La contribution du récepteur B1 des kinines dans les complications diabétiques chez le rat traité au glucose, un modèle de résistance à l'insuline

Les kinines agissent sur deux types de récepteurs couplés aux protéines G, nommés B1 et B2, lesquels jouent un rôle important dans le contrôle cardiovasculaire, la nociception et l’inflammation. Nous considérons l’hypothèse que le récepteur B1 des kinines est induit et contribue aux complications diabétiques, incluant l’hypertension artérielle, les polyneuropathies sensorielles, l’augmentation du stress oxydatif vasculaire, l’inflammation vasculaire et l’obésité chez le rat traité au D-glucose (10% dans l’eau de boisson) pendant 8 ou 12 semaines. Dans ce modèle de résistance à l’insuline, nous avons évalué les effets d’un traitement pharmacologique d’une semaine avec un antagoniste du récepteur B1 des kinines, le SSR240612 (10 mg/kg/jr). Les résultats montrent que le SSR240612 renverse l’hypertension, l’allodynie tactile et au froid, la production de l’anion superoxyde et la surexpression de plusieurs marqueurs inflammatoires dans l’aorte (iNOS, IL-1β, macrophage (CD68, CD11), ICAM-1, E-selectine, MIF ainsi que le B1R) et dans les adipocytes (iNOS, IL-1β, TNF-α et macrophage CD68). De plus, le SSR240612 corrige la résistance à l’insuline, les anomalies du profil lipidique plasmatique et le gain de poids et de masse adipeuse. Ces données supportent l’implication des kinines dans les complications diabétiques dans un modèle animal de résistance à l’insuline et suggèrent que le récepteur B1 est une cible thérapeutique potentielle dans le diabète et l’obésité.

Role of the homeodomain transcription factor Hoxa13 in embryonic development and formation of extra-embryonic structures

La famille des gènes Hox code pour des facteurs de transcription connus pour leur contribution essentielle à l’élaboration de l’architecture du corps et ce, au sein de tout le règne animal. Au cours de l’évolution chez les vertébrés, les gènes Hox ont été redéfinis pour générer toute une variété de nouveaux tissus/organes. Souvent, cette diversification s’est effectuée via des changements quant au contrôle transcriptionnel des gènes Hox. Chez les mammifères, la fonction de Hoxa13 n’est pas restreinte qu’à l’embryon même, mais s’avère également essentielle pour le développement de la vascularisation fœtale au sein du labyrinthe placentaire, suggérant ainsi que sa fonction au sein de cette structure aurait accompagné l’émergence des espèces placentaires. Au chapitre 2, nous mettons en lumière le recrutement de deux autres gènes Hoxa, soient Hoxa10 et Hoxa11, au compartiment extra-embryonnaire. Nous démontrons que l’expression de Hoxa10, Hoxa11 et Hoxa13 est requise au sein de l’allantoïde, précurseur du cordon ombilical et du système vasculaire fœtal au sein du labyrinthe placentaire. De façon intéressante, nous avons découvert que l’expression des gènes Hoxa10-13 dans l’allantoïde n’est pas restreinte qu’aux mammifères placentaires, mais est également présente chez un vertébré non-placentaire, indiquant que le recrutement des ces gènes dans l’allantoïde précède fort probablement l’émergence des espèces placentaires. Nous avons généré des réarrangements génétiques et utilisé des essais transgéniques pour étudier les mécanismes régulant l’expression des gènes Hoxa dans l’allantoïde. Nous avons identifié un fragment intergénique de 50 kb capable d’induire l’expression d’un gène rapporteur dans l’allantoïde. Cependant, nous avons trouvé que le mécanisme de régulation contrôlant l’expression du gène Hoxa au sein du compartiment extra-embryonnaire est fort complexe et repose sur plus qu’un seul élément cis-régulateur. Au chapitre 3, nous avons utilisé la cartographie génétique du destin cellulaire pour évaluer la contribution globale des cellules exprimant Hoxa13 aux différentes structures embryonnaires. Plus particulièrement, nous avons examiné plus en détail l’analyse de la cartographie du destin cellulaire de Hoxa13 dans les pattes antérieures en développement. Nous avons pu déterminer que, dans le squelette du membre, tous les éléments squelettiques de l’autopode (main), à l’exception de quelques cellules dans les éléments carpiens les plus proximaux, proviennent des cellules exprimant Hoxa13. En contraste, nous avons découvert que, au sein du compartiment musculaire, les cellules exprimant Hoxa13 et leurs descendantes (Hoxa13lin+) s’étendent à des domaines plus proximaux du membre, où ils contribuent à générer la plupart des masses musculaires de l’avant-bras et, en partie, du triceps. De façon intéressante, nous avons découvert que les cellules exprimant Hoxa13 et leurs descendantes ne sont pas distribuées uniformément parmi les différents muscles. Au sein d’une même masse musculaire, les fibres avec une contribution Hoxa13lin+ différente peuvent être identifiées et les fibres avec une contribution semblable sont souvent regroupées ensemble. Ce résultat évoque la possibilité que Hoxa13 soit impliqué dans la mise en place de caractéristiques spécifiques des groupes musculaires, ou la mise en place de connections nerf-muscle. Prises dans leur ensemble, les données ici présentées permettent de mieux comprendre le rôle de Hoxa13 au sein des compartiments embryonnaires et extra-embryonnaires. Par ailleurs, nos résultats seront d’une importance primordiale pour soutenir les futures études visant à expliquer les mécanismes transcriptionnels soutenant la régulation des gènes Hoxa dans les tissus extra-embryonnaires.

