Técnicas histopatológicas no diagnóstico de criptococose por Cryptococcus deficiente de cápsula: relato de caso

Caso de criptococose por Cryptococcus deficiente de cápsula, no qual cultivo do espécime clínico e pesquisa do antígeno capsular no líquor e soro foram negativos. As técnicas histopatológicas foram: Hematoxilina-eosina, Grocott, Mucicarmim de Mayer e Fontana-Masson. Confirmou-se o diagnóstico do Cryptococcus deficiente de cápsula pela técnica de Fontana-Masson e pela imunofluorescência direta. É discutida a potencialidade das técnicas histoquímicas.

Genetic and functional analysis of the bacillus subtilis BSP1 gam cluster

Mannans (linear mannan, glucomannan, galactomannan and galactoglucomannan) are the major constituents of the hemicellulose fraction in softwoods and show great importance as a renewable resource for fuel or feedstock applications. As complex polysaccharides, mannans can only be degraded through a synergistic action of different mannan-degrading enzymes, mannanases. Microbial mannanases are mainly extracellular enzymes that can act in wide range of pH and temperature, contributing to pulp and paper, pharmaceutical, food and feed, oil and textile successful industrial applications. Knowing and controlling these microbial mannan-degrading enzymes are essential to take advantage of their great biotechnological potential. The genome of the laboratory 168 strain of Bacillus subtilis carries genes gmuA-G dedicated to the degradation and utilization of glucomannan, including an extracellular -mannanase. Recently, the genome sequence of an undomesticated strain of B. subtilis, BSP1, was determined. In BSP1, the gmuA-G operon is maintained, interestingly, however, a second cluster of genes was found (gam cluster), which comprise a second putative extracellular β-mannanase, and most likely specify a system for the degradation and utilization of a different mannan polymer, galactoglucomannan. The genetic organization and function of the gam cluster, and whether its presence in BSP1 strain results in new hemicellulolytic capabilities, compared to those of the laboratory strain, was address in this work. In silico and in vivo mRNA analyses performed in this study revealed that the gam cluster, comprising nine genes, is organized and expressed in at least six different transcriptional units. Furthermore, cloning, expression, and production of Bbsp2923 in Escherichia coli was achieved and preliminary characterization shows that the enzyme is indeed a β-mannanase. Finally, the high hemicellulolytic capacity of the undomesticated B. subtilis BSP1, demonstrated in this work by qualitative analyses, suggests potential to be used in the food and feed industries.

Community prevalence of methicillin and vancomycin resistant Staphylococcus aureus in and around Bangalore, southern India

INTRODUCTION: Staphylococcus aureus is a known colonizer in humans and has been implicated in community acquired soft tissue infections. However emergence of methicillin resistant S. aureus (MRSA) has aroused great concern worldwide. This study aimed to determine the prevalence of MRSA in the community of Bangalore, southern India. METHODS: Swabs were collected from anterior nares, forearm, dorsum and palm of the hands of 1,000 healthy individuals residing in and around Bangalore, belonging to different socioeconomic strata and age groups. RESULTS: Analysis verified that 22.5% and 16.6% of the individuals presented Staphylococcus aureus and MRSA, respectively, at any of the three sites. Vancomycin resistance was observed in 1.4% of the S. aureus isolates, which was confirmed by detection of the vanA gene. It was interesting to note that 58.8% of the children in the age group 1-5 years-old presented MRSA, the highest percentage compared to other age groups of < 1 (44.4%) year-old, 5-20 (21.7%) years-old, > 40 (11%) years-old and 20-40 (9.9%) years-old. Among the population of various socioeconomic strata, maximum MRSA colonization was observed among doctors (22.2%), followed by upper economic class (18.8%), lower economic class (17.7%), apparently healthy hospital in-patients (16.5%), nurses (16%) and middle economic class (12.5%). Most of the MRSA isolates were capsular polysaccharide antigen type 8 (57.1%). CONCLUSIONS: There is a need for continuous surveillance and monitoring of the presence of MRSA in the community and a clearer understanding of the dynamics of the spread of MRSA will assist in controlling its dissemination.

Evaluating the potential of yeast strains to produce added value products for the food and/or pharmaceutical industries

This study focus in the valorization of the apple pomace with the main goal of obtaining added value products. For that, hot compressed water technology was used for the extraction of phenolic compounds and hydrolysis of polysaccharides presents in the lignocellulosic structure of apple pomace to obtain simple sugars. The sugars have been utilized as alternative carbon source for growth, lipid accumulation and carotenoids production by five different yeast Yarrowia lipolytica, Rhodotorula mucilaginosa, Rhodotorula glutinis, Rhodosporidium babjevae and Rhodosporidium toruloides. Hydrolysis experiments were carried out with constant pressure of 100 bar, flow rate of 2mL/min and temperatures between 50°C and 250°C. The amount of total sugars present in apple pomace hydrolysates showed maximum values for the hydrolysis temperatures of 110°C and 190°C. In fact, these temperatures revealed the best results regarding the monosaccharides quantities. The amount of 5-HMF and furfural in each hydrolysate varied through the different temperatures. Maximum values for 5-HMF were obtained with 170°C, while furfural showed to be maximum at 210°C. Extraction of phenolic compounds were performed in simultaneously with hydrolysis reactions. Total phenolic compounds (TPC) increased along the temperature, however with small variations between 170°C and 250°C. Hydrolysates were then used as alternative carbon source to yeast growth. R. mucilaginosa shows the highest optical density, with the hydrolysate obtained at 130°C. Carotenoids produced by these yeast scored a total of 7.02μg carotenoids/g cell dry weight, while for the control assay, the same yeast scored 9.31μg caratonoides/g cell dry weight. β-carotene was quantified by HPLC, were 33% of the carotenoid production by R. mucilaginosa with hydrolysate as carbon source, corresponded to β-caroteno.

