Étude sur l'utilisation de liquides ioniques à base imidazolium pour l'extraction sélective de phosphopeptides

La phosphorylation des protéines constitue l’une des plus importantes modifications post-traductionnelles (PTMs) et intervient dans de multiples processus physiologiques tels, la croissance, la différenciation cellulaire, l’apoptose, etc. En dépit de son importance, l’analyse des phosphoprotéines demeure une tâche difficile en raison de leur nature dynamique (car la phosphorylation des protéines est un processus réversible) et de leur faible abondance relative. En effet, la détermination des sites de phosphorylation est souvent difficile car les phosphopeptides sont souvent difficiles à détecter par des méthodes d’analyse chromatographique classique et par spectrométrie de masse (MS). De récentes études ont démontré que les nombreuses méthodes d’enrichissement de phosphopeptides existantes ne sont pas complètes, et que le nombre total de phosphopeptides détectés ne chevauchent pas complètement ces méthodes. C’est pour cela qu’il existe une nécessité de combler les lacunes des méthodes d’enrichissement existantes afin d’avoir des analyses phosphoprotéomiques plus complètes. Dans cette étude, nous avons utilisé les liquides ioniques (LI), plus particulièrement les sels d’imidazolium, comme une technique d’enrichissement alternative, dans le but de favoriser une extraction sélective de phosphopeptides présents en solution. Les sels d’imidazolium ont donc été utilisés en raison de leurs propriétés physico-chimiques "facilement" ajustables selon la nature des substituants sur le noyau imidazolium et la nature de l’anion. Les sels de monoimidazolium et de bis-imidazolium possédant respectivement des chaînes linéaires à 4, 12 et 16 atomes de carbone et ayant différents anions ont été synthétisés et utilisés pour effectuer des extractions liquide-liquide et solide-liquide des phosphopeptides en solution. Dans un premier temps, des extractions liquide-liquide ont été réalisées en utilisant un liquide ionique (LI) ayant une chaine linéaire de 4 atomes de carbone. Ces extractions réalisées avec le bis(trifluoromethanesulfonyl) amide de 3-butyl-1-methylimidazolium (BMIM-NTf2) et l’hexafluorophosphate de 3-butyl-1-methylimidazolium (BMIM-PF6) n’ont pas montré une extraction notable du PPS comparativement au PN. Dans un deuxième temps, des extractions solide-liquide ont été réalisées en fonctionnalisant des particules solides avec des sels d’imidazolium possédant des chaines linéaires de 12 ou 16 atomes de carbone. Ces extractions ont été faites en utilisant un phosphopentapeptide Ac-Ile-pTyr-Gly-Glu-Phe-NH2 (PPS) en présence de 2 analogues acides non-phosphorylés. Il a été démontré que les sels d’imidazolium à chaine C12 étaient meilleurs pour extraire le PPS que les deux autres peptides PN (Ac-Ile-Tyr-Gly-Glu-Phe-NH2) et PE (Ac-Glu-Tyr-Gly-Glu-Phe-NH2) L’électrophorèse capillaire (CE) et la chromatographie liquide à haute performance couplée à la spectrométrie de masse (LC-MS) ont été utilisées pour quantifier le mélange des trois peptides avant et après extraction ; dans le but de mesurer la sélectivité et l’efficacité d’extraction de ces peptides par rapport à la composition chimique du liquide ionique utilisé.

Caractérisation phénotypique et génotypique de Campylobacter jejuni et évaluation d’une stratégie de contrôle de la colonisation du poulet de chair par ce pathogène alimentaire

Campylobacter jejuni est l’agent causal de la campylobactériose, infection bactérienne importante en santé publique. Un des vecteurs de transmission de C. jejuni pour l’humain est le poulet via la chaîne alimentaire. Les mécanismes impliqués dans colonisation caecale commensale des oiseaux par C. jejuni sont toujours peu caractérisés, bien qu’une meilleure compréhension de ces mécanismes puisse apporter des solutions pour le contrôle du pathogène à la ferme. Cette étude avait pour buts de caractériser les propriétés phénotypiques et les facteurs génétiques impliqués dans la colonisation du poulet par C. jejuni et d’identifier de nouveaux mécanismes impliqués dans cette association. Des souches, issues d’élevages conventionnels échantillonnés en 2003 et en 2008 ainsi que d’élevages biologiques, ont été caractérisées afin d’obtenir leur profil de résistance aux antibiotiques, leur autoagglutination et leur chimiotactisme. Les souches des élevages conventionnels ont de plus été caractérisées pour leur capacité à adhérer et envahir une culture primaire de cellules caecales de poulet. Une puce à ADN a été développée pour détecter la présence de 254 gènes et variants associés à la colonisation des poulets ainsi qu’à la résistance aux antibiotiques chez les souches issues d’élevages conventionnels. Les propriétés phénotypiques et la présence de certains gènes chez les souches ont par la suite été comparées. Finalement, des souches ayant des caractéristiques différentes ont été utilisées dans un modèle de colonisation du poulet pour évaluer l’efficacité d’un nouvel additif alimentaire à base d’acides organiques et d’huiles essentielles sur le contrôle de C. jejuni. Les propriétés phénotypiques des souches étaient très variées et n’étaient pas corrélées entre elles, à l’exception de l’adhésion et de l’invasion. L’analyse génétique a révélé que le contenu en gènes des souches était variable, notamment au niveau des gènes de l’enveloppe bactérienne, au flagelle, aux récepteurs du chimiotactisme et à la résistance à l’arsenic. Les souches de 2003 et de 2008 étaient semblables lorsque leur contenu en gènes ainsi que leurs propriétés phénotypiques étaient comparés. Des gènes possiblement associés à un fort ou un faible potentiel de colonisation ont été identifiés. L’additif alimentaire a diminué la contamination des carcasses bien qu’une augmentation de la colonisation intestinale ait été observée pour certaines souches. La moitié des lots de poulets d’origine biologique étaient positifs pour C. jejuni. Les souches issues de ce type d’élevage étaient peu résistantes aux antibiotiques et possédaient des phénotypes variés. Cette étude a permis de mieux définir les caractéristiques importantes de C. jejuni qui sont associées à la colonisation intestinale du poulet. Elle a établi pour la première fois au Canada la présence du pathogène dans les élevages de poulets biologiques. Cette étude fait partie des quelques études qui décrivent la présence des gènes de colonisation et de résistance aux antibiotiques dans une collection de souches issues uniquement du poulet. Elle a également remis en doute l’importance de certains gènes dans la colonisation. La caractérisation exhaustive des souches a également permis d’identifier de nouveaux gènes possiblement associés à la colonisation de poulet par C. jejuni. Finalement, elle a indiqué que l’utilisation d’un mélange d’huiles essentielles et d’acide organique encapsulés pouvait être efficace pour réduire la contamination des carcasses de poulet par C. jejuni et que son effet était souche-dépendant.

