Molecular mechanisms of interleukin-2 gene inducibility: developmental control and combinatorial action of transcription factors

Interleukin-2 is one of the lymphokines secreted by T helper type 1 cells upon activation mediated by T-cell receptor (TCR) and accessory molecules. The ability to express IL-2 is correlated with T-lineage commitment and is regulated during T cell development and differentiation. Understanding the molecular mechanism of how IL-2 gene inducibility is controlled at each transition and each differentiation process of T-cell development is to understand one aspect of T-cell development. In the present study, we first attempted to elucidate the molecular basis for the developmental changes of IL-2 gene inducibility. We showed that IL-2 gene inducibility is acquired early in immature CD4- CD8-TCR- thymocytes prior to TCR gene rearrangement. Similar to mature T cells, a complete set of transcription factors can be induced at this early stage to activate IL-2 gene expression. The progression of these cells to cortical CD4^+CD8^+TCR^(1o) cells is accompanied by the loss of IL-2 gene inducibility. We demonstrated that DNA binding activities of two transcription factors AP-1 and NF-AT are reduced in cells at this stage. Further, the loss of factor binding, especially AP-1, is attributable to the reduced ability to activate expression of three potential components of AP-1 and NF-AT, including c-Fos, FosB, and Fra-2. We next examined the interaction of transcription factors and the IL-2 promoter in vivo by using the EL4 T cell line and two non-T cell lines. We showed an all-or-none phenomenon regarding the factor-DNA interaction, i.e., in activated T cells, the IL-2 promoter is occupied by sequence-specific transcription factors when all the transcription factors are available; in resting T cells or non-T cells, no specific protein-DNA interaction is observed when only a subset of factors are present in the nuclei. Purposefully reducing a particular set of factor binding activities in stimulated T cells using pharmacological agents cyclosporin A or forskolin also abolished all interactions. The results suggest that a combinatorial and coordinated protein-DNA interaction is required for IL-2 gene activation. The thymocyte experiments clearly illustrated that multiple transcription factors are regulated during intrathymic T-cell development, and this regulation in tum controls the inducibility of the lineage-specific IL-2 gene. The in vivo study of protein-DNA interaction stressed the combinatorial action of transcription factors to stably occupy the IL-2 promoter and to initiate its transcription, and provided a molecular mechanism for changes in IL-2 gene inducibility in T cells undergoing integration of multiple environmental signals.

Avaliação do potencial anti-inflamatório agudo e crônico e imunossupressor do extrato etanólico de Pterodon polygalaeflorus através de estudos in vivo e in vitro

O gênero Pterodon pertence à família das Papilonaceas e inclui cinco espécies nativas do Brasil: P. pubescens Benth., P. emarginatus Vog., P. apparicioi Pedersoli e P. abruptus Benth., sendo a espécie objeto deste estudo a P. polygalaeflorus Benth.. Seus frutos são livremente comercializados em mercados da flora medicinal e utilizados pela medicina popular devido a propriedades anti-reumática, analgésica, antiinflamatória, dentre outros efeitos associados a esses frutos. O principal uso popular está relacionado ao efeito antiartrítico que parece se encontrar na fração oleosa do fruto. O objetivo deste trabalho foi avaliar o extrato etanólico de Pterodon polygalaeflorus (EEPpg) quanto ao seu potencial antiinflamatório crônico através do modelo de artrite induzida por colágeno (CIA) e seu efeito sobre os linfócitos in vitro, bem como sobre a expansão de células MAC-1+ induzida por adjuvante completo de Freund (AFC). A caracterização química do EEPpg foi realizada por cromatografia em camada delgada (TLC), cromatografia líquida de alta performance (HPLC) e cromatografia gasosa acoplada a espectrômetro de massa (GC-MS), através dos quais uma gama de compostos, incluindo terpenóides de polaridades variadas e flavonóides, foram observados. No modelo de CIA, o EEPpg reduziu significativamente parâmetros associados ao desenvolvimento e progressão da doença e à severidade da doença , inibindo em até 99% o seu desenvolvimento e levando a ausência de sinais clínicos evidentes após tratamento com as menores doses do extrato (0,01 mg/kg e 0,001 mg/kg). O tratamento com EEPpg também reduziu características histopatológicas típicas de articulações de animais com CIA, que também são observadas na artrite reumatóide. O EEPpg reduziu significativamente o peso dos linfonodos dos camundongos, bem como o número absoluto de segmentados, monócitos e linfócitos no sangue. In vitro, O EEPpg mostrou uma atividade anti-proliferativa dos esplenócitos estimulados com concanavalina A (Con A) ou lipopolissacarídeo (LPS) analisada através do ensaio de redução do sal de tetrazólio MTT, corroborada pelo seu efeito sobre o ciclo celular de linfócitos estimulados com Con A, onde o EEPpg nas concentrações de 5, 10 e 20 μg/mL reduziu significativamente, de maneira concentração-dependente, o número de células nas fases S+G2/M e aumentou na fase G0/G1 do ciclo celular. O efeito anti-proliferativo do EEPpg parece também estar associado ao aumento da apoptose dos linfócitos após estimulação com Con A, com aumento estatisticamente significativo no percentual de células mortas por apoptose nas maiores concentrações . O EEPpg inibiu a expansão de células Mac-1+ induzida por AFC no baço, porém não no peritônio. Esse resultado sugere um efeito inibidor do EEPpg sobre a migração celular para as articulações artríticas. Esses resultados contribuem para a validação do uso popular de P. polygalaeflorus contra doenças relacionadas a processos inflamatórios e imunes, sobretudo na artrite reumatóide, antes nunca demonstrado.

