Étude des interactions protéiques impliquant NPM-MLF1 dans la leucémie myéloïde aiguë.

Différentes translocations génomiques sont fréquemment associées à l'apparition de leucémies myéloïdes aiguës (LMA). Ces translocations génomiques résultent de l’assemblage de deux gènes conduisant à la production d'une protéine de fusion. C'est le cas de la translocation t (3; 5) (q25.1; q34) impliquant le suppresseur tumoral NPM et l'oncogène MLF1 donnant naissance à la protéine de fusion NPM-MLF1. Généralement, les gènes impliqués dans ces translocations contrôlent la croissance cellulaire, la différenciation ou la survie cellulaire. Cependant, pour NPM-MLF1 les causes du gain ou de la perte de fonction associée à la translocation demeurent inconnues car nous ne savons pas comment cette translocation peut favoriser ou participer à l'avènement de la LMA. Le but de ce travail est d’analyser le rôle de NPM-MLF1 dans le cancer et d’examiner comment son activité contribue à la leucémie en faisant des études d’interactions protéine/protéine. En effet, l’étude de la fonction d’une protéine implique souvent de connaître ses partenaires d’interactions. Pour ce faire, la technique de double hybride dans la souche de levure AH109 a été utilisée. Tout d’abord, les ADN complémentaires (ADNc) de MLF1, NPM1 et de NPM-MLF1, MLF1-Like (une partie de MLF1 de l’acide aminé 94 à 157) normaux et mutés du domaine MTG8-Like constitué des acides aminés (a.a.) 151 à 164 de MLF1 (excepté NPM) ont été clonés dans un vecteur d'expression de levure pGBKT7. Les ADNc de GFI-1, mSin3A, PLZF, HDAC1 et HDAC3 ont été clonés dans le plasmide pGADT7 de façon à créer des protéines de fusion synthétiques avec le domaine de liaison à l'ADN et de trans-activation de la protéine GAL4. Le plasmide pGBKT7 possède un gène TRP1 et pGADT7 un gène LEU2 qui permettent la sélection des clones insérés dans la levure. Aussi, le pGBKT7 a un épitope c-myc et pGADT7 un épitope HA qui permet de voir l’expression des protéines par buvardage de type Western. Après la transformation des levures les interactions protéine/protéine ont été observées en vérifiant l’expression des gènes rapporteurs HIS3, LacZ, MEL1, ADE2 de la levure en utilisant des milieux de sélection YPD/-Leu/-Trp, YPD/-Leu/-Trp/-His, YPD/-Leu/-Trp/-His/-Ade, YPD/-Leu/-Trp/+ X-Gal, YPD/-Leu/-Trp/ + X-α-Gal. Ensuite, les interactions trouvées par double-hybride ont été vérifiées dans les cellules érythroleucémiques K562 par immuno-précipitation (IP) de protéines suivies de buvardages Westerns avec les anticorps appropriés. NPM-MLF1, MLF1, MTG8, MLF1-Like surexprimés dans les cellules K562 ont été clonés dans le plasmide pOZ-FH-N. pOZ-FH-N possède un récepteur IL-2 qui permet de sélectionner les cellules qui l’expriment ainsi qu’un tag Flag-HA qui permet de voir l’expression des protéines par buvardage-Western. Les résultats du double-hybride suggèrent une interaction faible de NPM-MLF1 avec HDAC1, HDAC3 et mSin3A ainsi qu’une interaction qui semble plus évidente entre NPM-MLF1 et PLZF, GFI-1. NPM interagit avec GFI-1 et mSin3A. Aussi, MLF1 et MLF1-Like interagissent avec HDAC1, HDAC3, GFI-1, PLZF mais pas avec mSin3A. Les IP suggèrent que NPM-MLF1 interagit avec HDAC1, HDAC3, mSin3A et PLZF. MLF1 et MLF1-Like interagissent avec HDAC1, HDAC3 et mSin3A. L’interaction de NPM-MLF1 avec GFI-1, MLF1 et MLF1-Like avec PLZF et GFI-1 n’a pas encore été vérifiée par IP. Ainsi, nos observations permettent de suggérer que NPM-MF1, MLF1 et NPM pourraient jouer un rôle dans la transcription et la régulation de l’expression de certains gènes importants dans l’hématopoïèse et une variété de processus cellulaires parce qu’ils interagissent avec différents corépresseurs. En déterminant les partenaires protéiques de MLF1, NPM et NPM-MLF1, leurs fonctions et comment NPM-MLF1 influence et modifie le fonctionnement cellulaire normal; il sera possible de renverser le processus de LMA favorisé par la t (3; 5) NPM-MLF1 par la technologie d’interférence à l’ARN.

