Produção de anticorpos para cafeína e seu derivado cafeinidina

São apresentados dados sobre a conjugação de cafeína e seu derivado cafeinidina com albumina de soro bovino e sua utilização para a produção de anticorpos. Galinhas poedeiras foram imunizadas e as globulinas extraídas das gemas dos ovos. Por ensaios de imunoprecipitação pode-se verificar que ambos anticorpos reagiram com seus respectivos antígenos, cafeína e cafeinidina. Também verificou-se que a posição do radical metil em mono e dimetilxantinas era importante para o reconhecimento antígeno-anticorpo. Metilação na posição N-3 pareceu ser determinante para o reconhecimento pelo anticorpo produzido para o conjugado cafeinidina-BSA. Por outro lado, metilação na posição N-7 foi importante para o conjugado cafeína-BSA. Discute-se as vantagens de um anticorpo sobre o outro e a possibilidade de seu emprego em testes imunológicos para determinação de alcalóides purínicos totais em material vegetal e seus derivados alimentícios.

Detecção de podocitúria em pacientes com nefrite lúpica

INTRODUÇÃO: A podocitúria tem sido detectada em doenças glomerulares, tais como em nefrite lúpica (NL), em que a proteinúria é uma manifestação importante, e sua ocorrência parece limitar-se à fase ativa da doença. OBJETIVO: Avaliar a podocitúria por imunofluorescência em pacientes portadores de NL e verificar possível associação com atividade clínica da doença. MÉTODOS: Foram avaliados 56 pacientes com NL. Os pacientes foram divididos em três grupos de acordo com o grau de atividade clínica: Grupo B, sem atividade (n = 17); Grupo C, com atividade discreta (n = 29) e Grupo D, moderada a grave (n = 10). Como grupo controle, foram incluídos 29 indivíduos saudáveis (Grupo A). A podocitúria foi estudada por meio de imunofluorescência indireta, usando-se anticorpos primários antipodocina, nefrina e sinaptopodina, e anticorpo secundário conjugado à FITC. Também foram avaliados os níveis de creatinina sérica e da relação proteína/creatinina (P/C) urinária, assim como a presença de hematúria e leucocitúria. RESULTADOS: A podocitúria com antipodocina e com antissinaptopodina correlacionou-se estatisticamente com a relação P/C (p = 0,001 e p = 0,013, respectivamente). Tanto a podocitúria com antipodocina, quanto a relação P/C, apresentaram correlação significante (p < 0,001) com a graduação de atividade da doença na NL, diferentemente do que se observou com os outros dois anticorpos, antinefrina e antissinaptopodina. CONCLUSÃO: Nossos achados sugerem que a pesquisa de podocitúria com anticorpos antipodocina poderia ser útil no acompanhamento de pacientes com NL, fornecendo dados relevantes quanto à atividade da doença.

Glomerulopatia membranosa: novos conhecimentos na fisiopatologia e possibilidades terapeuticas

Avanços dos conhecimentos moleculares na última década têm permitido a identificação de proteínas podocitárias que atuariam como alvos antigênicos na glomerulonefrite membranosa (GNM). Estudos envolvendo anticorpos contra estruturas podocitárias tem promovido o conceito autoimune da forma idiopática desta glomerulopatia. Neste contexto, o receptor de fosfolipase A2 do tipo M (PLA2R) tem merecido destaque como o primeiro e mais importante autoantígeno descrito na GNM idiopática humana. A presença do anticorpo anti-PLA2R tem sido destacada entre 70% e 89% de portadores da GNM idiopática, diferenciando das formas secundárias. Diversos estudos têm sugerido a detecção do anti-PLA2R como diagnóstico e apontado a correlação de seus níveis circulantes com a atividade clínica e resposta terapêutica. Entretanto, a coexistência de outros autoanticorpos sugere uma complexa via patogênica envolvendo diferentes antígenos podocitários. Estudos adicionais são necessários para esclarecer o tempo de aparecimento e o papel de cada anticorpo antipodócito no diagnóstico e progressão da GNM.