Étude de la dynamique des interactions des constituants du complexe de biosynthèse et d’insertion de la sélénocystéine dans la traduction des sélénoprotéines in vivo

Les sélénoprotéines sont des protéines auxquelles des sélénocystéines, soit le 21e acide aminé, sont incorporées durant leur traduction. Plus précisément, la sélénocystéine (Sec) est un dérivé métabolique de la sérine, mais structurellement équivalent à une cystéine dont on a remplacé l'atome de soufre par du sélénium. Elle se distingue des autres acides aminés puisqu’elle possède sa propre synthétase qui sert à convertir la sérine en Sec alors que le résidu est déjà fixé à l’ARNt. La position d’une Sec sur l’ARNm est indiquée par le codon UGA étant habituellement un signal STOP introduisant le concept de recoding. Grâce à une machinerie métabolique spécifique à l'ARNtSec et à la présence d’un SecIS (Selenocystein Insertion Sequence) sur l’ARNm, ce codon permet la présence d'une Sec dans la protéine. Il est connu que la synthèse débute avec l’acétylation de l’ARNt[Ser]Sec par la seryl-ARNt synthétase (SerRS) afin de donner la seryl-ARNt[Ser]Sec. Cette dernière est subséquemment phosphorylée par l’O-phosphoséryl-ARNt[Ser]Sec kinase (PSTK) qui donnera l’O-phosphoséryl-ARNt[Ser]Sec. Par la suite, un complexe de plusieurs protéines et cofacteurs, agissant comme machinerie pour l’incorporation des Sec durant la traduction, s’associe avec l’ARNt[Ser]Sec puis l’ARNm et, finalement, les composantes du ribosome. Parmi ces protéines, SepSecS catalyse l’étape finale de la synthèse des Sec en convertissant le O-phosphoseryl-ARNt[Ser]Sec en selenocysteinyl-ARNt[Ser]Sec utilisant le sélénophosphate comme source de sélénium. Des études récentes montrent que l’association avec SECp43 serait nécessaire pour que SepSecS joue son rôle et soit ségrégée au noyau pour s’associer à la machinerie de biosynthèse des sélénoprotéines, soit le complexe moléculaire qui reconnaît le codon UGA. Parmi les protéines de la machinerie de biosynthèse des sélénoprotéines que nous avons analysées, il y a eEFSec, RPL30, SPS2, SPS1, SBP2 et NSEP1. Nos résultats d’analyse de la dynamique de l’interaction entre les constituants de la machinerie de biosynthèse et d’incorporation des Sec, confirment plusieurs données de la littérature, mais remettent en question le modèle jusqu’à maintenant établi. Une meilleure compréhension de la dynamique des interactions entre ses constituants et la régulation de cette dynamique permet d’émettre des hypothèses quant au rôle de la machinerie de biosynthèse des sélénoprotéines et de l’importance de sa complexité. Nous avons analysé les interactions in vivo dans des cellules HEK293T au moyen de la technique de Protein-Fragment Complementation Assay (PCA) en couplant, par un clonage moléculaire, les gènes de chacune des protéines d’intérêt avec des fragments des gènes de la protéine luciférase (hRluc). Nous avons ainsi réalisé une fusion en N-terminal et en C-terminal des fragments de luciférase pour chacune des protéines d’intérêt. Puis, nous avons analysé la dynamique des interactions avec les composantes de la machinerie de biosynthèse des Sec. D’autres travaux seront essentiels afin de bâtir sur les résultats présentés dans cette recherche.

Rôle et implication du système cannabinoïde dans la modulation périphérique de la douleur inflammatoire et neuropathique

Les dérivés de l’opium (opioïdes) et du cannabis (cannabinoïdes) présentent de nombreuses propriétés intéressantes. Suite à l’identification de leurs récepteurs respectifs, diverses stratégies pharmacologiques ont tenté d’exploiter leurs propriétés analgésiques. Le clonage des récepteurs cannabinoïdes CB1 et CB2 a favorisé la découverte de composés endogènes pour ces récepteurs, les endocannabinoïdes, dont les deux plus étudiés sont l’anandamide et le 2-arachidonyl glycérol (2-AG). Cette découverte a également mené à l’identification d’enzymes qui catalysent l’inactivation de ces cannabinoïdes endogènes : une amidohydrolase des acides gras ou FAAH ainsi qu’une monoacylglycérol lipase ou MAGL. Le système cannabinoïde endogène est régulé à la hausse dans une variété de processus pathologiques, tels que les douleurs inflammatoire et neuropathique. Cette augmentation est habituellement interprétée comme une réaction physiologique visant à rétablir l’homéostasie et elle a notamment été observée en périphérie. Les endocannabinoïdes semblent donc agir de façon spécifique à des moments clés dans certains tissus ciblés afin de minimiser les conséquences reliées au déclenchement de ces douleurs. Cette observation est très intéressante d’un point de vue thérapeutique puisqu’elle suggère la possibilité de cibler les enzymes de dégradation des endocannabinoïdes dans le but d’augmenter leurs concentrations locales et d’ainsi prolonger leur action neuromodulatrice. En périphérie, l’activation des récepteurs cannabinoïdes induit des effets antinociceptifs bénéfiques tout en minimisant les effets indésirables souvent associés à leur activation centrale. Nous avons orienté nos travaux vers la modulation périphérique de ce système endogène à l’aide d’inhibiteurs des enzymes de dégradation des endocannabinoïdes afin d’évaluer leur potentiel thérapeutique et d’élucider les mécanismes d’action qui sous-tendent leurs effets dans des modèles animaux de douleurs inflammatoire et neuropathique. Nous avons démontré que cette approche permet de soulager les symptômes associés à ces deux types de douleurs, et ce via les récepteurs CB1 et CB2. Les systèmes cannabinoïde et opioïde présentent des similitudes, dont des localisations similaires le long des voies de la douleur, des mécanismes d’action relayés par des récepteurs couplés aux protéines G et des propriétés pharmacologiques communes telles que l’analgésie. Le système opioïde est impliqué dans les effets antinociceptifs induits par les cannabinoïdes. À l’inverse, le rôle joué par le système cannabinoïde dans ceux induits par la morphine demeure incertain. Nous avons démontré que les effets antinociceptifs périphériques et spinaux produits par la morphine sont diminués chez les souris génétiquement modifiées chez lesquelles l’expression des récepteurs CB1 ou CB2 a été éliminée, laissant supposer un rôle pour ces récepteurs dans les effets de la morphine. Nous avons de plus démontré que la diminution de l'analgésie produite par la morphine dans ces souris n'est pas causée par un dysfonctionnement des récepteurs opioïdes mu (MOP) ni par une régulation à la baisse de ces récepteurs. Nos résultats confirment l'existence d'interactions fonctionnelles entre les systèmes cannabinoïde et opioïde au niveau périphérique et spinal. Ces observations sont prometteuses d’un point de vue thérapeutique puisqu’une modulation périphérique ciblée des niveaux d’endocannabinoïdes et d’opioïdes endogènes permettrait de produire des effets analgésiques bénéfiques potentiellement synergiques tout en minimisant les effets indésirables associés à l’activation centrale de ces systèmes.

