Evidence for a non-replicative intracellular stage of nontypable Haemophilus influenzae in epithelial cells

Nontypable Haemophilus influenzae (NTHi) is a Gram-negative, non-capsulated human bacterial pathogen, a major cause of a repertoire of respiratory infections, and intimately associated with persistent lung bacterial colonization in patients suffering from chronic obstructive pulmonary disease (COPD). Despite its medical relevance, relatively little is known about its mechanisms of pathogenicity. In this study, we found that NTHi invades the airway epithelium by a distinct mechanism, requiring microtubule assembly, lipid rafts integrity, and activation of phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) signalling. We found that the majority of intracellular bacteria are located inside an acidic subcellular compartment, in a metabolically active and non-proliferative state. This NTHi-containing vacuole (NTHi-CV) is endowed with late endosome features, co-localizing with LysoTracker, lamp-1, lamp-2, CD63 and Rab7. The NTHi-CV does not acquire Golgi- or autophagy-related markers. These observations were extended to immortalized and primary human airway epithelial cells. By using NTHi clinical isolates expressing different amounts of phosphocholine (PCho), a major modification of NTHi lipooligosaccharide, on their surfaces, and an isogenic lic1BC mutant strain lacking PCho, we showed that PCho is not responsible for NTHi intracellular location. In sum, this study indicates that NTHi can survive inside airway epithelial cells.

Halophilic microorganisms as a source of novel antibiofilm compounds

Objectives: There is great urgency for alternate sources of antibiotics to be identified. One relatively untapped source of novel bioproducts, including antimicrobials, is organisms derived from extreme environments. Halophiles (which require high salt concentrations) are one such group which is being increasingly explored for their biotechnological potential. The aim of this study was to identify halophilic environmental isolates which possessed in vitro and in vivo antimicrobial and antibiofilm activities. Methods: 73 halophilic bacteria and archaea were isolated from Kilroot salt mine in Northern Ireland. Culture extracts of each isolate were screened for antimicrobial and antibiofilm activity against numerous pathogenic bacteria, including Staphylococcus species and Pseudomonas aeruginosa, both model strains and clinical isolates. The methods used included disc diffusion assays of crude extracts, MIC screening, the MBEC assay, and an in vivo model based on the Greater Wax Moth (Galleria mellonella). Results: The assays indicated >50% of extracts displayed antimicrobial and antibiofilm activity against at least one pathogen, the majority being Staphylococcus species, but also E. coli and P. aeruginosa. Biofilms were either reduced or eradicated by halophile extracts when tested with the MBEC device. Further experiments demonstrated that these effects could be replicated in vivo, with extracts reducing the severity of infections and enhancing the survival of infected G. mellonella. Conclusions: The importance of extremophiles to pharmaceutical research should not be underestimated. While not yet fully characterised, based on the data obtained, the halophiles isolated during this study may provide a promising reservoir of novel antimicrobial and antibiofilm compounds.

Complete nucleotide sequence of φCHU: A Luz24likevirus infecting Pseudomonas aeruginosa and displaying a unique host range

A complete nucleotide sequence of the new Pseudomonas aeruginosa Luz24likevirus phiCHU was obtained. This virus was shown to have a unique host range whereby it grew poorly on the standard laboratory strain PAO1, but infected 26 of 46 clinical isolates screened, and strains harboring IncP2 plasmid pMG53. It was demonstrated that phiCHU has single strand interruptions in its genome. Analysis of the phiCHU genome also suggested that recombination event(s) participated in the evolution of the leftmost portion of the genome, presumably encoding early genes.

Identification of synergists that potentiate the action of polymyxin B against Burkholderia cenocepacia

Burkholderia cenocepacia and other members of the Burkholderia cepacia complex (Bcc) are highly multidrug-resistant bacteria that cause severe pulmonary infections in patients with cystic fibrosis. A screen of 2686 compounds derived from marine organisms identified molecules that could synergize with polymyxin B to inhibit growth of B. cenocepacia. At 1 μg/ml, five compounds synergized with polymyxin B and inhibited the growth of B. cenocepacia by more than 70% compared to growth in polymyxin B alone. Follow-up testing revealed that one compound from the screen, the aminocoumarin antibiotic novobiocin, synergized with polymyxin B and colistin against tobramycin-resistant clinical isolates of B. cenocepacia and Burkholderia multivorans. In parallel, we show that novobiocin sensitivity is common among Bcc species and these bacteria are even more susceptible to an alternative aminocoumarin, clorobiocin, which also had an additive effect with polymyxin B against B. cenocepacia. These studies support using aminocoumarin antibiotics to treat Bcc infections and show that synergizers can be found to increase the efficacy of antimicrobial peptides and polymyxins against Bcc bacteria.

