Orpotrin: A novel vasoconstrictor peptide from the venom of the Brazilian Stingray Potamotrygon gr. orbignyi

Characterization of the peptide content of venoms has a number of potential benefits for basic research, clinical diagnosis, development of new therapeutic agents, and production of antiserum. In order to analyze in detail the peptides and small proteins of crude samples, techniques such as chromatography and mass spectrometry have been employed. The present study describes the isolation, biochemical characterization, and sequence determination of a novel peptide, named Orpotrin from the venom of Potamotrygon gr. orbignyi. The natural peptide was shown to be effective in microcirculatory environment causing a strong vasoconstriction. The peptide was fully sequenced by de novo amino acid sequencing with mass spectrometry and identified as the novel peptide. Its amino acid sequence, HGGYKPTDK, aligns only with creatine kinase residues 97-105, but has no similarity to any bioactive peptide. Therefore, possible production of this peptide from creatine kinase by limited proteolysis is discussed. Taken together, the results indicate the usefulness of this single-step approach for low molecular mass compounds in complex samples such as venoms. (c) 2006 Elsevier B.V. All rights reserved.

Subcellular localization of the coat protein in tobacco cells infected by cucumber mosaic virus isolated from Catharanthus roseus

Electron microscopy and immunolabelling with antiserum specific to cucumber mosaic virus coat protein were used to examine tobacco leaf cells infected by cucumber mosaic virus isolated from Catharanthus roseus (CMV-Cr). Crystalline and amorphous inclusions in the vacuoles were the most obvious cytological modifications seen. Immunogold labelling indicated that the crystalline inclusion was made up of virus particles and amorphous inclusions contained coat protein. Rows of CMV-Cr particles were found between membranes of dictyosomes, but membranous bodies and tonoplast-associated vesicles were not evident. Virus particles and/or free coat protein were easily detected in the cytoplasm by immunolabelling. No gold labelling was found within nuclei, chloroplasts and mitochondria.

Biological and molecular characterization of an isolate of Tobacco streak virus obtained from soybeans in Brazil

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)

Detecção do Southern bean mosaic virus no Paraná, e separação do Bean rugose mosaic virus em feijoeiro

Em lavouras de feijoeiro (Phaseolus vulgaris) da cultivar Carioca Comum, no município de Londrina, Estado do Paraná, foram encontradas plantas com sintomas de necrose da haste, mosaico clorótico leve e porte reduzido, semelhantes aos sintomas causados por infecção viral. Exames de microscopia eletrônica revelaram a presença de partículas isométricas. em testes de imunodifusão dupla em gel de ágar os extratos foliares de plantas infetadas reagiram positivamente com anti-soro específico para o Southern bean mosaic virus (SBMV). O vírus foi purificado e a massa molecular de sua proteína capsidial foi estimada em 30 kDa, valor esperado para proteínas do capsídeo de vírus do gênero Sobemovirus. A gama de hospedeiras do SBMV isolado no Paraná foi restrita ao feijoeiro e a algumas cultivares de soja (Glycine max). A separação de dois vírus isométricos comuns em infecções mistas no feijoeiro foi possível através da reação de imunidade ao SBMV apresentada por Crotalaria sp, Chenopodium quinoa e Mucuna deeringiana, e da reação de susceptibilidade dessas mesmas hospedeiras ao Bean rugose mosaic virus (BRMV).

Identificação e caracterização de um potyvírus isolado de Zinnia elegans

O presente trabalho teve como objetivo a identificação e caracterização de um potyvírus isolado de Zinnia elegans, na Região Noroeste do Estado de São Paulo. O potyvírus foi transmitido por inoculação mecânica e apresentou uma gama restrita de hospedeiras sendo que as espécies mais afetadas pertencem à família Asteraceae. em SDS-PAGE, a massa molecular da proteína capsidial (CP) foi estimada em 33 kDa e, em Western-blot, reagiu com anti-soro para o Bidens mosaic virus (BiMV). Um fragmento de aproximadamente 820 pb foi amplificado por RT/PCR, clonado e seqüenciado. O fragmento, que inclui o gene da proteína capsidial, mostrou similaridade de aminoácidos do core da CP variando de 55% (Tobacco vein mottling virus, TVMV) a 95% (Sunflower chlorotic mottle virus, SuCMoV) e da CP completa de 55% (TVMV) a 91% (SuCMoV). Na região N-terminal, o potyvírus de Zinnia tem uma deleção de quatro aminoácidos (posições 9 a 12 após o sítio de clivagem entre a proteína NIb e a CP) quando comparada com a seqüência do SuCMoV. A análise filogenética agrupou o potyvírus de Zinnia e o SuCMoV em um mesmo ramo em 100% das réplicas, mostrando uma relação de parentesco muito próxima entre esses dois vírus. Os resultados obtidos no presente trabalho demonstraram que o potyvírus de Zinnia e o SuCMoV são estirpes do mesmo vírus. Sugere-se o nome Sunflower chlorotic mottle virus, isolado Zinnia (SuCMoV-Zi), ao potyvírus encontrado em Z. elegans no Brasil.

