Avaliação do desenvolvimento do sistema genital e da funçao reprodutiva da prole feminina de ratos Wistar expostos à cisplatina durante a peri-puberdade

Pós-graduação em Biologia Geral e Aplicada - IBB

Protective role of melatonin in mouse spermatogenesis induced by sodium arsenite

Arsenic is a testicular environmental toxic. Melatonin (Me), being a potent antioxidant, may reduce the damage caused by arsenic in male fertility. The effects of daily oral exposure of Sodium Arsenite (As; 7.0 mg/kg/bw); Melatonin (Me, 10.0 mg/kg/bw); Me (10.0 mg/kg/bw) plus As (7.0 mg/kg/bw), and Negative Control (NaCl 0.9%) in male CF-1 adult mice were assessed in acute (8.3 days), chronic (33.2 days) and recovery (66,4 days) of testicular damage. We evaluated changes in testicular weight and histopathological, morphometric measurements, expression of COX-2 and Androgen Receptor (AR) antigens and lipid peroxidation levels. Treatment resulted in decreased tubular diameter and AR expression, and increased: interstitial area, luminal diameter, COX-2 expression levels and of lipid peroxidation. Co-administration of As and Me partially decreased germ cell degeneration and AR expression levels, improving testicular histopathological parameters. These results indicate that As causes toxicity and testicular germ cell degeneration by induction of oxidative stress. Me partially protects from this damage in mouse testis, acting as scavenger of oxygen radical species.

Morphological changes of mammalian nucleoli during spermatogenesis and their possible role in the chromatoid body assembling

Chromatoid body (CB) is a typical cytoplasmic organelle of germ cells, and it seems to be involved in RNA/protein accumulation for later germ-cell differentiation. Despite most of the events in mammals spermatogenesis had been widely described in the past decades and the increase in the studies related to the CB molecular composition and physiology, the origins and functions of this important structure of male germ cells are still unclear. The aims of this study were to describe the nucleolar cycle and also to find some relationship between the nucleolar organization and the CB assembling during the spermatogenesis in mammals. Cytochemical and cytogenetics analysis showed nucleolar fragmentation in post-pachytene spermatocytes and nucleolar reorganization in post-meiotic spermatids. Significant difference in the number and in the size of nucleoli between spermatogonia and round spermatids, as well as differences in the nucleolar position within the nucleus were also observed. Ultrastructural analysis showed the CB assembling in the cytoplasm of primary spermatocytes and the nucleolar fragmentation occurring at the same time. In conclusion our results suggest that the CB may play important roles during the spermatogenesis process in mammals and that its origin may be related to the nucleolar cycle during the meiotic cell cycle.

Transplante interespecífico de espermatogônias-tronco de Brycon orbignyanus em Astyanax altiparanae (Teleostei: Characidae)

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

The effects of temperature and busulfan (Myleran) on the yellowtail tetra Astyanax altiparanae (Pisces, Characiformes) spermatogenesis

We aimed to standardize a protocol to suppress spermatogenesis in the characiform fish, Astyanax altiparanae, for future use as a host in germ cell transplant research, opening opportunities for a range of studies, such as spermatogenesis analyses and transgenesis because this species presents livestock characteristics to be used as a biological model. The effects of the chemotherapeutic busulfan (formulated as Myleran), which is used as medicine, therefore not as toxic to humans manipulation as analytical grade busulfan (Fluka) used in previous studies, were evaluated at physiological temperature of 28 °C, ideal for growth and reproduction of A altiparanae, and also at increased temperature 35 °C. The temperature groups were divided into three treatment groups: busulfan, DMSO only, and an untreated control. Macroscopic, histologic, stereological, and ultrastructure analysis showed that, at 28 °C, busulfan did not cause depletion of germ cells in A altiparanae. However, at 35 °C, sterilization was observed 3 weeks after the initial application. Similar results were obtained with maintenance of fish at 35 °C for a longer period with no accompanying Myleran treatment. This procedure allows reduction in stress and lower mortality resulting from manipulation during busulfan injection and is also suitable for mass treatment because large numbers of fish can be incubated in warm water.