Structural analysis of glycans and development of microarrays from Helcobacter pylori cell surface glycome

Helicobacter pylori is a bacterial pathogen that affects more than half of the world’s population with gastro-intestinal diseases and is associated with gastric cancer. The cell surface of H. pylori is decorated with lipopolysaccharides (LPSs) composed of three distinct regions: a variable polysaccharide moiety (O-chain), a structurally conserved core oligosaccharide, and a lipid A region that anchors the LPS to the cell membrane. The O-chain of H. pylori LPS, exhibits unique oligosaccharide structures, such as Lewis (Le) antigens, similar to those present in the gastric mucosa and are involved in interactions with the host. Glucan, heptoglycan, and riban domains are present in the outer core region of some H. pylori LPSs. Amylose-like glycans and mannans are also constituents of some H. pylori strains, possibly co-expressed with LPSs. The complexity of H. pylori LPSs has hampered the establishment of accurate structure-function relationships in interactions with the host, and the design of carbohydrate-based therapeutics, such as vaccines. Carbohydrate microarrays are recent powerful and sensitive tools for studying carbohydrate antigens and, since their emergence, are providing insights into the function of carbohydrates and their involvement in pathogen-host interactions. The major goals of this thesis were the structural analysis of LPSs from H. pylori strains isolated from gastric biopsies of symptomatic Portuguese patients and the construction of a novel pathogen carbohydrate microarray of these LPSs (H. pylori LPS microarray) for interaction studies with proteins. LPSs were extracted from the cell surface of five H. pylori clinical isolates and one NCTC strain (26695) by phenol/water method, fractionated by size exclusion chromatography and analysed by gas chromatography coupled to mass spectrometry. The oligosaccharides released after mild acid treatment of the LPS were analysed by electrospray mass spectrometry. In addition to the conserved core oligosaccharide moieties, structural analyses revealed the presence of type-2 Lex and Ley antigens and N-acetyllactosamine (LacNAc) sequences, typically found in H. pylori strains. Also, the presence of O-6 linked glucose residues, particularly in LPSs from strains 2191 and NCTC 26695, pointed out to the expression of a 6-glucan. Other structural domains, namely ribans, composed of O-2 linked ribofuranose residues were observed in the LPS of most of H. pylori clinical isolates. For the LPS from strain 14382, large amounts of O-3 linked galactose units, pointing to the occurrence of a galactan, a domain recently identified in the LPS of another H. pylori strain. A particular feature to the LPSs from strains 2191 and CI-117 was the detection of large amounts of O-4 linked N-acetylglucosamine (GlcNAc) residues, suggesting the presence of chitin-like glycans, which to our knowledge have not been described for H. pylori strains. For the construction of the H. pylori LPS microarray, the structurally analysed LPSs, as well as LPS-derived oligosaccharide fractions, prepared as neoglycolipid (NGL) probes were noncovalently immobilized onto nitrocellulosecoated glass slides. These were printed together with NGLs of selected sequence defined oligosaccharides, bacterial LPSs and polysaccharides. The H. pylori LPS microarray was probed for recognition with carbohydratebinding proteins (CBPs) of known specificity. These included Le and blood group-related monoclonal antibodies (mAbs), plant lectins, a carbohydratebinding module (CBM) and the mammalian immune receptors DC-SIGN and Dectin-1. The analysis of these CBPs provided new information that complemented the structural analyses and was valuable in the quality control of the constructed microarray. Microarray analysis revealed the occurrence of type-2 Lex and Ley, but not type-1 Lea or Leb antigens, supporting the results obtained in the structural analysis. Furthermore, the H. pylori LPSs were recognised by DC-SIGN, a mammalian lectin known to interact with this bacterium through fucosylated Le epitopes expressed in its LPSs. The -fucose-specific lectin UEA-I, showed restricted binding to probes containing type-2 blood group H sequence and to the LPSs from strains CI-117 and 14382. The presence of H-type-2, as well Htype- 1 in the LPSs from these strains, was confirmed using specific mAbs. Although H-type-1 determinant has been reported for H. pylori LPSs, this is the first report of the presence of H-type-2 determinant. Microarray analysis also revealed that plant lectins known to bind 4-linked GlcNAc chitin oligosaccharide sequences bound H. pylori LPSs. STL, which exhibited restricted and strong binding to 4GlcNAc tri- and pentasaccharides, differentially recognised the LPS from the strain CI-117. The chitin sequences recognised in the LPS could be internal, as no binding was detected to this LPS with WGA, known to be specific for nonreducing terminal of 4GlcNAc sequence. Analyses of the H. pylori LPSs by SDS-PAGE and Western blot with STL provided further evidence for the presence of these novel domains in the O-chain region of this LPS. H. pylori LPS microarray was also applied to analysis of two human sera. The first was from a case infected with H. pylori (H. pylori+ CI-5) and the second was from a non-infected control.The analysis revealed a higher IgG-reactivity towards H. pylori LPSs in the H. pylori+ serum, than the control serum. A specific IgG response was observed to the LPS isolated from the CI-5 strain, which caused the infection. The present thesis has contributed to extension of current knowledge on chemical structures of LPS from H. pylori clinical isolates. Furthermore, the H. pylori LPS microarray constructed enabled the study of interactions with host proteins and showed promise as a tool in serological studies of H. pyloriinfected individuals. Thus, it is anticipated that the use of these complementary approaches may contribute to a better understanding of the molecular complexity of the LPSs and their role in pathogenesis.