Modulation de la néovascularisation post-ischémique en présence de facteurs de risque cardiovasculaire

L’athérosclérose est la principale cause d’infarctus du myocarde, de mort subite d’origine cardiaque, d’accidents vasculaires cérébraux et d’ischémie des membres inférieurs. Celle-ci cause près de la moitié des décès dans les pays industrialisés. Lorsque les obstructions artérielles athérosclérotiques sont tellement importantes que les techniques de revascularisation directe ne peuvent être effectuées avec succès, la sévérité de l’ischémie tissulaire résiduelle dépendra de l’habilité de l’organisme à développer spontanément de nouveaux vaisseaux sanguins (néovascularisation). La néovascularisation postnatale est le résultat de deux phénomènes : la formation de nouveaux vaisseaux à partir de la vasculature existante (angiogenèse) et la formation de vaisseaux à partir de cellules souches progénitrices (vasculogenèse). Notre laboratoire a démontré que plusieurs facteurs de risque associés aux maladies cardiovasculaires (tabagisme, vieillissement, hypercholestérolémie) diminuaient également la réponse angiogénique suite à une ischémie. Cependant, les mécanismes précis impliqués dans cette physiopathologie sont encore inconnus. Un point commun à tous ces facteurs de risque cardiovasculaire est l’augmentation du stress oxydant. Ainsi, le présent ouvrage visait à élucider l’influence de différents facteurs de risque cardiovasculaire et du stress oxydant sur la néovascularisation. Nos résultats démontrent que l’exposition à la fumée de cigarette et le vieillissement sont associés à une diminution de la néovascularisation en réponse à l’ischémie, et que ceci est au moins en partie causé par une augmentation du stress oxydant. De plus, nous démontrons que les acides gras dérivés de la diète peuvent affecter la réponse à l’ischémie tissulaire. La première étude du projet de recherche visait à évaluer l’impact de l’exposition à la fumée de cigarette sur la néovascularisation post-ischémique, et l’effet d’une thérapie antioxydante. L’exposition à la fumée de cigarette a été associée à une réduction significative de la récupération du flot sanguin et de la densité des vaisseaux dans les muscles ischémiques. Cependant, une récupération complète de la néovascularisation a été démontrée chez les souris exposées à la fumée de cigarette et traitées au probucol ou aux vitamines antioxydantes. Nous avons démontré qu’une thérapie antioxydante administrée aux souris exposées à la fumée de cigarette était associée à une réduction significative des niveaux de stress oxydant dans le plasma et dans les muscles ischémiques. De plus, les cellules endothéliales progénitrices (EPCs) exposées à de l’extrait de fumée de cigarette in vitro présentent une diminution significative de leur activité angiogénique (migration, adhésion et incorporation dans les tissus ischémiques) qui a été complètement récupérée par le probucol et les vitamines antioxydantes. La deuxième étude avait pour but d’investiguer le rôle potentiel de la NADPH oxydase (Nox2) pour la modulation de la néovascularisation post-ischémique dans le contexte du vieillissement. Nous avons trouvé que l’expression de la Nox2 est augmentée par le vieillissement dans les muscles ischémiques des souris contrôles. Ceci est associé à une réduction significative de la récupération du flot sanguin après l’ischémie chez les vieilles souris contrôles comparées aux jeunes. Nous avons aussi démontré que la densité des capillaires et des artérioles est significativement réduite dans les muscles ischémiques des animaux vieillissants alors que les niveaux de stress oxydant sont augmentés. La déficience en Nox2 réduit les niveaux de stress oxydant dans les tissus ischémiques et améliore la récupération du flot sanguin et la densité vasculaire chez les animaux vieillissants. Nous avons aussi démontré que l’activité fonctionnelle des EPCs (migration et adhésion à des cellules endothéliales matures) est significativement diminuée chez les souris vieillissantes comparée aux jeunes. Cependant, la déficience en Nox2 est associée à une récupération de l’activité fonctionnelle des EPCs chez les animaux vieillissants. Nous avons également démontré une augmentation pathologique du stress oxydant dans les EPCs isolées d’animaux vieillissants. Cette augmentation de stress oxydant dans les EPCs n’est pas présente chez les animaux déficients en Nox2. La troisième étude du projet de recherche a investigué l’effet des acides gras dérivés de la diète sur la néovascularisation postnatale. Pour ce faire, les souris ont reçu une diète comprenant 20% d’huile de maïs (riche en oméga-6) ou 20% d’huile de poisson (riche en oméga-3). Nos résultats démontrent qu’une diète riche en oméga-3 améliore la néovascularisation post-ischémique au niveau macro-vasculaire, micro-vasculaire et clinique comparée à une diète riche en oméga-6. Cette augmentation de la néovascularisation postnatale est associée à une réduction du ratio cholestérol total/cholestérol HDL dans le sérum et à une amélioration de la voie VEGF/NO dans les tissus ischémiques. De plus, une diète riche en acides gras oméga-3 est associée à une augmentation du nombre d’EPCs au niveau central (moelle osseuse) et périphérique (rate). Nous démontrons aussi que l’activité fonctionnelle des EPCs (migration et incorporation dans des tubules de cellules endothéliales matures) est améliorée et que le niveau de stress oxydant dans les EPCs est réduit par la diète riche en oméga-3. En conclusion, nos études ont permis de déterminer l’impact de différents facteurs de risque cardiovasculaire (tabagisme et vieillissement) et des acides gras dérivés de la diète (oméga-3) sur la néovascularisation post-ischémique. Nous avons aussi identifié plusieurs mécanismes qui sont impliqués dans cette physiopathologie. Globalement, nos études devraient contribuer à mieux comprendre l’effet du tabagisme, du vieillissement, des oméga-3, et du stress oxydant sur l’évolution des maladies vasculaires ischémiques.