Traitement de l'arthrose canine : étude d'efficacité d'une diète riche en moule verte (Perna canaliculus) et validité des méthodes cliniques d'évaluation de l'effet traitement

Introduction: L’arthrose est une maladie fréquente chez le chien. Même si des traitements palliatifs ont prouvé leur efficacité pour soulager les signes cliniques associés, aucun n’a permis de restaurer la structure des cartilages ou la fonction des patients. De nouvelles modalités de traitement sont proposées mais très peu d’évidences existent quant à leur efficacité. Un problème récurrent pour apporter plus d’évidence est le manque d’outils d’évaluation dûment validés. Objectif: Evaluer l’efficacité d’une diète contenant de la moule verte, ainsi que la validité de différentes méthodes pour évaluer les effets de ce traitement sur la condition arthrosique de chiens de propriétaire. Méthodes: Une étude prospective croisée contrôlée en aveugle a été conduite sur 30 chiens de propriétaires. Leur condition était stable et non traitée. Ils ont reçu une diète contrôle pendant 30 jours puis la diète thérapeutique pendant 60 jours. A J0 (inclusion), J30 (fin de la période contrôle) et J90 (fin du traitement), les concentrations plasmatiques en acides gras ω–3 (EPA et DHA), le pic de force verticale (PVF – critère de référence), un questionnaire multifactoriel standardisé (MFQ), et la conductance électrodermique (EDA) ont été mesurés. Deux fois par semaine, les propriétaires remplissaient un questionnaire sur la fonction spécifique à leur animal (CODI). L’activité locomotrice (actimétrie) a été enregistrée en continu sur 7 chiens. Résultats: Aucun effet secondaire n’a été documenté excepté une augmentation du poids des chiens durant la période traitement. La localisation -thoracique ou pelvienne- du membre étudié et le poids ont interagi avec PVF. Les taux d’EPA et DHA ont augmenté durant la période traitement (p=0.026 et p<0.001, respectivement), tout comme PVF corrigé pour l’effet du poids et de la localisation du membre (p=0.003). La validité technique de PVF a été vérifiée. La validité technique et selon-critère du CODI ont été vérifiées. MFQ n’a pas montré d’homogénéité suffisante entre ses différents composants, bien que les résultats du composite convergent partiellement avec PVF. L’EDA n’a pas montré de validité technique suffisante. L’actimétrie a montré une validité technique satisfaisante ainsi que des résultats convergeant avec ceux de PVF. Conclusions: La méthode choisie comme référence a montré un effet bénéfique de la diète testée et sa validité technique a été vérifiée. À la fois, CODI et l’actimétrie ont été validés. La validité d’EDA et de MFQ a été remise en question. L’actimétrie a donné des résultats prometteurs, probablement complémentaires de PVF.

Evaluation des liens entre l’indice de la qualité alimentaire globale C-HEI, des paramètres nutritionnels et anthropométriques et des indicateurs de santé dans la cohorte «NuAge»

Introduction: Plusieurs indices de qualité alimentaire globale ont été élaborés en misant sur la consommation de certains nutriments ou aliments, ou des groupes d’aliments. Les indices de la qualité alimentaire globale sont en mesure d’évaluer de manière intégrée les aspects recherchés d’une bonne alimentation. C’est dans ce cadre que le Canadian Healthy Eating Index (C-HEI) a été développé pour évaluer le degré auquel les apports alimentaires des individus rencontrent les consignes du guide alimentaire canadien et les Recommandations nutritionnelles canadiennes. Objectif: Evaluer les liens entre l’indice de la qualité alimentaire globale C-HEI calculé à partir de la moyenne de trois rappels alimentaires de 24 heures et des paramètres nutritionnels, anthropométriques et des indicateurs de santé au recrutement (T1) dans l’étude longitudinale québécoise sur la nutrition et le vieillissement réussi (NuAge). Méthodologie: Des analyses bivariées (coefficients de corrélation, tableaux croisés et la statistique khi deux) ont été réalisées afin de déterminer les associations entre le score total C-HEI et certaines variables nutritionnelles, anthropométriques et le nombre de maladies chroniques. Résultats et discussion: Les participants ont rencontré ou dépassé la plupart de leurs apports nutritionnels de référence. Le C-HEI n’a pas été fortement corrélé aux nutriments individuels (rs= 0,14-0,52, p<0,01). Le C-HEI total était significativement associé aux recommandations canadiennes pour l’apport en fibres (rs= 0,51), le % d’énergie provenant des lipides (rs=-0,60) et des acides gras saturés (rs= -0,59), p<0,01. De plus, la suffisance en protéines et en énergie est augmentée lorsqu’on passait du Q1 (plus faible) à Q4 (plus élevé) du C-HEI (p<0,05). De même, les proportions des sujets ayant des mesures anthropométriques associées aux risques accrus pour la santé sont diminuées en passant du Q1 au Q4 (p<0,05), témoignant ainsi des liens entre une alimentation de bonne qualité et la protection des risques de santé associés à l’embonpoint et à l’obésité. Conclusion : Les résultats de cette recherche ont fourni des preuves additionnelles sur le lien entre le score C-HEI et certains paramètres nutritionnels et anthropométriques d’intérêt, et ce, provenant des données alimentaires quantitatives colligées au sein d’une population âgée vivant dans la communauté.