Bacteriophage lytic enzymes and their engineering towards improved antibacterial efficacy

Tese de doutoramento, Farmácia (Microbiologia), Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2015

Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae–bacteriophage combination from the caecal effluent of a healthy woman

A sample of caecal effluent was obtained from a female patient who had undergone a routine colonoscopic examination. Bacteria were isolated anaerobically from the sample, and screened against the remaining filtered caecal effluent in an attempt to isolate bacteriophages (phages). A lytic phage, named KLPN1, was isolated on a strain identified as Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae (capsular type K2, rmpA+). This Siphoviridae phage presents a rosette-like tail tip and exhibits depolymerase activity, as demonstrated by the formation of plaque-surrounding haloes that increased in size over the course of incubation. When screened against a panel of clinical isolates of K. pneumoniae subsp. pneumoniae, phage KLPN1 was shown to infect and lyse capsular type K2 strains, though it did not exhibit depolymerase activity on such hosts. The genome of KLPN1 was determined to be 49,037 bp (50.53 %GC) in length, encompassing 73 predicted ORFs, of which 23 represented genes associated with structure, host recognition, packaging, DNA replication and cell lysis. On the basis of sequence analyses, phages KLPN1 (GenBank: KR262148) and 1513 (a member of the family Siphoviridae, GenBank: KP658157) were found to be two new members of the genus “Kp36likevirus”.

ß-lactamases in the biochemistry and molecular biology laboratory

β-lactamases are hydrolytic enzymes that inactivate the β-lactam ring of antibiotics such as penicillins and cephalosporins. The major diversity of studies carried out until now have mainly focused on the characterization of β-lactamases recovered among clinical isolates of Gram-positive staphylococci and Gram-negative enterobacteria, amongst others. However, only some studies refer to the detection and development of β-lactamases carriers in healthy humans, sick animals, or even in strains isolated from environmental stocks such as food, water, or soils. Considering this, we proposed a 10-week laboratory programme for the Biochemistry and Molecular Biology laboratory for majors in the health, environmental, and agronomical sciences. During those weeks, students would be dealing with some basic techniques such as DNA extraction, bacterial transformation, polymerase chain reaction (PCR), gel electrophoresis, and the use of several bioinformatics tools. These laboratory exercises would be conducted as a mini research project in which all the classes would be connected with the previous ones. This curriculum was compared in an experiment involving two groups of students from two different majors. The new curriculum, with classes linked together as a mini research project, was taught to a major in Pharmacy and an old curriculum was taught to students from environmental health. The results showed that students who were enrolled in the new curriculum obtained better results in the final exam than the students who were enrolled in the former curriculum. Likewise, these students were found to be more enthusiastic during the laboratory classes than those from the former curriculum.

The role of the efflux mechanisms in multidrug resistance in Mycobacterium tuberculosis