Implication de la protéine tyrosine phosphatase DEP-1 dans la perméabilité vasculaire induite par le VEGF

La perméabilité vasculaire est une caractéristique cruciale de l’angiogenèse. Les acteurs principaux sont les cellules endothéliales qui la régulent en réponse à divers facteurs perméabilisant, tels que le « Vascular Endothelial Growth Factor » (VEGF). Dans le contexte pathologique du cancer, les cellules tumorales produisent de grandes quantités de VEGF qui stimulent la perméabilité, ce qui leur permet d’infiltrer le réseau vasculaire. Il est connu que la tyrosine kinase Src contrôle cette modulation de la perméabilité. Puisque notre laboratoire a préalablement démontré que la phosphatase de type récepteur (PTP) DEP-1 est impliquée dans l’activation de Src en réponse au VEGF, nous avons émis l'hypothèse que DEP-1 pourrait aussi jouer un rôle dans la perméabilité des cellules endothéliales. Grâce à des expériences de transfections d’ARN interférant, nous démontrons que DEP-1 est important pour la régulation de la phosphorylation de la VE-Cadhérine, un médiateur critique de la perméabilité. L’impact de DEP-1 sur la dissociation de jonctions intercellulaires est également démontré par microscopie à immunofluorescence de cellules endothéliales. DEP-1 est également nécessaire à l’augmentation de la perméabilité induite par VEGF in vitro. Deux résidus tyrosine retrouvés dans la queue carboxy-terminale de DEP-1 sont essentiels à l’activation de Src en réponse au VEGF. Suite à la transfection d’un plasmide encodant DEP-1 muté pour ces deux résidus, nous démontrons aussi leur implication dans la régulation de la perméabilité in vitro par DEP-1. Ces travaux permettent ainsi d’approfondir nos connaissances sur un nouveau régulateur potentiel de la perméabilité vasculaire.

Strategies for revascularizing the ischemic retina

Les rétinopathies ischémiques (RI) sont la cause majeure de cécité chez les personnes âgées de moins de 65 ans. Il existe deux types de RIs soit la rétinopathie du prématuré (ROP) ainsi que la rétinopathie diabétique (RD). Les RIs sont décrites en deux phases soit la phase de vasooblitération, marquée par une perte importante de vaisseaux sanguins, et une phase de néovascularisation secondaire à lʼischémie menant à une croissance pathologique de vaisseaux. Cette seconde phase peut générer des complications cliniques telles quʼun oedème dans lʼhumeur vitré ainsi que le détachement de la rétine chez les patients déjà atteints dʼune RI. Les traitements approuvés pour les RIs visent à réduire la formation des vaisseaux pathologiques ou lʼoedème; mais ceux-ci malheureusement ne règlent pas les problèmes sous-jacents tels que la perte vasculaire et lʼischémie. La rétine est un tissu hautement vascularisé qui contribue à lʼirrigation et à lʼhoméostasie des neurones. Lʼinteraction neurovasculaire, comprenant de neurones, vaisseaux et cellules gliales, contribue au maintien de cette homéostasie. Durant le développement, les neurones et les cellules gliales jouent un rôle important dans la vascularisation de la rétine en sécrétant des facteurs qui stimulent l'angiogenèse. Cependant, nos connaissances sur lʼinteraction neurovasculaire dans les RIs sont limitées. En identifiant les interactions importantes entre les cellules composant cette unité neurovasculaire dans la rétine, nous pourrons viser des cibles qui engendreront une revascularisation seine afin de diminuer les signes pathologiques chez les patients atteints dʼune RI. Les travaux présentés dans cette thèse visent à mieux expliquer cette interaction neurovasculaire en soulignant des concepts importants propres aux RIs. En utilisant un modèle de rétinopathie induite par lʼoxygène chez la souris, qui reproduit les caractéristiques importantes de la ROP (et en certaines instances, la RD), nous identifions quelques molécules clés jouant un rôle significatif dans les RIs soit la sémaphorine 3A (sema3A), lʼIL-1β, ainsi que le récepteur PAR2. Nos résultats démontrent que Sema3A, sécrétée par les cellules ganglionnaires rétiniennes (CGRs) durant une ischémie, empêche la revascularisation normale et que cette expression est induite par lʼIL-1β provenant des microglies activées. En bloquant Sema3A directement ou via lʼinhibition de lʼIL- 1β, nous remarquons une revascularisation seine ainsi quʼune diminution importante des vaisseaux pathologiques. Cela nous indique que Sema3A est impliquée dans la guidance vasculaire et quʼelle contribue à la pathogenèse des RIs. Lʼactivation de façon exogène de PAR2, identifié aussi comme régulateur du récepteur de lʼIL-1β (IL- 1RI) sur les CGRs, se traduit par une diminution séquentielle de lʼIL-1RI et de Sema3A ce qui mène également à une revascularisation seine. En conclusion, ces travaux soulignent lʼimportance de lʼinteraction neurovasculaire ainsi que la guidance vasculaire dans les RIs. Ils renforcent lʼimportance de la communication entre neurone, vaisseau et microglie dans la pathogenèse des RIs. Finalement, nous identifions quelques molécules clés qui pourront servir comme cibles afin de lutter contre lʼischémie qui cause des problèmes vasculaires chez les patients atteints dʼune RI.

