Étude moléculaire des mécanismes d’action de potentiateurs du canal CFTR sur le canal KCa3.1

Les cellules épithéliales des voies aériennes respiratoires sécrètent du Cl- via le canal CFTR. La fibrose kystique est une maladie génétique fatale causée par des mutations de ce canal. La mutation la plus fréquente en Amérique du Nord, ∆F508, met en péril la maturation de la protéine et affecte les mécanismes d’activation du canal. Au cours des dernières années, plusieurs molécules ont été identifiées par criblage à haut débit qui peuvent rétablir l’activation de protéines CFTR mutées. Ces molécules sont nommées potentiateurs. Les canaux K+ basolatéraux, dont KCa3.1, jouent un rôle bien documenté dans l’établissement d’une force électromotrice favorable à la sécrétion de Cl- par CFTR dans les cellules épithéliales des voies aériennes respiratoires. Il a par exemple été démontré que l’application de 1-EBIO, un activateur de KCa3.1, sur des monocouches T84 résulte en une augmentation soutenue de la sécrétion de Cl- et que cette augmentation était réversible suite à l’application de CTX, un inhibiteur de KCa3.1(Devor et al., 1996). Dans le cadre d’une recherche de potentiateurs efficaces en conditions physiologiques et dans un contexte global de transport trans-cellulaire, il devient essentiel de considérer les effets des potentiateurs de CFTR sur KCa3.1. Une caractérisation électrophysiologique par la méthode du patch clamp et structurelle via l’utilisation de canaux modifiés par mutagenèse dirigée de différents potentiateurs de CFTR sur KCa3.1 fut donc entreprise afin de déterminer l’action de ces molécules sur l’activité de KCa3.1 et d’en établir les mécanismes. Nous présentons ici des résultats portant sur les effets sur KCa3.1 de quelques potentiateurs de CFTR possédant différentes structures. Un criblage des effets de ces molécules sur KCa3.1 a révélé que la genisteine, le SF-03, la curcumine et le VRT-532 ont des effets inhibiteurs sur KCa3.1. Nos résultats suggèrent que le SF-03 pourrait agir sur une protéine accessoire et avoir un effet indirect sur KCa3.1. La curcumine aurait aussi une action inhibitrice indirecte, probablement via la membrane cellulaire. Nos recherches sur les effets du VRT-532 ont montré que l’accessibilité au site d’action de cette v molécule est indépendante de l’état d’ouverture de KCa3.1. L’absence d’effets inhibiteurs de VRT-532 sur le mutant constitutivement actif V282G indique que cette molécule pourrait agir via l’interaction CaM-KCa3.1 et nécessiter la présence de Ca2+ pour agir. Par ailleurs, un autre potentiateur de CFTR, le CBIQ, a des effets potentiateurs sur KCa3.1. Nos résultats en canal unitaire indiquent qu’il déstabilise un état fermé du canal. Nos travaux montrent aussi que CBIQ augmente la probabilité d’ouverture de KCa3.1 en conditions sursaturantes de Ca2+, ainsi que son affinité apparente pour le Ca2+. Des expériences où CBIQ est appliqué en présence ou en absence de Ca2+ ont indiqué que l’accessibilité à son site d’action est indépendante de l’état d’ouverture de KCa3.1, mais que la présence de Ca2+ est nécessaire à son action. Ces résultats sont compatibles avec une action de CBIQ déstabilisant un état fermé du canal. Finalement, des expériences en Ba2+ nous ont permis d’investiguer la région du filtre de sélectivité de KCa3.1 lors de l’action de CBIQ et nos résultats pointent vers une action de CBIQ dans cette région. Sur la base de nos résultats nous concluons que CBIQ, un potentiateur de CFTR, aurait un effet activateur sur KCa3.1 via la déstabilisation d’un état fermé du canal à travers une action sur sa ‘gate’ au niveau du filtre de sélectivité. De plus, les potentiateurs de CFTR ayant montré des effets inhibiteurs sur KCa3.1 pourraient agir via la membrane ou via une protéine accessoire du canal ou sur l’interaction CaM-KCa3.1. Dans l’optique de traitements potentiels de la fibrose kystique, nos résultats indiquent que le CBIQ pourrait être un potentiateur efficace pusiqu’il est capable de trimuler à la fois KCa3.1 et CFTR. Par contre, dans les cas du VRT-532 et du SF-03, une inhibition de KCa3.1 pourraient en faire des potentiateurs moins efficaces.