Abstract The emergence of multi and extensively drug resistant tuberculosis (MDRTB and XDRTB) has increased the concern of public health authorities around the world. The World Health Organization has defined MDRTB as tuberculosis (TB) caused by organisms resistant to at least isoniazid and rifampicin, the main first-line drugs used in TB therapy, whereas XDRTB refers to TB resistant not only to isoniazid and rifampicin, but also to a fluoroquinolone and to at least one of the three injectable second-line drugs, kanamycin, amikacin and capreomycin. Resistance in Mycobacterium tuberculosis is mainly due to the occurrence of spontaneous mutations and followed by selection of mutants by subsequent treatment. However, some resistant clinical isolates do not present mutations in any genes associated with resistance to a given antibiotic, which suggests that other mechanism(s) are involved in the development of drug resistance, namely the presence of efflux pump systems that extrude the drug to the exterior of the cell, preventing access to its target. Increased efflux activity can occur in response to prolonged exposure to subinhibitory concentrations of anti-TB drugs, a situation that may result from inadequate TB therapy. The inhibition of efflux activity with a non-antibiotic inhibitor may restore activity of an antibiotic subject to efflux and thus provide a way to enhance the activity of current anti-TB drugs. The work described in this thesis foccus on the study of efflux mechanisms in the development of multidrug resistance in M. tuberculosis and how phenotypic resistance, mediated by efflux pumps, correlates with genetic resistance. In order to accomplish this goal, several experimental protocols were developed using biological models such as Escherichia coli, the fast growing mycobacteria Mycobacterium smegmatis, and Mycobacterium avium, before their application to M. tuberculosis. This approach allowed the study of the mechanisms that result in the physiological adaptation of E. coli to subinhibitory concentrations of tetracycline (Chapter II), the development of a fluorometric method that allows the detection and quantification of efflux of ethidium bromide (Chapter III), the characterization of the ethidium bromide transport in M. smegmatis (Chapter IV) and the contribution of efflux activity to macrolide resistance in Mycobacterium avium complex (Chapter V). Finally, the methods developed allowed the study of the role of efflux pumps in M. tuberculosis strains induced to isoniazid resistance (Chapter VI). By this manner, in Chapter II it was possible to observe that the physiological adaptation of E. coli to tetracycline results from an interplay between events at the genetic level and protein folding that decrease permeability of the cell envelope and increase efflux pump activity. Furthermore, Chapter III describes the development of a semi-automated fluorometric method that allowed the correlation of this efflux activity with the transport kinetics of ethidium bromide (a known efflux pump substrate) in E. coli and the identification of efflux inhibitors. Concerning M. smegmatis, we have compared the wild-type M. smegmatis mc2155 with knockout mutants for LfrA and MspA for their ability to transport ethidium bromide. The results presented in Chapter IV showed that MspA, the major porin in M. smegmatis, plays an important role in the entrance of ethidium bromide and antibiotics into the cell and that efflux via the LfrA pump is involved in low-level resistance to these compounds in M. smegmatis. Chapter V describes the study of the contribution of efflux pumps to macrolide resistance in clinical M. avium complex isolates. It was demonstrated that resistance to clarithromycin was significantly reduced in the presence of efflux inhibitors such as thioridazine, chlorpromazine and verapamil. These same inhibitors decreased efflux of ethidium bromide and increased the retention of [14C]-erythromycin in these isolates. Finaly, the methods developed with the experimental models mentioned above allowed the study of the role of efflux pumps on M. tuberculosis strains induced to isoniazid resistance. This is described in Chapter VI of this Thesis, where it is demonstrated that induced resistance to isoniazid does not involve mutations in any of the genes known to be associated with isoniazid resistance, but an efflux system that is sensitive to efflux inhibitors. These inhibitors decreased the efflux of ethidium bromide and also reduced the minimum inhibitory concentration of isoniazid in these strains. Moreover, expression analysis showed overexpression of genes that code for efflux pumps in the induced strains relatively to the non-induced parental strains. In conclusion, the work described in this thesis demonstrates that efflux pumps play an important role in the development of drug resistance, namely in mycobacteria. A strategy to overcome efflux-mediated resistance may consist on the use of compounds that inhibit efflux activity, restoring the activity of antimicrobials that are efflux pump substrates, a useful approach particularly in TB where the most effective treatment regimens are becoming uneffective due to the increase of MDRTB/XDRTB.

Evolution of Drug Resistance: Insight on TEM -Lactamases Structure and Activity and Beta-Lactam Antibiotics

Extended-spectrum β-lactamases (ESBLs) prevalence was studied in the north of Portugal, among 193 clinical isolates belonging to citizens in a district in the boundaries between this country and Spain from a total of 7529 clinical strains. In the present study we recovered some members of Enterobacteriaceae family, producing ESBL enzymes, including Escherichia coli (67.9%), Klebsiella pneumoniae (30.6%), Klebsiella oxytoca (0.5%), Enterobacter aerogenes (0.5%), and Citrobacter freundii (0.5%). β-lactamases genes blaTEM, blaSHV, and blaCTX-M were screened by polymerase chain reaction (PCR) and sequencing approaches. TEM enzymes were among the most prevalent types (40.9%) followed by CTX-M (37.3%) and SHV (23.3%). Among our sample of 193 ESBL-producing strains 99.0% were resistant to the fourth-generation cephalosporin cefepime. Of the 193 isolates 81.3% presented transferable plasmids harboring genes. Clonal studies were performed by PCR for the enterobacterial repetitive intragenic consensus (ERIC) sequences. This study reports a high diversity of genetic patterns. Ten clusters were found for E. coli isolates and five clusters for K. pneumoniae strains by means of ERIC analysis. In conclusion, in this country, the most prevalent type is still the TEM-type, but CTX-M is growing rapidly.