Elucidating the role of glycans in leucocyte function

RESUMO: O processo de glicosilação é a modificação pós-traducional de proteínas mais comum e está envolvido em vários processos fisiológicos e patológicos. Especificamente, certos perfis glicosídeos estão correlacionados a estados específicos de diferenciação celular, e podem modular vários eventos celulares, como sinalização celular, migração celular e interações hospedeiro-patogénio. Assim sendo, a glicosilação desempenha um papel crucial na modulação de vários processos imunológicos. No entanto, permanece por esclarecer como as estruturas glicosídicas influenciam a imunidade. Especificamente, algumas estruturas glicosídicas terminais que estão modificadas pela ligação de ácido siálico desempenham um papel importante em várias funções do sistema imune, nomeadamente migração leucocitária em contexto de inflamação e ativação de células imunes. Como tal, este trabalho teve como objectivo investigar como a expressão de certos glicanos influencia componentes importantes da resposta imune inata e adaptativa. Este trabalho está dividido em três componentes principais: 1) A imunidade está amplamente dependente da habilidade das células circulantes migrarem para os tecidos inflamados, sendo que a ligação de leucócitos à Eselectina endotelial é o primeiro passo. Assim, nós analisámos a estrutura e função dos ligandos de E-selectina que são expressos pelas células humanas mononucleares de sangue periférico (PBMCs), fornecendo novos conhecimentos para a compreensão dos intervenientes moleculares que mediam a ligação dos monócitos, células CD4+ e CD8+T e células B ao endotélio vascular. Surpreendentemente, os monócitos apresentaram maior capacidade de ligação à E-selectina comparativamente aos linfócitos. Esta observação pode ser explicada pelo facto de os monócitos humanos expressarem, uniformemente, um vasto reportório de glicoproteínas que exibem afinidade de ligação à E-selectina, nomeadamente: as glicoformas do CD43 (CD43E) e do CD44 (HCELL), em adição à já previamente reportada glicoforma da PSGL-1 (CLA). Consistentemente, a diferente capacidade que as diversas populações linfocitárias apresentam de se ligar à E-selectina, está integralmente relacionada com a sua expressão de glicoproteínas com afinidade de ligação à E-selectina. Enquanto que as células CD4+T apresentam uma elevada reatividade à E-selectina, as células CD8+T e B demonstram pouca ou nenhuma capacidade de ligação à E-selectina. Esta atividade de ligação à E-selectina das células CD4+T é conferida pela expressão de HCELL, em adição às já previamente reportadas CLA e CD43E. As células CD8+ T não expressam HCELL e apenas expressam pequenas quantidades de CLA e CD43E, enquanto que as células B não expressam ligandos de Eselectina. Mais, a exofucosilação da superfície destas células, levou ao dramático aumento da expressão dos ligandos de E-selectina em todos as populações leucocitárias, verificando-se que a criação de certos ligandos de E-selectina está dependente do tipo de célula, após fucosilação. Colectivamente, estes resultados redefinem o nosso conhecimento acerca dos mecanismos moleculares que governam o tráfico das células mononucleares de sangue periférico em contexto de inflamação. 2) A habilidade das células dendríticas (DCs) para extravasarem em locais de inflamação é crucial para o sucesso da terapia com DCs. Assim, analisámos a estrutura e função das moléculas de adesão que mediam a migração transendotelial (TEM) das DCs. Para isso, foram usadas DCs geradas a partir da diferenciação de monócitos (mo-DCS), obtidos quer pelo métodos de separação imuno-magnética de células CD14+ (CD14-S) ou por isolamento por aderência ao plástico (PA-S). Os resultados obtidos indicam que as glicoformas de ligação à Eselectina de PSGL-1, CD43 e CD44 são expressas pelas CD14-S mo-DCs, enquanto que as PA-S mo-DCs expressam apenas CLA. É importante notar que a ligação do CD44 nas mo-DCs, mas não nas PA-S mo-DCs, desencadeia a ativação e consequente adesão da VLA-4 ao endotélio na ausência de um gradiente de quimiocinas. Procedeu-se também à análise dos ligandos E-selectina expressos em mo-DCs geradas a partir de monócitos do sangue do cordão umbilical (UCB) e, inesperadamente, as UCB mo-DCs não expressam qualquer glicoproteína com reatividade à E-selectina. Além disso, a exofucosilação das mo- DCs humanas utilizando uma α(1,3)-fucosiltransferase aumenta significativamente a expressão de HCELL e, portanto, estas células apresentam uma capacidade aumentada para se ligarem à E-selectina em condições de fluxo hemodinâmico. Estes resultados destacam o papel do HCELL no desencadeamento do TEM das CD14-S mo-DCs e sugerem que estratégias para potenciar a expressão de HCELL poderão impulsionar o recrutamento de mo-DCs para locais de inflamação. 3) Outro obstáculo para alcançar o sucesso promissor de vacinas baseadas em DCs é o estabelecimento de abordagens eficientes que poderão melhorar o estado de maturação e apresentação antigénica das DCs. Por conseguinte, foram investigadas abordagens alternativas que podem superar este obstáculo. Através da remoção de ácido siálico de superfície celular das DCs, conseguiu-se induzir a maturação de DC humanas e de ratinhos. Notavelmente, tanto as DCs humanas como as de ratinho, ao serem desialiladas mostraram uma capacidade aumentada para induzir a proliferação de células T, para secretar citocinas Th1 e para induzir a morte específica de células tumorais. Em adição, as DCs desialiladas apresentam uma maior capacidade de apresentação cruzada de antigénios tumorais às células T citotóxicas. Colectivamente, o presente estudo oferece uma visão chave para optimizar a capacidade das DCs em induzir respostas imunitárias anti-tumorais, e indica que o tratamento com sialidase é uma nova tecnologia para melhorar a eficácia e aplicabilidade das vacinas baseadas em DCs. Coletivamente, os nossos resultados demostram como a glicosilação e a sua manipulação podem modular a imunidade. Concretamente, através de uma reação de exofucosilação conseguimos aumentar