Rôle de la ghréline dans la régulation du coactivateur transcriptionnel PGC-1alpha

L’adaptation de l’organisme à son environnement est essentielle à sa survie. L’homéostasie énergétique permet l’équilibre entre les apports, les dépenses et le stockage d’énergie. Un surplus calorique important dérègle ce processus et mène au développement du syndrome métabolique caractérisé, entre autres, par une obésité, un diabète de type II, des maladies cardiovasculaires et des dyslipidémies. La ghréline participe au maintien de l’équilibre énergétique durant le jeûne en stimulant la production de glucose par le foie et le stockage lipidique dans le tissu adipeux. Le coactivateur transcriptionnel PGC-1alpha, surexprimé en situation de jeûne, est impliqué dans l’induction de la production de glucose par le foie et l’oxydation des acides gras. Notre hypothèse est que ces deux acteurs clés du métabolisme énergétique constituent un axe de régulation commun. Dans cette étude, nous montrons que la ghréline participe à la régulation de PGC-1alpha. Son récepteur GHS-R1a, possédant une forte activité constitutive, est également impliqué de façon indépendante au ligand. GHS-R1a réduit l’activité transcriptionnelle de PGC-1alpha tandis que l’ajout du ligand inverse modérément cette action. L’effet de GHS-R1a corrèle avec l’acétylation de PGC-1alpha qui est fortement augmentée de façon dose-dépendante. La stabilité de PGC-1alpha est également augmentée par le GHS-R1a indépendamment de l’ubiquitine. La ghréline diminue la capacité de PGC-1alpha à lier PPARbeta, un récepteur nucléaire partenaire de PGC-1alpha. De plus, la ghréline réduit, de façon ligand-dépendante, la capacité de coactivation de PGC-1alpha sur PPARbeta dans les hépatocytes. L’ensemble de ces résultats identifie PGC-1alpha comme cible du signal de la ghréline et suggère un axe de régulation ghréline/PGC-1alpha/PPARbeta.Une meilleure compréhension de cet axe de régulation va permettre la mise en évidence de nouvelles cibles thérapeutiques pour faire face aux pathologies associées au syndrome métabolique.

Le rôle de la dysrégulation du métabolisme du cholestérol par le retrait des estrogènes sur la stéatose hépatique

Les estrogènes confèrent aux femmes une protection cardiovasculaire jusqu’à la ménopause. En effet, la perte des fonctions ovariennes engendre plusieurs désordres du profil lipidique qui s’accompagnent d’une accumulation de triglycérides au foie appelée stéatose hépatique. Le retrait des estrogènes perturbe de nombreuses voies de contrôle de la cholestérolémie, provoquant simultanément une hypercholestérolémie et une stéatose hépatiques. Toutefois, à ce jour, les mécanismes d’action du retrait des estrogènes sur le métabolisme du cholestérol favorisant le stockage de triglycérides au foie demeurent imprécis. À cet égard, les travaux de cette thèse visaient à clarifier l’ensemble des effets du retrait des estrogènes sur le métabolisme du cholestérol pouvant mener à la pathogenèse de la stéatose hépatique. Lors de la première étude, l’ovariectomie (Ovx) chez la rate, un modèle bien établi de la stéatose, avait permis d’identifier la voie d’assemblage des lipoprotéines à très faible densité (VLDL) comme élément contributif à la stéatose. La voie des VLDL reliant étant également une voie de transport du cholestérol, l’étude suivante a été réalisée afin de comprendre le rôle du cholestérol alimentaire sur les lipides hépatiques. Dans cette deuxième étude, le modèle de la diète riche en lipides et en cholestérol (HFHC), aussi reconnu pour induire une stéatose hépatique, a permis d’établir des liens étroits entre le métabolisme du cholestérol et celui des lipides hépatiques. Étonnamment, de manière similaire à l’Ovx, la diète HFHC perturbait la voie d’assemblage des VLDL. En outre, les données recueillies au cours de ces travaux indiquaient qu’une dysrégulation du métabolisme des acides biliaires avait contribué à la sévérité de la stéatose hépatique induite par cette diète HFHC. Dans la continuité de ces deux premiers projets, nous nous sommes intéressés aux effets concomitants du retrait des estrogènes et d’une diète HFHC sur la stéatose hépatique. De manière intéressante, lorsque combinés, l’Ovx et la diète HFHC potentialisaient non seulement l’accumulation de lipides hépatiques, mais également les perturbations moléculaires des voies sous-jacentes à la stéatose, dont l’assemblage des VLDL et de la sécrétion d’acides biliaires. Dans l’ensemble, les données présentées dans la revue de littérature et dans les trois études reliées à cette thèse indiquent qu’une dysrégulation du métabolisme du cholestérol en réponse au retrait des estrogènes entraîne des complications favorisant l’accumulation de lipides dans le foie.

Évolution moléculaire : un modèle Markov-modulé pour les processus de substitution

Les processus Markoviens continus en temps sont largement utilisés pour tenter d’expliquer l’évolution des séquences protéiques et nucléotidiques le long des phylogénies. Des modèles probabilistes reposant sur de telles hypothèses sont conçus pour satisfaire la non-homogénéité spatiale des contraintes fonctionnelles et environnementales agissant sur celles-ci. Récemment, des modèles Markov-modulés ont été introduits pour décrire les changements temporels dans les taux d’évolution site-spécifiques (hétérotachie). Des études ont d’autre part démontré que non seulement la force mais également la nature de la contrainte sélective agissant sur un site peut varier à travers le temps. Ici nous proposons de prendre en charge cette réalité évolutive avec un modèle Markov-modulé pour les protéines sous lequel les sites sont autorisés à modifier leurs préférences en acides aminés au cours du temps. L’estimation a posteriori des différents paramètres modulants du noyau stochastique avec les méthodes de Monte Carlo est un défi de taille que nous avons su relever partiellement grâce à la programmation parallèle. Des réglages computationnels sont par ailleurs envisagés pour accélérer la convergence vers l’optimum global de ce paysage multidimensionnel relativement complexe. Qualitativement, notre modèle semble être capable de saisir des signaux d’hétérogénéité temporelle à partir d’un jeu de données dont l’histoire évolutive est reconnue pour être riche en changements de régimes substitutionnels. Des tests de performance suggèrent de plus qu’il serait mieux ajusté aux données qu’un modèle équivalent homogène en temps. Néanmoins, les histoires substitutionnelles tirées de la distribution postérieure sont bruitées et restent difficilement interprétables du point de vue biologique.