The roles of the somatosensory cortices in the perception of noxious and innocuous stimuli

Résumé Les premières études électrophysiologiques et anatomiques ont établi le rôle crucial du cortex somatosensoriel primaire et secondaire (SI et SII) dans le traitement de l'information somatosensorielle. Toutefois, les récentes avancées en techniques d’imagerie cérébrale ont mis en question leur rôle dans la perception somatosensorielle. La réorganisation du cortex somatosensoriel est un phénomène qui a été proposé comme cause de la douleur du membre fantôme chez les individus amputés. Comme la plupart des études se sont concentrées sur le rôle du SI, une étude plus approfondie est nécessaire. La présente série d'expériences implique une exploration du rôle des régions somatosensorielles dans la perception des stimuli douleureux et non-douleureux chez des volontaires sains et patients avec des douleurs de membre fantôme. La première étude expérimentale présentée dans le chapitre 3 est une méta-analyse des études de neuro-imagerie employant des stimuli nociceptifs chez des volontaires sains. En comparaison aux précédentes, la présente étude permet la génération de cartes quantitatives probabilistes permettant la localisation des régions activées en réponse à des stimuli nociceptifs. Le rôle du cortex somatosensoriel dans la perception consciente de stimuli chauds a été étudié dans le chapitre 4 grâce à une étude d'imagerie par résonance magnétique fonctionnelle, dans laquelle des stimuli thermiques douloureux et non-douloureux ont été administrés de manière contrebalancée. Grâce à cette procédure, la perception de la chaleur fut atténuée par les stimuli douloureux, ce qui permit la comparaison des stimuli consciemment perçus avec ceux qui ne le furent pas. Les résultats ont montrés que les stimulations chaudes perçues ont engendré l’activation de l’aire SI controlatérale, ainsi que de la région SII. Grâce à l’évaluation clinique de patients amputés présentant une altération de leurs perceptions somatosensorielles, il est également possible de dessiner un aperçu des régions corticales qui sous-tendent ces modifications perceptuelles. Dans le chapitre 5 nous avons émis l'hypothèse proposant que les sensations du membre fantôme représentent un corrélat perceptuel de la réorganisation somatotopique des représentations sensorielles corticales. En effet, la réorganisation des sensations peut donner des indices sur les régions impliquées dans la genèse des sensations référées. Ainsi, un protocole d’évaluation sensoriel a été administré à un groupe de patients affligés de douleur au niveau du membre fantôme. Les résultats ont montré que, contrairement aux études précédentes, les sensations diffèrent grandement selon le type et l'intensité des stimuli tactiles, sans évidence de la présence d’un modèle spatialement localisé. Toutefois, les résultats actuels suggèrent que les régions corticales à champs récepteurs bilatéraux présentent également des modifications en réponse à une déafférentation. Ces études présentent une nouvelle image des régions corticales impliquées dans la perception des stimuli somatosensoriels, lesquelles comprennent les aires SI et SII, ainsi que l'insula. Les résultats sont pertinents à notre compréhension des corrélats neurologiques de la perception somatosensorielle consciente.

Influence des glycines du lien S4-S5 sur le couplage électromécanique des canaux ioniques dépendants du voltage

Les canaux potassiques dépendants du voltage sont formés de quatre sous-unités, chacune possédant six segments transmembranaires (S1-S6) et une boucle (p-loop) qui se trouve entre le cinquième et le sixième segment au niveau du pore. Il est connu que le segment senseur du voltage (S1-S4) subit un mouvement lorsque le potentiel membranaire change. Pour ouvrir le canal, il est nécessaire de transférer l'énergie du senseur du voltage (généré par le mouvement des charges positives de S4) au pore. Le mécanisme exact de ce couplage électromécanique est encore sous étude. Un des points de liaison entre le senseur de voltage et le pore est le lien physique fait par le segment S4-S5 (S45L). Le but de cette étude est de déterminer l'influence de la flexibilité du segment S45L sur le processus de couplage. Dans le S45L, trois glycines sont distribuées dans des positions différentes. Elles sont responsables de la flexibilité des hélices-alpha. Ces glycines (mais pas leurs positions exactes) sont conservées pour tous les canaux potassiques dépendants de potentiel. En utilisant la technique de mutagènes dirigé, la glycine a été remplacée dans chacune de ces différentes positions par une alanine et dans une deuxième étape, par une proline (pour introduire un angle dans l'hélice). Pour étudier le comportement des canaux dans cette nouvelle conformation, on a appliqué la technique de « patch clamp » pour déterminer les effets lors de l'ouverture du pore (courant ionique). Avec le « cut-open oocyte voltage-clamp », nous avons étudié les effets sur le mouvement du senseur de voltage (courant “gating”) et la coordination temporelle avec l'ouverture du pore (courant ionique). Les données ont montré qu’en réduisant la flexibilité dans le S45L, il faut avoir plus d'énergie pour faire ouvrir le canal. Le changement pour une proline suggère que le mouvement du senseur est indépendant du pore pendant l'ouverture du canal.