Caractérisation de la SERPINA1, une antiprotéase différentiellement exprimée dans le cancer épithélial de l’ovaire

Le cancer épithélial de l’ovaire est le cancer gynécologique le plus létal. La survie à 5 ans est de 30-40% chez les patientes atteintes d’une tumeur invasive (TOV), comparativement à 95% chez les patientes diagnostiquées pour une tumeur à faible potentiel de malignité ou borderline (LMP). Au laboratoire, l’analyse de l’expression des gènes de la micropuce à ADN U133 d’Affymetrix a révélé que la SERPINA1 est un gène dont l’expression varie entre les tumeurs LMP et TOV. La validation par Q-PCR nous a confirmé que cette antiprotéase est majoritairement surexprimée dans les tumeurs LMP, par rapport aux tumeurs bénignes (BOV) et aux tumeurs TOV. Nous avons donc surexprimé la SERPINA1 dans les lignées cellulaires invasives TOV 112D et TOV 1946 du cancer de l’ovaire et dérivé des clones stables. Les résultats obtenus nous indiquent que la surexpression de la SERPINA1 a un effet sur la capacité d’invasion et de migration cellulaire et non au niveau de la croissance cellulaire et la formation de structures tridimensionnelles. Les résultats issus de l’étude in vivo dans les souris SCID nous permettront de déterminer si la surexpression de la SERPINA1 a un effet sur la tumorigénèse ovarienne. Ainsi, la SERPINA1 demeure à notre avis un candidat d’intérêt pour tenter de mieux comprendre les différences biologiques entre les tumeurs LMP et TOV, ainsi que le rôle des protéases et de leurs inhibiteurs dans la progression tumorale du cancer de l’ovaire.

Étude du rôle des gènes TGF-β1 et HSP-70 lors du processus de régénération du membre chez l’axolotl

Les urodèles amphibiens, dont fait partie l’axolotl (Ambystoma mexicanum), ont la capacité de régénérer leurs organes et membres suite à une amputation, tout au long de leur vie. La patte est l’organe dont le processus de régénération est le mieux caractérisé et ce dernier est divisé en deux phases principales. La première est la phase de préparation et commence immédiatement suite à l’amputation. Elle renferme des étapes essentielles au processus de régénération comme la guérison de la plaie et la formation d’une coiffe apicale ectodermique. Par la suite, les fibroblastes du derme et certaines cellules musculaires vont revenir à un état pluripotent via un processus appelé dédifférenciation cellulaire. Une fois dédifférenciées, ces cellules migrent et s’accumulent sous la coiffe apicale pour former le blastème. Lors de la phase de redéveloppement, les cellules du blastème se divisent puis se redifférencient pour régénérer la partie amputée. Fait intéressant, la régénération d’un membre ou la guérison d’une plaie chez l’axolotl ne mène jamais à la formation d’une cicatrice. Afin d’en apprendre plus sur le contrôle moléculaire de la régénération, les gènes Heat-shock protein-70 (Hsp-70) et Transforming growth factor-β1 (Tgf-β1) ont été sélectionnés. Ces gènes jouent un rôle important dans la réponse au stress et lors de la guérison des plaies chez les mammifères. HSP-70 est une chaperonne moléculaire qui est produite pour maintenir l’intégrité des protéines cellulaires lorsqu’un stress se présente. TGF-β1 est une cytokine produite suite à une blessure qui active la réponse inflammatoire et qui stimule la fermeture de la plaie chez les amniotes. Les résultats présentés dans cette thèse démontrent que Hsp-70 est exprimé et régulé lors du développement et de la régénération du membre chez l’axolotl. D’autre part, nos expériences ont mené à l’isolation de la séquence codante pour Tgf-β1 chez l’axolotl. Nos résultats montrent que Tgf-β1 est exprimé spécifiquement lors de la phase de préparation dans le membre en régénération. De plus, le blocage de la voie des Tgf-β avec l’inhibiteur pharmacologique SB-431542, lors de la régénération, mène à l’inhibition du processus. Ceci démontre que la signalisation via la voie des Tgf-β est essentielle à la régénération du membre chez l’axolotl.