Polymères de coordination et éponge cristalline : de nouveaux matériaux pour la conversion de l’énergie solaire et la résolution de la structure cristalline de composés huileux.

Le premier volet de ce travail portera sur l’expérience acquise lors d’un stage d’étude à Tokyo, au Japon, dans le groupe de recherche du Pr. Makoto Fujita, une sommité d’envergure internationale dans le domaine de l’auto-assemblage. En continuité avec les plus récents travaux du Pr. Fujita, des systèmes poreux auto-assemblés présentant des cavités fonctionnalisées ont été développés dans le but d’encapsuler des acides gras afin d’en déterminer la structure cristalline. Ces éponges ont été caractérisées par des techniques courantes telles que la spectroscopie à résonance magnétique nucléaire 1H, 13C{1H} et Cosy, la spectrométrie de masse, l’analyse élémentaire, la microscopie optique infrarouge ainsi que la diffraction des rayons X. Une autre approche employée pour obtenir de meilleures propriétés spectroscopiques fut la synthèse de dendrimères métalliques de génération 0. Un nouveau ligand de type 1,3,5-triazine a été synthétisé par une réaction typique de cyclisation de nitrile en présence catalytique d’hydrure de sodium. Des espèces mono-, bis- et trinucléaire de Ru(II) furent synthétisés ainsi que deux espèces hétérométalliques de Ru(II)/Pt(II) et de Ru(II)/Os(II). Tous les complexes obtenus furent caractérisés par spectroscopie à résonance magnétique nucléaire (1H, 13C{1H} et Cosy) à l’état liquide, par spectroscopie de masse à haute résolution et par analyse élémentaire. La génération de dihydrogène à partir de l’espèce hétérométallique a été étudiée. Les propriétés optiques et électroniques ont été analysées par spectroscopie UV-Vis, par analyse de la luminescence, du temps de vie de luminescence, par des analyses de rendement quantique ainsi que par des analyses de voltampérométrie cyclique à balayage. Finalement, dans le but d’améliorer les propriétés spectroscopiques d’absorption de complexes métalliques, nous avons synthétisé une série de polymères homo- et hétérométalliques, intégrant des ligands de type bis(2,2’:6,2’’-terpyridine). Les complexes générés furent caractérisés par diverses techniques tel que la spectroscopie à résonance magnétique nucléaire (1H, 13C{1H} et Cosy) à l’état liquide, par spectroscopie de masse à haute résolution ainsi que par analyse élémentaire. Les propriétés optiques et électroniques ont été analysées par spectroscopie UV-Vis, par analyse de la luminescence, du temps de vie de luminescence, par des analyses de rendement quantique ainsi que par des analyses de voltampérométrie cyclique à balayage.

Carence en œstrogènes et bases moléculaires du métabolisme des triglycérides et du cholestérol dans le foie et l'intestin : effet de l'exercice physique