fortemente a capacidade de os leucócitos extravasarem para os tecidos afectados, enquanto que a remoção dos níveis de ácido siálico da superfície celular das DCs, induz potentes respostas anti-tumorais mediadas por células T citotóxicas. ------------------------------------ ABSTRACT: Glycosylation is the most widely form of protein post-translational modification and is involved in many physiological and pathological processes. Specifically, certain patterns of glycosylation are associated with determined stages of cell differentiation and can modulate processes like cell-signaling and migration and host-pathogen interactions. As such, glycosylation plays a crucial role in the modulation of several immune events. However, how glycans execute this immune-modulation and, therefore, influence immunity is still poorly unknown. Specifically, some terminal sialic acid-modified determinants are known to be involved in several physiological immune processes, including leukocyte trafficking into sites of inflammation and cell immune activation. Therefore, in this work, we sought to investigate more deeply how the expression of these glycosidic structures affects events form both innate and adaptive immune responses. To this end, we divided our work into three main parts: 1) Immunity critically depends on the ability of sentinel circulating cells to infiltrate injured sites, of which leukocyte binding to endothelial E-selectin is the critical first step. Thus, we first analyzed the structure and function of the E-selectin ligands expressed on native human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), providing novel insights into the molecular effectors governing adhesion of circulating monocytes, and of circulating CD4+T, CD8+T and B cells, to vascular endothelium under hemodynamic shear conditions. Strikingly, monocytes show a higher ability to tether and roll on endothelial cells than lymphocyte subsets. This is due to the fact that human circulating monocytes uniformly display a wide repertoire of E-selectin binding glycoproteins, namely the E-selectin-binding glycoforms of CD43 (CD43E) and CD44 (HCELL), in addition to the previously described E-selectin-binding glycoform of PSGL-1 (CLA). In addition, we also observed a differential ability of the different lymphocyte subsets to bind to Eselectin under hemodynamic shear stress conditions, and these differences were highly correlated with their individual expression of E-selectin binding glycoproteins. While CD4+T cells show a robust E-selectin binding ability, CD8+T and B cells show little to no E-selectin reactivity. CD4+T cell potent Eselectin rolling activity is conferred by HCELL expression, in addition to the previously reported E-selectin-binding glycoproteins CD43E and CLA. CD8+T cells display no HCELL and low amounts of CLA and CD43E, whereas B cells lack E-selectin ligand expression. Moreover, enforced exofucosylation of cell surface of these cells noticeably increases expression of functional E-selectin ligands among all leukocytes subsets, with cell type-dependent specificity in the protein scaffolds that are modified. Taken together, these findings redefine our understanding of the molecular mechanisms governing the trafficking patterns of PBMCs that are relevant in the context of acute or chronic inflammatory conditions. 2) The ability of circulating dendritic cells (DCs) to extravasate at inflammatory sites is critical to the success of DC-based therapies. Therefore, we assessed the structure and function of adhesion molecules mediating the transendothelial migration (TEM) of human monocyte derived-DCs (mo-DCs), obtained either by CD14 positive immune-magnetic selection (CD14-S) or by plastic adherence of blood monocytes (PA-S). We report for the first time that the E-selectin binding glycoforms of PSGL-1, CD43 and CD44 are all expressed on CD14-S mo-DCs, in contrast to PA-S mo-DCs that express only CLA. Importantly, CD44 engagement on CD14-S mo-DCs, but not on PA-S mo-DCs, triggers VLA-4-dependent adhesiveness and programs TEM in absence of chemokine gradient. We also analyzed the E-selectin ligands expressed on mo-DCs generated from umbilical cord blood (UCB) monocytes, and unexpectedly, UCB mo-DCs do not express any glycoprotein with E-selectin reactivity. Furthermore, exoglycosylation of human mo-DCs using an α(1,3)-fucosyltransferase significantly increases expression of HCELL, and therefore exofucosylated mo-DCs exhibit an augmented ability to bind to E-selectin under hemodynamic shear stress conditions. These findings highlight a role for HCELL engagement in priming TEM of CD14-S mo-DCs, and suggest that strategies to enforce HCELL expression could boost mo-DC recruitment to inflammatory sites. 3) Another obstacle to achieve the promising success of DC-based vaccines is the establishment of efficient approaches that could successfully enhance maturation and cross-presentation ability of DCs. Therefore, we investigated an alternative approach that can overcome this problem. Through removal of sialic acid content from DC cell surface we are able to elicit maturation of both human and mouse DCs. Notably, desialylated human and murine DCs showed enhanced ability to induce autologous T cell to proliferate, to secrete Th1 cytokines and to kill tumor cells. Moreover, desialylated DCs display enhanced cross-presentation of tumor antigens to cytotoxic CD8+ T cells. Collectively, this study offers key insight to optimize the ability of DCs to boost anti-tumor immune responses, and indicates that the treatment with an exogenous sialidase is a powerful new technology to improve the efficacy and applicability of DC-based vaccines. Overall, our findings show how glycosylation and its manipulation can modulate immunity. Concretely, through an exofucosylation reaction we are able to greatly augment the ability of leukocytes to extravasate into injured tissues, while removal of sialic acid moieties from cell surface of DCs, significantly potentiate their ability to induce anti-tumor cytotoxic T cell-mediate responses.