Síndrome Hemolítico-Urêmica na infância

O grupo de doenças que podem manifestar-se com MAT podem apresentar superposição clínica, dificultando o diagnóstico diferencial. Entre estas ressaltamos a PTT e SHU, sendo que esta última pode ocorrer pela ação de toxinas, doenças sistêmicas, hiperativação da via alterantiva descontrolada por alterações nas proteínas reguladoras desta via (SHUa) e por fim, idiopática. Deve-se proceder a uma série de exames para diferenciá-las. Ressaltando que SHUa é um diagnóstico de exclusão de outras causas de MAT. O tratamento da SHUa com infusão de plasma ou plasmaferese, resulta na maior parte dos casos com boa resposta, especialmente hematológica a curto-prazo, porém é uma doença grave e devastadora e, pode levar a óbito e doença renal crônica terminal. Tratamento com plasma apresenta grande recorrência da doença a longo-prazo e evolução renal desfavorável. Eculizumab, um anticorpo monoclonal anti-C5, tem surgido como uma esperança no prognóstico a curto e a longo-prazo nestes pacientes.

Podocitúria na doença de Fabry

Resumo Introdução: A doença de Fabry (DF) é uma desordem lisossômica ligada ao cromossomo X ocasionada por mutações no gene que codifica a enzima lisossômica α-galactosidase A (α-GAL). A redução ou ausência da atividade dessa enzima leva ao acúmulo progressivo de gb3. A doença renal é uma importante consequência clínica da acumulação de Gb3. Podócito é o tipo celular mais afetado na doença renal, que mostra apenas uma resposta parcial à Terapia de Reposição Enzimática. Além disso, a disfunção podocitária é a principal contribuinte para a perda progressiva da função renal e pode ser encontrada alterada mesmo antes do início da microalbuminúria. Assim, a podocitúria na DF pode ser uma ferramenta importante para prever a doença renal. Objetivo: O objetivo deste estudo foi quantificar a excreção urinária de podócitos em pacientes com DF (V269M, n = 14) e controles saudáveis (n = 40), e relacioná-las com as variáveis sexo, idade, tempo de terapia e a razão albumina: creatinina (AUC). Métodos: Podócitos urinários foram identificados utilizando imunofluorescência para podocalixina e DAPI. O número de células podocalixina positivo foi contado e o número médio foi utilizado (faixa normal 0-0.6 podócitos/mL). Resultados: O número médio de podócitos na urina de pacientes com DF foi significativamente maior do que os controles saudáveis (p < 0.0001). Observou-se uma correlação positiva entre podocitúria e AUC (p = 0.004; r2 = 0.6417). Conclusão: A podocitúria pode ser uma ferramenta adicional para avaliar a progressão da doença renal em pacientes que se espera que tenha um fenótipo mais agressivo.

Patogênese e tratamento da glomerulonefrite - uma atualização

Resumo A presente revisão traz os conceitos mais atuais acerca dos fatores de risco genéticos, eventos etiológicos, respostas nefritogênicas e tratamento dos principais tipos de glomerulonefrite (GN) imunomediada. Tais patologias incluem GN pós-infecciosa, nefropatia por IgA, doença por anticorpo antimembrana basal glomerular (anti-MBG), vasculite associada a ANCA (VAA) e nefrite lúpica. Apesar da(s) etiologia(s) da maioria dos casos de GN permanecer indefinida, acredita-se que seu início se deva, em grande parte, a insultos ambientais, particularmente na forma de processos infecciosos que deflagram respostas de hospedeiro em indivíduos geneticamente suscetíveis, levando assim a quadros de GN. A concepção mecanicista em torno dessas patologias evoluiu a partir da visão mais antiga de que a maioria seria consequência do aprisionamento glomerular de complexos imunes pré-formados para a percepção atual de que as mesmas, em sua maioria, são doenças autoimunes por natureza mediadas por anticorpos e linfócitos T reativos a auto-antígenos. O tratamento da GN não tem acompanhado os progressos na compreensão de sua patogênese. Os papéis recentemente atribuídos a mediadores mais antigos como complemento e proteínas reguladoras do complemento lançam luz sobre novos alvos terapêuticos.