Optimisation de la domiciliation des cellules CD34+ de sang de cordon ombilical: élucider les mécanismes en cause dépendant du CXCR4.

Le sang provenant d’un cordon ombilical (SCO) représente une bonne source de cellules souches hématopoïétiques (CSH) pour des transplantations. Cependant, le nombre de cellules souches contenues dans ce sang est souvent insuffisant pour greffer un adulte. Le mécanisme intervenant dans la domiciliation de ces cellules au sein de la moelle osseuse (MO) est encore mal compris. On sait que l’interaction entre la chimiokine SDF-1 et le récepteur CXCR4, présent sur les cellules CD34+ de SCO, mène à la migration de ces cellules en direction de la MO. Nous pensons que l’augmentation de la proportion de cellules qui réussit à se greffer pourra pallier au problème du nombre. Les produits de dégradation, C3a et le C3desarg,, issus du système du complément, sont connus pour favoriser la réponse de cellules exprimant CXCR4 vers SDF-1. Nous avons analysé l’effet du C3adesarg, molécule non anaphylatoxique, sur la migration cellulaire vers SDF-1, de même que sur la prise de greffe des cellules CD34+ issues de SCO suite à une transplantation sur des souris NOD/SCIDyC-. Nos expériences ont démontré que le C3a ainsi que le C3adesarg augmentaient tous les deux la réponse des cellules CD34+ vers SDF-1. Toutefois, nous n’avons pas pu démontrer que ces molécules liaient directement le récepteur CXCR4. Par contre, le composé C3adesarg favorise la prise de greffe des cellules CD34+ de SCO. Il serait donc un bon candidat pour poursuivre une optimisation de ses propriétés. Nous avons également constaté que suite à une transplantation chez la souris, les cellules CD34+ de SCO subissent une hausse d’expression transitoire de leur CXCR4 environ quatre jours après la greffe. Cette hausse d’expression coïncide avec la multiplication des cellules CD34+ dans la MO. Nous avons également confirmé qu’une cellule CD34+ avec une forte expression de CXCR4 était dans un état prolifératif. Nos données suggèrent que l’interaction directe avec les cellules stromales soit responsable de cette hausse d’expression de CXCR4.

Étude de prévention de la thrombose veineuse associée au cathéter veineux central de type PICC chez les patients en oncologie recevant une chimiothérapie

Nous avons mené une étude prospective randomisée dans le but de comparer l'effet de l'irrigation du cathéter de type PICC avec deux types d'anticoagulants: Héparine standard et Tinzaparine, une héparine de faible poids moléculaire. Notre étude s'adresse aux patients de la clinique externe d'oncologie de l'hôpital Maisonneuve-Rosemont. Entre début Mai 2005 et Mars 2008, nous avons recruté 131 patients dont 70 ont été randomisés. Parmi les 61 patients exclus, 23 n'ont pas rencontré les critères d'inclusion, 30 ont refusé de participer et 8 ne sont pas inclus pour d'autres raisons. Sur les 70, 36 sujets sont randomisés dans le groupe Héparine standard et 34 dans le groupe Tinzaparine. La population en intention de traiter comprend 65 sujets dont 32 dans le groupe Héparine standard et 33 dans le groupe Tinzaparine. Le médicament a été administré pendant un mombre maximal de 30 jours et les sujets ont été suivis pendant 90 jours. La thrombose veineuse associée au cathéter (TVAC) a été objectivée par une phlébographie ou une échographie-Doppler à la fin de la période de 30 jours suivant l'installation du cathéter. L'incidence de la TVAC sur 30 jours est de 14,39 par 1000 cathéter-jours (IC à 95%:[9,0;19,79]/1000 cathéter-jours ou 41,5% (27/65). L'incidence de la thrombose veineuse profonde (TVP) symptômatique du membre supérieur sur la période de suivi de 90 jours est de 0,41 par 1000 cathéter-jours (IC à 95%:[0,08;0,81]/1000 cathéter-jours ou 3% (2/65). Nous n'avons observé aucune différence entre les deux groupes par rapport à la fréquence de la TVAC ni de la TVP. Nous ne pouvons conclure à une différence dans l'efficacité de la Tinzaparine par rapport à l'Héparine standard dans la prévention de la TVAC.