Implication des cellules Nestin+ dans le remodelage vasculaire en conditions pathologiques

La protéine de filament intermédiaire Nestin, marqueur de cellules souches neurales, est exprimée dans les cellules vasculaires. Il a été démontré que les cellules de la crosse aortique dérivent de la crête neurale pendant le développement. Des cellules endothéliales exprimant Nestin sont retrouvées dans les capillaires durant l’embryogénèse ainsi que durant la vascularisation de tumeurs cancéreuses. Cette protéine est impliquée dans les mécanismes de prolifération cellulaire. Récemment des cellules Nestin+ ont été identifiées au niveau des cellules du muscle lisse de l’aorte. La régulation de Nestin dans ces cellules, pendant le développement et en conditions pathologiques, est inconnue. Cette thèse porte sur l’analyse de la protéine Nestin dans le remodelage vasculaire en situation diabétique et d’hypertension au niveau des artères carotide et aortique. Nos travaux examinent l’hypothèse que l’expression vasculaire de Nestine joue un rôle dans l’homéostasie durant le vieillissement physiologique et participe au remodelage suite à des stimuli pathologiques. La protéine Nestin est fortement exprimée dans les aortes de rats néonataux et cette expression diminue rapidement avec le développement. Au niveau de l’aorte l’expression de la protéine Nestin est retrouvée dans une sous-population de cellules du muscle lisse et au niveau des cellules endothéliales. L’expression de la protéine Nestin est corrélée avec sa proximité au cœur, une plus grande expression est observée dans l’arche aortique et une faible expression est détectée dans la partie thoracique. Nous avons déterminé qu’en présence de diabète de type I, il y a une perte de l’expression de la protéine Nestin dans la média de l’aorte et de la carotide. Cette perte d’expression représente un évènement précoce dans la pathologie diabétique et précède la dysfonction endothéliale. La diminution de l’expression de la protéine Nestin est également concomitante avec la perte de la capacité proliférative des cellules du muscle lisse. Dans les rats souffrant de diabète de type 1, une réduction significative de la densité des cellules du muscle lisse exprimant la protéine phosphorylée phosphohistone 3, une protéine impliquée dans un cycle cellulaire actif, est observée. De plus, cette réduction est corrélée avec la perte de l’expression de la protéine Nestin. Nous avons également démontré in vitro qu’un traitement hyperglycémique réduit l’expression de Nestin ainsi que la prolifération des cellules du muscle lisse. Enfin, l’utilisation d’un shARN dirigé contre Nestin nous a permis de déterminer l’implication de cette protéine dans la prolifération des cellules du muscle lisse en condition basale caractérisée par la diminution de l’incorporation de [3H] thymidine. Dans le modèle d’hypertension induite par une constriction aortique abdominale surrénale, l’augmentation de la pression sanguine est associée avec l’augmentation de l’expression de la protéine Nestin dans l’artère carotidienne. Une corrélation positive a été observée entre l’expression de la protéine Nestin dans la carotide et la pression artérielle moyenne à laquelle la paroi de la carotide est soumise. De plus, les facteurs de croissance impliqués dans le remodelage vasculaire secondaire à l’hypertension augmentent l’expression de Nestin dans les cellules du muscle lisse isolées des carotides. Puis, la réduction de l’expression de la protéine Nestin via un shARN atténue l’incorporation de [3H] thymidine, associée à la prolifération cellulaire, stimulée par ces facteurs de croissance alors que l’incorporation de [3H] leucine, associée à la synthèse protéique, demeure inchangée. Ces résultats suggèrent que l’augmentation de l’expression de la protéine Nestin, secondaire à l’hypertension, pourrait représenter une réponse adaptative où il y a une augmentation de la croissance des cellules du muscle lisse afin de permettre à la paroi vasculaire de s’ajuster à l’augmentation de la pression sanguine.