Um caso de recuperação da função renal na síndrome hemolítico-urêmica tratada com eculizumab

Resumo A síndrome hemolítico-urêmica atípica (SHUa) é uma doença grave, pouco prevalente, com acometimento em qualquer idade e apresentação esporádica ou familiar. A SHUa é causada por uma ativação descontrolada do sistema complemento. A plasmaférese foi o tratamento padronizado por anos, com resultados desfavoráveis, levando à doença renal crônica terminal ou morte em aproximadamente 40% dos pacientes durante as primeiras manifestações clínicas. O Eculizumab é um anticorpo monoclonal humanizado contra o componente C5 do complemento e nos últimos anos vem sendo utilizado como novo arsenal terapêutico com resultados promissores. O presente caso descreve uma paciente adulta tratada com eculizumab em que se obteve resultados satisfatórios evitando-se potenciais riscos e aumento da morbidade com o procedimento de plasmaférese.

Avaliação da relevância da gp63 de Leishmania braziliensis e Leishmania infantum na interação com o hospedeiro invertebrado

A gp63, metalopeptidase altamente abundante na superfície de Leishmania, contribui para uma infinidade de funções bem estabelecidas na interação deste parasito com o hospedeiro mamífero. No entanto, apesar desta molécula ser abundantemente expressa na superfície das formas promastigotas, encontradas no inseto vetor, pouco é conhecido sobre as funções desempenhadas por essa metalopeptidase no flebotomíneo. Nosso grupo de pesquisa, utilizando abordagens bioquímicas, tem demonstrado que moléculas de gp63 de vários tripanosomatídeos não patogênicos ao homem estão implicadas na adesão ao intestino de insetos hospedeiros. Aqui, nós analisamos o papel da gp63 na interação de Leishmania braziliensis e Leishmania infantum, com os seus respectivos insetos hospedeiros, Lutzomyia intermedia e Lu. longipalpis e com a linhagem celular derivada de Lu. longipalpis (LL5). Os intestinos dissecados de insetos foram prétratados ou não com o fosfoglicano (PG) puro derivado do lipofosfoglicano e colocados para interagir com os parasitos. Em paralelo, promastigotas de L. braziliensis e L. infantum foram pré-tratados com anticorpo anti-gp63 ou com inibidores da metalopeptidase. Depois disso, os parasitos foram colocados para interagir com os intestinos dissecados de insetos ou com as células LL5 Como esperado, o PG praticamente elimina a capacidade dos parasitos de se ligarem ao intestino dos insetos. Todos os tratamentos relacionados com a gp63 também provocaram uma diminuição acentuada nestes ensaios de ligação. Além disso, o sobrenadante de cultura de L. braziliensis foi concentrado por precipitação com sulfato de amônio e analisado por SDS-PAGE e SDS-PAGE-gelatina. Observamos uma degradação proteolítica, por volta de 63 kDa, que corresponde à enzima gp63 já identificada e caracterizada em várias espécies de Leishmania. Esses resultados em conjunto demonstram uma possível participação da gp63 na interação com o inseto vetor e nos estimulam a continuar estudando o papel dessa metalopeptidase no ciclo de vida de Leishmania

Avaliação da expressão do gene MDR1 (Glicoproteína-P) e atividade de efluxo em células do sangue periférico de pacientes sob tratamento da tuberculose multirresistente

O regime de tratamento com múltiplas drogas é correspondente a uma interação de drogas que pode causar efeitos adversos e falha no tratamento. Essa interação pode gerar modificações funcionais dos transportadores de membrana e por consequência a biodisponibilidade das drogas durante o tratamento. Dentre os transportadores de drogas transmembranares está a glicoproteína-P (P-gp), uma proteína de 170KD, produto do gene MDR1, caracterizada como uma \201CATP Binding cassete\201D (ABC). Seu papel está muito bem definido nas células neoplásicas multirresistentes a drogas, assim como sua relação com as drogas para o tratamento da infecção pelo HIV. Entretanto, pouco tem sido estudado sobre esta bomba de efluxo na tuberculose multirresistente (TBMR). Neste estudo analisamos por citometria de fluxo sua expressão e atividade de efluxo nos monócitos, principal célula relacionada com a tuberculose e também em linfócitos e granulócitos do sangue periférico por meio da citometria de fluxo. A taxa de efluxo foi medida através do uso da Rodamina 123 (Rho123) e a expressão da P-gp através do anticorpo monoclonal anti-CD243 (clone UIC2). A utilização direta do sangue total para a determinação da atividade de efluxo por citometria de fluxo caracterizou a implantação de uma nova ferramenta de análise para a pesquisa A análise contemplou 52% do total de pacientes em tratamento de TBMR no ambulatório do Laboratório de Pesquisa em Micobacterioses do Instituto de Pesquisa Clínica Evandro Chagas (IPEC). Para as análises foram levadas em consideração a idade, cor da pele, o tempo de tratamento e a quantidade de drogas administradas. O estudo revelou que há correlação entre a expressão da P-gp nos monócitos e a idade dos pacientes (P<0,01). Diferenças entre pacientes brancos e não brancos também foram observadas. Em linfócitos a expressão de P-gp quando aumentada foi diretamente proporcional à atividade de efluxo observada nos monócitos (P< 0,05). Além disso, pacientes submetidos ao tratamento para TBMR por até seis meses apresentaram uma maior expressão de P-gp e, linfócitos quando comparados àqueles que receberam o tratamento por mais de seis meses (P<0,01)