Cloning and Characterisation of the human gene gremlin promoter

L’ostéoarthrose (OA) est une maladie articulaire invalidante caractérisée par la perte de l’intégrité du cartilage articulaire. Les recherches tentent de comprendre les mécanismes moléculaires de la maladie afin de trouver des inhibiteurs efficaces pouvant prévenir la dégradation du cartilage articulaire. Les BMPs (bone morphogenic proteins) jouent un rôle dans le processus pathophysiologique de cette maladie. Cette étude cible le rôle d’un antagoniste des BMPs, le gremlin. Nous avons étudié la régulation de l’expression de gremlin par le clonage et la caractérisation de son promoteur et en déterminant si gremlin pouvait jouer un rôle autre qu’antagoniste des BMP, en affectant l’expression d’autres gènes par l’activation d’une cascade de signalisation dans la cellule. Les résultats ont identifié une région importante dans le promoteur de gremlin qui affecte son activité basale et induite, et ont montré que le gremlin ne pouvait pas affecter l’expression génique et l’activation de signalisation intracellulaire indépendamment des BMPs. Cette étude démontre que le rôle de gremlin dans l’OA en est un essentiellement d’antagoniste des BMPs.

Phosphorylation du CTD de l'ARN polymérase II et impact de l'histone H2A.Z sur le positionnement des nucléosomes chez S. cerevisiae

La phosphorylation du domaine C-terminal de l’ARN polymérase II permet à ce complexe protéique d’exécuter la transcription des gènes, en plus de coupler à la transcription des événements moléculaires comme la maturation des ARNm. Mes résultats montrent que même si cette phosphorylation suit un patron similaire à l’ensemble des gènes, il existe des exceptions pouvant être dues à des mécanismes alternatifs de phosphorylation du CTD. Le présent ouvrage s’intéresse également au rôle qu’occupe la variante d’histone H2A.Z dans l’organisation de la chromatine. Des études précédentes on montré que le positionnement de certains nucléosomes le long de l’ADN serait influencé par H2A.Z et aurait une influence sur la capacité de transcrire les gènes. Par une approche génomique utilisant les puces à ADN, j’ai cartographié l’impact de la délétion de H2A.Z sur la structure des nucléosomes. Enfin, des résultats intéressants sur la dynamique d’incorporation de H2A.Z à la chromatine ont été obtenus.

Étude des récepteurs aux estrogènes dans les ostéoblastes de patients atteints de Scoliose Idiopathique de l'Adolescent

Plusieurs éléments de la pathogenèse de la scoliose idiopathique de l’adolescent indiquent que les estrogènes pourraient intervenir dans le développement et la progression de cette maladie. Ce projet avait donc pour but d’explorer l’expression et la fonctionnalité des récepteurs aux estrogènes ERα et ERβ ainsi que leurs isoformes dans les ostéoblastes de patients scoliotiques et sains. L’induction des gènes de facteurs influençant la minéralisation et la différenciation des ostéoblastes par les estrogènes a également été étudié. Par immunofluorescence, nous avons remarqué une augmentation de la présence protéique de ERβ dans les ostéoblastes de patients SIA comparé aux sujets contrôles. Les récepteurs aux estrogènes provenant des ostéoblastes des patients sont fonctionnels tout comme ceux des contrôles et aucune différence dans l'interaction ADN-protéine n’a été observée. Il y a également une augmentation de l’expression génique de l’ostéopontine, l’ostéocalcine, le collagène de type I, la phosphatase alkaline et BMP2 dans les ostéoblastes des patients SIA. Un début de minéralisation in vitro a été observé dans les ostéoblastes de patients SIA et contrôles. ERα et ERβ sont présents et fonctionnels dans les ostéoblastes des patients SIA et sains. Leur expression est variable, mais ces variations existent chez les patients SIA et les contrôles. L’implication des estrogènes dans la SIA ne serait donc pas au niveau des récepteurs aux estrogènes mais au niveau de l’interactions des estrogènes avec d’autres facteurs étiologiques tels que la mélatonine, la formation/résorption osseuse ou autres facteurs neuro-endocriniens.