Étude de l'EEG quantifié en éveil et en sommeil chez des adolescents présentant un trouble anxieux

Les troubles anxieux sont parmi les troubles psychiatriques les plus souvent diagnostiqués chez les adolescents. Ces troubles sont souvent accompagnés de nombreuses comorbidités, dont des difficultés de sommeil. L’objectif principal de cette thèse est de caractériser l’activité corticale à l’éveil et pendant le sommeil à l’aide de l’EEG quantifié chez une population d’adolescents présentant un trouble anxieux, et de la comparer à un groupe témoin d’adolescents. Dans un second temps, on cherche à savoir si l’activité EEG des patients anxieux corrèle avec différentes mesures cliniques. Deux études permettent de répondre à ces objectifs, une première portant sur l’activité EEG au cours de l’éveil, et une seconde portant sur l’activité EEG au cours du sommeil (SL et SP). La première étude démontre que l’activité EEG des deux groupes ne présente pas de différence à l’EEG le soir. Par contre, le matin, les patients anxieux présentent une activité significativement supérieure à celle des contrôles aux électrodes centrales (0,75-10 Hz et 13-20 Hz) ainsi qu’aux électrodes occipitales (2,5-7,75 Hz). Dans la seconde étude, nous avons analysé l’activité EEG absolue et relative en SL et en SP. Nous avons trouvé une activité absolue significativement supérieure à l’EEG de la région centrale chez les participants du groupe anxieux : en SLP (stades 3 et 4) sur l’ensemble des bandes de fréquence, en stade 2 sur les bandes de fréquence thêta, alpha et beta seulement. Finalement, en SP, les différences sont trouvées en alpha et beta, et non en thêta et delta. Les résultats obtenus à ces deux études suggèrent la présence de mécanismes de synchronisation et de filtrage inadéquats au niveau de la boucle thalamo-corticale, entraînant une hypervigilance du SNC. Quant aux corrélations entre l’activité EEG et les mesures cliniques, les résultats obtenus dans les deux études révèlent que les fréquences lentes (thêta et delta) de l’activité d’éveil le matin corrèlent à la fois avec l’anxiété de trait et d’état et les fréquences rapides (Alpha et Beta) de l’EEG du sommeil corrèlent sélectivement avec l’anxiété d’état. Il semble donc exister un lien entre les mesures cliniques et l’activité EEG. Une hausse d’activité EEG pourrait être un indicateur de la sévérité accrue des symptômes anxieux.

Études de type structure fonction du couplage électromécanique et de la coopérativité sous-unitaire chez les canaux potassiques dépendants du voltage

Les canaux potassiques voltage-dépendants forment des tétramères dont chaque sous-unité comporte six segments transmembranaires (S1 à S6). Le pore, formé des segments S5-S6 de chaque sous-unité, est entouré de quatre domaines responsables de la sensibilité au potentiel membranaire, les senseurs de voltage (VS; S1-S4). Lors d’une dépolarisation membranaire, le mouvement des résidus chargés situés dans le VS entraine un mouvement de charges détectable en électrophysiologie, le courant de « gating ». L’activation du VS conduit à l'ouverture du pore, qui se traduit par un changement de conformation en C-terminal du segment S6. Pour élucider les principes qui sous-tendent le couplage électromécanique entre ces deux domaines, nous avons étudié deux régions présumées responsables du couplage chez les canaux de type Shaker K+, soit la région carboxy-terminale du segment S6 et le lien peptidique reliant les segments transmembranaire S4-S5 (S4-5L). Avec la technique du « cut-open voltage clamp fluorometry » (COVCF), nous avons pu déterminer que l’interaction inter-sous-unitaire RELY, formée par des acides aminés situés sur le lien S4-5L et S6 de deux sous-unités voisines, est impliquée dans le développement de la composante lente observée lors du retour des charges de « gating » vers leur état de repos, le « OFF-gating ». Nous avons observé que l’introduction de mutations dans la région RELY module la force de ces interactions moléculaires et élimine l’asymétrie observée dans les courants de « gating » de type sauvage. D’ailleurs, nous démontrons que ce couplage inter-sous-unitaire est responsable de la stabilisation du pore dans l’état ouvert. Nous avons également identifié une interaction intra-sous-unitaire entre les résidus I384 situé sur le lien S4-5L et F484 sur le segment S6 d’une même sous-unité. La déstabilisation de cette interaction hydrophobique découple complètement le mouvement des senseurs de voltage et l'ouverture du pore. Sans cette interaction, l’énergie nécessaire pour activer les VS est moindre en raison de l’absence du poids mécanique appliqué par le pore. De plus, l’abolition du couplage électromécanique élimine également le « mode shift », soit le déplacement de la dépendance au voltage des charges de transfert (QV) vers des potentiels hyperpolarisants. Ceci indique que le poids mécanique du pore imposé au VS entraine le « mode shift », en modulant la conformation intrinsèque du VS par un processus allostérique.