Identification des réseaux transcriptionnnels de résistance aux antifongiques chez Candida albicans

Plusieurs souches cliniques de Candida albicans résistantes aux médicaments antifongiques azolés surexpriment des gènes encodant des effecteurs de la résistance appartenant à deux classes fonctionnelles : i) des transporteurs expulsant les azoles, CDR1, CDR2 et MDR1 et ii) la cible des azoles 14-lanostérol déméthylase encodée par ERG11. La surexpression de ces gènes est due à la sélection de mutations activatrices dans des facteurs de transcription à doigts de zinc de la famille zinc cluster (Zn2Cys6) qui contrôlent leur expression : Tac1p (Transcriptional activator of CDR genes 1) contrôlant l’expression de CDR1 et CDR2, Mrr1p (Multidrug resistance regulator 1), régulant celle de MDR1 et Upc2p (Uptake control 2), contrôlant celle d’ERG11. Un autre effecteur de la résistance clinique aux azoles est PDR16, encodant une transférase de phospholipides, dont la surexpression accompagne souvent celle de CDR1 et CDR2, suggérant que les trois gènes appartiennent au même régulon, potentiellement celui de Tac1p. De plus, la régulation transcriptionnelle du gène MDR1 ne dépend pas seulement de Mrr1p, mais aussi du facteur de transcription de la famille basic-leucine zipper Cap1p (Candida activator protein 1), un régulateur majeur de la réponse au stress oxydatif chez C. albicans qui, lorsque muté, induit une surexpression constitutive de MDR1 conférant la résistance aux azoles. Ces observations suggèrent qu’un réseau de régulation transcriptionnelle complexe contrôle le processus de résistance aux antifongiques azolés chez C. albicans. L’objectif de mon projet au doctorat était d’identifier les cibles transcriptionnelles directes des facteurs de transcription Tac1p, Upc2p et Cap1p, en me servant d’approches génétiques et de génomique fonctionnelle, afin de i) caractériser leur réseau transcriptionnel et les modules transcriptionnels qui sont sous leur contrôle direct, et ii) d’inférer leurs fonctions biologiques et ainsi mieux comprendre leur rôle dans la résistance aux azoles. Dans un premier volet, j’ai démontré, par des expériences de génétique, que Tac1p contrôle non seulement la surexpression de CDR1 et CDR2 mais aussi celle de PDR16. Mes résultats ont identifié une nouvelle mutation activatrice de Tac1p (N972D) et ont révélé la participation d’un autre régulateur dans le contrôle transcriptionnel de CDR1 et PDR16 dont l’identité est encore inconnue. Une combinaison d’expériences de transcriptomique et d’immunoprécipitation de la chromatine couplée à l’hybridation sur des biopuces à ADN (ChIP-chip) m’a permis d’identifier plusieurs gènes dont l’expression est contrôlée in vivo et directement par Tac1p (PDR16, CDR1, CDR2, ERG2, autres), Upc2p (ERG11, ERG2, MDR1, CDR1, autres) et Cap1p (MDR1, GCY1, GLR1, autres). Ces expériences ont révélé qu’Upc2p ne contrôle pas seulement l’expression d’ERG11, mais aussi celle de MDR1 et CDR1. Plusieurs nouvelles propriétés fonctionnelles de ces régulateurs ont été caractérisées, notamment la liaison in vivo de Tac1p aux promoteurs de ses cibles de façon constitutive et indépendamment de son état d’activation, et la liaison de Cap1p non seulement à la région du promoteur de ses cibles, mais aussi celle couvrant le cadre de lecture ouvert et le terminateur transcriptionnel putatif, suggérant une interaction physique avec la machinerie de la transcription. La caractérisation du réseau transcriptionnel a révélé une interaction fonctionnnelle entre ces différents facteurs, notamment Cap1p et Mrr1p, et a permis d’inférer des fonctions biologiques potentielles pour Tac1p (trafic et la mobilisation des lipides, réponse au stress oxydatif et osmotique) et confirmer ou proposer d’autres fonctions pour Upc2p (métabolisme des stérols) et Cap1p (réponse au stress oxydatif, métabolisme des sources d’azote, transport des phospholipides). Mes études suggèrent que la résistance aux antifongiques azolés chez C. albicans est intimement liée au métabolisme des lipides membranaires et à la réponse au stress oxydatif.