Pragmatemas e a música no ensino-aprendizagem de inglês como língua adicional em um colégio estadual do RJ: papel na retenção lexical

O presente estudo analisa as contribuições do uso da música e de pragmatemas na retenção lexical por parte de três turmas de inglês como língua adicional em uma escola estadual na cidade de São João de Meriti (RJ). Para tal, constituiu três condições de pesquisa das quais fizeram parte doze alunos na turma 1 (T1); doze alunos na turma 2 (T2); e nove alunos na turma 3 (T3). A turma 1 (T1) participou de práticas pedagógicas com foco na música e sem foco explícito nos pragmatemas presentes na letra; a turma 2 (T2) de práticas pedagógicas com foco na música e nos pragmatemas da letra; e a turma 3 (T3) de práticas pedagógicas voltadas somente para o ensino-aprendizagem dos pragmatemas presentes na letra, sem o suporte da música. Anteriormente à intervenção, foi aplicado um questionário sobre os hábitos sócio-culturais dos participantes visando conhecer suas preferências musicais e perfil de letramento. Para analisar a relação entre o uso da música e de pragmatemas na retenção lexical, foram aplicados um pré-teste antes da intervenção e dois pós-testes com intervalo de 1 mês entre eles. Além disso, o estudo contou com uma entrevista semi-estruturada com os participantes, visando entender a percepção dos mesmos sobre as práticas utilizadas na intervenção. Os achados apontam que houve uma retenção ligeiramente superior nas condições T2 (música e foco nos pragmatemas) e T3 (foco exclusivo nos pragmatemas), com ligeira superioridade para a condição 3. O pragmatema recuperado com maior frequência foi "What's up", fato que pode ser parcialmente explicado pelo fato de ser pronunciado como uma palavra só e pelo número de letras que o representa ortograficamente. Estudos futuros poderão esclarecer se há significância estatística entre as diferenças encontradas assim como melhor explorar como o ensino explícito de unidades lexicais complexas pode contribuir para a retenção desses itens lexicais e consequentemente para o ensino-aprendizagem de línguas adicionais.194;A intervenção permitiu que os aprendizes passassem a entender que as palavras não ocorrem de modo isolado, mas que sempre caminham junto a outras. Permitiu também que a rotina pedagógica contemplasse a coconstrução do conhecimento, levando os aprendizes a reagir positivamente às práticas utilizadas no ensino de inglês, conforme relatos durante as entrevistas semi-estruturadas. Isso per se já justifica a utilização de práticas semelhantes e ilustra a contribuição do presente estudo