La stéatose hépatique et la détérioration du profil lipidique plasmatique sont des pathologies métaboliques favorisées par la carence œstrogénique post-ménopausique. Cependant les mécanismes à la base de ces pathologies n’ont été que très peu étudiés. Le but de cette thèse a été d’investiguer les mécanismes moléculaires possibles à l’origine de l’hypercholestérolémie et de l’accumulation des lipides (triglycérides : TG et cholestérol) dans le foie en utilisant un modèle animal de la ménopause, la rate Sprague Dawley ovariectomisée (Ovx). Nous avons également examiné si le changement des habitudes de vie comme la pratique de l’exercice physique pouvait prévenir ou corriger les modifications induites par l’Ovx. Enfin, rosuvastatine (statine) a été utilisée comme thérapie pharmacologique de l’hypercholestérolémie dans le but de comprendre son effet au niveau moléculaire chez la rate Ovx. L’objectif de la première étude était de déterminer comment l’Ovx peut affecter les niveaux de TG et de cholestérol dans le foie des rates nourries avec une diète riche en lipides (HF : 42% gras). Les rates ont été soumises à la diète HF ou normale pendant 6 semaines avant d’être Ovx ou Sham (ovariectomie simulée), puis maintenues aux mêmes conditions diététiques pour 6 autres semaines. L’Ovx a provoqué une accumulation de TG dans le foie, mais pas la diète HF seule. Cependant, lorsque l’Ovx était combinée à la diète HF, l’accumulation des TG était beaucoup plus importante comparé à ce qui était observé chez les rates Ovx soumises à la diète normale. L’expression génique (ARNm) de CPT1 (Carnitine palmitoyltransferase 1), PGC1α (Peroxisome proliferator-activated receptor gamma, coactivator 1) et PPARα (Peroxysome proliferetor activated receptor alpha) intervenant dans l’oxydation des acides gras dans le foie était augmentée par la diète HF (p ˂ 0.001; p ˂ 0.01; p ˂ 0.05 respectivement) ; mais atténuée (p ˂ 0.05; p ˂ 0.05; p ˂ 0.07 respectivement) lorsque les rates ont été Ovx, favorisant ainsi l’accumulation des TG dans le foie. La combinaison de la diète HF à l’Ovx a également provoqué une hypercholestérolémie et une accumulation de cholestérol dans le foie malgré la diminution de l’expression de la HMGCoA-r (3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase), enzyme clé de la synthèse du cholestérol. Ceci était associé à l’inhibition de l’expression génique de CYP7a1 (Cytochrome P450, family 7, subfamily a, polypeptide 1), suggérant une diminution de la synthèse des acides biliaires. Ayant constaté dans la première étude que l’Ovx élevait les niveaux de cholestérol hépatique et plasmatique, nous nous sommes fixés comme objectif dans la deuxième étude d’évaluer les effets de l’Ovx sur l’expression génique des transporteurs et enzymes responsables du métabolisme du cholestérol et des acides biliaires dans le foie et l’intestin, et de vérifier si l’exercice sur tapis roulant pouvait prévenir ou corriger les changements causés par l’Ovx. L’hypercholestérolémie constatée chez les rates Ovx comparativement aux Sham était accompagnée de la diminution de l’expression génique des récepteurs des LDL (R-LDL), des résidus de lipoprotéines (LRP1), de SREBP-2 (Sterol regulatory element binding protein 2) et de PCSK9 (Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9) dans le foie, suggérant une défaillance dans la clairance des lipoprotéines plasmatiques. L’Ovx a aussi inhibé l’expression génique de la MTP (Microsomal triglyceride transfer protein) et stimulé celle de SR-B1 (Scavenger receptor class B, member 1); mais aucun changement n’a été observé avec CYP7a1. Ces changements moléculaires pourraient par conséquent favoriser l’accumulation de cholestérol dans le foie. L’exercice physique n’a pas corrigé les modifications causées par l’Ovx sur l’expression génique de ces molécules au niveau hépatique à l’exception de SREBP-2. Par contre, au niveau intestinal (iléum), l’exercice sur tapis roulant a inhibé l’expression génique des marqueurs moléculaires intervenant dans l’absorption des acides biliaires (OSTα/β, FXR, RXRα, Fgf15) et du cholestérol (LXRα, NCP1L1) au niveau de l’iléum chez les rates Sham entraînées. Ces adaptations pourraient prévenir le développement de l’hypercholestérolémie protégeant en partie contre la survenue de l’athérosclérose. Au vue des effets délétères (hypercholestérolémie et diminution de l’expression du R-LDL, PCSK9, LRP1, SREBP-2 et HMGCOA-r dans le foie) causés par l’Ovx sur le métabolisme du cholestérol constatés dans l’étude 2, la 3ième étude a été conçue pour évaluer l’efficacité de rosuvastatine (Ros) sur l’expression génique de ces marqueurs moléculaires chez les rates Ovx sédentaires ou soumises à l’entraînement volontaire. Ros a été administrée aux rates Ovx pendant 21 jours par voie sous-cutanée à la dose de 5mg/kg/j à partir de la 9ième semaine après l’Ovx. Ros n’a pas diminué la concentration plasmatique de LDL-C et de TC chez les rates Ovx. Par contre, Ros a stimulé (P ˂ 0.05) l’expression génique de PCSK9, SREBP-2, LRP1, HMGCoA-r et ACAT2 (Acyl-CoA cholesterol acyltransferase) mais pas significativement (P = 0.3) celle du R-LDL dans le foie des rates Ovx sédentaires et entraînées. Ros n’a pas réduit la concentration plasmatique de LDL-C probablement à cause de l’induction plus importante de PCSK9 par rapport au R-LDL. Cependant, la stimulation de LRP1 par Ros protège partiellement contre la survenue des maladies cardiovasculaires. En conclusion, les études de cette thèse indiquent que la baisse du niveau des œstrogènes entraîne des changements radicaux du métabolisme hépatique des TG et du cholestérol provoqués par des altérations de l’expression des gènes clés des voies métaboliques associées.

Les mécanismes de régulation du métabolisme lipidique par les peptides QRFP (pyroglutamylated RF-amide peptides)

Plusieurs cibles thérapeutiques dans le développement de médicaments contre l’obésité visent une diminution de l’appétit et de la masse adipeuse et à augmenter la dépense énergétique. L’appétit et le métabolisme énergétique sont régulés par certains neuropeptides qui agissent au niveau du système nerveux central, notamment dans l’hypothalamus. Parmi ces neuropeptides, les peptides RF-amide ou QRFP (pyroglutamylated RF-amide peptides), ainsi nommés par la présence du motif conservé Arg-Phe-NH2 dans le domaine C-terminal, induisent une hyperphagie et une augmentation de la masse adipeuse lorsqu’administrés par voie centrale. Les formes bioactives de ces peptides comprennent principalement 43 (QRFP-43) et 26 (QRFP-26) acides aminés. Outre les peptides QRFP, leurs récepteurs, les GPR103 de la famille des récepteurs à 7 passages transmembranaires couplés aux protéines G, sont exprimés dans l’hypothalamus. Plus récemment, des études ont montré la sécrétion de ces neuropeptides, et la présence du GPR103, dans le tissu adipeux. Cependant, le rôle de la voie signalétique (QRFP/GPR103) dans la régulation du métabolisme lipidique au niveau périphérique est peu connu. Les travaux de cette thèse ont porté sur la caractérisation des effets adipogéniques périphériques des neuropeptides QRFP. En premier lieu, nos travaux ont montré que les adipocytes 3T3-L1 et les adipocytes murins isolés des dépôts adipeux blancs expriment le prépro-QRFP et uniquement le récepteur GPR103B, un des deux sous-types de récepteurs présents chez la souris. De plus, nous avons montré que l’expression du récepteur est régulée par une diète riche en lipides réduisant l’expression du prépro-QRFP, mais augmentant celle du GPR103B dans les dépôts lipidiques. Chez l’humain, les adipocytes de l’omentum expriment autant le GPR103 que le prépro-QRFP. Nous avons de plus étudié la fonctionnalité du GPR103B dans les adipocytes 3T3-L1 par l’utilisation d’ARN interférents. Nous avons observé que ce récepteur médie les effets adipogéniques des QRFPs en augmentant l’expression du récepteur nucléaire PPAR-gamma (peroxisome proliferator-activated receptor gamma) et le facteur de transcription C/EBP-alpha (CCAAT-enhancer binding protein alpha) résultant en une accumulation des triglycérides. Nous avons aussi mis en évidence les effets anti-lipolytiques des QRFPs. En effet, les QRFP inhibent fortement la lipolyse induite avec l’isoprotérénol. L’étude des mécanismes moléculaires à l’origine des effets anti-lipolytiques du QRFP-43 a montré l’activation de la voie de signalisation PI3-K/PKB (phosphatidylinositol 3-kinase/protéine kinase B) en réponse à la stimulation du GPR103B. La réponse anti-lipolytique induite par le QRFP-43 est associée à une diminution de la phosphorylation de la périlipine A (PLIN1a) et de la lipase hormono-sensible (HSL). Nos études ont élucidé les mécanismes conduisant à l’inhibition de la phosphorylation de la PLIN1a en réponse à l’activation du GPR103B, impliquant l’inhibition de la migration de la cavéoline 1 et de la sous unité catalytique de la protéine kinase A (PKA) au niveau des gouttelettes lipidiques, ainsi que l’inhibition de l’activité des Src kinases et de la protéine kinase C (PKC). En conclusion, nos travaux ont montré que les QRFP-43 et -26 exercent un effet adipogénique et anti-lipolytique dans les adipocytes, mettant ainsi en évidence le rôle des neuropeptides QRFPs dans la régulation du métabolisme lipidique au niveau adipocytaire.