Caracterização de rizóbios (Bradyrhizobium japonicum) e produtividade da soja

Fez-se um estudo de campo sobre a competição e a dinâmica de ocupação de sítios de nodulação de estirpes de Bradyrhizobium japonicum naturalizadas ou inoculadas em sementes. O ensaio foi instalado em Latossolo Vermelho Escuro utilizando blocos ao acaso, com 8 repetições dos seguintes tratamentos: A) controle sem inoculante; B) controle sem inoculante, com adubação nitrogenada; C) inoculante com cerca de 107 rizóbios/g (8g/kg de semente); D) inoculação com cerca de 1010 rizóbios/g (8g/kg de semente). Os inoculantes foram preparados com as estirpes recomendadas na ocasião, SMS - 314 (= SEMIA 587) e SMS - 463 (= SEMIA 5019 = 29W). A identificação das estirpes formadoras dos nódulos foi realizada em amostras coletadas aos 10, 42 e 70 dias após a germinação. Realizou-se também a colheita dos grãos para avaliação da produção e de N-total. A tipificação sorológica foi feita com antissoro preparado a partir de antígenos constituídos pelas seguintes estirpes de Bradyrhizobium japonicum: SEMIA 587, SEMIA 5019 e SEMIA 5052 (= USDA 6), utilizando-se da técnica immunodot. A caracterização das estirpes dos nódulos revelou um pequeno aumento (6,2 a 8,7%), na ocorrência de nódulos formados pelas estirpes recomendadas, nas três épocas de amostragem. Houve expressiva participação da estirpe 5052 (= sorogrupo USDA 6) na formação dos nódulos. Verificou-se que as estirpes naturalizadas podem contribuir de forma diferente na formação dos nódulos durante o ciclo, dependendo da amostragem.

Breakdown of resistance in sweet pepper against Pepper yellow mosaic virus in Brazil

Plantas de Capsicum annuum cv. Magali R, resistentes ao Pepper yellow mosaic virus (PepYMV), exibindo sintomas severos de mosaico amarelo, malformação foliar e subdesenvolvimento foram encontradas em plantios na região de Lins, SP, Brasil, em 2003/04. Partículas semelhantes àquelas do gênero Potyvirus foram observadas em extrato foliar de planta infectada examinado em microscópio eletrônico de transmissão. O extrato foliar também reagiu com anti-soro contra o PepYMV em PTA-ELISA. Além de C. annuum cv. Magali R, esse potyvirus também infectou sistemicamente C. annuum cv. Rubia R, que é resistente ao PepYMV. A seqüência de nucleotídeos de parte do gene da proteína capsidial (CP) desse potyvirus apresentou 96-98% de identidade com a de outros isolados do PepYMV. A seqüência parcial de nucleotídeos da região 3' não traduzida (3' NTR) apresentou 94-96% de identidade com a do PepYMV. Esses resultados são indicativos de que o potyvirus que quebrou a resistência em pimentão é um isolado do PepYMV.

Endocrine profiles and ovulation rate of cows superovulated with FSH following passive immunization against steroid free-bovine follicular fluid

Dez vacas multíparas, secas, foram distribuídas aleatoriamente em dois grupos de cinco animais cada. Nos dias 8 a 12 do diestro, o primeiro grupo recebeu 100 ml de anti-soro contra líquido folicular livre de esteróides (anti-LFb) produzido em ovelhas ovariectomizadas. O segundo grupo (controle) recebeu 100 ml de soro de ovelhas não-imunizadas. Seis horas após a aplicação, os dois grupos foram superovulados com FSH (18 NIH-FSH-S1 unidades) e LH (0,29 NIH-LH-S1 unidades) administrados em quantidades decrescentes durante quatro dias. Na manhã do terceiro dia, foi administrada uma dose luteolítica de cloprostenol. Duas inseminações foram realizadas 48 e 60 horas após. Os embriões foram recuperados pelo método cervical 7 dias após a primeira inseminação. Amostras de sangue foram coletadas durante todo o período experimental para determinar, por radioimunoensaio, as concentrações plasmáticas de FSH, LH e progesterona. Todas as vacas do grupo imunizado e 3 do grupo controle apresentaram mais de 2 CL. Não existiu diferença significativa (P>0,05) na taxa de ovulação entre os grupos imunizado e controle (14,4 e 9,9, respectivamente). O número de embriões recuperado não foi significativamente diferente (P>0,05) entre os grupos, embora o grupo imunizado tenha apresentado maior número de embriões transferíveis (3,4 ± 1,0 versus 0,8 ± 0,4, P<0,05). As concentrações de gonadotrofinas plasmáticas não foram correlacionadas com a taxa de ovulação ou com o número de embriões recuperados. As concentrações de progesterona plasmática foram positivamente correlacionadas (r = 0,88, P<0,01) com a taxa de ovulação. Os resultados sugerem que o anti-LFb, aplicado antes da superovulação, não reduz a variabilidade da resposta ovariana.