Elucidating the role of glycans in leucocyte function

RESUMO:O processo de glicosilação é a modificação pós-traducional de proteínas mais comum e está envolvido em vários processos fisiológicos e patológicos. Especificamente, certos perfis glicosídeos estão correlacionados a estados específicos de diferenciação celular, e podem modular vários eventos celulares, como sinalização celular, migração celular e interações hospedeiro-patogénio. Assim sendo, a glicosilação desempenha um papel crucial na modulação de vários processos imunológicos. No entanto, permanece por esclarecer como as estruturas glicosídicas influenciam a imunidade. Especificamente, algumas estruturas glicosídicas terminais que estão modificadas pela ligação de ácido siálico desempenham um papel importante em várias funções do sistema imune, nomeadamente migração leucocitária em contexto de inflamação e ativação de células imunes. Como tal, este trabalho teve como objectivo investigar como a expressão de certos glicanos influencia componentes importantes da resposta imune inata e adaptativa. Este trabalho está dividido em três componentes principais: 1) A imunidade está amplamente dependente da habilidade das células circulantes migrarem para os tecidos inflamados, sendo que a ligação de leucócitos à Eselectina endotelial é o primeiro passo. Assim, nós analisámos a estrutura e função dos ligandos de E-selectina que são expressos pelas células humanas mononucleares de sangue periférico (PBMCs), fornecendo novos conhecimentos para a compreensão dos intervenientes moleculares que mediam a ligação dos monócitos, células CD4+ e CD8+T e células B ao endotélio vascular. Surpreendentemente, os monócitos apresentaram maior capacidade de ligação à E-selectina comparativamente aos linfócitos. Esta observação pode ser explicada pelo facto de os monócitos humanos expressarem, uniformemente, um vasto reportório de glicoproteínas que exibem afinidade de ligação à E-selectina, nomeadamente: as glicoformas do CD43 (CD43E) e do CD44 (HCELL), em adição à já previamente reportada glicoforma da PSGL-1 (CLA). Consistentemente, a diferente capacidade que as diversas populações linfocitárias apresentam de se ligar à E-selectina, está integralmente relacionada com a sua expressão de glicoproteínas com afinidade de ligação à E-selectina. Enquanto que as células CD4+T apresentam uma elevada reatividade à E-selectina, as células CD8+T e B demonstram pouca ou nenhuma capacidade de ligação à E-selectina. Esta atividade de ligação à E-selectina das células CD4+T é conferida pela expressão de HCELL, em adição às já previamente reportadas CLA e CD43E. As células CD8+ T não expressam HCELL e apenas expressam pequenas quantidades de CLA e CD43E, enquanto que as células B não expressam ligandos de Eselectina. Mais, a exofucosilação da superfície destas células, levou ao dramático aumento da expressão dos ligandos de E-selectina em todos as populações leucocitárias, verificando-se que a criação de certos ligandos de E-selectina está dependente do tipo de célula, após fucosilação. Colectivamente, estes resultados redefinem o nosso conhecimento acerca dos mecanismos moleculares que governam o tráfico das células mononucleares de sangue periférico em contexto de inflamação. 2) A habilidade das células dendríticas (DCs) para extravasarem em locais de inflamação é crucial para o sucesso da terapia com DCs. Assim, analisámos a estrutura e função das moléculas de adesão que mediam a migração transendotelial (TEM) das DCs. Para isso, foram usadas DCs geradas a partir da diferenciação de monócitos (mo-DCS), obtidos quer pelo métodos de separação imuno-magnética de células CD14+ (CD14-S) ou por isolamento por aderência ao plástico (PA-S). Os resultados obtidos indicam que as glicoformas de ligação à Eselectina de PSGL-1, CD43 e CD44 são expressas pelas CD14-S mo-DCs, enquanto que as PA-S mo-DCs expressam apenas CLA. É importante notar que a ligação do CD44 nas mo-DCs, mas não nas PA-S mo-DCs, desencadeia a ativação e consequente adesão da VLA-4 ao endotélio na ausência de um gradiente de quimiocinas. Procedeu-se também à análise dos ligandos E-selectina expressos em mo-DCs geradas a partir de monócitos do sangue do cordão umbilical (UCB) e, inesperadamente, as UCB mo-DCs não expressam qualquer glicoproteína com reatividade à E-selectina. Além disso, a exofucosilação das mo- DCs humanas utilizando uma α(1,3)-fucosiltransferase aumenta significativamente a expressão de HCELL e, portanto, estas células apresentam uma capacidade aumentada para se ligarem à E-selectina em condições de fluxo hemodinâmico. Estes resultados destacam o papel do HCELL no desencadeamento do TEM das CD14-S mo-DCs e sugerem que estratégias para potenciar a expressão de HCELL poderão impulsionar o recrutamento de mo-DCs para locais de inflamação. 3) Outro obstáculo para alcançar o sucesso promissor de vacinas baseadas em DCs é o estabelecimento de abordagens eficientes que poderão melhorar o estado de maturação e apresentação antigénica das DCs. Por conseguinte, foram investigadas abordagens alternativas que podem superar este obstáculo. Através da remoção de ácido siálico de superfície celular das DCs, conseguiu-se induzir a maturação de DC humanas e de ratinhos. Notavelmente, tanto as DCs humanas como as de ratinho, ao serem desialiladas mostraram uma capacidade aumentada para induzir a proliferação de células T, para secretar citocinas Th1 e para induzir a morte específica de células tumorais. Em adição, as DCs desialiladas apresentam uma maior capacidade de apresentação cruzada de antigénios tumorais às células T citotóxicas. Colectivamente, o presente estudo oferece uma visão chave para optimizar a capacidade das DCs em induzir respostas imunitárias anti-tumorais, e indica que o tratamento com sialidase é uma nova tecnologia para melhorar a eficácia e aplicabilidade das vacinas baseadas em DCs. Coletivamente, os nossos resultados demostram como a glicosilação e a sua manipulação podem modular a imunidade. Concretamente, através de uma reação de exofucosilação conseguimos aumentar