Criptorquidia e exposição in utero ao di(n-butil)-ftalato e à acrilamida: avaliação morfológica do dano testicular

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)

Avaliação de células germinativas e células de Sertoli em modelo experimental de criptorquidia e orquidopexia

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)

Rananos expression pattern during oogenesis and early embryonic development in Rhynchosciara americana

The Dipteran a native Brazilian insect that has become a valuable model system for developmental biology research because it provides an interesting opportunity to study a different type of insect oogenesis. Sequences from a cDNA library that was constructed with poly A + RNA from the ovaries of larvae at different ages were analyzed. Molecular characterization confirmed interesting findings, such as the presence of . The gene encodes a conserved RNA-binding protein that is required during early development for the maintenance and division of the primordial germ cells of Diptera. plays an important role in specifying the posterior regions of insect embryos and is important for abdomen formation. In the present work, we showed the spatial and temporal expression profiles of this important gene, which is involved in oogenesis and early development. Data mining techniques were used to obtain the complete sequence of . Bioinformatic tools were used to determine the following: (1) the secondary structure of the 3'-untranslated region of the mRNA, (2) the encoded protein of the isolated gene, (3) the conserved zinc-finger domains of the Nanos protein, and (4) phylogenetic analyses. Furthermore, RNA in situ hybridization and immunolocalization were used to determine mRNA and protein expression in the tissues that were studied and to define as a germ cell molecular marker.

Predicting necrosis in residual mass analysis after retroperitoneal lymph node dissection: a retrospective study

Background: Recent studies have demonstrated that pathological analysis of retroperitoneal residual masses of patients with testicular germ cell tumors revealed findings of necrotic debris or fibrosis in up to 50% of patients. We aimed at pursuing a clinical and pathological review of patients undergoing post chemotherapy retroperitoneal lymph node dissection (PC-RPLND) in order to identify variables that may help predict necrosis in the retroperitoneum. Methods: We performed a retrospective analysis of all patients who underwent PC-RPLND at the University Hospital of the University of Sao Paulo and Cancer Institute of Sao Paulo between January 2005 and September 2011. Clinical and pathological data were obtained and consisted basically of: measures of retroperitoneal masses, histology of the orchiectomy specimen, serum tumor marker and retroperitoneal nodal size before and after chemotherapy. Results: We gathered a total of 32 patients with a mean age of 29.7; pathological analysis in our series demonstrated that 15 (47%) had necrosis in residual retroperitoneal masses, 15 had teratoma (47%) and 2 (6.4%) had viable germ cell tumors (GCT). The mean size of the retroperitoneal mass was 4.94 cm in our sample, without a difference between the groups (P = 0.176). From all studied variables, relative changes in retroperitoneal lymph node size (P = 0.04), the absence of teratoma in the orchiectomy specimen (P = 0.03) and the presence of choriocarcinoma in the testicular analysis after orchiectomy (P = 0.03) were statistically significant predictors of the presence of necrosis. A reduction level of 35% was therefore suggested to be the best cutoff for predicting the absence of tumor in the retroperitoneum with a sensitivity of 73.3% and specificity of 82.4%. Conclusions: Even though retroperitoneal lymph node dissection remains the gold standard for patients with residual masses, those without teratoma in the primary tumor and a shrinkage of 35% or more in retroperitoneal mass have a considerably smaller chance of having viable GCT or teratoma in the retroperitoneum and a surveillance program could be considered.