Imunorreatividade à FMRF-amida no sistema nervoso central e na musculatura pediosa de Megalobulimus oblongus

O mapeamento da imunorreatividade ao neuropeptídio FMRF-amida no SNC e na musculatura pediosa de Megalobulimus oblongus foi realizado com o objetivo de dar continuidade aos estudos que vem sendo realizados nesta espécie, com o interesse em estabelecê-lo como modelo experimental em estudos neurobiológicos. O neuropeptídio FMRF-amida foi o primeiro peptídio nativo de invertebrados a ser purificado e seqüenciado, a partir do extrato de gânglios cardioativos do molusco Macrocallista nimbosa. Ele atuaria sobre os receptores metabotrópicos, induzindo a abertura dos canais iônicos de K+ tipo S (sensíveis à serotonina (5HT)), hiperpolarizando a membrana celular e assim, aumentando o limiar para o desencadeamento do potencial de ação. A distribuição da imunorreatividade à FMRF-amida em M. oblongus foi investigada empregando-se a técnica imunohistoquímica com anticorpo não-marcado de Sternberger (1979). Todos os gânglios nervosos centrais apresentaram neurônios e fibras FLI (FMRF-amide-like immunoreactivity), assim como suas comissuras, conetivos e a maioria dos nervos emergentes destes gânglios. Nos cortes da musculatura pediosa observou-se também uma intensa imunorreatividade a FMRF-amida. O maior número de neurônios FLI foi encontrado nos gânglios cerebrais com seus tamanhos variando de pequeno a grande. O corpo dorsal apresentou grande quantidade de fibras viii imunomarcadas. No mesocérebro foram detectados alguns agrupamentos FLI junto ao neuropilo e à comissura cerebral e neurônios dispersos na sua porção ântero-medial. O pró-cérebro mostrou-se repleto de neurônios globulosos FLI. Vários agrupamentos foram observados nos lobos pedal, pleural e comissural do pós-cérebro. Nos gânglios pedais houve intensa imunomarcação em agrupamentos neuronais localizados principalmente nas regiões posterior e lateral dos gânglios. Na região anterior foi observado um par de neurônios gigantes FLI. Uma distribuição homogênea de neurônios FLI foi observada por toda a extensão dos gânglios pleurais, com a exceção de apenas um neurônio grande localizado no gânglio pleural esquerdo. A diferença no tamanho dos dois gânglios parietais foi constatada também em M. oblongus. No hemigânglio esquerdo, o menor, foi identificado um neurônio gigante (300 µm). O gânglio direito apresentou um número maior de neurônios FLI, de tamanhos variados. O gânglio visceral foi a estrutura que mais apresentou neurônios grandes e gigantes por toda a sua extensão, com imunorreatividades variáveis. O par de gânglios bucais possuía agrupamentos neuronais FLI médios e grandes. Os neurônios gigantes não se mostraram imunorreativos, ou foram apenas levemente imunomarcados no trofospôngio. Na musculatura pediosa foram observadas fibras nervosas de diferentes calibres nas regiões dorsal, medial e ventral e sobre as células musculares. Identificaram-se gânglios nervosos nos pontos de intersecção dos ramos nervosos e malhas nervosas que formavam plexos nervosos nas regiões ventral e dorsal da musculatura pediosa de M. oblongus.