fortemente a capacidade de os leucócitos extravasarem para os tecidos afectados, enquanto que a remoção dos níveis de ácido siálico da superfície celular das DCs, induz potentes respostas anti-tumorais mediadas por células T citotóxicas. ---------------------------- ABSTRACT: Glycosylation is the most widely form of protein post-translational modification and is involved in many physiological and pathological processes. Specifically, certain patterns of glycosylation are associated with determined stages of cell differentiation and can modulate processes like cell-signaling and migration and host-pathogen interactions. As such, glycosylation plays a crucial role in the modulation of several immune events. However, how glycans execute this immune-modulation and, therefore, influence immunity is still poorly unknown. Specifically, some terminal sialic acid-modified determinants are known to be involved in several physiological immune processes, including leukocyte trafficking into sites of inflammation and cell immune activation. Therefore, in this work, we sought to investigate more deeply how the expression of these glycosidic structures affects events form both innate and adaptive immune responses. To this end, we divided our work into three main parts: 1) Immunity critically depends on the ability of sentinel circulating cells to infiltrate injured sites, of which leukocyte binding to endothelial E-selectin is the critical first step. Thus, we first analyzed the structure and function of the E-selectin ligands expressed on native human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), providing novel insights into the molecular effectors governing adhesion of circulating monocytes, and of circulating CD4+T, CD8+T and B cells, to vascular endothelium under hemodynamic shear conditions. Strikingly, monocytes show a higher ability to tether and roll on endothelial cells than lymphocyte subsets. This is due to the fact that human circulating monocytes uniformly display a wide repertoire of E-selectin binding glycoproteins, namely the E-selectin-binding glycoforms of CD43 (CD43E) and CD44 (HCELL), in addition to the previously described E-selectin-binding glycoform of PSGL-1 (CLA). In addition, we also observed a differential ability of the different lymphocyte subsets to bind to Eselectin under hemodynamic shear stress conditions, and these differences were highly correlated with their individual expression of E-selectin binding glycoproteins. While CD4+T cells show a robust E-selectin binding ability, CD8+T and B cells show little to no E-selectin reactivity. CD4+T cell potent Eselectin rolling activity is conferred by HCELL expression, in addition to the previously reported E-selectin-binding glycoproteins CD43E and CLA. CD8+T cells display no HCELL and low amounts of CLA and CD43E, whereas B cells lack E-selectin ligand expression. Moreover, enforced exofucosylation of cell surface of these cells noticeably increases expression of functional E-selectin ligands among all leukocytes subsets, with cell type-dependent specificity in the protein scaffolds that are modified. Taken together, these findings redefine our understanding of the molecular mechanisms governing the trafficking patterns of PBMCs that are relevant in the context of acute or chronic inflammatory conditions. 2) The ability of circulating dendritic cells (DCs) to extravasate at inflammatory sites is critical to the success of DC-based therapies. Therefore, we assessed the structure and function of adhesion molecules mediating the transendothelial migration (TEM) of human monocyte derived-DCs (mo-DCs), obtained either by CD14 positive immune-magnetic selection (CD14-S) or by plastic adherence of blood monocytes (PA-S). We report for the first time that the E-selectin binding glycoforms of PSGL-1, CD43 and CD44 are all expressed on CD14-S mo-DCs, in contrast to PA-S mo-DCs that express only CLA. Importantly, CD44 engagement on CD14-S mo-DCs, but not on PA-S mo-DCs, triggers VLA-4-dependent adhesiveness and programs TEM in absence of chemokine gradient. We also analyzed the E-selectin ligands expressed on mo-DCs generated from umbilical cord blood (UCB) monocytes, and unexpectedly, UCB mo-DCs do not express any glycoprotein with E-selectin reactivity. Furthermore, exoglycosylation of human mo-DCs using an α(1,3)-fucosyltransferase significantly increases expression of HCELL, and therefore exofucosylated mo-DCs exhibit an augmented ability to bind to E-selectin under hemodynamic shear stress conditions. These findings highlight a role for HCELL engagement in priming TEM of CD14-S mo-DCs, and suggest that strategies to enforce HCELL expression could boost mo-DC recruitment to inflammatory sites.3) Another obstacle to achieve the promising success of DC-based vaccines is the establishment of efficient approaches that could successfully enhance maturation and cross-presentation ability of DCs. Therefore, we investigated an alternative approach that can overcome this problem. Through removal of sialic acid content from DC cell surface we are able to elicit maturation of both human and mouse DCs. Notably, desialylated human and murine DCs showed enhanced ability to induce autologous T cell to proliferate, to secrete Th1 cytokines and to kill tumor cells. Moreover, desialylated DCs display enhanced cross-presentation of tumor antigens to cytotoxic CD8+ T cells. Collectively, this study offers key insight to optimize the ability of DCs to boost anti-tumor immune responses, and indicates that the treatment with an exogenous sialidase is a powerful new technology to improve the efficacy and applicability of DC-based vaccines. Overall, our findings show how glycosylation and its manipulation can modulate immunity. Concretely, through an exofucosylation reaction we are able to greatly augment the ability of leukocytes to extravasate into injured tissues, while removal of sialic acid moieties from cell surface of DCs, significantly potentiate their ability to induce anti-tumor cytotoxic T cell-mediate responses.