Évaluation du rôle du récepteur CD36 comme cible thérapeutique potentielle dans le traitement de la maladie cardiaque ischémique

La maladie cardiaque ischémique, la plus commune des maladies qui affectent le cœur, est encore aujourd’hui une importante cause de décès dans les pays industrialisés. Une réponse cardio-métabolique inflammatoire à un changement aigu initié par une modification du métabolisme énergétique du cœur ischémique est accentuée après que l’apport en oxygène ait été rétabli. Parmi les altérations délétères dans le myocarde qui en résultent, sont inclus l’accumulation d’acides gras non estérifiés (AGNE) ainsi que leur oxydation au détriment de l’utilisation du glucose, ce qui amplifie la génération d’espèces réactives de l’oxygène (ROS). Les tissus en périphérie du cœur tel que le tissu adipeux peuvent affecter l’étendue des blessures au myocarde par la relâche en circulation de substances bioactives comme les AGNE et l’adiponectine. Le CD36 est le principal facilitateur de l’entrée d’AGNE dans le cœur et les adipocytes et constitue une importante cible métabolique spécialement lors d’un stress d’ischémie-reperfusion (I/R). Il a été rapporté précédemment par notre groupe qu’un ligand synthétique et sélectif envers le CD36 exerce un effet protecteur puissant sur le système vasculaire. Cependant, aucune étude in vivo n’a rapporté d’effet cardioprotecteur de ligands sélectifs envers le CD36. Ainsi, ce projet visait à évaluer le rôle et possiblement l’effet cardioprotecteur de ligands sélectifs du récepteur CD36 sur la blessure au myocarde en I/R. Des souris CD36+/+ et CD36-/- ont été traitées quotidiennement avec le EP 80317, le CP-3(iv) ou le véhicule pendant 14 jours avant de subir la ligature temporaire de l’artère coronaire antérieure descendante gauche (LAD). Notre première étude a montré que le EP 80317 exerce un effet cardioprotecteur puissant tel que montré par la réduction de la surface des lésions et l’amélioration de la fonction cardiaque in vivo suivant la blessure au myocarde en I/R. De plus, le EP 80317 a réduit l’internalisation totale d’AGNE dans le myocarde, mesurée in vivo par l’imagerie métabolique cardiaque, en accord avec la diminution du niveau circulant d’AGNE. Une réduction de la lipolyse révélée par une perfusion de radiotraceur de palmitate et une augmentation du niveau d’expression de gènes adipogéniques et anti-lipolytiques appuient davantage l’effet du EP 80317 dans la prévention de la mobilisation délétère d’acides gras du tissu adipeux. Notre deuxième étude a investigué le mécanisme cardioprotecteur d’une nouvelle génération de ligands dotés d’une plus grande affinité de liaison envers le CD36. Cette étude a montré que le CP-3(iv) est aussi pourvu d’un puissant effet cardioprotecteur comme le montre la réduction de la taille de l’infarctus et l’amélioration de la fonction cardiaque post-I/R du myocarde qui est fonction d’une signalisation métabolique et anti-oxydante de l’adiponectine. En effet, l’augmentation des principales voies de signalisation régulant la sécrétion de l’adiponectine et des gènes antioxydants a été démontrée dans le tissu adipeux suivant l’I/R du myocarde et un traitement avec le CP-3(iv). L’activation de la protéine kinase B ou Akt dans le myocarde avec la diminution de la génération de ROS et de la signalisation de mort cellulaire appuient davantage le rôle cardioprotecteur du CP-3(iv) dans l’I/R du myocarde. En conclusion, le travail présenté dans cette thèse soutient qu’une signalisation du CD36 par le EP 80317 et le CP-3(iv) pourrait s’avérer être une nouvelle approche thérapeutique dans le traitement de la maladie cardiaque ischémique. Ces ligands synthétiques sélectifs envers le CD36 provoquent un effet salutaire sur le myocarde ischémique par le biais d’une amélioration du profil métabolique dans les premières heures de la reperfusion. Le EP 80317 réduit le niveau délétère d’AGNE et leur internalisation dans le cœur en situation d’excès, tandis que le CP-3(iv) augmente le niveau bénéfique d’adiponectine et son effet cardioprotecteur.