Corpo carotídeo e hipertensão: alterações celulares e da matriz extracelular

O aumento de doenças cardiovasculares possui como fator primordial e, mais comum, o aumento da pressão arterial (PA). Esta, pode gerar complicações em outros órgãos e acarretar diversas patologias, podendo levar a morte. A hipertensão é uma síndrome multifatorial, cuja maior incidência ocorre em indivíduos obesos, sedentários e consumidores em excesso de bebidas alcoólicas e sal. O corpo carotídeo (CC) é um órgão quimiorreceptor localizado na bifurcação da artéria carótida, formado de estruturas básicas chamadas glomus. Cada glomus carotídeo é constituído de células tipo 1 envoltas por células tipo 2 ou sustentaculares. Este trabalho teve como objetivo analisar as alterações morfofuncionais que ocorrem no CC, causada por hipertensão arterial induzida pelo L-NAME, um inibidor da enzima óxido nítrico sintase. Para isso, o estudo utilizou 20 ratos Wistar divididos em dois grupos: controle (C) e L-NAME (LN). Após a administração de 40mg/kg/dia de L-NAME por 45 dias, o CC foi coletado. Observou-se aumento significativo da pressão arterial a partir da segunda semana de administração de L-NAME. Análise quantitativa mostrou uma redução no número de núcleos do glomus carotídeo e o aumento na área total do órgão no grupo LN. Não foi encontrado diferença significativa no número de núcleos totais do corpo carotídeo entre os grupos. Na análise morfológica do grupo LN, observamos a formação de vacúolos nas células tipo 1 do glomus, bem como uma redução do número total de núcleos das células de cada glomus carotídeo. A análise qualitativa sugeriu um aumento no número de fibras colágenas e fibras do sistema elástico na matriz extracelular e grânulos no grupo LN. Imunomarcações com anticorpo anti VEGF e NF-kB e nNOS mostram-se aumentadas e dispersas por todo CC no grupo LN em relação ao grupo C. Além disso, marcações para Substância-P também foram observadas em maior quantidade nas células tipo 1 do grupo LN. Quanto à marcação para PGP 9.5, houve a redução desta marcação caracterizada dentro do glomus carotídeo grupo LN comparado ao grupo C. O estudo sugere que o corpo carotídeo, em resposta à hipertensão induzida pela inibição da enzima óxido nítrico sintase, gera mudanças morfofisiológicas semelhantes as encontradas em hipóxia.

Reprodução e parasitismo em Melanoides tuberculata (Müller, 1774) (Gastropoda, Thiaridae) da Vila do Abraão, Ilha Grande, Angra dos Reis, RJ

Melanoides tuberculata (Müller, 1774), molusco exótico límnico de origem afroasiática, foi registrado pela primeira vez na Vila do Abraão, Ilha Grande, Angra dos Reis, Rio de Janeiro, em 2005. Atua como primeiro hospedeiro intermediário de diversos trematódeos de importância médica. As populações são compostas majoritariamente por fêmeas partenogenéticas que possuem um marsúpio onde se desenvolvem os juvenis. Os objetivos foram verificar: a presença de machos; se existem flutuações na produção de ovos e juvenis ao longo do tempo; quando a maturidade sexual é atingida e, a existência de parasitos relacionando sua presença com o número de ovos e juvenis. Para a contagem de ovos e juvenis, foram utilizadas fêmeas coletadas bimestralmente de setembro/07 a outubro/10, separadas em quatro classes de tamanho, segundo o diâmetro da concha: Classe I: < 3mm; Classe II: 3 a 5,99mm; Classe III: 6 a 8,99mm; Classe IV: > 9mm. Separamos cinco fêmeas/classe, totalizando 20 fêmeas/coleta, exceto nas amostras de setembro/07 (16 exemplares), abril/09 (19 exemplares) e de abril/10 (13 exemplares), totalizando 348 fêmeas. Para observação dos parasitos, ovos e juvenis o teto da cavidade palial foi retirado e o marsúpio dissecado. Classificamos os juvenis em classes de acordo com o número de voltas: com menos de duas; com duas a quatro e com mais de quatro. Os dados foram analisados utilizando Excel e SYSTAT 12. Para a histologia da gônada e do marsúpio, utilizamos cinco exemplares coletados mensalmente de setembro/12 a fevereiro/13, de cada classe de tamanho, totalizando 20 espécimes/coleta, exceto em outubro/12, quando 16 espécimes foram usados, pois somente um espécime da Classe IV foi encontrado. Os espécimes foram fixados em formalina Millonig de Carson, descalcificados em EDTA, incluídos em parafina e corados em hematoxilina e eosina. Foram encontrados 16 machos. Quantificamos 24.694 ovos e 31.474 juvenis, com as seguintes médias: Classe I: 0 ovos e 0,31 juvenis; Classe II: 24,19 ovos e 47,56 juvenis; Classe III: 114,84 ovos e 155,78 juvenis; Classe IV: 146,76 ovos e 158,41 juvenis. O teste de Kruskal-Wallis mostrou que existe variação significativa no número de ovos e juvenis ao longo do ano (p < 0,01 para ambos) e entre o número de ovos e juvenis entre as diferentes classes de tamanho de concha (p <0,01 para ambos). Foram contabilizados 27.877 juvenis com menos de duas voltas, 3.251 juvenis com duas a quatro voltas e 346 juvenis com mais de quatro voltas. Dentre 348 fêmeas, 111 estavam parasitadas (32% do total) por Centrocestus formosanus (Nishigori, 1924). O Teste de Mann-Whitney, levando em consideração todas as fêmeas, demonstrou que fêmeas parasitadas apresentaram menor número de ovos e juvenis que as não parasitadas ( p<0,01). Excluindo as fêmeas da Classe 1, o resultado do teste foi o mesmo (p< 0,01). Concluímos que: a população de M. tuberculata da Vila do Abraão não é formada somente por fêmeas; as fêmeas se reproduzem o ano todo, pois foram encontrados ovos e juvenis em todas as coletas; que quanto maior a fêmea há mais ovos e, em média, há mais juvenis no marsúpio; que a maturidade sexual é alcançada com aproximadamente 3 mm de diâmetro de concha, devido a presença de ovócitos vitelogênicos tardios e, que o parasitismo afeta negativamente M. tuberculata, reduzindo o número de ovos e juvenis formados