Padronização da técnica de imunoistoquímica para identificação de Listéria monocytogenes em placentas humanas e tecido nervoso central de ruminantes.

Este projeto foi desenvolvido no Laboratório de Patologia Experimental do Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA), com a aprovação da Comitê de Ética em Pesquisa do HCPA e com apoio financeiro parcial do Fundo de Incentivo à Pesquisa e Eventos do HCPA (FIPE). O experimento 1, chamado de projeto piloto, teve como objetivo implementar a técnica de IHQ para identificar a Listeria monocytogenes (L.m.), utilizando anticorpo policlonal antilisteria monocytogenes (Biodesig ). Vários testes foram realizados para acertar a diluição (1:1000) que foi diferente da preconizada pelo fabricante. Os blocos de parafina, de dez placentas provenientes de parto prematuro ou aborto foram utilizados para os cortes histológicos e a preparação das lâminas para a coloração Hematoxilina e Eosina (HE) e imunoistoquímica (IHQ). As lâminas foram identificadas por números para resguardar a identidade das pacientes. O resultado do HE mostrou alterações inflamatórias em oito placentas e L. m. foi identificada pelo IHQ em cinco dessas placentas. O objetivo do 2º experimento foi identificar a L. m. em tecido nervoso cerebral de ruminantes, utilizando a técnica implementada no projeto piloto. O material utilizado neste trabalho foi cedido pelo Setor de Patologia Veterinária do Departamento de Patologia da Universidade Federal de Santa Maria. Os casos estudados (2 ovinos, 1 caprino e 2 bovinos) tinham suspeitas clínicas diversas e as necropsias dos animais evidenciaram aspectos sugestivos da doença. Os cinco casos foram confirmados pelo IHQ, comprovando a importância da utilização desta técnica para o diagnóstico da listeriose no SNC de ruminantes. O 3º experimento objetivou identificar a L. m. em placentas encaminhadas ao Serviço de Patologia do HCPA no ano 2000. Da mesma forma que no experimento 1, as lâminas foram identificadas por números. Após o levantamento realizado nos registros dos exames anatomopatológicos (AP) deste setor, observou-se que 714 AP eram de placentas provenientes de aborto, parto prematuro e nascimento a termo examinados naquele período. Foram sorteados 254 AP para análise através de HE, revelando que 148 desses AP apresentavam alterações inflamatórias (corioamnionite, vilite e deciduite). Os blocos destas placentas foram utilizados para fazer as lâminas e realizar IHQ. A consulta aos prontuários dos casos com alterações inflamatórias permitiu observar que um deles tinha a confirmação bacteriológica de L. m. na placenta, tornando-se este o controle positivo. O controle negativo foi selecionado entre aqueles sorteados que não apresentavam alterações inflamatórias. A presença de L. m. foi identificada em 33,78% das placentas analisadas pela técnica IHQ. Corioamnionite e vilite foram as alterações inflamatórias que mostraram diferença estatística significativa nas placentas positivas. L. m. estava presente nas placentas de 1º, 2º e 3º trimestres gestacionais. A idade das gestantes, casos de aborto e/ou parto prematuro não mostraram diferença estatística significativa com a presença ou ausência de L. m. nas placentas. Abortos habituais ocorreram em pacientes com ou sem L. m. no tecido placentário. Conclusão: a técnica de imunohistoquímica pode ser utilizada para confirmar o diagnóstico histopatológico de listeriose em placentas e tecido nervoso central de ruminantes.

Expressão da imunorreatividade à tirosina hidroxilase no hipotálamo de ratos machos adultos submetidos à manipulação neonatal