Effect of acute heat stress on heat shock protein 70 messenger RNA and on heat shock protein expression in the liver of broilers

1. The synthesis of heat shock protein 70 (Hsp70) mRNA and the expression of Hsp70 in the liver of broiler chickens submitted to acute heat stress (35 degrees C for 5 h) was investigated.2. Hsp70 expression was detected by SDS-PAGE and Western blot analysis using a polyclonal antiserum against Hsp70 of Blastocladiella emersonii. The specific signal of Hsp70 mRNA was analysed by Northern blot using as probe a Hsp70 cDNA of B. emersonii.3. An increase in the amount of Hsp70 was detected from the first up to the fifth hour of acute heat exposure. This increase in the amount of Hsp70 was accompanied by an increase in Hsp70 mRNA which peaked at 3 h.4. This study shows that the heat induced increase in Hsp70 mRNA and protein in broiler liver, in vivo, are time dependent, similar to that in mammals.

Urocortin in the central nervous system of a primate (Cebus apella): Sequencing, immunohistochemical, and hybridization histochemical characterization

The urocortin (UCN)-like immunoreactivity and UCN mRNA distribution in various regions of the nonprimate mammalian brain have been reported. However, the Edinger-Westphal nucleus (EW) appears to be the only brain site where UCN expression is conserved across species. Although UCN peptides are present throughout vertebrate phylogeny, the functional roles of both UCN and EW remain poorly understood. Therefore, a study focused on UCN system organization in the primate brain is warranted. By using immunohistochemistry (single and double labeling) and in situ hybridization, we have characterized the organization of UCN-expressing cells and fibers in the central nervous system and pituitary of the capuchin monkey (Cebus apella). In addition, the sequence of the prepro-UCN was determined to establish the level of structural conservation relative to the human sequence. To understand the relationship of acetylcholine cells in the EW, a colocalization study comparing choline acetyltransferase (ChAT) and UCN was also performed. The cloned monkey prepro-UCN is 95% identical to the human preprohormone across the matched sequences. By using an antiserum raised against rat UCN and a probe generated from human cDNA, we found that the EW is the dominant site for UCN expression, although UCN mRNA is also expressed in spinal cord lamina IX. Labeled axons and terminals were distributed diffusely throughout many brain regions and along the length of the spinal cord. of particular interest were UCN-immunoreactive inputs to the medial preoptic area, the paraventricular nucleus of the hypothalamus, the oral part of the spinal trigeminal nucleus, the flocculus of the cerebellum, and the spinal cord laminae VII and X. We found no UCN hybridization signal in the pituitary. In addition, we observed no colocalization between ChAT and UCN in EW neurons. Our results support the hypothesis that the UCN system might participate in the control of autonomic, endocrine, and sensorimotor functions in primates.

Leukotoxic activity of Actinobacillus actinomycetemcomitans isolated from Brazilian periodontal patients

The leukotoxic activity of 31 Actinobacillus actinomycetemcomitans isolates from Brazilian periodontal patients [nine from Localized Juvenile Periodontitis (LJP) patients, 22 from patients with AIDS-associated Necrotizing Ulcerative Periodontitis (AIDS/NUP)], and from the reference strain A. actinomycetemcomitans ATCC43718, were analyses for their cytotoxicity on human monocytes. A cytotoxicity inhibitory assay of the isolate P35 and the reference strain ATCC 43718 with sera from ten LJP patients and ten healthy subjects was also performed and leukotoxin reactivity was evaluated with serum from rabbits immune to leukotoxin from A. actinomycetemcomitans ATCC 43718. The cytotoxicity results were not statistically different among groups of A. actinomycetemcomitans isolates from LJP and AIDS/NUP patients, but the individual analysis of each isolate showed two isolates (P24 and P35) from LJP patients with high leukotoxic activity (P<0.05). Also, a high leucotoxic inhibitory effect with LJP patients' sera compared with healthy subjects with sonic extract from isolate P35 (P<0.05) and the reactivity of rabbit antiserum to leukotoxin were observed. Both leukotoxic and non-leukotoxic activity is more frequent in PJL than AIDS/NUP patients. Even though A. actinomycetemcomitans exhibits leukotoxic activity, there is an immune response to the leucotoxin in LJP patients. (C) 2000 Academic Press.

Effect of gamma irradiation on the behavioral properties of crotoxin

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Type 2 heat-labile enterotoxin (LT-II)-producing Escherichia coli isolated from ostriches with diarrhea

The culture supernatant of Escherichia coli, isolated from ostriches with diarrhea in Brazil, caused elongation in Vero cell, rounding in Chinese hamster ovary (CHO) cells and a cytoplasmic vacuolation in ostrich embryo fibroblasts (OEF), but it was not cytotoxic for chicken embryo fibroblasts (CEF). These effects were not neutralized by antiserum to cholera toxin. Polymerase chain reaction assays showed that the ostrich E.coli contained the gene encoding (eltII-A), but not those for type 1 heat-labile enterotoxin (eltA), heat-stable enterotoxins (estA, estB), verocytotoxins (stx-I, stx-II), or cytotoxic necrotizing factors (cnf 1, cnf 2). All isolates belonged to serotype O15:H8. The enteropathogenic relevance of LT-II in ostrich diarrhea remains undetermined. (C) 2004 Elsevier B.V. All rights reserved.