Cianobactérias como parâmetro de qualidade ambiental: um estudo no complexo lagunas de Jacarepaguá.

O Complexo Lagunar de Jacarepaguá, localizado no município do Rio de Janeiro, região sudeste do Brasil, é formado pelas lagunas de Jacarepaguá, Camorim, Tijuca e Marapendi. Estas lagunas estão interligadas ao mar pelo canal da Joatinga e têm como afluentes rios e canais que vertem dos maciços da Tijuca e da Pedra Branca. Recebem esgotos sanitários e efluentes industriais, além de contribuições difusas de águas de drenagem e circulação das massas de águas de várias origens, com elevada carga de poluição. A eutrofização cultural aliada aos processos de evolução de ecossistemas costeiros produziu um estado de degradação destas águas com constantes florações de cianobactérias potencialmente tóxicas. O presente estudo tem como objetivo avaliar a ocorrência das cianobactérias (Classe Cyanophyceae) no Complexo Lagunar de Jacarepaguá e corroborar a hipótese de serem boas indicadoras de qualidade ambiental de águas salobras. Foi realizado um monitoramento ambiental nas lagunas de Jacarepaguá, Camorim, Tijuca e Marapendi, nos anos de 2004 a 2006, sendo analisados parâmetros físicos, químicos e biológicos. Os resultados obtidos demonstraram a dominância e a persistência das cianobactérias em elevadas concentrações de nutrientes, caracterizando a hipereutrofização dessas lagunas. As estratégias ecológicas das cianobactérias garantiram sua dominância em quase todo o período amostral e demonstraram ser um refinado sensor das variáveis ambientais. A salinidade não foi um fator de limitação ao desenvolvimento desses microorganismos. Desta forma, este estudo, oferece subsídios para gestão de recursos hídricos, corroborando com a legislação CONAMA 357/05-MMA, na sugestão de indicação deste parâmetro de qualidade ambiental também para ambientes salobros na classe 1.

Caracterização de beta-lactamases de espectro ampliado (ESBLs), genes de resistência aos antimicrobianos e conteúdo plasmidial em cepas de Escherichia coli e Salmonella spp. não tifóides isoladas do ambiente hospitalar e da comunidade