A problemática da quebra de garrafas de vidro no processo de engarrafamento da JMF

A indústria alimentar tem como dever básico assegurar a qualidade dos seus produtos e garantir a segurança alimentar. Para uma eficácia no processo produtivo é necessário que o mesmo seja controlado e otimizado, sendo fundamental identificar problemas, avaliar a sua origem e encontrar soluções adequadas para a sua resolução. A José Maria da Fonseca é uma das empresas mais antigas no ramo vitivinícola, a sua missão é produzir e comercializar vinhos de qualidade reconhecida. Direcionada para a qualidade dos seus produtos, a empresa tem a consciencialização que é fundamental investir na identificação contínua de problemas do processo produtivo, que possam conduzir a oportunidades de melhoria. O objetivo deste trabalho consistiu na identificação das causas da quebra de vidro na zona de engarrafamento, identificação da causa raiz, e o impacto que as partículas de vidro resultantes dessa quebra, principalmente de uma quebra com explosão possam ter sobre a segurança do produto para o consumidor. Na linha de engarrafamento, podem ocorrer quebras de garrafas no despaletizador, na máquina de lavar, na máquina de encher e na máquina de rolhar ou capsular roscas (Pilfer-Proof). As quebras de garrafas no despaletizador não são consideradas uma vez que as garrafas ainda passam por um processo de lavagem, que tem como objetivo a eliminação de objetos estranhos existentes no interior da garrafa, sendo também feita a validação deste equipamento. Após a máquina de rolhar ou capsular Pilfer-Proof, o produto encontra-se selado e livre de contaminações físicas, pelo que todo o processo produtivo deve ser controlado, com as devidas medidas de monitorização e ações corretivas de forma a evitar a sua contaminação. Neste enquadramento efetuou-se o estudo nas linhas de produção 1, 2 e 3, pois estas apresentam quebras de garrafas com explosão de vidro, que é a principal causa da contaminação do produto e dos equipamentos. Deste estudo conclui-se e explica-se as várias causas que levam à quebra de garrafa na linha de produção e identifica-se a causa raiz do problema. Devido a não se conseguir evitar o problema na causa raiz, as ações de melhoria propostas vão atuar nas ações corretivas efetuadas na máquina de encher, de forma a evitar a contaminação do produto e a garantir a segurança do consumidor.

Production of mexican brown macroalgae fucoidan and fucosidases under an integral green technology bioproceses by the biorefinery concept

Marine ecosystem can be considered a rather exploited source of natural substances with enormous bioactive potential. In Mexico macro-algae study remain forgotten for research and economic purposes besides the high amount of this resource along the west and east coast. For that reason the Bioferinery Group of the Autonomous University of Coahuila, have been studying the biorefinery concept in order to recover high value byproducts of Mexican brown macro-algae including polysaccharides and enzymes to be applied in food, pharmaceutical and energy industry. Brown macroalgae are an important source of fucoidan, alginate and laminarin which comprise a complex group of macromolecules with a wide range of important biological properties such as anticoagulant, antioxidant, antitumoral and antiviral and also as rich source of fermentable sugars for enzymes production. Additionally, specific enzymes able to degrade algae matrix (fucosidases, sulfatases, aliginases, etc) are important tools to establish structural characteristics and biological functions of these polysaccharides. The aims of the present work were the integral study of bioprocess for macroalgae biomass exploitation by the use of green technologies as hydrothermal extraction and solid state fermentation in order to produce polysaccharides and enzymes (fucoidan and fucoidan hydrolytic enzymes). This work comprises the use of the different bioprocess phases in order to produce high value products with lower time and wastes.

Evidence for inter- and intra-species biofilm formation variability among a small group of coagulase-negative staphylococci

Coagulase-negative staphylococci (CoNS) are common bacterial colonisers of the human skin. They are often involved in nosocomial infections due to biofilm formation in indwelling medical devices. While biofilm formation has been extensively studied in Staphylococcus epidermidis, little is known regarding other CoNS species. Here, biofilms from six different CoNS species were characterised in terms of biofilm composition and architecture. Interestingly, the ability to form a thick biofilm was not associated with any particular species, and high variability on biofilm accumulation was found within the same species. Cell viability assays also revealed different proportions of live and dead cells within biofilms formed by different species, although this parameter was particularly similar at the intra-species level. On the other hand, biofilm disruption assays demonstrated important inter- and intra-species differences regarding extracellular matrix composition. Lastly, confocal laser scanning microscopy (CLSM) experiments confirmed this variability, highlighting important differences and common features of CoNS biofilms. We hypothesised that the biofilm formation heterogeneity observed was rather associated with biofilm matrix composition than with cells themselves. Additionally, our results indicate that polysaccharides, DNA and proteins are fundamental pieces in the process of CoNS biofilm formation.

Modification of microfiltration membranes by hydrogel impregnation for pDNA purification

The huge efforts for the achievement of highly purified biomolecules are growing every day. A great number of efficient techniques, such as chromatography, are already available in laboratory for separation processes. However, membrane-based technologies are the best match to assure simplicity, efficiency and easy scale-up procedures. Herein we report the modification of a commercial microfiltration membrane for plasmid DNA purification by agarose gel impregnation. The membrane was characterized by SEM, ATR-FTIR, EDS, contact angle, and porosity measurements. Additionally, the membrane pore radius was estimated from observed rejections of different proteins and with that information the rejection of a 6050 bp plasmid DNA (pDNA) molecule was estimated for different values of flux using a theoretical model of large flexible molecules in membranes with parallel cylindrical pores, which is applicable to pDNA ultrafiltration in conventional membranes, as recently shown in the literature. The experimental results show that the modified membrane has higher pDNA rejections than the predicted by the model, suggesting that the different type of porous structure that a hydrogel has, may have a positive effect on pDNA rejections as compared to other biomolecules with more rigid structures, making this type of modified membranes potential better candidates to be used for the selective recovery of pDNA in this type of bioprocesses.