Semisynthetic aminoglycoside antibiotics : toward biomimetic synthesis, evasion of bacterial resistance and reduced toxicity

Les antibiotiques aminoglycosidiques sont des agents bactéricides de grande valeur et d’efficacité à large spectre contre les pathogènes Gram-positifs et Gram-négatifs, dont plusieurs membres naturels et semisynthétiques sont importants dans l’histoire clinique depuis 1950. Des travaux crystallographiques sur le ribosome, récompensés par le prix Nobel, ont démontré comment leurs diverses structures polyaminées sont adaptées pour cibler une hélice d’ARN dans le centre de codage de la sous-unité 30S du ribosome bactérien. Leur interférence avec l’affinité et la cinétique des étapes de sélection et vérification des tARN induit la synthèse de protéines à basse fidélité, et l’inhibition de la translocation, établissant un cercle vicieux d’accumulation d’antibiotique et de stress sur la membrane. En réponse à ces pressions, les pathogènes bactériens ont évolué et disséminé une panoplie de mécanismes de résistance enzymatiques et d’expulsion : tels que les N acétyltransférases, les O phosphotransférases et les O nucleotidyltransférases qui ciblent les groupements hydroxyle et amino sur le coeur des aminoglycosides; des méthyl-transférases, qui ciblent le site de liaison ribosomale; et des pompes d’expulsion actives pour l’élimination sélective des aminoglycosides, qui sont utilisés par les souches Gram-négatives. Les pathogènes les plus problématiques, qui présentent aujourd’hui une forte résilience envers la majorité des classes d’antibiotiques sur le bord de la pan-résistance ont été nommés des bactéries ESKAPE, une mnémonique pour Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa et Enterobacteriaceae. La distribution globale des souches avec des mécanismes de résistance envers les standards cliniques aminoglycosides, tels que la tobramycine, l’amikacine et la gentamicine, est comprise entre 20 et 60% des isolées cliniques. Ainsi, les aminoglycosides du type 4,6-disubstitués-2-deoxystreptamine sont inadéquats comme thérapies anti-infectieuses à large spectre. Cependant, la famille des aminoglycosides 4,5-disubstitués, incluant la butirosine, la neomycine et la paromomycine, dont la structure plus complexe, pourrait constituter une alternative. Des collègues dans le groupe Hanessian et collaborateurs d’Achaogen Inc. ont démontré que certains analogues de la paraomomycine et neomycine, modifiés par désoxygénation sur les positions 3’ et 4’, et par substitution avec la chaîne N1-α-hydroxy-γ-aminobutyramide (HABA) provenant de la butirosine, pourrait produire des antibiotiques très prometteurs. Le Chapitre 4 de cette dissertation présente la conception et le développement d’une stratégie semi-synthétique pour produire des nouveaux aminoglycosides améliorés du type 4,5 disubstitués, inspiré par des modifications biosynthétiques de la sisomicine, qui frustrent les mécanismes de résistance bactérienne distribuées globalement. Cette voie de synthèse dépend d’une réaction d’hydrogénolyse de type Tsuji catalysée par palladium, d’abord développée sur des modèles monosaccharides puis subséquemment appliquée pour générer un ensemble d’aminoglycosides hybrides entre la neomycine et la sisomicine. Les études structure-activité des divers analogues de cette nouvelle classe ont été évaluées sur une gamme de 26 souches bactériennes exprimant des mécanismes de résistance enzymatique et d’expulsion qui englobe l’ensemble des pathogènes ESKAPE. Deux des antibiotiques hybrides ont une couverture antibacterienne excellente, et cette étude a mis en évidence des candidats prometteurs pour le développement préclinique. La thérapie avec les antibiotiques aminoglycosidiques est toujours associée à une probabilité de complications néphrotoxiques. Le potentiel de toxicité de chaque aminoglycoside peut être largement corrélé avec le nombre de groupements amino et de désoxygénations. Une hypothèse de longue date dans le domaine indique que les interactions principales sont effectuées par des sels des groupements ammonium, donc l’ajustement des paramètres de pKa pourrait provoquer une dissociation plus rapide avec leurs cibles, une clairance plus efficace et globalement des analogues moins néphrotoxiques. Le Chapitre 5 de cette dissertation présente la conception et la synthèse asymétrique de chaînes N1 HABA β substitutées par mono- et bis-fluoration. Des chaînes qui possèdent des γ-N pKa dans l’intervalle entre 10 et 7.5 ont été appliquées sur une neomycine tétra-désoxygénée pour produire des antibiotiques avancés. Malgré la réduction considérable du γ N pKa, le large spectre bactéricide n’a pas été significativement affecté pour les analogues fluorés isosteriques. De plus, des études structure-toxicité évaluées avec une analyse d’apoptose propriétaire d’Achaogen ont démontré que la nouvelle chaîne β,β difluoro-N1-HABA est moins nocive sur un modèle de cellules de rein humain HK2 et elle est prometteuse pour le développement d’antibiotiques du type neomycine avec des propriétés thérapeutiques améliorées. Le chapitre final de cette dissertation présente la proposition et validation d’une synthèse biomimétique par assemblage spontané du aminoglycoside 66-40C, un dimère C2 symétrique bis-imine macrocyclique à 16 membres. La structure proposée du macrocycle a été affinée par spectroscopie nucléaire à un système trans,trans-bis-azadiène anti-parallèle. Des calculs indiquent que l’effet anomérique de la liaison α glycosidique entre les anneaux A et B fournit la pré-organisation pour le monomère 6’ aldéhydo sisomicine et favorise le produit macrocyclique observé. L’assemblage spontané dans l’eau a été étudié par la dimérisation de trois divers analogues et par des expériences d’entre croisement qui ont démontré la généralité et la stabilité du motif macrocyclique de l'aminoglycoside 66-40C.