Rôle de l'AmtB dans la régulation de la nitrogénase et la production d'hydrogène chez la bactérie Rhodobacter capsulatus

L’azote est l’élément le plus abondant dans l’atmosphère terrestre avec un pourcentage atteignant 78 %. Composant essentiel pour la biosynthèse des matériels organiques cellulaires, il est inutilisable sous sa forme diatomique (N2) très stable par la plupart des organismes. Seules les bactéries dites diazotrophiques comme Rhodobacter capsulatus sont capables de fixer l’azote moléculaire N2 par le biais de la synthèse d’une enzyme, la nitrogénase. Cette dernière catalyse la réduction du N2 en ammonium (NH4) qui peut alors être assimilé par d’autres organismes. La synthèse et l’activité de la nitrogénase consomment beaucoup d’énergie ce qui implique une régulation rigoureuse et son inhibition tant qu’une quantité suffisante d’ammonium est disponible. Parmi les protéines impliquées dans cette régulation, la protéine d’intérêt AmtB est un transporteur membranaire responsable de la perception et le transport de l’ammonium. Chez R. capsulatus, il a été démontré que suite à l’addition de l’ammonium, l’AmtB inhibe de façon réversible (switch off/switch on) l’activité de la nitrogénase en séquestrant la protéine PII GlnK accompagnée de l’ajout d’un groupement ADP ribose sur la sous unités Fe de l’enzyme par DraT. De plus, la formation de ce complexe à lui seul ne serait pas suffisant pour cette inactivation, ce qui suggère la séquestration d’une troisième protéine, DraG, afin d’inhiber son action qui consiste à enlever l’ADP ribose de la nitrogénase et donc sa réactivation. Afin de mieux comprendre le fonctionnement de l’AmtB dans la régulation et le transport de l’ammonium à un niveau moléculaire et par la même occasion la fixation de l’azote, le premier volet de ce mémoire a été d’introduire une mutation ponctuelle par mutagénèse dirigée au niveau du résidu conservé W237 de l’AmtB. La production d’hydrogène est un autre aspect longtemps étudié chez R. capsulatus. Cette bactérie est capable de produire de l’hydrogène à partir de composés organiques par photofermentation suite à l’intervention exclusive de la nitrogénase. Plusieurs études ont été entreprises afin d’améliorer la production d’hydrogène. Certaines d’entre elles se sont intéressées à déterminer les conditions optimales qui confèrent une production maximale de gaz tandis que d’autres s’intéressent au fonctionnement de la bactérie elle même. Ainsi, le fait que la bioproduction de H2 par fermentation soit catalysée par la nitrogénase cela implique la régulation de l’activité de cette dernière par différents mécanismes dont le switch off par ADP ribosylation de l’enzyme. De ce fait, un mutant de R. capsulatus dépourvu d’AmtB (DG9) a été étudié dans la deuxième partie de cette thèse en termes d’activité de la nitrogénase, de sa modification par ADP ribosylation avec la détection des deux protéines GlnK et DraG qui interviennent dans cette régulation pour connaitre l’influence de différents acides aminés sur la régulation de la nitrogénase et pour l‘utilisation future de cette souche dans la production d’H2 car R. capsulatus produit de l’hydrogène par photofermentation grâce à cette enzyme. Les résultats obtenus ont révélé une activité de la nitrogénase continue et ininterrompue lorsque l’AmtB est absent avec une activité maximale quand la proline est utilisée comme source d’azote durant la culture bactérienne ce qui implique donc que l’abolition de l’activité de cette protéine entraine une production continue d’H2 chez R. capsulatus lorsque la proline est utilisée comme source d’azote lors de la culture bactérienne. Par ailleurs, avec des Western blots on a pu déterminer l’absence de régulation par ADP ribosylation ainsi que les expressions respectives de GlnK et DraG inchangées entre R. capsulatus sauvage et muté. En conclusion, la nitrogénase n’est pas modifiée et inhibée lorsque l’amtB est muté ce qui fait de la souche R. capsulatus DG9 un candidat idéal pour la production de biohydrogène en particulier lorsque du glucose et de la proline sont respectivement utilisés comme source de carbone et d'azote pour la croissance.

Régulation de la fonction vasculaire pendant le vieillissement : rôles de l’environnement post-natal et du gène suppresseur de tumeurs p53