Enterobactérias produtoras de ESBLs são descritas tanto no ambiente hospitalar quanto na comunidade em todo o mundo. No Brasil, esses microrganismos também têm emergido como uma causa importante de infecções, sendo as enzimas CTX-M as prevalentes. O objetivo deste estudo foi analisar diferentes aspectos genotípicos relacionados à expressão da resistência aos antimicrobianos em cepas Escherichia coli e de Salmonella spp, tais como: a diversidade de ESBLs, os genes de resistência aos antimicrobianos e o conteúdo plasmidial. Os aspectos epidemiológicos das cepas produtoras de ESBLs também foram investigados. Foram estudadas 88 cepas de enterobactérias, sendo 43 E. coli e 45 cepas de Salmonella spp., de origem hospitalar e da comunidade (principalmente alimentos), isoladas na cidade do Rio de Janeiro. A expressão de ESBL foi observada em sete cepas de E. coli (7/43, 16,3%) e em uma cepa de Salmonella Typhimurium (1/45, 2,3%) e as enzimas foram identificadas como variantes de CTX-M e SHV-5, respectivamente. Entre as cepas de E. coli, a enzima CTX-M-2 foi a mais frequente (n = 4), sendo detectada em cepas isoladas de swab retal de pacientes hospitalizados, enquanto as enzimas CTX-M-59 (uma variante de CTX-M) (n = 1) e CTX-M-9 (n = 2) foram identificadas em cepas isoladas a partir de espécimes clínicos. Salmonella Typhimurium produtora de SHV-5 foi isolada do ambiente hospitalar (fórmula infantil). As cepas de E. coli produtoras das enzimas CTX-M pertenceram a grupos filogenéticos (A, B1, D) e STs (ST34, ST69, ST101) diferentes, sendo os genes blaCTX-M identificados em plasmídeos com tipo de replicon IncA/C de cerca de 150 kb (blaCTX-M-2, blaCTX-M-9, blaCTX-M-59) ou 80 kb (blaCTX-M-2). A cepa de S. Typhimurium produtora de SHV-5 pertenceu a um único clone (A-ST19) e o gene blaSHV-5 foi identificado em plasmídeo com o replicon IncL/M com aproximadamente 55Kb. Foi identificado pela primeira vez no Brasil o ST313 em um clone de S. Typhimurium (D-ST313), comumente associado com doenças invasivas severas, particulamente no continente africano. Genes que codificam para a resistência aos antimicrobianos não-beta-lactâmicos e integrons classe 1 foram identificados entre as cepas de E. coli e de Salmonella spp. multirresistentes produtoras ou não de ESBLs. Em conclusão: i) nossos resultados referentes à E. coli confirmaram a disseminação de enzimas CTX-M (principalmente variantes do grupo CTX-M-2) desde, pelo menos, o ano de 2000, em hospitais no Rio de Janeiro; demonstraram a implicação dos plasmídeos IncA/C na disseminação de genes blaCTX-M; indicaram a possível evolução intra-plasmídeo de blaCTX-M-59 a partir de blaCTX-M-2; a observação da diversidade e multiplicidade de plasmídeos poderiam fornecer plataformas genéticas para a dispersão de diferentes genes e/ou elementos de resistência aos antimicrobianos; ii) em relação à Salmonella spp. este estudo descreveu, pela primeira vez, o isolamento, a partir de fórmula infantil, de uma cepa de S. Typhimurium produtora de ESBL; foi demonstrada a associação do gene blaSHV-5 com plasmídeo do tipo IncL/M, que é considerado epidêmico; foi identificado o clone D-ST313 de S. Typhimurium, que está associado a doenças invasivas severas no continente africano, que reuniu cepas isoladas exclusivamente do ambiente hospitalar.

River Plym SAP Consultation

This is the River Plym Salmon Action Plan Consultation document produced by the Environment Agency in 2003. The report pays attention on the external consultation of the River Plym Salmon Action Plan (SAP). This strategy represents an entirely new approach to salmon management within the UK and introduces the concept of river-specific salmon spawning targets as a salmon management tool. The River Plym SAP follows the format of those completed for the rivers Tamar, Lynher, Tavy, Camel and Fowey. It is the sixth of seven action plans that will be produced for salmon rivers managed by Cornwall Area. The River Plym SAP contains a description of the river catchment and highlights particular features that are relevant to the salmon population and the associated fishery. Notably, there are historic workings for china clay and a significant potable water supply at Burrator Reservoir. The main River Plym has been designated as River Ecosystem class 1 for its water quality objectives. This is the highest water quality target set for rivers. This standard has been met in all reaches of the main River Plym and River Meavy.

River Yealm SAP Consultation

This is the River Yealm Salmon Action Plan Consultation document produced by the Environment Agency in 2003. The report pays attention on the external consultation of the River Yealm Salmon Action Plan (SAP). This strategy represents an entirely new approach to salmon management within the UK and introduces the concept of river-specific salmon spawning targets as a salmon management tool. The River Yealm Salmon Action Plan follows the format of those completed for the rivers Tamar, Lynher, Tavy, Camel, Fowey and Plym. It is the final one of seven action plans that will be produced for salmon rivers managed by Cornwall Area. The River Yealm SAP contains a description of the river catchment and highlights particular features that are relevant to the salmon population and the associated fishery. Notably there are potable water abstractions in the headwaters, workings for china clay on the main tributary, two inert waste landfill sites and an aggregate quarry adjacent to the main river and inputs from several Sewage Treatment Works (STW) and two industrial estates. The main River Yealm has been designated as River Ecosystem Class 1 for its water quality objectives. This is the highest water quality target set for rivers.