Étude du couplage entre les sous-unités du canal potassique KcsA par des mesures de spectroscopie de fluorescence en canal unitaire

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Étude des mécanismes moléculaires de formation des pores des toxines formeuses de pores par la spectroscopie de fluorescence

Les toxines formeuses de pore (PFTs) sont des protéines exogènes responsables d’un grand nombre de maladies infectieuses qui perméabilisent les membranes cellulaires de leur hôte. La formation des pores ou l’introduction d’une enzyme dans le cytoplasme peut entrainer l’apparition de symptômes de maladies connues (l’anthrax, le botulisme) et, dans le pire des cas, la mort. Les mécanismes d’infection et de destruction des cellules infectées sont bien caractérisés. Toutefois, l’aspect dynamique des changements de conformation durant le processus de perméabilisation reste à découvrir pour la majorité des toxines formeuses de pore. Le but de cette thèse est d’étudier les mécanismes d’oligomérisation des PFTs, ainsi que la formation des pores à la membrane lipidique grâce à la spectroscopie de fluorescence. Nous avons choisi la toxine Cry1Aa, un bio pesticide produit par le bacille de Thuringe et qui a été rigoureusement caractérisé, en tant que modèle d’étude. La topologie de la Cry1Aa à l’état actif et inactif a pu être résolue grâce à l’utilisation d’une technique de spectroscopie de fluorescence, le FRET ou transfert d’énergie par résonance entre un fluorophore greffé au domaine formeur de pore (D1) et un accepteur non fluorescent (le DPA ou dipicrylamine) localisé dans la membrane et qui bouge selon le potentiel membranaire. Le courant électrique, ainsi que la fluorescence provenant de la bicouche lipidique membranaire horizontale ont été enregistrés simultanément. De cette manière, nous avons pu localiser toutes les boucles reliant les hélices de D1 avant et après la formation des pores. Dans la forme inactive de la toxine, toutes ces boucles se trouvent du côté interne de la bicouche lipidique, mais dans sa forme active l’épingle α3-α4 traverse du côté externe, alors que toutes les autres hélices demeurent du côté interne. Ces résultats suggèrent que α3-α4 forment le pore. Nous avons découvert que la toxine change significativement de conformation une fois qu’elle se trouve dans la bicouche lipidique, et que la Cry1Aa attaque la membrane lipidique de l’extérieur, mais en formant le pore de l’intérieur. Dans le but de caractériser la distribution de toxines à chaque extrémité de la bicouche, nous avons utilisé une technique de double FRET avec deux accepteurs ayant des vitesses de translocation différentes (le DPA et l’oxonol) dans la membrane lipidique. De cette manière, nous avons déterminé que la toxine était présente des deux côtés de la bicouche lipidique durant le processus de perméabilisation. La dynamique d’oligomérisation de la toxine dans une bicouche lipidique sans récepteurs a été étudiée avec une technique permettant le compte des sauts de fluorescence après le photoblanchiment des fluorophore liés aux sous unités composant un oligomère présent dans la bicouche lipidique supportée. Nous avons confirmé de cette manière que la protéine formait ultimement des tétramères, et que cet état résultait de la diffusion des monomères de toxine dans la bicouche et de leur assemblage subséquent. Enfin nous avons voulu étudier le « gating » de la colicine Ia, provenant de la bactérie E.Coli, dans le but d’observer les mouvements que font deux positions supposées traverser la bicouche lipidique selon le voltage imposé aux bornes de la bicouche. Nos résultats préliminaires nous permettent d’observer un mouvement partiel (et non total) de ces positions, tel que le suggèrent les études de conductances du canal.

Modulation de l’adressage membranaire et de la fonction du canal CaV2.3 par les résidus leucine du domaine guanylate kinase impliqués dans la liaison à forte affinité de CaVβ