La dysfonction endothéliale vasculaire constitue un marqueur précoce des maladies cardiovasculaires car l’endothélium est l’une des premières cibles des facteurs de risque cardiovasculaire. La présence d'un stress chronique engendré par les facteurs de risque cardiovasculaire sollicite les mécanismes de défense endogènes, tels que les enzymes antioxydantes, qui servent au maintien de la fonction endothéliale. L’environnement vasculaire auquel l’endothélium est exposé a un effet direct sur son fonctionnement à long terme. Certaines habitudes de vie sont ainsi associées à une bonne santé cardiovasculaire. Par exemple, la diète méditerranéenne et/ou la pratique régulière de l’exercice physique aident à maintenir une fonction endothéliale adéquate et à réduire l’incidence des maladies cardiovasculaires. D'autre part, certains gènes clés, comme le gène suppresseur de tumeurs p53, régulent plusieurs voies métaboliques importantes pour préserver l’intégrité des cellules endothéliales. Nous posons l’hypothèse que l’environnement vasculaire post-natal influence la mise en place de mécanismes de défenses endogènes tels que les enzymes antioxydantes afin de faire face à des stress plus tard dans la vie. Notre objectif global était d’évaluer les impacts d’interventions post-natales bénéfiques et d’une diminution endogène du gène suppresseur de tumeurs p53, sur la fonction endothéliale vasculaire et sur sa capacité à faire face à un stress métabolique. Dans une première étude, nous avons soumis des souris saines C57Bl/6 dès leur sevrage et jusqu’à l’âge de 9 mois, à un programme d’exercice physique volontaire (course dans une roue) ou à un antioxydant (catéchine), comparé à un groupe de souris sédentaires et sans antioxydant. Puis les interventions ont été stoppées et une diète riche en gras a été introduite, ou non, pour une période de 3 mois; les souris ont été sacrifiées à l'âge de 9 ou 12 mois. Nous avons observé que l’exercice a protégé les cellules endothéliales des effets délétères induits par la diète riche en gras en préservant la fonction endothéliale par le maintien d’un profil rédox sain et en évitant la hausse de l’inflammation. La catéchine a maintenu la fonction endothéliale aortique, mais n’a pas prévenu le profil inflammatoire en présence de la diète riche en gras. Finalement, chez les souris sédentaires, la fonction endothéliale a été détériorée en présence de la diète riche en gras, sans indice d’inflammation vasculaire. Dans une seconde étude, des souris partiellement déficientes en p53 (p53+/-) et contrôles C57Bl/6 ont été exposées à la même diète riche en gras à partir de 3 mois et ce jusqu’à l’âge de 6 mois. Notre raisonnement était basé sur la démonstration que p53 est un régulateur de l’expression des enzymes antioxydantes in vitro. Chez les souris p53+/-, les cellules endothéliales ont été protégées du stress induit par l’hypercholestérolémie engendrée par la diète riche en gras. Cependant, chez les souris p53+/- cette protection pourrait être secondaire à un métabolisme accru des acides biliaires, qui en prévenant la hausse de cholestérol, protègerait indirectement l'endothélium. Nous avons donc pu démontrer l’importance de l’environnement vasculaire sur la fonction endothéliale. La diète riche en gras a stimulé certains mécanismes de défense vasculaires tels que la voie des EDHF et la superoxyde dismutase afin de maintenir la fonction endothéliale malgré les conditions pro-athérosclérotiques. Nous avons observé que l’exercice et la catéchine influencent différemment l’endothélium malgré leurs capacités antioxydantes. Ces études soulignent la sensibilité de l’endothélium aux changements dans l’environnement vasculaire. En accord avec le vieillissement de la population et la progression des maladies cardiovasculaires, la proportion de personnes ayant une dysfonction endothéliale augmente. Ainsi, une meilleure compréhension des mécanismes ou d’interventions qui permettent le maintien de la fonction endothéliale à long terme s’avère utile.

Rôle de l’enzyme PAS kinase dans la régulation du facteur de transcription PDX-1 dans la cellule bêta pancréatique.

Le diabète de type 2 (DT2) se caractérise par une production insuffisante d'insuline par le pancréas ainsi qu'une résistance des tissus périphériques à l'action de l'insuline. Dans les cellules bêta pancréatiques, le glucose stimule la production de l'insuline en induisant la transcription de son gène et la traduction ainsi que la sécrétion de sa protéine. Paradoxalement, une exposition prolongée et simultanée de ces cellules à de hautes concentrations de glucose en présence d'acides gras conduit à la détérioration de la fonction bêta pancréatique et au développement du DT2. Toutefois, les mécanismes moléculaires responsables de ces effets du glucose ne sont que partiellement connus. L'objectif du travail décrit dans cette thèse est d'identifier les mécanismes responsables de la régulation de la transcription du gène de l'insuline. PDX-1 (de l’anglais pour pancreatic and duodenal homeobox 1) est un facteur de transcription majeur et essentiel tant pour le développement du pancréas que pour le maintien de sa fonction à l'état adulte. En réponse au glucose, PDX-1 se lie au promoteur du gène de l'insuline et induit sa transcription. Ceci est inhibé par l'acide gras palmitate. Dans la première partie des travaux effectués dans le cadre de cette thèse, nous avons identifié deux mécanismes de régulation de la transcription du gène de l'insuline: le premier via ERK1/2 (de l'anglais pour extracellular-signal-regulated protein kinases 1 and 2) et le second par l’enzyme PASK (pour per-arnt-sim kinase). Nous avons également mis en évidence l'existence d'un troisième mécanisme impliquant l'inhibition de l'expression du facteur de transcription MafA par le palmitate. Nos travaux indiquent que la contribution de la signalisation via PASK est majeure. L'expression de PASK est augmentée par le glucose et inhibée par le palmitate. Sa surexpression dans les cellules MIN6 et les îlots isolés de rats, mime les effets du glucose sur l'expression du gène de l'insuline ainsi que sur l'expression de PDX-1 et prévient les effets délétères du palmitate. Dans la deuxième partie de la thèse, nous avons identifié un nouveau mécanisme par lequel PASK augmente la stabilité protéique de PDX-1, soit via la phosphorylation et l'inactivation de la protéine kinase GSK3 bêta (de l'anglais pour glycogen synthase kinase 3 beta). Le glucose induit la translocation de PDX-1 du cytoplasme vers le noyau, ce qui est essentiel à sa liaison au promoteur de ses gènes cibles. L'exclusion nucléaire de PDX-1 a été observée dans plusieurs modèles ex vivo et in vivo de dysfonction de la cellule bêta pancréatique. Dans le dernier volet de cette thèse, nous avons démontré l'importance de l'utilisation de cellules primaires (îlots isolés et dispersés) pour étudier la translocation nucléaire de PDX-1 endogène étant donné que ce mode de régulation est absent dans les lignées insulino-sécrétrices MIN6 et HIT-T15. Ces études nous ont permis d'identifier et de mieux comprendre les mécanismes régulant la transcription du gène de l'insuline via le facteur de transcription PDX-1. Les cibles moléculaires ainsi identifiées pourraient contribuer au développement de nouvelles approches thérapeutiques pour le traitement du diabète de type 2. Mots-clés : Diabète, îlots de Langerhans, cellule bêta pancréatique, gène de l'insuline, PDX-1, PASK, GSK3 bêta, ERK1/2, PKB, glucose, palmitate.