Modulação por Sucupira (Pterodon polygalaeflorus, Benth) da distribuição de Linfócitos T ativados e T de memória em linfonodos (LN) de camundongos com Artrite Induzida por Colágeno tipo II (CIA) e da mielopoiese em baços de camundongos primados com Adjuvante Completo de Freund (AFC)

Sementes de árvores do gênero Pterodon, conhecidas principalmente pelo nome Sucupira, são utilizadas popularmente para o tratamento de doenças reumáticas. Na presente dissertação, temos como objetivo estudar a possível ação do extrato hidroalcoólico de sementes de Pterodon polygalaeflorus (EHPp) no tratamento de Artrite Induzida por Colágeno tipo II (CIA) em camundongos DBA/1J. Verificou-se a distribuição de Linfócitos T CD4+ com fenótipo de memória em linfonodos de animais com CIA; a possível interferência do tratamento no segundo aumento de células mielóides (Mac-1+) esplênicas gerado pela segunda injeção de colágeno tipo II (CII) para indução da CIA e confirmou-se o fenótipo granulocítico dessas células mielóides. Além disso, através de outro modelo experimental de 10 dias de duração, objetivou-se estudar as células mielóides Mac-1+: se o tratamento com EHPp interfere na mielopoese esplênica induzida somente pela injeção de Adjuvante de Freund Completo (AFC) em camundongos DBA1/J e avaliar uma eventual diferença entre o grau de ativação dessas células em animais primados com AFC tratados ou não com EHPp. A CIA foi induzida em camundongos DBA/1J machos, por injeção intradérmica (i.d.) de CII em AFC com reforço intraperitonial de CII três semanas após a primeira injeção. O tratamento oral, diário, com EHPp por cerca de 30 dias foi iniciado no dia do reforço com CII. No modelo de curta duração, com o intuito de verificar o possível aumento de células Mac-1+ no baço, os animais foram tratados oralmente com EHPp, por 9 dias, sendo o AFC injetado, i.d., no 5o dia do tratamento e os animais sacrificados no 10o. Os resultados obtidos foram: o tratamento com EHPp interfere na distribuição de Linfócitos T com fenótipo de memória em animais com indução de CIA; resultados preliminares sugerem que o tratamento com EHPp não interfere no segundo aumento de células mielóides no baço no modelo CIA; a maioria das células mielóides presentes no baço de animais sadios ou de animais com CIA apresenta fenótipo granulocítico (GR.1+); o tratamento com EHPp reduz significantemente a mielopoese esplênica induzida pela injeção de AFC; a fração significante de células Mac-1+ no baço de animais primados com AFC apresenta aumento de produção de Espécies Reativas de Oxigênio em relação aos animais sadios ou tratados com EHPp. Em conjunto, estes resultados permitem identificar uma possível ação anti-inflamatória do EHPp ao impedir o aumento de células inflamatórias no baço de animais primados com AFC, bem como uma atividade imunossupressora, evidenciada pela redução de Linfócitos com perfil de recém ativação e de Linfócitos com perfil de memória nos LNs em relação aos animais com CIA, sugerindo o seu envolvimento nos processos de ativação e de migração linfocitários.

Age and length composition of Columbia Basin chinook, sockeye, and coho salmon at Bonneville Dam in 2002