A estimulação neonatal tem sido utilizada como modelo experimental para examinar os mecanismos pelos quais variações precoces do ambiente do animal afetam o desenvolvimento de sistemas neurais, dando origem a alterações comportamentais e endócrinas estáveis. A estimulação neonatal consiste na manipulação dos animais por alguns minutos diariamente durante os primeiros dias de vida. Esse procedimento provoca, na vida adulta, uma série de alterações comportamentais e endócrinas que se caracterizam pela diminuição do medo a ambientes novos e uma resposta menos acentuada da secreção de glicocorticóides pela supra-renal quando os animais são expostos a estímulos estressantes. A dopamina é um neurotransmissor que atua no sistema nervoso central, onde está envolvida na integração de vários aspectos da função neuroendócrina, como, por exemplo, um regulador na secreção de prolactina e do hormônio liberador de corticotrofina. O objetivo do presente estudo foi investigar o papel da manipulação neonatal sobre o sistema dopaminérgico através da quantificação de neurônios contendo tirosina hidroxilase, a enzima inicial e limitante da síntese de catacolaminas, em núcleos hipotalâmicos. Ratos machos Wistar foram divididos em dois grupos. Um grupo foi submetido à manipulação por um minuto, uma vez por dia, durante os dez primeiros dias de vida (grupo manipulado) e outro grupo não sofreu manipulação (grupo não-manipulado, controle). Aos 75-80 dias, os animais foram anestesiados, perfundidos e os cérebros processados para a detecção imunohistoquímica da tirosina hidroxilase. Foi utilizado um anticorpo monoclonal contra tirosina hidroxilase e o método indireto avidina-biotina-peroxidase. A quantificação da expressão da tirosina hidroxilase consistiu na contagem dos neurônios imunorreativos à tirosina hidroxilase nos núcleos arqueado, paraventricular e periventricular do hipotálamo em cada indivíduo. A média ± EPM do número de neurônios positivos para tirosina hidroxilase de todos os indivíduos foi comparada entre os grupos manipulado e não-manipulado através do teste t de Student. Não houve diferença significativa no número de neurônios imunorreativos à tirosina hidroxilase nos núcleos arqueado, paraventricular e periventricular do hipotálamo de ratos machos adultos entre os animais do grupo manipulado e controle não-manipulado. O estudo mostrou que a manipulação neonatal não se constituiu num estímulo suficiente para promover alterações no número de neurônios imunorreativos à tirosina hidroxilase nos núcleos arqueado, paraventricular e periventricular do hipotálamo de ratos machos adultos.

Imunoquantificação da proteína S100beta em líquor, soro e tecido cerebral por um ensaio de quimioluminescência

A proteína S100β pertence a uma família de proteínas ligantes de cálcio ácidas e de baixo peso molecular, e tem sido implicada no desenvolvimento e manutenção do sistema nervoso. Esta proteína tem atividade neurotrófica e gliotrófica e está localizada principalmente no Sistema Nervoso Central em astrócitos e células de Schawnn, mas pode ser detectada em menores concentrações em outras células, como melanócitos e adipócitos. Relatos sugerem que a S100β está envolvida nos mecanismos da neuropatologia principalmente na doença de Alzheimer e Síndrome de Down, onde astrócitos reativos expressam altos níveis desta proteína. Neste trabalho foi padronizado uma técnica imunoluminométrica muito sensível (0,02 µg/L) que utiliza um anticorpo marcado com o isoluminol como molécula “tracer”. A emissão de luz na fase final da reação é diretamente proporcional a concentração de proteína S100β das amostras. Na fase inicial do trabalho utilizamos amostras biológicas (soro, LCR e tecido cerebral) de ratos e também realizamos alguns ensaios metodológicos para se avaliar a sensibilidade, especificidade e a reprodutibilidade do imunoensaio. Demonstramos que o método empregado para se coletar sangue e LCR de ratos influencia na quantificação da proteína S100β. Finalmente, utilizamos este imunoensaio em investigações clínicas. Observamos que níveis desta proteína em pacientes diagnosticados com mielopatia associada ao vírus HTLV-I estava aumentada no soro, mas não em LCR. Também quantificamos a proteína em fluído amniótico, sendo que nas gestantes com fetos diagnosticados com Síndrome de Down os níveis foram mais elevados.