Caractérisation génétique, phénotypique et formation de biofilm des souches de Candida albicans répondant ou non au farnésol

Candida albicans, le pathogène opportuniste le plus commun, peut subir des transitions morphologiques entre la forme levure et la forme hyphe, jouant un rôle dans la formation de biofilm. Le farnésol, un lipide endogène produit par C. albicans, est une molécule de quorum sensing qui inhibe cette transition morphologique. Certaines souches ne répondent pas au farnésol et nous avons vérifié les hypothèses que : 1) l’isolat clinique SC5314, la souche la mieux caractérisée, est un répondeur au farnésol; 2) la germination, la croissance et la formation de biofilm des non répondeurs diffèrent des répondeurs; 3) l’absence de la réponse au farnésol se manifeste en dehors de conditions de culture précises; 4) le farnésol agit via un récepteur nucléaire qui présente des altérations chez les non répondeurs; 5) la différence de la réponse au farnésol entre les souches s’explique par des variations au niveau transcriptionnel de certains gènes (CHK1, HST7, CPH1, GAP1, RAM2 et DPP3). Les non répondeurs produisent un plus grand nombre d’hyphes, forment 60% plus de biofilm et croissent 50% moins vite que les répondeurs. La souche SC5314 se comporte comme un répondeur. L’absence de la réponse au farnésol se manifeste indépendamment des conditions de culture. Cependant, elle ne s’explique pas par une différence dans le niveau d’expression des gènes proposés, excepté pour DPP3 qui est surexprimé chez le non répondeur ATTC® 36802, suggérant ainsi une surproduction de farnésol chez cette souche. De plus, si le farnésol agit via un récepteur nucléaire, il sera d’un type non décrit précédemment.

Étude de la résistance aux antibiotiques des entérocoques d'origine animale du Québec