Les canaux Ca2+ activés par le voltage (CaV) sont des protéines membranaires qui génèrent des courants Ca2+ dans les cellules excitables suite à une dépolarisation membranaire. Ces complexes oligomériques sont classifiés selon les propriétés structurelles de la sous-unité principale qui forme le pore du canal, soit la sous-unité CaVα1. La sous-unité auxiliaire CaVβ module l’expression membranaire et la dépendance au voltage du « gating » de la sous-unité CaVα1 des canaux HVA (« high-voltage-activated ») CaV1 et CaV2. La sous-unité CaVβ est formée par un domaine SH3 (« Src homology-3 ») connecté à un domaine GK (« guanylate kinase-like ») par le biais d’un domaine variable HOOK. Dans le but d’identifier les résidus dans la CaVβ3 qui sont responsables de la densité membranaire du CaV2.3, nous avons produit des mutants de la sous-unité auxiliaire le long de ses domaines fonctionnels. Cela dit, la délétion complète du domaine SH3 ainsi que la délétion du domaine HOOK n’ont pas modifié la densité membranaire de CaV2.3 ni ses propriétés d’activation. Cependant, la délétion de cinq résidus dans le domaine GK interrompt l’expression membranaire et l’expression fonctionnelle de CaV2.3. La mutation de résidus identifiés précédemment comme soutenant une affinité de liaison de l’ordre du nanomolaire dans le domaine GK de CaVβ n’a pas modifié de manière significative l’adressage membranaire de CaV2.3. Toutefois, les mutations de quatre résidus leucine dans les régions α3, α6, β10 et α9 du domaine GK ont grandement réduit l’adressage membranaire du canal CaV2.3. Nos résultats confirment que le domaine GK contient les déterminants moléculaires responsables de la fonction chaperone de CaVβ. Cela dit, l’adressage membranaire induit par CaVβ semble être déterminé par des éléments structuraux qui ne sont pas strictement dépendants d’une liaison à haute affinité de CaVβ sur CaVα1.

Études de type structure fonction des mutations causant l’ataxie épisodique de type I sur les canaux potassiques dépendants du voltage

Les ataxies épisodiques (EA) d’origine génétique sont un groupe de maladies possédant un phénotype et génotype hétérogènes, mais ont en commun la caractéristique d’un dysfonctionnement cérébelleux intermittent. Les EA de type 1 et 2 sont les plus largement reconnues des ataxies épisodiques autosomiques dominantes et sont causées par un dysfonctionnement des canaux ioniques voltage-dépendants dans les neurones. La présente étude se concentrera sur les mutations causant l'EA-1, retrouvées dans le senseur de voltage (VSD) de Kv1.1, un canal très proche de la famille des canaux Shaker. Nous avons caractérisé les propriétés électrophysiologiques de six mutations différentes à la position F244 et partiellement celles des mutations T284 A/M, R297 K/Q/A/H, I320T, L375F, L399I et S412 C/I dans la séquence du Shaker grâce à la technique du ‘’cut open voltage clamp’’ (COVC). Les mutations de la position F244 situées sur le S1 du canal Shaker sont caractérisées par un décalement des courbes QV et GV vers des potentiels dépolarisants et modifient le couplage fonctionnel entre le domaine VSD et le pore. Un courant de fuite est observé durant la phase d'activation des courants transitoires et peut être éliminé par l'application du 4-AP (4-aminopyridine) ou la réinsertion de l'inactivation de type N mais pas par le TEA (tétraéthylamonium). Dans le but de mieux comprendre les mécanismes moléculaires responsables de la stabilisation d’un état intermédiaire, nous avons étudié séparément la neutralisation des trois premières charges positives du S4 (R1Q, R2Q et R3Q). Il en est ressorti l’existence d’une interaction entre R2 et F244. Une seconde interface entre S1 et le pore proche de la surface extracellulaire agissant comme un second point d'ancrage et responsable des courants de fuite a été mis en lumière. Les résultats suggèrent une anomalie du fonctionnement du VSD empêchant la repolarisation normale de la membrane des cellules nerveuses affectées à la suite d'un potentiel d'action.

Couplage entre les régions IIS4S5 et IIIS6 lors de l’activation du canal calcique CaV3.2

Le canal calcique dépendant du voltage de type-T CaV3.2 joue un rôle important dans l’excitabilité neuronale et dans la perception de la douleur. Le canal CaV3.2 partage une grande homologie structurale et fonctionnelle avec les canaux NaV. Ces deux types de canaux sont activés par de faibles dépolarisations membranaires et possèdent des cinétiques de temps d’activation et d’inactivation plus rapides que les canaux CaV de type-L. Les structures cristallines à haute résolution des canaux bactériens NaVAb (Payandeh et al. 2011; Payandeh et al. 2012) et NaVRh (Zhang et al. 2012) suggèrent que l’hélice amphiphile S4S5 du domaine II peut être couplée avec les résidus de l’hélice S6 dans le domaine II ainsi qu’avec des résidus de l’hélice homologue dans le domaine adjacent, soit le domaine III, et ce, durant l’activation du canal. Pour déterminer les résidus fonctionnellement couplés, durant l’activation du canal CaV3.2, une analyse cyclique de doubles mutants a été effectuée par substitution en glycine et alanine des résidus clés entre l’hélice S4S5 du domaine II et le segment S6 des domaines II et III. Les propriétés biophysiques ont été mesurées à l’aide de la technique de « cut-open » sur les ovocytes. Les énergies d’activation ont été mesurées pour 47 mutations ponctuelles et pour 14 paires de mutants. De grandes énergies de couplage (ΔΔGinteract > 2 kcal mol-1) ont été observées pour 3 paires de mutants introduites dans les IIS4S5/IIS6 et IIS4S5/IIIS6. Aucun couplage significatif n’a été observé entre le IIS4S5 et le IVS6. Nos résultats semblent démontrer que les hélices S4S5 et S6 provenant de deux domaines voisins sont couplées durant l’activation du canal calcique de type-T CaV3.2.