Mastocitose na infância : estudo anátomo-patológico e imuno-histoquímico

Introdução A mastocitose abrange um grupo heterogêneo de condições crônicas caracterizado pela proliferação excessiva de mastócitos nos tecidos. Os sinais e sintomas clínicos são decorrentes da distribuição anatômica dos mastócitos e do efeito funcional dos mediadores produzidos e liberados por estas células. Na infância, a doença é considerada uma condição benigna na maioria dos casos, cujo comprometimento característico é o cutâneo. As mais freqüentes manifestações na pele são os mastocitomas e a urticária pigmentosa. Lesões cutâneas bolhosas podem manifestar-se e acompanhar todas as formas de mastocitose e quando esta apresentação é a predominante, é denominada de mastocitose bolhosa. O diagnóstico de mastocitose é suspeitado clinicamente e confirmado pela histologia. A demonstração do aumento do número de mastócitos nas lesões cutâneas características se constitui no principal critério diagnóstico. Contudo, este método tem dificuldades técnicas que impedem a adequada reprodutibilidade dos achados, dificultando a elucidação de casos duvidosos e retardando seu tratamento. Considerando as propriedades imunológicas e a importância clínica dos mastócitos reveste-se de maior importância compreender o papel destas células nas doenças, sendo indispensável identificá-las e enumerá-las com acurácia nos tecidos. Objetivos Quantificar o número de mastócitos marcados com anticorpo monoclonal antitriptase, através de técnica imuno-histoquímica e análise de imagem, em biópsias cutâneas de crianças, com diagnóstico clínico de mastocitose. Descrever os achados histológicos; quantificar o número de mastócitos marcados com o anticorpo antitriptase entre as diferentes expressões clínicas da mastocitose cutânea; comparar o número de mastócitos entre os casos de mastocitose cutânea e mastocitose associada à sintomas sistêmicos e correlacionar as contagens de mastócitos entre os dois diferentes métodos (coloração por Giemsa com contagem manual e marcação com anticorpo antitriptase e análise digital). Material e Método Foram incluídas no estudo biópsias cutâneas de crianças de 0 a 14 anos, com diagnóstico clínico e histológico de mastocitose. Os casos foram classificados de acordo com a apresentação clínica cutânea em mastocitoma, urticária pigmentosa ou mastocitose bolhosa e assinalada a presença de sintomas sistêmicos associados. Os fragmentos de pele fixados em formalina e emblocados em parafina foram cortados e utilizados para diagnóstico histopatológico convencional, corados com hematoxilina-eosina e Giemsa, e para análise imuno-histoquímica com estreptavidina peroxidase marcados com anticorpo antitriptase. A densidade de mastócitos (número de células por área) foi realizada por um único observador na técnica histológica e através de um sistema de análise de imagem de vídeo no método imuno-histoquímico. Resultados Foram avaliados 33 casos de mastocitose, sendo 21 do sexo masculino. Dez casos (30,3%) apresentavam mastocitoma, 21 (63,6%) urticária pigmentosa e 2 (6,1%) mastocitose bolhosa. Todos os casos da amostra foram classificados como tendo mastocitose incipiente e em 6 (18,8%) pacientes pôde ser identificada a associação com sintomas sistêmicos. Prurido foi o sintoma mais freqüente, sendo relatado em 21 casos. Em 21 dos 33 casos foi identificada a infiltração de mastócitos na derme havendo predominância pela região perivascular (p=0,001, teste exato de Fisher). Não houve diferenças significativas entre a presença de infiltrado mastocitário e as várias formas cutâneas de mastocitose ou a mastocitose sistêmica. A presença de eosinófilos foi identificada em 15 casos (45,5%) e em 10 casos associadamente ao infiltrado perivascular de mastócitos. A densidade de mastócitos na técnica histológica, incluindo-se todos os casos, foi 50,00 células/mm2. Não houve diferença significativa das contagens entre os pacientes com mastocitoma e aqueles com urticária pigmentosa, assim como entre os pacientes com e sem sintomas sistêmicos associados aos cutâneos. A densidade de mastócitos encontrada com a técnica imuno-histoquímica e contagem por análise de imagem foi 158,85 células/mm2. Não houve diferença significativa das contagens entre os pacientes com mastocitoma e aqueles com urticária pigmentosa, assim como entre aqueles com e sem sintomas sistêmicos. Comparando-se a contagem dos mastócitos por área (densidade) entre a histologia e a imuno-histoquímica houve uma diferença significativa (p=0,0001 teste não-paramétrico de Wilcoxon). A média da diferença entre as contagens foi 199,98 células/mm2 (±365,31 DP). Também não houve semelhança, entre os dois métodos, nos grupos mastocitoma e urticária pigmentosa (p=0,005 e p=0,01, respectivamente, teste não-paramétrico de Wilcoxon). Puderam ser identificados 518% a mais de mastócitos com a técnica imunohistoquímica quando comparada com a histológica. Conclusões O presente estudo permite concluir que: 1) a localização preferencial da infiltração de mastócitos é dérmica e perivascular, não sendo possível identificar diferenças histológicas entre casos de urticária pigmentosa e mastocitoma; 2) o número de mastócitos marcados com o anticorpo monoclonal antitriptase e contados com análise digital de imagem, em biópsia de pele de crianças com diagnóstico clínico de mastocitose, foi 159 células por milímetro quadrado; 3) a densidade de mastócitos, foi semelhante entre os casos de urticária pigmentosa e mastocitoma e entre os casos com e sem sintomas sistêmicos associados nas duas diferentes técnicas empregadas; 4) o número de mastócitos por milímetro quadrado com a técnica imuno-histoquímica e a contagem através de análise de imagem foi significativamente maior quando comparada com a coloração através de Giemsa e a contagem manual, com uma diferença média entre os dois métodos de 200 células por milímetro quadrado; 5) a densidade de mastócitos com a técnica imunohistoquímica foi significativamente maior tanto nos casos com urticária pigmentosa quanto nos com mastocitoma, quando comparada com a técnica empregada rotineiramente e 6) com a técnica imuno-histoquímica e a contagem através de análise de imagem foi possível identificar 518% a mais de mastócitos quando comparada com a técnica histológica.