Absence of inactivating mutations and deletions in the DMRT1 and FGF9 genes in a large cohort of 46,XY patients with gonadal dysgenesis

Despite advances in our understanding of the mechanisms involved in sex determination and differentiation, the specific roles of many genes in these processes are not completely understood in humans. Both DMRT1 and FGF9 are among this group of genes. Dmrt1 controls germ cell differentiation, proliferation, migration and pluripotency and Sertoli cell proliferation and differentiation. Fgf9 has been considered a critical factor in early testicular development and germ cell survival in mice. We screened for the presence of DMRT1 and FGF9 mutations in 33 patients with 46,XY gonadal dysgenesis. No deletions in either DMRT1 or FGF9 were identified using the MLPA technique. Eight allelic variants of DMRT1 were identified, and in silico analysis suggested that the novel c.968-15insTTCTCTCT variant and the c.774G>C (rs146975077) variant could have potentially deleterious effects on the DMRT1 protein. Nine previously described FGF9 allelic variants and six different alleles of the 3' UTR microsatellite were identified. However, none of these DMRT1 or FGF9 variants was associated with increased 46,XY gonadal dysgenesis. In conclusion, our study suggests that neither DMRT1 nor FGF9 abnormalities are frequently involved in dysgenetic male gonad development in patients with non-syndromic 46,XY disorder of sex development. (C) 2012 Published by Elsevier Masson SAS.

Eine neue Form der Pyruvatkinase in Säugerspermien

Nach Homogenisation ejakulierter Eberspermien und Zentrifugation des Homogenates blieben mehr als 60% der Aktivität des glykolytischen Enzyms Pyruvatkinase (PK) an Zellfragmenten im Sediment gebunden. Diese strukturgebundene PK wurde als PK-S bezeichnet. Das Detergenz Triton X-100 führte nicht zur Ablösung der PK-S; mit Trypsin konnten jedoch rund 80% der PK-S ohne Verlust an Aktivität von den Strukturen gelöst und durch kombinierte Kationenaustausch- und Hydrophobizitätschromatographie gereinigt werden (spezifische Aktivität: 116,7 U/mg Protein). Die lösliche PK aus Eberspermien konnte ebenfalls durch ein ähnliches Verfahren angereichert werden. Im Gel (SDS-PAGE) zeigten die Untereinheiten der PK-S mit 64.400 eine geringfügig größere relative Molekülmasse als die der PK-M1 aus Kaninchenmuskel (62.000). Die kinetischen Eigenschaften der abgelösten PK-S als auch der noch an Spermienstrukturen gebundenen PK-S und der löslichen PK aus Eberspermien waren sehr ähnlich und entsprachen der M1-Isoform der PK. Antikörper gegen Kaninchenmuskel-PK (Anti-PK-M1) reagierten auch mit der löslichen PK und der PK-S aus Eberspermien. Edman-Abbau der ersten 19 Aminosäuren zeigte, dass die tryptisch abgelöste PK-S am N-Terminus um 5 Aminosäuren gegenüber nativer PK-M1 verlängert ist, während der C-Terminus der erhaltenen PK-S-Sequenz mit einem meist nahe dem N-Terminus gelegenen Sequenzabschnitt der PK-M1 und -M2 übereinstimmt. Die N-terminale Verlängerung der nativen PK-S enthält sicherlich mehr als die nach tryptischer Lyse nachgewiesenen 5 Aminosäuren. Vergleiche der Aminosäure- und übersetzten Nukleotidsequenzen sowie