cell lines and primary astrocytes and show that each isoform can reach the cell surface. In transfected HEK-293 or COS-7 cells, all four isoforms support high-affinity sodium-dependent L-glutamate uptake with identical pharmacological and kinetic properties. Inserting a viral epitope (V5, HA or FLAG) into the second extracellular domain of each isoform allowed co-immunoprecipitation and tr-FRET studies using transfected HEK-293 cells. Here we show for the first time that each of the four isoforms are able to combine to form homomeric and heteromeric assemblies, each of which are expressed at the cell surface of primary astrocytes. After activation of protein kinase C by phorbol ester, V5-tagged GLT-1 is rapidly removed from the cell surface of HEK-293 cells and degraded. This study provides direct biochemical evidence for oligomeric assembly of GLT-1 and reports the development of novel tools to provide insight into the trafficking of GLT-1.

Domain swapping in the human histamine H-1 receptor

G-protein-coupled receptors (GPCRs) represent the largest family of receptors involved in transmembrane signaling. Although these receptors were generally believed to be monomeric entities, accumulating evidence supports the presence of GPCRs in multimeric forms. Here, using immunoprecipitation as well as time-resolved fluorescence resonance energy transfer to assess protein-protein interactions in living cells, we unambiguously demonstrate the occurrence of dimerization of the human histamine H-1 receptor. We also show the presence of domain-swapped H-1 receptor dimers in which there is the reciprocal exchange of transmembrane domain TM domains 6 and 7 between the receptors present in the dimer. Mutation of aspartate(107) in transmembrane (TM) 3 or phenylalanine(432) in TM6 to alanine results in two radioligand-binding-deficient mutant H-1 receptors. Coexpression of H-1 D(107)A and H-1 F(432)A, however, results in a reconstituted radioligand binding site that exhibits a pharmacological profile that corresponds to the wildtype H-1 receptor. Interestingly, the H-1 receptor radioligands [H-3] mepyramine and [H-3]-(-)- trans-1-phenyl-3-N, N-dimethylamino-1,2,3,4-tetrahydronaphthalene show differential saturation binding values (B-max) for wild-type H-1 receptors but not for the radioligand binding site that is formed upon coexpression of H-1 D(107)A and H-1 F(432)A receptors, suggesting the presence of different H-1 receptor populations.

Evidence that GABA rho subunits contribute to functional ionotropic GABA receptors in mouse cerebellar Purkinje cells

Ionotropic gamma-amino butyric acid (GABA) receptors composed of heterogeneous molecular subunits are major mediators of inhibitory responses in the adult CNS. Here, we describe a novel ionotropic GABA receptor in mouse cerebellar Purkinje cells (PCs) using agents reported to have increased affinity for rho subunit-containing GABA(C) over other GABA receptors. Exogenous application of the GABA(C)-preferring agonist cis-4-aminocrotonic acid (CACA) evoked whole-cell currents in PCs, whilst equimolar concentrations of GABA evoked larger currents. CACA-evoked currents had a greater sensitivity to the selective GABA(C) antagonist (1,2,5,6-tetrahydropyridin-4-yl)methylphosphinic acid (TPMPA) than GABA-evoked currents. Focal application of agonists produced a differential response profile; CACA-evoked currents displayed a much more pronounced attenuation with increasing distance from the PC soma, displayed a slower time-to-peak and exhibited less desensitization than GABA-evoked currents. However, CACA-evoked currents were also completely blocked by bicuculline, a selective agent for GABA(A) receptors. Thus, we describe a population of ionotropic GABA receptors with a mixed GABA(A)/GABA(C) pharmacology. TPMPA reduced inhibitory synaptic transmission at interneurone-Purkinje cell (IN-PC) synapses, causing clear reductions in miniature inhibitory postsynaptic current (mIPSC) amplitude and frequency. Combined application of NO-711 (a selective GABA transporter subtype 1 (GAT-1) antagonist) and SNAP-5114 (a GAT-(2)/3/4 antagonist) induced a tonic GABA conductance in PCs; however, TPMPA had no effect on this current. Immunohistochemical studies suggest that rho subunits are expressed predominantly in PC soma and proximal dendritic compartments with a lower level of expression in more distal dendrites; this selective immunoreactivity contrasted with a more uniform distribution of GABA(A) alpha 1 subunits in PCs. Finally, co-immunoprecipitation studies suggest that rho subunits can form complexes with GABA(A) receptor alpha 1 subunits in the cerebellar cortex. Overall, these data suggest that rho subunits contribute to functional ionotropic receptors that mediate a component of phasic inhibitory GABAergic transmission at IN-PC synapses in the cerebellum.