Variabilité Génétique des Populations Ouest-Africaines

Notre patrimoine génétique dévoile, de plus en plus, les passerelles démogénétiques d’une susceptibilité plus accrue de certains individus à des maladies infectieuses complexes. En vue d’une caractérisation de la variabilité génétique des populations ouest-africaines, nous avons analysé 659 chromosomes X au locus dys44 qui comprend, 35 SNPs et un microsatellite distribués sur 2853 pb en amont et 5034 pb en aval de l’exon 44 du gène de la dystrophine en Xp21.3. Les génotypes obtenus, par ASO dynamique et électrophorèse sur gel d’acrylamide, ont servi à la détermination des haplotypes. Des paramètres comme la diversité haplotypique (G) et l'indice de fixation (Fst) ont été calculés. Des analyses en composantes principales ainsi que multidimensionnelles ont été réalisées. Sur 68 haplotypes détectés, 26 sont nouveaux, et cette région, avec une diversité haplotypique moyenne (Gmoy) de 0,91 ± 0,03, se révèle beaucoup plus hétérogène que le reste du continent (Gmoy = 0,85 ± 0,04). Toutefois, malgré l’existence de disparités sous régionales dans la distribution des variants du marqueur dys44, l’AMOVA montre d’une manière générale, une faible érosion de l’éloignement génétique entre les populations subsahariennes (Fst = 1,5% ; p<10-5). Certains variants tel que l’haplotype eurasien B006 paraissent indiquer des flux transsahariens de gènes entre les populations nord-africaines et celles subsahariennes, comme l’exemplifie le pool génétique de l’une des populations ubiquitaires de la famille linguistique Nigéro-congolaise : Les Fulani. Nos résultats vont aussi dans le sens d’un héritage phylétique commun entre les Biaka, les Afro-américains et les populations de la sous-famille de langues Volta-Congo.

Régulation de l’expression du gène Six6 par les facteurs de transcription Lhx2 et Pax6 dans le contexte des cellules souches rétiniennes

La rétinogésèse des vertébrés est la culmination de processus biologiques complexes parfaitement exécutés. Cette délicate orchestration est principalement contrôlée par les facteurs de transcription qui permettent aux progéniteurs rétiniens de proliférer, de s’auto-renouveler et de se différencier de façon appropriée. Les facteurs de transcription à homéodomaine sont les protéines qui sont responsables de la démarcation du site du primordium optique et participeront même à la différenciation tardive des différents types cellulaires de la rétine. Le contrôle génétique concernant l‘activation de l’expression de facteurs de transcription est peu connu. Nous avons étudié les séquences génomique avoisinant le gène Six6 afin d’identifier et mieux comprendre son promoteur. Des expériences d’immunoprécipitation de chromatine et des essais luciférases ont confirmé la liaison et la transactivation synergique du promoteur potentiel de Six6 par Lhx2 et Pax6 in vitro. Cette présente étude confirme et précise également le rôle de Lhx2 au niveau du développement précoce de l’oeil. La compréhension détaillée des réseaux génétiques régulant les progéniteurs rétiniens à former une rétine fonctionnelle est essentielle. En effet, lorsque ces connaissances seront acquises, nous serons en mesure d’appliquer les thérapies cellulaires pour rétablir les fonctions rétiniennes lors de pathologies dégénératives.