Modulation du réflexe acoustique de sursaut et de l’inhibition par le prépulse : une comparaison entre les jeunes adultes et les âgés

Une des théories actuellement prépondérante pour expliquer le déclin cognitif observé chez les personnes âgées est une perte généralisée de la fonction inhibitrice. En revanche, de plus en plus d’études révèlent un maintien et même un gain sur le plan émotionnel chez les âgés. Afin de caractériser l’effet de l’âge sur la fonction inhibitrice et sur les émotions, nous avons utilisé le paradigme bien connu du réflexe acoustique de sursaut et de son inhibition par le prépulse, un phénomène reconnu comme reflétant le filtrage sensorimoteur, soit une mesure pré-attentionnelle d’inhibition. Le réflexe acoustique de sursaut est une réponse du corps tout entier à un bruit fort et inattendu et a été mesuré via la magnitude et la latence du clignement des yeux. La présentation d’un son faible (prépulse) quelques millisecondes avant le bruit de sursaut réduit la réponse de sursaut. Deux groupes de participants (jeunes adultes et âgés) ont visionné des images plaisantes, neutres et déplaisantes issues du International Affective Picture System (IAPS), lesquelles étaient associées à des stimuli auditifs évaluant le réflexe acoustique de sursaut et son inhibition par le prépulse. Les résultats démontrent que le réflexe de sursaut est modulé différemment par les émotions chez les jeunes adultes et les âgés. Plus particulièrement, les adultes âgés ont un plus grand réflexe de sursaut que les jeunes adultes lorsqu’ils visionnent des images plaisantes et neutres. Le processus d’inhibition par le prépulse est également modulé différemment par les émotions chez les âgés et les jeunes adultes: les âgés ont une plus grande inhibition du réflexe de sursaut que les jeunes adultes lorsqu’ils visionnent des images plaisantes et déplaisantes, mais ils ne diffèrent pas des jeunes adultes pour les images neutres. Dans l’ensemble, les résultats obtenus ne sont pas compatibles avec une perte d’inhibition chez les adultes âgés, et supportent plutôt un biais émotionnel positif.

Criblage génétique et caractérisation fonctionnelle des mutations dans les différentes sous-unités du récepteur GABAA associées à l'épilepsie génétique généralisée

Les épilepsies génétiques généralisées (ÉGGs) sont un groupe de syndromes épileptiques hétérogènes qui se manifestent habituellement durant les périodes de l’enfance et de l’adolescence. Les ÉGGs représentent 30% de toutes les épilepsies. Il n’existe présentement aucun remède à l’épilepsie génétique généralisée. Au sein de ce groupe d’épilepsies, les sujets sont le plus souvent dépourvus de lésions cérébrales, ce qui signifie que les facteurs génétiques jouent un rôle important dans l’étiologie de la maladie. Au cours des dernières années, plusieurs gènes impliqués dans des formes familiales d’ÉGG ont été identifiés. La majorité d'entre elles codent pour des canaux ioniques incluant le récepteur-ligand GABAA (RGABAA). De ce groupe, des mutations ont été identifiées dans quatre sous-unités du récepteur GABAA. Dans un premier temps, l’objectif général de cette thèse vise l’évaluation de la composante génétique de notre cohorte d’ÉGG expliquée par les gènes codant pour les sous-unités du récepteur GABAA. Puis, dans un second souffle, le rôle des variants identifiés est défini et analysé afin de mieux cerner leurs impacts dans la pathogénèse de ce phénotype. La première partie du projet consiste en une analyse exhaustive des mutations existantes dans la partie codante des 19 gènes GABRA pour des patients atteints d’ÉGG. En criblant des familles québécoises avec ÉGG, nous avons identifié 22 variants rares incluant 19 faux-sens et 3 non-sens dans 14 sous-unités du RGABAA. En séquençant ces gènes dans une grande cohorte de cas et de contrôles, nous avons établi le profil des variations rares pour ceux-ci. Ces données suggèrent qu’une proportion significative (8%) des patients atteints d’ÉGG ont des variants rares sur les gènes du RGABAA. La deuxième partie porte directement sur certains gènes identifiés lors de la première partie. De ce groupe, cinq nouvelles mutations ont été découvertes dans des gènes déjà associés à l’épilepsie (GABRA1 et GABRG2). Nous avons constaté l’impact de ces mutations dans les mécanismes génétiques de l’épilepsie, en mesurant les effets des variants sur la structure et la fonction du récepteur GABAA. La troisième partie se concentre sur notre hypothèse, voulant que les RGABAA mutants altèrent l’effet du GABA durant le développement du système nerveux central (SNC). L’objectif principal vise à déterminer la contribution relative de chacune des sous-unités mutées dans le développement du SNC. Ainsi, nous avons démontré qu’une telle perte de fonction a un impact significatif sur le développement des synapses GABAergiques et glutamatergiques ainsi que sur la plasticité des circuits corticaux. Nos résultats nous ont permis de préciser comment les mutations dans les gènes GABRA peuvent mener à l’ÉGG. Éventuellement, la caractérisation moléculaire de ces mutations contribuera à l’élaboration de nouveaux outils diagnostiques et facilitera la mise au point de traitements mieux ciblés pour les gens atteints de cette condition neurologique chronique.