Quantitative functional MRI of the Cerebrovascular Reactivity to CO2

Le dioxyde de carbone (CO2) est un résidu naturel du métabolisme cellulaire, la troisième substance la plus abondante du sang, et un important agent vasoactif. À la moindre variation de la teneur en CO2 du sang, la résistance du système vasculaire cérébral et la perfusion tissulaire cérébrale subissent des changements globaux. Bien que les mécanismes exacts qui sous-tendent cet effet restent à être élucidés, le phénomène a été largement exploité dans les études de réactivité vasculaire cérébrale (RVC). Une voie prometteuse pour l’évaluation de la fonction vasculaire cérébrale est la cartographie de la RVC de manière non-invasive grâce à l’utilisation de l’Imagerie par Résonance Magnétique fonctionnelle (IRMf). Des mesures quantitatives et non-invasives de de la RVC peuvent être obtenus avec l’utilisation de différentes techniques telles que la manipu- lation du contenu artériel en CO2 (PaCO2) combinée à la technique de marquage de spin artériel (Arterial Spin Labeling, ASL), qui permet de mesurer les changements de la perfusion cérébrale provoqués par les stimuli vasculaires. Toutefois, les préoccupations liées à la sensibilité et la fiabilité des mesures de la RVC limitent de nos jours l’adoption plus large de ces méthodes modernes de IRMf. J’ai considéré qu’une analyse approfondie ainsi que l’amélioration des méthodes disponibles pourraient apporter une contribution précieuse dans le domaine du génie biomédical, de même qu’aider à faire progresser le développement de nouveaux outils d’imagerie de diagnostique. Dans cette thèse je présente une série d’études où j’examine l’impact des méthodes alternatives de stimulation/imagerie vasculaire sur les mesures de la RVC et les moyens d’améliorer la sensibilité et la fiabilité de telles méthodes. J’ai aussi inclus dans cette thèse un manuscrit théorique où j’examine la possible contribution d’un facteur méconnu dans le phénomène de la RVC : les variations de la pression osmotique du sang induites par les produits de la dissolution du CO2. Outre l’introduction générale (Chapitre 1) et les conclusions (Chapitre 6), cette thèse comporte 4 autres chapitres, au long des quels cinq différentes études sont présentées sous forme d’articles scientifiques qui ont été acceptés à des fins de publication dans différentes revues scientifiques. Chaque chapitre débute par sa propre introduction, qui consiste en une description plus détaillée du contexte motivant le(s) manuscrit(s) associé(s) et un bref résumé des résultats transmis. Un compte rendu détaillé des méthodes et des résultats peut être trouvé dans le(s) dit(s) manuscrit(s). Dans l’étude qui compose le Chapitre 2, je compare la sensibilité des deux techniques ASL de pointe et je démontre que la dernière implémentation de l’ASL continue, la pCASL, offre des mesures plus robustes de la RVC en comparaison à d’autres méthodes pulsés plus âgées. Dans le Chapitre 3, je compare les mesures de la RVC obtenues par pCASL avec l’utilisation de quatre méthodes respiratoires différentes pour manipuler le CO2 artérielle (PaCO2) et je démontre que les résultats peuvent varier de manière significative lorsque les manipulations ne sont pas conçues pour fonctionner dans l’intervalle linéaire de la courbe dose-réponse du CO2. Le Chapitre 4 comprend deux études complémentaires visant à déterminer le niveau de reproductibilité qui peut être obtenu en utilisant des méthodes plus récentes pour la mesure de la RVC. La première étude a abouti à la mise au point technique d’un appareil qui permet des manipulations respiratoires du CO2 de manière simple, sécuritaire et robuste. La méthode respiratoire améliorée a été utilisée dans la seconde étude – de neuro-imagerie – où la sensibilité et la reproductibilité de la RVC, mesurée par pCASL, ont été examinées. La technique d’imagerie pCASL a pu détecter des réponses de perfusion induites par la variation du CO2 dans environ 90% du cortex cérébral humain et la reproductibilité de ces mesures était comparable à celle d’autres mesures hémodynamiques déjà adoptées dans la pratique clinique. Enfin, dans le Chapitre 5, je présente un modèle mathématique qui décrit la RVC en termes de changements du PaCO2 liés à l’osmolarité du sang. Les réponses prédites par ce modèle correspondent étroitement aux changements hémodynamiques mesurés avec pCASL ; suggérant une contribution supplémentaire à la réactivité du système vasculaire cérébral en lien avec le CO2.

Drug-loaded nanocarriers : passive targeting and crossing of biological barriers

Poor bioavailability and poor pharmacokinetic characteristics are some of the leading causes of drug development failure. Therefore, poorly-soluble drugs, fragile proteins or nucleic acid products may benefit from their encapsulation in nanosized vehicles, providing enhanced solubilisation, protection against degradation, and increased access to pathological compartments. A key element for the success of drug-loaded nanocarriers (NC) is their ability to either cross biological barriers themselves or allow loaded drugs to traverse them to achieve optimal pharmacological action at pathological sites. Depending on the mode of administration, NC may have to cross different physiological barriers in their journey towards their target. In this review, the crossing of biological barriers by passive targeting strategies will be presented for intravenous delivery (vascular endothelial lining, particularly for tumour vasculature and blood-brain barrier targeting), oral administration (gastrointestinal lining) and upper airway administration (pulmonary epithelium). For each specific barrier, background information will be provided on the structure and biology of the tissues involved as well as available pathways for nano-objects or loaded drugs (diffusion and convection through fenestration, transcytosis, tight junction crossing, etc.). The determinants of passive targeting − size, shape, surface chemistry, surface patterning of nanovectors − will be discussed in light of current results. Perspectives on each mode of administration will be presented. The focus will be on polymeric nanoparticles and dendrimers although advances in liposome technology will be also reported as they represent the largest body in the drug delivery literature.