die kinetischen Eigenschaften lassen vermuten, dass die PK-S, wie die PK-M1 und PK-M2, vom PKM-Gen codiert wird. Gegen die gereinigte PK-S wurden Antikörper in Kaninchen produziert. Da das Antiserum nicht ausreichend spezifisch für PK-S war, wurden aus ihm affinitätschromatographisch Antikörper (Anti-PK-S) isoliert, die hohe Affinität zu einem synthetisierten PK-S-Peptid (13 N-terminale Aminosäuren der tryptisch abgelösten PK-S) hatten. Dieses Anti-PK-S-Präparat war spezifisch für PK-S; es reagierte weder mit Kaninchenmuskel-PK noch mit löslicher PK oder anderen Proteinen aus Eberspermien. Anti-PK-S und Anti-PK-M1 wurden zur Lokalisierung von PK-S und löslicher PK in Spermien von Eber, Bulle und Mensch sowie in Schnitten von Eberhoden eingesetzt. Mit Anti-PK-S wurden der Bereich des Akrosoms und das lange flagellare Hauptstück sowie der Übergangsbereich zwischen Kopf und Mittelstück von Eberspermien fluoreszenzmarkiert, wogegen das kurze, die Mitochondrien enthaltende Mittelstück des Flagellums und der postakrosomale Kopfbereich nur mit Anti-PK-M1 markiert wurden. Immunogoldmarkierung in elektronenmikroskopischen Bildern bestätigte die Lokalisierung von PK-S im Akrosombereich. Im Hauptstück banden Anti-PK-M1 und Anti-PK-S an die fibröse Scheide. Glyzerinaldehyd-3-phosphat Dehydrogenase (GAPDH) konnte von mir ebenfalls im Akrosombereich, im Übergangsbereich zwischen Kopf und Mittelstück und an der fibrösen Scheide detektiert werden. Auch an Bullen- und Humanspermien konnte über Immunogoldmarkierung PK und vermutlich GAPDH an der fibrösen Scheide gezeigt werden. Im Akrosombereich dieser Spermien waren die Nachweise von PK und GAPDH jedoch nicht sicher. In Eberhodenschnitten war die PK-S erstmals, oder zumindest vermehrt, in den elongierenden Spermatiden über Fluoreszenzmarkierung nachweisbar, während andere, vermutlich somatische PK vermehrt in den früheren Stadien (Spermatogonien, aber auch in den Spermatozyten und runden Spermatiden) auftrat. Für die GAPDH zeigte sich ein ähnlicher Entwicklungsverlauf. Die Ergebnisse zeigen, dass in Eberspermien zwei Isoformen der PK auftreten: eine N-terminal verlängerte, strukturgebundene Form, die PK-S, und eine lösliche Form, die beide der PK-M1 ähneln. Der ungewöhnliche N-Terminus der PK-S dient vermutlich der spezifischen räumlichen Anordnung der PK-S im Akrosombereich und an der fibrösen Scheide, nicht aber der Modulation kinetischer Eigenschaften. Meine Untersuchungen stützen die Hypothese, dass in bestimmten Kompartimenten von Säugerspermien die Glykolyse durch Verankerung einiger ihrer Enzyme strukturell hochgeordnet ist. Dadurch wird vermutlich die Versorgung der Mitochondrien-freien Regionen mit ATP sichergestellt. Man kann diese Organisation als Anpassung des Stoffwechsels von Spermien deuten, bei denen die Mitochondrien in einem kleinen Bereich (Mittelstück) hinter dem Spermienkopf kompartimentiert sind. Im Hauptstück des Flagellums könnte die Glykolyse ATP für die Spermienmotilität liefern, im Akrosombereich für die Verhinderung einer vorzeitigen Akrosomreaktion. Somit käme der strukturierten Glykolyse eine essentielle Bedeutung für die Befruchtungsfähigkeit von Säugerspermien zu.