Assemblage oligomérique des récepteurs couplés aux protéines G avec les RAMPs

Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPGs) constituent la plus grande classe de récepteurs membranaires impliqués dans la transmission des signaux extracellulaires. Traditionnellement, la transmission de la signalisation par les RCPGs implique l’activation d’une protéine G hétéro-trimérique qui pourra à son tour moduler l’activité de divers effecteurs intracellulaires. Ce schéma classique de signalisation s’est complexifié au fils des années et l’on sait maintenant qu’en plus d’interagir avec les protéines G, les RCPGs s’associent avec une panoplie d’autres protéines afin de transmettre adéquatement les signaux extracellulaires. En particulier, la découverte d’une famille de protéines transmembranaires modulant la fonction des RCPGs, baptisées protéines modifiant l’activité des récepteurs (« receptor activity-modifying proteins » ; RAMPs), a changé la façon de concevoir la signalisation par certains RCPGs. Dans le cas du récepteur similaire au récepteur de la calcitonine (« calcitonin-like receptor » ; CLR), l’association avec les RAMPs permet l’acheminement à la surface cellulaire du récepteur tout en modulant ses propriétés pharmacologiques. Lorsqu’il est associé avec RAMP1, le CLR fonctionne comme un récepteur du peptide relié au gène de la calcitonine (« calcitonin gene-related peptide » ; CGRP), alors qu’il devient un récepteur de l’adrénomedulline lorsqu’il interagit avec RAMP2 ou RAMP3. D’autre part, en plus d’interagir avec des protéines accessoires transmembranaires telles les RAMPs, les RCPGs peuvent aussi s’associer entre eux pour former des oligomères de récepteurs. Dans cette thèse, nous nous sommes penchés sur les interactions entre les RCPGs et les RAMPs, et plus particulièrement sur l’interrelation entre ce type d’association RCPG/RAMP et l’assemblage en oligomères de récepteurs, en utilisant le récepteur du CGRP comme modèle d’étude. Une première étude nous a tout d’abord permis de confirmer l’interaction entre le récepteur CLR et RAMP1, dans un contexte de cellules vivantes. Nous avons démontré que ce complexe CLR/RAMP1 active la protéine G et recrute la protéine de signalisation -arrestine suite à une stimulation par le CGRP. Ensuite, nous avons déterminé que même s’il doit obligatoirement former un hétéro-oligomère avec les RAMPs pour être actif, le CLR conserve malgré tout sa capacité à interagir avec d’autres RCPGs. En plus d’observer la présence d’homo-oligomère de CLR, nous avons constaté que tout comme les RCPGs, les RAMPs peuvent eux-aussi s’associer entre eux pour former des complexes oligomériques pouvant comprendre différents sous-types (RAMP1/RAMP2 et RAMP1/RAMP3). Cette observation de la présence d’homo-oligomères de CLR et de RAMP1, nous a amené à nous questionner sur la stœchiométrie d’interaction du complexe CLR/RAMP1. Dans une deuxième étude ayant pour but d’établir la composition moléculaire du récepteur CGRP1 in vivo, nous avons développé une nouvelle approche permettant l’étude de l’interaction entre trois protéines dans un contexte de cellules vivantes. Cette technique baptisée BRET/BiFC, est basée sur le transfert d’énergie de résonance de bioluminescence entre un donneur luminescent, la Renilla luciférase, et un accepteur fluorescent, la protéine fluorescente jaune (YFP), reconstituée suite au ré-assemblage de ces deux fragments. En utilisant cette approche, nous avons pu déterminer que le récepteur CGRP1 est constitué d’un homo-oligomère de CLR interagissant avec un monomère de RAMP1. En démontrant un assemblage oligomérique asymétrique pour le récepteur CGRP1 à partir d’une nouvelle approche biophysique, nous croyons que les travaux présentés dans cette thèse ont contribué à élargir nos connaissances sur le fonctionnement de la grande famille des RCPGs, et seront utile à la poursuite des recherches sur les complexes protéiques impliqués dans la signalisation.

Étude du rôle de la tyrosine kinase Src dans la régulation de la signalisation des récepteurs opioïdes delta (∆OR)

Les opioïdes sont les analgésiques les plus efficaces mais leur utilisation est limitée par la tolérance, un processus lié en partie à la désensibilisation des récepteurs. Le rôle de la présente étude était de mieux caractériser le processus de désensibilisation des récepteurs et plus particulièrement, d’étudier le rôle de la tyrosine kinase Src sur la régulation de la signalisation des récepteurs delta opioïdes. Nos résultats démontrent que l’inhibition pharmacologique avec PP2 (à faible concentration : 20- 40µM) ou encore l’inhibition moléculaire de la kinase avec de faibles concentrations d’ADN d’un mutant dominant inactif de Src (0,2µg/ml) potentialise l’amplitude et la durée de l’activation de la cascade ERK lorsqu’un agoniste, DPDPE (1µM; 5 min), se lie aux récepteurs. Nous avons également démontré que de fortes concentrations d’inhibiteurs de Src (80 et 100µM de PP2 ou 1µg/ml d’ADN du mutant dominant négatif) bloquent la cascade des MAPK suivant la stimulation de DOR par l’agoniste DPDPE. Ces observations indiquent que Src a un effet biphasique sur l’activité de ERK : l’inhibition complète de Src inhibe l’activité de la cascade MAPK alors qu’une inhibition modérée potentialise cette même cascade. Nous pensons aussi que de fortes concentrations des bloqueurs de Src interfèrent avec l’activation de ERK alors que de faibles concentrations interfèrent avec la désensibilisation des récepteurs. Cette possibilité a été testée à l’aide d’essais d’accumulation d’AMPc qui visaient à évaluer l’effet des bloqueurs de Src (PP2, 20 µM; 1h) sur la désensibilisation induite par un agoniste. L'activation de DOR par DPDPE inhibe la production d’AMPc, préalablement stimulée par du forskolin, de façon dose-dépendante. Le maximum d'inhibition observé est de 61%, mais lors d’un prétraitement au DPDPE (1 µM, 30 min) l’inhibition maximale est réduite à 72% de l’inhibition initiale observée. Cependant, un prétraitement des cellules au PP2 (20µM pendant 1 heure) avant d’effectuer la désensibilisation protège contre cette désensibilisation. L’effet protecteur des bloqueurs de Src n’entraîne pas de changement au niveau de l’internalisation des DOR mais l’altération de leur internalisation via un mutant tronqué du DOR ou via un milieu sucré hypertonique (0.4M de saccharose) réduit cette protection. Ces données suggèrent alors que l’internalisation optimale du récepteur est nécessaire pour que l’effet protecteur prenne place. Nous concluons donc que Src contribue à la désensibilisation de DOR après que l’internalisation du DOR soit survenue.