Étude de l'oligomérisation et de la fonction de canaux ioniques par spectroscopie de fluorescence et fluorométrie en voltage imposé

La fonction des canaux ioniques est finement régulée par des changements structuraux de sites clés contrôlant l’ouverture du pore. Ces modulations structurales découlent de l’interaction du canal avec l’environnement local, puisque certains domaines peuvent être suffisamment sensibles à des propriétés physico-chimiques spécifiques. Les mouvements engendrés dans la structure sont notamment perceptibles fonctionnellement lorsque le canal ouvre un passage à certains ions, générant ainsi un courant ionique mesurable selon le potentiel électrochimique. Une description détaillée de ces relations structure-fonction est cependant difficile à obtenir à partir de mesures sur des ensembles de canaux identiques, puisque les fluctuations et les distributions de différentes propriétés individuelles demeurent cachées dans une moyenne. Pour distinguer ces propriétés, des mesures à l’échelle de la molécule unique sont nécessaires. Le but principal de la présente thèse est d’étudier la structure et les mécanismes moléculaires de canaux ioniques par mesures de spectroscopie de fluorescence à l’échelle de la molécule unique. Les études sont particulièrement dirigées vers le développement de nouvelles méthodes ou leur amélioration. Une classe de toxine formeuse de pores a servi de premier modèle d’étude. La fluorescence à l’échelle de la molécule unique a aussi été utilisée pour l’étude d’un récepteur glutamate, d’un récepteur à la glycine et d’un canal potassique procaryote. Le premier volet porte sur l’étude de la stœchiométrie par mesures de photoblanchiment en temps résolu. Cette méthode permet de déterminer directement le nombre de monomères fluorescents dans un complexe isolé par le décompte des sauts discrets de fluorescence suivant les événements de photoblanchiment. Nous présentons ici la première description, à notre connaissance, de l’assemblage dynamique d’une protéine membranaire dans un environnement lipidique. La toxine monomérique purifiée Cry1Aa s’assemble à d’autres monomères selon la concentration et sature en conformation tétramérique. Un programme automatique est ensuite développé pour déterminer la stœchiométrie de protéines membranaires fusionnées à GFP et exprimées à la surface de cellules mammifères. Bien que ce système d’expression soit approprié pour l’étude de protéines d’origine mammifère, le bruit de fluorescence y est particulièrement important et augmente significativement le risque d’erreur dans le décompte manuel des monomères fluorescents. La méthode présentée permet une analyse rapide et automatique basée sur des critères fixes. L’algorithme chargé d’effectuer le décompte des monomères fluorescents a été optimisé à partir de simulations et ajuste ses paramètres de détection automatiquement selon la trace de fluorescence. La composition de deux canaux ioniques a été vérifiée avec succès par ce programme. Finalement, la fluorescence à l’échelle de la molécule unique est mesurée conjointement au courant ionique de canaux potassiques KcsA avec un système de fluorométrie en voltage imposé. Ces enregistrements combinés permettent de décrire la fonction de canaux ioniques simultanément à leur position et densité alors qu’ils diffusent dans une membrane lipidique dont la composition est choisie. Nous avons observé le regroupement de canaux KcsA pour différentes compositions lipidiques. Ce regroupement ne paraît pas être causé par des interactions protéine-protéine, mais plutôt par des microdomaines induits par la forme des canaux reconstitués dans la membrane. Il semble que des canaux regroupés puissent ensuite devenir couplés, se traduisant en ouvertures et fermetures simultanées où les niveaux de conductance sont un multiple de la conductance « normale » d’un canal isolé. De plus, contrairement à ce qui est actuellement suggéré, KcsA ne requiert pas de phospholipide chargé négativement pour sa fonction. Plusieurs mesures indiquent plutôt que des lipides de forme conique dans la phase cristalline liquide sont suffisants pour permettre l’ouverture de canaux KcsA isolés. Des canaux regroupés peuvent quant à eux surmonter la barrière d’énergie pour s’ouvrir de manière coopérative dans des lipides non chargés de forme cylindrique.