Les entérocoques font partie de la flore normale intestinale des animaux et des humains. Plusieurs études ont démontré que les entérocoques d’origine animale pouvaient représenter un réservoir de gènes de résistance aux antibiotiques pour la communauté humaine et animale. Les espèces Enterococcus faecalis et Enterococcus faecium sont importantes en santé publique; elles sont responsables d’environ 12% de toutes les infections nosocomiales aux États-Unis. Au Canada, les cas de colonisation et/ou d’infections à entérocoques résistants à la vancomycine ont plus que triplé de 2005 à 2009. Un total de 387 isolats E. faecalis et E. faecium aviaires, et 124 isolats E. faecalis porcins ont été identifiés et analysés pour leur susceptibilité aux antibiotiques. De hauts pourcentages de résistance envers les macrolides et les tétracyclines ont été observés tant chez les isolats aviaires que porcins. Deux profils phénotypiques prédominants ont été déterminés et analysés par PCR et séquençage pour la présence de gènes de résistance aux antibiotiques. Différentes combinaisons de gènes de résistance ont été identifiées dont erm(B) et tet(M) étant les plus prévalents. Des extractions plasmidiques et des analyses par hybridation ont permis de déterminer, pour la première fois, la colocalisation des gènes erm(B) et tet(M) sur un plasmide d’environ 9 kb chez des isolats E. faecalis porcins, et des gènes erm(B) et tet(O) sur un plasmide de faible poids moléculaire d’environ 11 kb chez des isolats E. faecalis aviaires. De plus, nous avons démontré, grâce à des essais conjugatifs, que ces plasmides pouvaient être transférés. Les résultats ont révélé que les entérocoques intestinaux aviaires et porcins, lesquels peuvent contaminer la viande à l’abattoir, pouvaient représenter un réservoir de gènes de résistance envers la quinupristine-dalfopristine, la bacitracine, la tétracycline et les macrolides. Afin d’évaluer l’utilisation d’un antisérum polyclonal SA dans l’interférence de la résistance à de fortes concentrations de bacitracine (gènes bcrRAB), lors d’un transfert conjugatif répondant aux phéromones, un isolat multirésistant E. faecalis aviaire a été sélectionné. Après induction avec des phéromones produites par la souche réceptrice E. faecalis JH2-2, l’agrégation de la souche donatrice E. faecalis 543 a été observée ainsi que des fréquences de transfert élevées en bouillon lors d’une courte période de conjugaison. Le transfert conjugatif des gènes asa1, traB et bcrRAB ainsi que leur colocalisation a été démontré chez le donneur et un transconjugant T543-1 sur un plasmide de 115 kb par électrophorèse à champs pulsé (PFGE) et hybridation. Une CMI de > 2 048 µg/ml envers la bacitracine a été obtenue tant chez le donneur que le transconjuguant tandis que la souche réceptrice JH2-2 démontrait une CMI de 32 µg/ml. Le séquençage des gènes asa1, codant pour la substance agrégative, et traB, une protéine régulant négativement la réponse aux phéromones, a révélé une association de cet élément génétique avec le plasmide pJM01. De plus, cette étude présente qu’un antisérum polyclonal SA peut interférer significativement dans le transfert horizontal d’un plasmide répondant aux phéromones codant pour de la résistance à de fortes doses de bacitracine d’une souche E. faecalis aviaire multirésistante. Des isolats cliniques E. faecium d’origine humaine et canine ont été analysés et comparés. Cette étude rapporte, pour la première fois, la caractérisation d’isolats cliniques E. faecium résistants à l’ampicilline (EFRA) d’origine canine associés à CC17 (ST17) au Canada. Ces isolats étaient résistants à la ciprofloxacine et à la lincomycine. Leur résistance envers la ciprofloxacine a été confirmée par la présence de substitutions dans la séquence en acides aminés des gènes de l’ADN gyrase (gyrA/gyrB) et de la topoisomérase IV (parC/parE). Des résistances élevées envers la gentamicine, la kanamycine et la streptomycine, et de la résistance envers les macrolides et les lincosamides a également été observées. La fréquence de résistance envers la tétracycline était élevée tandis que celle envers la vancomycine n’a pas été détectée. De plus, aucune résistance n’a été observée envers le linézolide et la quinupristine-dalfopristine. Les données ont démontré une absence complète des gènes esp (protéine de surface des entérocoques) et hyl (hyaluronidase) chez les isolats canins EFRA testés tandis qu’ils possédaient tous le gène acm (adhésine de liaison au collagène d’E. faecium). Aucune activité reliée à la formation de biofilm ou la présence d’éléments CRISPR (loci de courtes répétitions palindromiques à interespaces réguliers) n’a été identifiée chez les isolats canins EFRA. Les familles de plasmide rep6 and rep11 ont significativement été associées aux isolats d’origine canine. Les profils PFGE des isolats d’origine humaine et canine n'ont révélé aucune relation (≤ 80%). Ces résultats illustrent l'importance d'une utilisation judicieuse des antibiotiques en médecine vétérinaire afin d’éviter la dissémination zoonotique des isolats EFRA canins. Nous pensons que ces résultats contribueront à une meilleure compréhension des mécanismes de résistance aux antibiotiques et de leurs éléments mobiles ainsi qu’à de nouvelles stratégies afin de réduire le transfert horizontal de la résistance aux antibiotiques et des facteurs de virulence.

Campylobacter dans différents environnements aquatiques : quantification et génotypage afin de mieux évaluer les risques potentiels d’infection pour l’être humain

Campylobacter est l’agent pathogène zoonotique responsable de la majorité des gastro-entérites d’origine bactérienne chez l’homme. Les produits de volaille représentent la principale source d’infection; toutefois, l’exposition peut également découler de contacts directs avec les animaux ou avec l’eau. Une forte variation saisonnière est présente dans les cas rapportés, qui n’est toujours pas élucidée : les eaux environnementales, sources d’infection connues, sont soupçonnées. Cette étude transversale a été réalisée dans la région Sud-Est du Québec (Canada) où Campylobacter fut quantifié et génotypé à partir de différentes sources d’eau (eaux de captage, récréatives et usées) et de cas cliniques afin d’évaluer les risques potentiels posé par l’eau environnementale. Différents essais PCR en temps réel furent appliqués à l’eau environnementale et comparés: 2 ont été sélectionnés pour leur spécificité et sensibilité de quantification. Les courbes standards ont été calibrées en utilisant la PCR digitale pour déterminer précisément les concentrations. Les isolats environnementaux et cliniques furent comparés génétiquement en utilisant le CGF (« comparative genomic fingerprinting »). Les eaux usées étaient plus contaminées que les eaux de captage et récréatives (3.9Log, 1.7Log et 1.0Log cellules/L en moyenne, respectivement). Six pour cent des isolats d’eaux environnementales étaient génétiquement similaires (100 % homologie) aux isolats cliniques. Les cas cliniques de campylobactériose d’été montraient des isolats avec davantage de similarités génétiques avec les isolats retrouvés dans l’eau environnementale comparativement aux autres saisons (p<0.01). Les faibles concentrations et similarités génétiques entre les isolats d’eau et cliniques suggèrent un risque de transmission possible, mais faible.