In 2002, representative samples of migrating Columbia Basin chinook (Oncorhynchus tshawytscha), sockeye (O. nerka), and coho salmon (O. kisutch) adult populations were collected at Bonneville Dam. Fish were trapped, anesthetized, sampled for scales and biological data, revived, and then released. Scales were examined to estimate age composition; the results contributed to an ongoing database for age class structure of Columbia Basin salmon populations. Based on scale analysis of chinook salmon, four-year-old fish (from brood year [BY] 1998) comprised 86% of the spring chinook, 51% of the summer chinook, and 51% of the bright fall chinook salmon population. Five-year-old fish (BY 1997) comprised 13% of the spring chinook, 43% of the summer chinook, and 11% of the bright fall chinook salmon population. The sockeye salmon population at Bonneville was predominantly five-year-old fish (55%), with 40% returning as four-year-olds in 2002. For the coho salmon population, 88% of the population was three-year-old fish of age class 1.1, while 12% were age class 1.0. Length analysis of the 2002 returns indicated that chinook salmon with a stream-type life history are larger (mean length) at age than the chinook salmon with an ocean-type life history. Trends in mean length over the sampling period for returning 2002 chinook salmon were analyzed. Chinook salmon of age classes 1.2 and 1.3 show a significant increase in mean length over the duration of the migration. A year class regression over the past 14 years of data was used to predict spring, summer, and bright fall chinook salmon population sizes for 2003. Based on three-year-old returns, the relationship predicts four-year-old returns of 54,200 (± 66,600, 90% predictive interval [PI]) spring chinook, 23,800 (± 19,100, 90% PI) summer, and 169,100 (± 139,500, 90% PI) bright fall chinook salmon for the 2003 runs. Based on four-year-old returns, the relationship predicts five-year-old returns of 36,300 (± 35,400, 90% PI) spring, 63,800 (± 10,300, 90% PI) summer, and 91,100 (± 69,400, 90% PI) bright fall chinook salmon for the 2003 runs. The 2003 run size predictions should be used with caution; some of these predictions are well beyond the range of previously observed data.

Exploiting the bioactive potential of marine sponge microbiota

Endospore-forming bacteria are often isolated from different marine sponges, but their abundance varies, and they are frequently missed by culture-independent studies. Within endospore-formers, Bacillus are renowned for the production of antimicrobials and other compounds of medical and industrial importance. Although this group has been well studied in many different environments, very little is known about the actual diversity and properties of sporeformers associated with marine sponges. Identification of the endospore-forming bacteria associated with the marine sponges; Haliclona simulans, Amphilectus fucorum and Cliona celata, has uncovered an abundant and diverse microbial population composed of Bacillus, Paenibacillus, Solibacillus, Halobacillus and Viridibacillus species. This diversity appears to be overlooked by other non-targeted approaches where spore-formers are masked by more dominant species within the ecosystem. In addition to the identification of two antibiotic resistant plasmids, this bank of sporeformers produce a range of bioactive compounds. New antimicrobial compounds are urgently needed to combat the spread of multidrug resistant pathogens, as few new options are entering the drug discovery pipelines for clinical trials. Based on the results of this project, endospore-formers associated with marine sponges may hold the answer. The power of coupling functional based assays with genomic approaches has enabled us to identify a novel class 1 lantibiotic, subtilomycin, which is active against several clinically relevant pathogens. Subtilomycin is encoded in the genomes of all the marine sponge B. subtilis isolates analysed. They cluster together phylogenetically and form a distinct group from other sequenced B. subtilis strains. Regardless of its potential clinical relevance, subtilomycin may be providing these strains with a specific competitive advantage(s) within the stringent confines of the marine sponge environment. This work has outlined the industrial and biotechnological potential of marine sponge endospore-formers which appear to produce a cocktail of bioactive compounds. Genome sequencing of specific marine sponge isolates highlighted the importance of mining extreme environments and habitats for new lead compounds with potential therapeutic applications.

The relevance of bacterial isoprenoid biosynthetic pathways for host-microbe interactions

This thesis was undertaken to investigate the relevance of two bacterial isoprenoid biosynthetic pathways (Mevalonate (MVAL) and 2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphate (MEP)) for host-microbe interactions. We determined a significant reduction in microbial diversity in the murine gut microbiota (by next generation sequencing) following oral administration of a common anti-cholesterol drug Rosuvastatin (RSV) that targets mammalian and bacterial HMG-CoA reductase (HMG-R) for inhibition of MVAL formation. In tandem we identified significant hepatic and intestinal off-target alterations to the murine metabolome indicating alterations in inflammation, bile acid profiles and antimicrobial peptide synthesis with implications on community structure of the gastrointestinal microbiota in statin-treated animals. However we found no effect on local Short Chain Fatty Acid biosynthesis (metabolic health marker in our model). We demonstrated direct inhibition of bacterial growth in-vitro by RSV which correlated with reductions in bacterial MVAL formation. However this was only at high doses of RSV. Our observations demonstrate a significant RSV-associated impact on the gut microbiota prompting similar human analysis. Successful deletion of another MVAL pathway enzyme (HMG-CoA synthase (mvaS)) involved in Listeria monocytogenes EGDe isoprenoid biosynthesis determined that the enzyme is non-essential for normal growth and in-vivo pathogenesis of this pathogen. We highlight potential evidence for alternative means of synthesis of the HMG-CoA substrate that could render mvaS activity redundant under our test conditions. Finally, we showed by global gene expression analysis (Massive Analysis of cDNA Ends (MACE RNA-seq) a significant role for the penultimate MEP pathway metabolite (E)-4-hydroxy-3-methyl-2-but-2-enyl pyrophosphate (HMBPP) in significant up regulation of genes of immunity and antigen presentation in THP-1 cells at nanomolar levels. We infected THP-1 cells with wild type or HMBPP under/over-producing L. monoctyogenes EGDe mutants and determined subtle effects of HMBPP upon overall host responses to Listeria infection. Overall our findings provide greater insights regarding bacterial isoprenoid biosynthetic pathways for host-microbe/microbe-host dialogue.