Platelet lysate-based pro-angiogenic nanocoatings

Human platelet lysate (PL) is a cost-effective and human source of autologous multiple and potent pro-angiogenic factors, such as vascular endothelial growth factor A (VEGF A), fibroblast growth factor b (FGF b) and angiopoietin-1. Nanocoatings previously characterized were prepared by layer-by-layer assembling incorporating PL with marine-origin polysaccharides and were shown to activate human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). Within 20 h of incubation, the more sulfated coatings induced the HUVECS to the form tube-like structures accompanied by an increased expression of angiogenicassociated genes, such as angiopoietin-1 and VEGF A. This may be a cost-effective approach to modify 2D/3D constructs to instruct angiogenic cells towards the formation of neo-vascularization, driven by multiple and synergistic stimulations from the PL combined with sulfated polysaccharides. Statement of Significance The presence, or fast induction, of a stable and mature vasculature inside 3D constructs is crucial for new tissue formation and its viability. This has been one of the major tissue engineering challenges, limiting the dimensions of efficient tissue constructs. Many approaches based on cells, growth factors, 3D bioprinting and channel incorporation have been proposed. Herein, we explored a versatile technique, layer-by-layer assembling in combination with platelet lysate (PL), that is a cost-effective source of many potent pro-angiogenic proteins and growth factors. Results suggest that the combination of PL with sulfated polyelectrolytes might be used to introduce interfaces onto 2D/3D constructs with potential to induce the formation of cell-based tubular structures.

An overview of the brewing process

The first chapter of this book has an introductory character, which discusses the basics of brewing. This includes not only the essential ingredients of beer, but also the steps in the process that transforms the raw materials (grains, hops) into fermented and maturated beer. Special attention is given to the processes involving an organized action of enzymes, which convert the polymeric macromolecules present in malt (such as proteins and polysaccharides) into simple sugars and amino acids; making them available/assimilable for the yeast during fermentation.

Diseño y simulación numérica de un biorreactor: Aplicación a la producción de células microbianas

Los biorreactores son ampliamente empleados en las industrias de alimentos, fermentación, farmacéuticas y tratamiento de residuos. (...) Una característica de los biorreactores es que el medio de reacción está constituido por distintas fases. Esto hace que exista una importante interrelación entre los fenómenos bioquímicos, fisicoquímicos, fuidodinámicos y de transporte. (...) La experimentación preliminar en reactores de laboratorio, acompañada con el desarrollo de un modelo que permita comprender la naturaleza del fenómeno, es esencial para el diseño de biorreactores de capacidad de producción comercial. En el presente proyecto se establecerán, a partir de un estudio experimental a escala de laboratorio y la elaboración de un modelo y programa de simulación numérica de su operación, los factores que determinan la problemática del diseño de un reactor tanque agitado, de capacidad comercial, para la producción de cepas de Staphylococcus aureus. Los objetivos generales del presente proyecto son los siguientes: * Generar las bases técnico-científicas que permitan el diseño de un biorreactor discontinuo para la producción a escala comercial de cepas de Staphylococcus aureus. * Desarrollar equipos experimentales y generar herramientas computacionales que en el futuro permitan abordar otros problemas en el campo de la bioingeniería. Los objetivos específicos a alcanzar durante el período que abarca este proyecto de un año son los siguientes: * Determinar la cinética de crecimiento de cepas de S. aureus que contemplen la formación de productos. * Verificar el funcionamiento y calibración de sensores y controladores que forman parte del biorreactor experimental recientemente adquirido. * Estudiar experimentalmente la producción de S. aureus en un biorreactor de 3 lt. de capacidad, cuantificando el consumo de sustratos y la producción de biomasa, polisacárido capsular y exoproteínas. * Continuar con el desarrollo de un modelo matemático y un programa de simulación numérica que permitan describir la operación del reactor experimental y definir la problemática del escalado de la producción a nivel comercial.

Regulación de la función de macrófagos por Cryptococcus neoformans y Cryptococcus gattii y su participación en la generación de la inmunidad adaptativa antifúngica. Regulation of macrophage function by Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii and their role in the antifungal adaptative immunity.