Untersuchungen zur Chemosensitivität von testikulären Tumorzellen gegenüber Cisplatin

Metastasierender Krebs ist bei Erwachsenen in der Regel nicht heilbar. Eine Ausnahme stellen testikuläre Keimzelltumoren (TKZT) dar, da über 75 % der Patienten mit fortgeschrittenen metastasierenden TKZT mit einer auf Cisplatin basierenden Kombinations-Chemotherapie geheilt werden können. Zelllinien, die aus TKZT isoliert wurden, behalten diese Cisplatin-Sensitivität in vitro bei. Somit spiegeln Testistumorzelllinien die klinische Situation wider und sind deswegen ein gutes Modellsystem um zu untersuchen, welche Faktoren der Cisplatin-Sensitivität zugrunde liegen. Die Ursachen der Cisplatin-Sensitivität in Testistumoren sind nicht bekannt. Es wurde bereits gezeigt, dass Testistumorzellen eine geringe Kapazität für die Entfernung von Cisplatin-induzierten DNA-Platinierungen aufweisen. Dieser Defekt in der DNA-Reparatur könnte ein Faktor für die beobachtete Cisplatin-Sensitivität sein. Cisplatin induziert sowohl Intrastrang-Vernetzungen als auch Interstrang-Vernetzungen (ICLs). Die Bildung und Reparatur der Cisplatin-induzierten Intrastrang-Vernetzungen wurde mittels DNA-Slot-Blot, die Bildung und Entfernung von Interstrang-Vernetzungen wurde mithilfe des Comet-Assays untersucht. In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, dass die Reparatur von Intrastrang-Vernetzungen in Testis- und Blasentumorzelllinien vergleichbar ist. Somit sind Testistumorzellen in diesem Reparaturweg nicht beeinträchtigt. Im Unterschied dazu zeigte sich, dass Testistumorzellen die ICLs nicht oder nur mit einer reduzierten Kapazität entfernen können.Da die ICL-Reparatur über die Bildung von DNA-Doppelstrangbrüchen (DSB) mit anschließender DSB-Reparatur verläuft, wurde die Kinetik der DSB-Reparatur anhand der Immundetektion der Histon-Variante γH2AX, die zur Visualisierung von DSB verwendet wird, verfolgt. γH2AX Foci wurden nach Behandlung mit Cisplatin in Testistumorzellen und Blasentumorzellen gebildet. Anders als in Blasentumorzellen blieb der Prozentsatz an γH2AX-positiven Zellen in Testistumorzellen bestehen. Offensichtlich konnten die Testistumorzellen die Cisplatin-induzierten ICLs nicht korrekt prozessieren, was dazu führte, dass γH2AX Foci persistierten. Da unreparierte DNA-Läsionen eine DNA-schadensabhängige Antwort einleiten können, wurde die Aktivierung der Hauptfaktoren dieser Signalwege untersucht. In den Testistumorzellen zeigte sich eine Erhöhung der p53 Proteinmenge nach Cisplatin-Behandlung. Des Weiteren wurde die durch Cisplatin induzierte Aktivierung von ATM/ATR, Chk1/Chk2, Bax und Noxa in Testis- und Blasentumorzellen vergleichend untersucht. Es wurde bereits gezeigt, dass der Reparaturfaktor ERCC1-XPF in Testistumorzelllinien reduziert vorliegt. Um eine mögliche Rolle von ERCC1-XPF für die Reparatur-Defizienz der ICLs und Cisplatin-Sensitivität in Testistumorzellen zu analysieren, wurde ERCC1-XPF in der Testistumorenzelllinie 833K mithilfe eines Expressionsvektors überexprimiert, und der Einfluss von ERCC1-XPF auf ICL-Reparatur sowie Cisplatin-Sensitivität wurde ermittelt. Überexpression von ERCC1-XPF führte zur Reparatur der ICLs in 833K-Zellen und verminderte die Cisplatinsensitivität. Somit scheint die Cisplatinsensitivität der Testistumorzellen, zumindest zum Teil, auf einer verminderten ICL-Reparatur zu beruhen. Des Weiteren wurde in „proof of principle“ Experimenten ERCC1-XPF in der Cisplatin-resistenten Blasentumorzelllinie MGH-U1 mittels siRNA herunterreguliert, und die Auswirkung der Herunterregulation auf die ICL-Reparatur und die Cisplatinsensitivität wurde geprüft. RNA-Interferenz-vermittelte Herunterregulierung von ERCC1-XPF reduzierte die Prozessierung der Cisplatin-induzierten ICLs und verstärkte die Cisplatinsensitivität in MGH-U1 Zellen. Somit wurde in dieser Arbeit zum ersten Mal gezeigt, dass die Testistumorzellen in Vergleich zu Blasentumorzellen in der Reparatur von ICLs defizient sind, wobei die verminderte ICL-Reparatur auf die geringe Expression von ERCC1-XPF zurückgeführt werden konnte. Diese ICL-Reparatur-Defizienz könnte, zumindest zu einem Teil, für die Sensitivität der Testistumoren gegenüber Cisplatin verantwortlich sein.