Direct evidence that Gi-coupled receptor stimulation of mitogen-activated protein kinase is mediated by G beta gamma activation of p21ras.

Stimulation of Gi-coupled receptors leads to the activation of mitogen-activated protein kinases (MAP kinases). In several cell types, this appears to be dependent on the activation of p21ras (Ras). Which G-protein subunit(s) (G alpha or the G beta gamma complex) primarily is responsible for triggering this signaling pathway, however, is unclear. We have demonstrated previously that the carboxyl terminus of the beta-adrenergic receptor kinase, containing its G beta gamma-binding domain, is a cellular G beta gamma antagonist capable of specifically distinguishing G alpha- and G beta gamma-mediated processes. Using this G beta gamma inhibitor, we studied Ras and MAP kinase activation through endogenous Gi-coupled receptors in Rat-1 fibroblasts and through receptors expressed by transiently transfected COS-7 cells. We report here that both Ras and MAP kinase activation in response to lysophosphatidic acid is markedly attenuated in Rat-1 cells stably transfected with a plasmid encoding this G beta gamma antagonist. Likewise in COS-7 cells transfected with plasmids encoding Gi-coupled receptors (alpha 2-adrenergic and M2 muscarinic), the activation of Ras and MAP kinase was significantly reduced in the presence of the coexpressed G beta gamma antagonist. Ras-MAP kinase activation mediated through a Gq-coupled receptor (alpha 1-adrenergic) or the tyrosine kinase epidermal growth factor receptor was unaltered by this G beta gamma antagonist. These results identify G beta gamma as the primary mediator of Ras activation and subsequent signaling via MAP kinase in response to stimulation of Gi-coupled receptors.

CD4 enumeration technologies: a systematic review of test performance for determining eligibility for antiretroviral therapy.

BACKGROUND: Measurement of CD4+ T-lymphocytes (CD4) is a crucial parameter in the management of HIV patients, particularly in determining eligibility to initiate antiretroviral treatment (ART). A number of technologies exist for CD4 enumeration, with considerable variation in cost, complexity, and operational requirements. We conducted a systematic review of the performance of technologies for CD4 enumeration. METHODS AND FINDINGS: Studies were identified by searching electronic databases MEDLINE and EMBASE using a pre-defined search strategy. Data on test accuracy and precision included bias and limits of agreement with a reference standard, and misclassification probabilities around CD4 thresholds of 200 and 350 cells/μl over a clinically relevant range. The secondary outcome measure was test imprecision, expressed as % coefficient of variation. Thirty-two studies evaluating 15 CD4 technologies were included, of which less than half presented data on bias and misclassification compared to the same reference technology. At CD4 counts <350 cells/μl, bias ranged from -35.2 to +13.1 cells/μl while at counts >350 cells/μl, bias ranged from -70.7 to +47 cells/μl, compared to the BD FACSCount as a reference technology. Misclassification around the threshold of 350 cells/μl ranged from 1-29% for upward classification, resulting in under-treatment, and 7-68% for downward classification resulting in overtreatment. Less than half of these studies reported within laboratory precision or reproducibility of the CD4 values obtained. CONCLUSIONS: A wide range of bias and percent misclassification around treatment thresholds were reported on the CD4 enumeration technologies included in this review, with few studies reporting assay precision. The lack of standardised methodology on test evaluation, including the use of different reference standards, is a barrier to assessing relative assay performance and could hinder the introduction of new point-of-care assays in countries where they are most needed.