La criptococosis es causada por la inhalación de levaduras encapsuladas de Cryptococcus neoformans o Cryptococcus gattii. Representa una de las tres infecciones graves por oportunistas en pacientes con SIDA y existe aproximadamente un 6 por ciento de incidencia de criptococosis clínica en pacientes con transplante de órganos sólidos. Estas dos especies difieren la fisiopatogenia durante la infección. El factor de virulencia principal de Cryptococcus sp. es la presencia del polisacárido capsular, glucuronoxilomanano (GXM), de alto peso molecular, que es continuamente secretado por las levaduras. Los macrófagos son células centrales en la respuesta innata al hongo, los cuales deben ser activados por linfocitos T helper 1 para un eficiente control de la infección. Sin embargo, estas células también son suceptibles al parasitismo intracelular, permitiendo la infección persistente y la diseminación a sitios extrapulmonares. Este proyecto propone investigar la capacidad de levaduras de C. neoformans, C. gattii y de los polisacáridos capsulares para modular la respuesta proinflamatoria de los macrófagos. Queremos estudiar si el tratamiento de macrófagos con levaduras o polisacárido puede inducir perfiles supresores de la respuesta protectiva T helper 1, tales como linfocitos T helper 2 o T reguladores, favoreciendo la sobrevida intracelular del hongo. Además, pensamos que C. neoformans o C. gattii podrían inducir un activación diferencial de macrófagos lo que condicionaría la respuesta adaptativa, lo que podría explicar las diferencias en la fisiopatogenia de estas dos especies. Procedimientos experimentales -Microorganismos y obtención de GXM: se trabajará con C. neoformans variedad grubii, cepa ATCC 62067 y C. gattii serotipo B, cepa NIH112B. Se obtendrán polisacáridos capsulares (GXM) de C. neoformans y C. gattii por precipitación con etanol y y acomplejamiento selectivo con CTAB. - Obtención de macrófagos murinos y cultivos celulares: se obtendrán macrófagos por lavados peritoneales y/o alveolares de ratones BALB/c. Los macrófagos se cultivarán por 24 h en ausencia o presencia de levaduras muertas o vivas (sin opsonizar u opsonizadas) de C. neoformans o C. gattii o en presencia de GXM purificado. -Objetivo 1. Estudio de la modulación de las propiedades proinflamatorias de Mac: en sobrenadantes de los cultivos se medirán las citoquinas por ELISA de captura y en lisados celulares, la expresión de las enzimas (iNOS, arginasa, IDO) por western blot. Se analizará por citometría de flujo la expresión de MCHII y moléculas CD80, CD86, CD40, CTLA-4. -Objetivo 2. Estudios in vitro de la capacidad de macrófagos tratados con levaduras o GXM para inducir linfocitos Th1, Th2 o Treg: los macrófagos preincubados con GXM o levaduras, se incubarán con linfocitos autólogos estimulados con anti-CD3. Se medirá la proliferación celular y el perfil de citoquinas por citomtría de flujo. Células T CD4+ CD25- serán purificadas de suspenciones esplénicas de ratones normales. Luego las células serán incubadas con macrófagos (sin tratar o tratados con levaduras o GXM) y estimulados con anti-CD3. Se analizará la proliferación celular con CFSE y expresión de CD4, CD25 y Foxp3 . - Objetivo 3. Estudios in vivo de la capacidad de levaduras o GXM para inducir linfocitos Th1, Th2 o Treg . Rol de los macrófagos in vivo: Los ratones serán inyectados con 100000 levaduras o con 200 µg de GXM puro vía endovenosa y luego de 7, 14, 30 y 40 días se evaluarán las poblaciones celulares de bazo, por citometría de flujo usando marcaciones simultáneas para CD4, CD8, CD25, Foxp3 y citoquinas intracelulares. Para investigar la participación in vivo de los macrófagos, se depletaran estas células inyectando los animales con PBS-liposomas o clodronato (DMDP)-liposomas por vía endovenosa o inhalatoria (200- 300 µl por ratón). Luego de 24 h, los animales se infectarán con levaduras o inocularán con GXM y se evaluarán los perfiles de células T esplénicos o de nódulos linfaticos.

Dinámica poblacional de Streptococcus mutans en niños de edad escolar de la provincia de Córdoba. Population dynamics of Streptococcus mutans in school age children in the province of Córdoba

La caries dental es una enfermedad infecciosa, crónica y trasmisible, que se caracteriza por la desmineralización de los tejidos duros del diente, producida por la acción de los ácidos resultantes de la actividad metabólica del biofilm desarrollado sobre los dientes. Si bien, la etiología de la caries sería polimicrobiana, los estreptococos del grupo mutans son señalados como los principales protagonistas en el inicio de la lesión cariosa. En la pared celular se destacan proteínas que participan en procesos de adhesión, agregación y co-agregación, además de polisacáridos que muestran distintas especificidades antigénicas, lo que permite distinguir cuatro serotipos: c, e, f y k. Es escasa la información de las características antigénicas de las cepas circulantes de estreptococos del grupo mutans y se desconoce la relación de las mismas con la actividad de caries. En este estudio nuestros objetivos son identificar y caracterizar fenotípica y genotípicamente las cepas de estreptococos del grupo mutans circulantes en la provincia de Córdoba. La población de estudio estará constituida por escolares, urbano–marginales de la capital y del interior de la provincia. Se determinarán los serotipos de las mismas a través de de amplificaciones por PCR de tipo multiplex y luego se secuenciarán 8 genes a través de la técnica de tipado multilocus, con el fin de realizar estudios de sistemática molecular, y de estimar la estructura genética de S. mutans. Una vez que se hayan caracterizado los patrones de diversidad y distribución geográfica de S. mutans del centro de Argentina, se intentará dilucidar cómo se relacionan la diversidad genética con la experiencia de caries de los niños del estudio. Se analizarán de forma conjunta nuestros resultados con los publicados por otros autores. De esta forma se logrará una mejor comprensión de los factores históricos y ecológicos que han moldeado su distribución y aportar conocimientos a la sistemática del grupo “mutans” en relación a otras bacterias del género Streptococcus. Dental caries is an infectious, chronic and transmissible disease, characterized by demineralization of the hard tissues of the teeth, produced by the action of acids resulting from the metabolic activity of biofilm developed on the teeth. Although the etiology of caries would be polymicrobial, the streptococci of the mutans group are identified as the major responsible in the initiation of the carious lesion. In the cell wall there are proteins involved in adhesion, aggregation and co-aggregation processes, as well as polysaccharides that present different antigenic specificities, which allow the distinction of four serotypes c, e, f and k. There is little information about the antigenic characteristics of the Streptococcus mutans strains and the relationship of those characteristics with the caries activity is unknown. In the present study our goals are to identify and characterize the phenotypic and genotypic strains of streptococci of the mutans group circulating in the province of Cordoba. The study population will consist of urban and rural scholar children from Cordoba city and from the interior of the province. In order to study the molecular systematic, and the genetic structure of S. mutans, different serotypes will be determined by multiplex PCR amplifications and eight genes will be sequenced by using the multilocus typing technique. Once the diversity and the geographical distribution patterns of S. mutans from the center of Argentina is characterized, we will attempt to clarify how the genetic diversity is related with the caries experience in the children of the study. Our results will be analyzed together with those published by other authors. This will achieve a better understanding of the historical and ecological factors that shaped the bacteria’s distribution and will contribute to the knowledge of the systematic of the mutans group in relation to other bacteria of the genus Streptococcus.