Prevalência da expressão imunoistoquímica da proteína p21 em adenocarcinoma do esôfago

INTRODUÇÃO: No mundo ocidental, a prevalência de adenocarcinoma da junção esofagogástrica vem crescendo nas últimas décadas. Atualmente, é aceito que o adenocarcinoma do esôfago se desenvolve de uma lesão pré-maligna: esôfago de Barrett. Este carcinoma é de difícil diagnóstico nos seus estágios iniciais, o que resulta em uma mortalidade significativa. O estudo da biologia molecular tem demonstrado que grande parte dos tumores malignos tem origem na interação entre o componente hereditário e influências externas, que em indivíduos predispostos podem ocasionar alterações genéticas que influenciem o controle da diferenciação e crescimento celular. O p21 (WAF1/CIP1) tem um papel fundamental na regulação do ciclo celular, e sua expressão imunoistoquímica tem sido estudada em diversos tumores, mostrando influência no prognóstico de várias neoplasias. OBJETIVO: Verificar a prevalência da expressão da proteína p21 em pacientes com adenocarcinoma de esôfago diagnosticados nos últimos cinco anos no Grupo de Cirurgia de Esôfago e Estômago do Hospital de Clínicas de Porto Alegre (GCEE/HCPA). METODOLOGIA: A população em estudo foi constituída de 42 pacientes com adenocarcinoma de esôfago diagnosticados no GCEE/HCPA entre janeiro de 1998 e dezembro de 2002. A expressão da proteína p21 foi realizada por meio de imunoistoquímica, com anticorpo primário, p21, clone SX118, código M7202 da DAKO, e avaliada de acordo com o Sistema de Escore de Imunorreatividade (Immunoreactive scoring system – IRS). RESULTADOS: Foram estudados 42 pacientes. 83,3% eram do sexo masculino, com idade superior a 40 anos. Destes, 56,2% foram submetidos a procedimentos cirúrgicos com intenção curativa: Gastrectomia total e Esofagogastrectomia transiatal. Os demais foram submetidos à cirurgia paliativa ou não sofreram tratamento cirúrgico. Apenas cinco pacientes receberam tratamento adjuvante com quimioterapia e radioterapia, isoladas ou combinadas. Quanto ao estadiamento, 78,6% dos pacientes apresentavam doença avançada, estádios III e IV. Apenas 9 apresentaram positividade para o p21, quando considerado o Sistema de Escore de Imunorreatividade (em que p21+ é ³ 3). CONCLUSÃO: A proteína p21 esteve expressa em 9 dos 42 pacientes (21,4%) com adenocarcinoma de esôfago diagnosticados nos últimos cinco anos no Grupo de Cirurgia de Esôfago e Estômago do Hospital de Clínicas de Porto Alegre. Nessa casuística, o acúmulo de p21 não se mostrou essencial no processo de carcinogênese do adenocarcinoma esofágico.