Les R-loops et leurs conséquences sur l'expression génique chez Escherichia coli.

Des variations importantes du surenroulement de l’ADN peuvent être générées durant la phase d’élongation de la transcription selon le modèle du « twin supercoiled domain ». Selon ce modèle, le déplacement du complexe de transcription génère du surenroulement positif à l’avant, et du surenroulement négatif à l’arrière de l’ARN polymérase. Le rôle essentiel de la topoisomérase I chez Escherichia coli est de prévenir l’accumulation de ce surenroulement négatif générée durant la transcription. En absence de topoisomérase I, l’accumulation de ce surenroulement négatif favorise la formation de R-loops qui ont pour conséquence d’inhiber la croissance bactérienne. Les R-loops sont des hybrides ARN-ADN qui se forment entre l’ARN nouvellement synthétisé et le simple brin d’ADN complémentaire. Dans les cellules déficientes en topoisomérase I, des mutations compensatoires s’accumulent dans les gènes qui codent pour la gyrase, réduisant le niveau de surenroulement négatif du chromosome et favorisant la croissance. Une des ces mutations est une gyrase thermosensible qui s’exprime à 37 °C. La RNase HI, une enzyme qui dégrade la partie ARN d’un R-loop, peut aussi restaurer la croissance en absence de topoisomérase I lorsqu’elle est produite en très grande quantité par rapport à sa concentration physiologique. En présence de topoisomérase I, des R-loops peuvent aussi se former lorsque la RNase HI est inactive. Dans ces souches mutantes, les R-loops induisent la réponse SOS et la réplication constitutive de l’ADN (cSDR). Dans notre étude, nous montrons comment les R-loops formés en absence de topoisomérase I ou RNase HI peuvent affecter négativement la croissance des cellules. Lorsque la topoisomérase I est inactivée, l’accumulation d’hypersurenroulement négatif conduit à la formation de nombreux R-loops, ce qui déclenche la dégradation de l’ARN synthétisé. Issus de la dégradation de l’ARNm de pleine longueur, des ARNm incomplets et traductibles s’accumulent et causent l’inhibition de la synthèse protéique et de la croissance. Le processus par lequel l’ARN est dégradé n’est pas encore complètement élucidé, mais nos résultats soutiennent fortement que la RNase HI présente en concentration physiologique est responsable de ce phénotype. Chose importante, la RNase E qui est l’endoribonuclease majeure de la cellule n’est pas impliquée dans ce processus, et la dégradation de l’ARN survient avant son action. Nous montrons aussi qu’une corrélation parfaite existe entre la concentration de RNase HI, l’accumulation d’hypersurenroulement négatif et l’inhibition de la croissance bactérienne. Lorsque la RNase HI est en excès, l’accumulation de surenroulement négatif est inhibée et la croissance n’est pas affectée. L’inverse se produit Lorsque la RNase HI est en concentration physiologique. En limitant l’accumulation d’hypersurenroulement négatif, la surproduction de la RNase HI prévient alors la dégradation de l’ARN et permet la croissance. Quand la RNase HI est inactivée en présence de topoisomérase I, les R-loops réduisent le niveau d’expression de nombreux gènes, incluant des gènes de résistance aux stress comme rpoH et grpE. Cette inhibition de l’expression génique n’est pas accompagnée de la dégradation de l’ARN contrairement à ce qui se produit en absence de topoisomérase I. Dans le mutant déficient en RNase HI, la diminution de l’expression génique réduit la concentration cellulaire de différentes protéines, ce qui altère négativement le taux de croissance et affecte dramatiquement la survie des cellules exposées aux stress de hautes températures et oxydatifs. Une inactivation de RecA, le facteur essentiel qui déclenche la réponse SOS et le cSDR, ne restaure pas l’expression génique. Ceci démontre que la réponse SOS et le cSDR ne sont pas impliqués dans l’inhibition de l’expression génique en absence de RNase HI. La croissance bactérienne qui est inhibée en absence de topoisomérase I, reprend lorsque l’excès de surenroulement négatif est éliminé. En absence de RNase HI et de topoisomérase I, le surenroulement négatif est très relaxé. Il semble que la réponse cellulaire suite à la formation de R-loops, soit la relaxation du surenroulement négatif. Selon le même principe, des mutations compensatoires dans la gyrase apparaissent en absence de topoisomérase I et réduisent l’accumulation de surenroulement négatif. Ceci supporte fortement l’idée que le surenroulement négatif joue un rôle primordial dans la formation de R-loop. La régulation du surenroulement négatif de l’ADN est donc une tâche essentielle pour la cellule. Elle favorise notamment l’expression génique optimale durant la croissance et l’exposition aux stress, en limitant la formation de R-loops. La topoisomérase I et la RNase HI jouent un rôle important et complémentaire dans ce processus.