Meningocerebral angiodysplasia with metanephric induction failure: Broadening the spectrum of an emerging maldevelopmental syndrome

The uncommon simultaneous occurrence of an exuberant, angioma-like proliferation of superficial cerebral microvessels along with absence of the kidneys has been proposed to constitute a syndromic complex for which the term "meningocerebral angiodysplasia (or angiomatosis) with renal agenesis" (MCA-RA) is being descriptively used. We observed this constellation in one of a pair of dichorionic male twins following postpartal death in the 38th week of pregnancy. General autopsy revealed rudimentary metanephric anlagen made up of few residual glomeruli, cysts lined by flattened tubular epithelium, and islands of cartilage - corresponding to renal aplastic dysplasia. Largely inconspicuous with respect to its gyral pattern, as well as the configuration of the ventricular system, the brain microscopically showed extensive replacement of the cortex by a lattice of proliferating capillaries with necrosis of the intervening parenchyma. Minute foci of calcified necrosis were scattered in the deep subcortical white matter as well, while the ventricular ependyma and the subventricular germ cell layer remained remarkably intact. The cerebellum and brain stem appeared unaffected as well. Karyotyping of skin fibroblasts indicated a normal chromosome set of 46XY without gross structural anomalies. We interpret these findings as ones apt to being reasonably accommodated within the spectrum of MCA-RA. Although exceedingly rare, accurate identification of individual cases of MCA-RA is relevant both to differential diagnosis from its prognostically different look-alike "proliferative vasculopathy and hydranencephaly-hydrocephaly" (PVHH), and to refine the nosology of unconventional pediatric vascular malformations, for which the rather nonspecific label "angiodysgenetic necrotizing encephalopathy" is still commonly used.

High expression of NPY receptors in the human testis

NPY receptors represent novel molecular therapeutic targets in cancer and obesity. However, the extent of NPY receptor expression in normal human tissues is poorly investigated. Based on the role of NPY in reproductive functions, the NPY receptor expression was studied in 25 normal human testes and, additionally, 24 testicular tumors using NPY receptor autoradiography. In the normal testis, Leydig cells strongly expressed NPY receptor subtype Y2, and small arterial blood vessels Y1. Y2 receptors were found to be functional with agonist-stimulated [(35)S]GTPγS binding autoradiography. Full functional integrity of the NPY system was further suggested by the immunohistochemical detection of NPY peptide in nerve fibers directly adjacent to Leydig cells and arteries. Germ cell tumors expressed Y1 and Y2 on tumor cells in 33% and Y1 on intratumoral blood vessels in 50%. Based on its strong NPY receptor expression in Leydig cells and blood vessels, the normal human testis represents a potentially important physiological and pharmalogical NPY target.

Caenorhabditis elegans Heterochromatin protein 1 (HPL-2) links developmental plasticity, longevity and lipid metabolism

Background Heterochromatin protein 1 (HP1) family proteins have a well-characterized role in heterochromatin packaging and gene regulation. Their function in organismal development, however, is less well understood. Here we used genome-wide expression profiling to assess novel functions of the Caenorhabditis elegans HP1 homolog HPL-2 at specific developmental stages. Results We show that HPL-2 regulates the expression of germline genes, extracellular matrix components and genes involved in lipid metabolism. Comparison of our expression data with HPL-2 ChIP-on-chip profiles reveals that a significant number of genes up- and down-regulated in the absence of HPL-2 are bound by HPL-2. Germline genes are specifically up-regulated in hpl-2 mutants, consistent with the function of HPL-2 as a repressor of ectopic germ cell fate. In addition, microarray results and phenotypic analysis suggest that HPL-2 regulates the dauer developmental decision, a striking example of phenotypic plasticity in which environmental conditions determine developmental fate. HPL-2 acts in dauer at least partly through modulation of daf-2/IIS and TGF-β signaling pathways, major determinants of the dauer program. hpl-2 mutants also show increased longevity and altered lipid metabolism, hallmarks of the long-lived, stress resistant dauers. Conclusions Our results suggest that the worm HP1 homologue HPL-2 may coordinately regulate dauer diapause, longevity and lipid metabolism, three processes dependent on developmental input and environmental conditions. Our findings are of general interest as a paradigm of how chromatin factors can both stabilize development by buffering environmental variation, and guide the organism through remodeling events that require plasticity of cell fate regulation.