Not the outside but the inside matters : functional analysis of Capricious and Tartan during Drosophila tracheal morphogenesis

The tubular structures, which transport essential gases, liquids, or cells from one site to another, are shared among various divergent organisms. These highly organized tubular networks include lung, kidney, vasculature and mammary gland in mammals as well as trachea and salivary gland in Drosophila melanogaster. Many questions regarding the tubular morphogenesis cannot be addressed sufficiently by investigating the mammalian organs because their structures are extremely complex and therefore, systematic analyses of genetic and cellular programs guiding the development is not possible. In contrast, the Drosophila tracheal development provides an excellent model system since many molecular markers and powerful tools for genetic manipulations are available. Two mechanisms were shown to be important for the outgrowth of tracheal cells: the FGF signaling pathway and the interaction between the tracheal cells and the surrounding mesodermal cells. The Drosophila FGF ligand encoded by branchless (bnl) is localized in groups of cells near tracheal metameres. The tracheal cells expressing the FGF receptor breathless (btl) respond to these sources of FGF ligand and extend towards them. However, this FGF signaling pathway is not sufficient for the formation of continuous dorsal trunk, the only muticellular tube in tracheal system. Recently, it was found out that single mesodermal cells called bridge-cells are essential for the formation of continuous dorsal trunk as they direct the outgrowth of dorsal trunk cells towards the correct targets. The results in this PhD thesis demonstrate that a cell adhesion molecule Capricious (Caps), which is specifically localized on the surface of bridge-cells, plays an essential role in guiding the outgrowing dorsal trunk cells towards their correct targets. When caps is lacking, some bridge-cells cannot stretch properly towards the adjacent posterior tracheal metameres and thus fail to interconnect the juxtaposing dorsal trunk cells. Consequently, discontinuous dorsal trunks containing interruptions at several positions are formed. On the other hand, when caps is ectopically expressed in the mesodermal cells through a twi-GAL4 driver, these mesodermal cells acquire a guidance function through ectopic caps and misguide the outgrowing dorsal trunk cells in abnormal directions. As a result, disconnected dorsal trunks are formed. These loss- and gain-of-function studies suggest that Caps presumably establishes the cell-to-cell contact between the bridge-cells and the tracheal cells and thereby mediates directly the guidance function of bridge-cells. The most similar protein known to Caps is another cell adhesion molecule called Tartan (Trn). Interestingly, trn is expressed in the mesodermal cells but not in the bridge-cells. When trn is lacking, the outgrowth of not only the dorsal trunks but also the lateral trunks are disrupted. However, in contrast to the ectopic expression of caps, the misexpression of trn does not affect tracheal development. Whereas Trn requires only its extracellular domain to mediate the matrix function, Caps requires both its extracellular and intracellular domains to function as a guidance molecule in the bridge-cells. These observations suggest that Trn functions differently from Caps during tracheal morphogenesis. Presumably, Trn mediates a matrix function of mesodermal cells, which support the tracheal cells to extend efficiently through the surrounding mesodermal tissue. In order to determine which domains dictate the functional specificity of Caps, two hybrid proteins CapsEdTrnId, which contains the Caps extracellular domain and the Trn intracellular domain, and TrnEdCapsId, which consists of the Trn extracellular domain and the Caps intracellular domain, were constructed. Gain of function and rescue experiments with these hybrid proteins suggest on one hand that the extracellular domains of Caps and Trn are functionally redundant and on the other hand that the intracellular domain dictates the functional specificity of Caps. In order to identify putative interactors of Caps, yeast two-hybrid screening was performed. An in vivo interaction assay in yeast suggests that Ras64B interacts specifically with the Caps intracellular domain. In addition, an in vitro binding assay reveals a direct interaction between an inactive form of Ras64B and the Caps intracellular domain. ras64B, which encodes a small GTPase, is expressed in the mesodermal cells concurrently as caps. Finally, a gain-of-function study with the constitutively active Ras64B suggests that Ras64B presumably functions downstream of Caps. All these results suggest consistently that the small GTPase Ras64B binds specifically to the Caps intracellular domain and may thereby mediate the guidance function of Caps.

Plasmodium falciparum Rosetting Epitopes Converge in the SD3-Loop of PfEMP1-DBL1α

The ability of Plasmodium falciparum parasitized RBC (pRBC) to form rosettes with normal RBC is linked to the virulence of the parasite and RBC polymorphisms that weaken rosetting confer protection against severe malaria. The adhesin PfEMP1 mediates the binding and specific antibodies prevent sequestration in the micro-vasculature, as seen in animal models. Here we demonstrate that epitopes targeted by rosette disrupting antibodies converge in the loop of subdomain 3 (SD3) which connects the h6 and h7 α-helices of PfEMP1-DBL1α. Both monoclonal antibodies and polyclonal IgG, that bound to epitopes in the SD3-loop, stained the surface of pRBC, disrupted rosettes and blocked direct binding of recombinant NTS-DBL1α to RBC. Depletion of polyclonal IgG raised to NTS-DBL1α on a SD3 loop-peptide removed the anti-rosetting activity. Immunizations with recombinant subdomain 1 (SD1), subdomain 2 (SD2) or SD3 all generated antibodies reacting with the pRBC-surface but only the sera of animals immunized with SD3 disrupted rosettes. SD3-sequences were found to segregate phylogenetically into two groups (A/B). Group A included rosetting sequences that were associated with two cysteine-residues present in the SD2-domain while group B included those with three or more cysteines. Our results suggest that the SD3 loop of PfEMP1-DBL1α is an important target of anti-rosetting activity, clarifying the molecular basis of the development of variant-specific rosette disrupting antibodies.