Étude structurale et fonctionnelle du canal potassium dépendant du voltage KvAP

Les canaux ioniques dépendants du voltage sont responsables de l'initiation et de la propagation des potentiels d'action dans les cellules excitables. De nombreuses maladies héréditaires (channelopathies) sont associées à un contrôle défectueux du voltage par ces canaux (arythmies, épilepsie, etc.). L’établissement de la relation structure-fonction exacte de ces canaux est donc crucial pour le développement de nouveaux agents thérapeutiques spécifiques. Dans ce contexte, le canal procaryote dépendant du voltage et sélectif au potassium KvAP a servi de modèle d’étude afin d’approfondir i) le processus du couplage électromécanique, ii) l’influence des lipides sur l’activité voltage-dépendante et iii) l’inactivation de type closed-state. Afin de pallier à l’absence de données structurales dynamiques du côté cytosolique ainsi que de structure cristalline dans l’état fermé, nous avons mesuré le mouvement du linker S4-S5 durant le gating par spectroscopie de fluorescence (LRET). Pour ce faire, nous avons utilisé une technique novatrice du contrôle de l’état conformationnel du canal en utilisant les lipides (phospholipides et non phospholipides) au lieu du voltage. Un modèle dans l’état fermé a ainsi été produit et a démontré qu’un mouvement latéral modeste de 4 Å du linker S4-S5 est suffisant pour mener à la fermeture du pore de conduction. Les interactions lipides - canaux jouent un rôle déterminant dans la régulation de la fonction des canaux ioniques mais ne sont pas encore bien caractérisées. Nous avons donc également étudié l’influence de différents lipides sur l’activation voltage - dépendante de KvAP et mis en évidence deux sites distincts d’interactions menant à des effets différents : au niveau du senseur de voltage, menant au déplacement de la courbe conductance-voltage, et du côté intracellulaire, influençant le degré de la pente de cette même courbe. Nous avons également démontré que l’échange de lipides autour de KvAP est extrêmement limité et affiche une dépendance à l’état conformationnel du canal, ne se produisant que dans l’état ouvert. KvAP possède une inactivation lente particulière, accessible depuis l'état ouvert. Nous avons étudié les effets de la composition lipidique et de la température sur l'entrée dans l'état inactivé et le temps de récupération. Nous avons également utilisé la spectroscopie de fluorescence (quenching) en voltage imposé afin d'élucider les bases moléculaires de l’inactivation de type closed-state. Nous avons identifié une position à la base de l’hélice S4 qui semble impliquée à la fois dans le mécanisme responsable de ce type d'inactivation et dans la récupération particulièrement lente qui est typique du canal KvAP.

A theoretical and experimental dissociation of two models of decision‐making

La prise de décision est un processus computationnel fondamental dans de nombreux aspects du comportement animal. Le modèle le plus souvent rencontré dans les études portant sur la prise de décision est appelé modèle de diffusion. Depuis longtemps, il explique une grande variété de données comportementales et neurophysiologiques dans ce domaine. Cependant, un autre modèle, le modèle d’urgence, explique tout aussi bien ces mêmes données et ce de façon parcimonieuse et davantage encrée sur la théorie. Dans ce travail, nous aborderons tout d’abord les origines et le développement du modèle de diffusion et nous verrons comment il a été établi en tant que cadre de travail pour l’interprétation de la plupart des données expérimentales liées à la prise de décision. Ce faisant, nous relèveront ses points forts afin de le comparer ensuite de manière objective et rigoureuse à des modèles alternatifs. Nous réexaminerons un nombre d’assomptions implicites et explicites faites par ce modèle et nous mettrons alors l’accent sur certains de ses défauts. Cette analyse servira de cadre à notre introduction et notre discussion du modèle d’urgence. Enfin, nous présenterons une expérience dont la méthodologie permet de dissocier les deux modèles, et dont les résultats illustrent les limites empiriques et théoriques du modèle de diffusion et démontrent en revanche clairement la validité du modèle d'urgence. Nous terminerons en discutant l'apport potentiel du modèle d'urgence pour l'étude de certaines pathologies cérébrales, en mettant l'accent sur de nouvelles perspectives de recherche.