Diabetes gestacional como factor de riesgo para incontinencia urinaria: revisión sistemática de la literatura

La diabetes mellitus es una de las patologías frecuentes durante el embarazo, existe literatura que la ha relacionado con un mayor riesgo de aparición de incontinencia urinaria en el postparto patología que de manera clara afecta la calidad de vida de las mujeres, pero a la fecha la literatura no es concluyente. Con la presente revisión sistemática se pretendió evaluar la evidencia relacionada con la diabetes gestacional como causa de incontinencia urinaria en el postparto.

Imagem por ressonância magnética da vasculatura da pele humana : viabilidade no contexto clínico

Imagiologia por Ressonância Magnética (IRM) é uma modalidade de imagem médica que está a recuperar o interesse como uma técnica não invasiva no estudo da pele. Tipicamente campos magnéticos de elevada densidade e quipamentos específicos são usados. Este facto limita o usos da técnica a laboratórios e centros de investigação especializados. Neste trabalho estudou-se a viabilidade do uso da IRM no estudo da pele e da sua vasculatura usando equipamento convencional disponível em contexto clínico. Sequências IRM para imagem estrutural e veascular foram optimizadas e testadas para obtenção de imagens da pele do punho de 6 voluntários saudáveis. As sequências observáveis dos vasos, razão sinal-ruído, e razão contraste-ruído. Foi observado que duas sequências volumétricas baseadas em eco de gradiente e com ponderações T1 e T2 forneciam informação complementar em respeito à vasculatura da pele com resoluções espaciais da ordem dos micrómetros, podendo ainda esta informação ser fundida com imagens estruturais das cadamas da pele. Foi igualmente observado que estas sequências fornecem informação útil usando equipamento convencional e perspectiva-se a sua utilização no estudo das vasculatura de tumores cutâneos e na doença vascular periférica.

Platelet 12-lipoxygenase activation via glycoprotein VI: involvement of multiple signaling pathways in agonist control of H(P)ETE synthesis

Lipoxygenases (LOX) contribute to vascular disease and inflammation through generation of bioactive lipids, including 12-hydro(pero xyeicosatetraenoic acid (12-H(P)ETE). The physiological mechanisms that acutely control LOX product generation in mammalian cells are uncharacterized. Human platelets that contain a 12-LOX isoform (p12-LOX) were used to define pathways that activate H(P)ETE synthesis in the vasculature. Collagen and collagen-related peptide (CRP) (1 to 10 g/mL) acutely induced platelet 12-H(P)ETE synthesis. This implicated the collagen receptor glycoprotein VI (GPVI), which signals via the immunoreceptor-based activatory motif (ITAM)- containing FcR chain. Conversely, thrombin only activated at high concentrations ( 0.2 U/mL), whereas U46619 and ADP alone were ineffective. Collagen or CRP-stimulated 12-H(P)ETE generation was inhibited by staurosporine, PP2, wortmannin, BAPTA/AM, EGTA, and L-655238, implicating src-tyrosine kinases, PI3-kinase, Ca2 mobilization, and p12-LOX translocation. In contrast, protein kinase C (PKC) inhibition potentiated 12-H(P)ETE generation. Finally, activation of the immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif (ITIM)– containing platelet endothelial cell adhesion molecule (PECAM-1) inhibited p12-LOX product generation. This study characterizes a receptor-dependent pathway for 12-H(P)ETE synthesis via the collagen receptor GPVI, which is negatively regulated by PECAM-1 and PKC, and demonstrates a novel link between immune receptor signaling and lipid mediator generation in the vasculature. (Circ Res. 2004;94:1598-1605.)

Neurokinin B is a paracrine vasodilator in the human fetal placental circulation

Neurokinin (NK) B is a member of the tachykinin family of neurotransmitters, exerting hypotensive or hypertensive effects in the mammalian vasculature through synaptic release from peripheral neurons, according to either NK1 and NK2 or NK3 receptor subtype expression, respectively. There is recent evidence that NKB is expressed by the syncytiotrophoblast of the human placenta, an organ that is not innervated. We hypothesized that NKB is a paracrine modulator of tone in the fetal placental circulation. We tested this hypothesis using the in vitro perfused human placental cotyledon. Our data show that NKB is a dilator of the fetal vasculature, causing a maximal 25.1+/-4.5% (mean+/-SEM; n=5) decrease in fetal-side arterial hydrostatic pressure (5-muM NKB bolus; effective concentration in the circulation, 1.89 nM) after preconstriction with U-46619. RT-PCR demonstrated the presence of mRNA for NK1 and NK2 tachykinin receptors in the placenta. Using selective receptor antagonists, we found that NKB-induced vasodilation is through the NK1 receptor subtype. We found no evidence for the involvement of either nitric oxide or prostacyclin in this response. This study demonstrates a paracrine role for NKB in the regulation of fetal placental vascular tone.