Caractérisation structurale de la molécule HLA-DO

Les molécules classiques du CMH de classe II présentent des peptides antigéniques aux lymphocytes T CD4+. Cette présentation est régulée par deux molécules non classiques : HLA-DM catalyse la relâche de CLIP et le chargement de peptides et HLA-DO module l’activité de DM. Une expression insuffisante en cellules d’insectes empêche les expériences de cristallisation de DO, probablement en raison de sa conformation, rendant DO instable et inapte à sortir du réticulum endoplasmique (RE). DM corrige la conformation de DO et permet sa sortie du RE. Aussi, par ses ponts disulfures uniques, DM adopte une conformation stable et peut sortir du RE sans lier d’autre molécule. Nous avons tenté de corriger la conformation de DO en introduisant des cystéines pour établir des ponts homologues à ceux de DM. La conformation de DO ne fut pas corrigée. Par ailleurs, nous avons augmenté l’expression de DO en introduisant une séquence partielle de Kozak. Nous avons aussi étudié l’effet de DM sur l’expression de DO. DM a favorisé l’expression de DO, probablement en diminuant sa dégradation. Chaque chaîne du dimère DMαβ est impliquée dans l’oxydation de sa chaîne partenaire. La conformation non-optimale de DO pourrait traduire une incapacité des chaînes α ou β à favoriser l’oxydation de sa partenaire; DM corrigerait ce problème. Notre analyse d’immunobuvardage de type Western a toutefois démontré que DM ne modifie pas l’état d’oxydation de DOα et DOβ. Finalement, nous avons étudié l’interaction DO-DM. L’acide aminé DOαE41 est impliqué dans cette liaison. Certains des acides aminés entre α80 et α84 pourraient être impliqués. Nous avons muté des acides aminés de cette région de DOα. Les résidus testés ne semblent pas impliqués dans la liaison DO-DM. L’obtention de la structure tridimensionnelle de DO et la caractérisation de son état oxydatif et de sa liaison à DM permettront de mieux comprendre son rôle.

Étude de l’activité de Staufen1 dans la régulation traductionnelle de certains ARNm

Le transport et la traduction localisée des ARN messagers sont observés chez plusieurs organismes et sont requis pour de multiples phénomènes tels la mémoire, la division cellulaire asymétrique et l’établissement des axes durant le développement. Staufen, une protéine liant l’ARN double-brin, a été identifié dans un premier temps chez la mouche à fruits Drosophila melanogaster. Il a été montré, chez cet organisme, que Staufen est requis pour la localisation des messagers bicoid et oskar aux pôles antérieur et postérieur de l’ovocyte, respectivement. Également, Staufen est requis afin que la répression traductionnelle du messager oskar soit levée une fois qu’il est bien localisé. Chez les mammifères, Stau1 est une protéine ubiquiste qui est présente dans des complexes prenant la forme de granules dans les dendrites des neurones. Également, Stau1 peut interagir de façon indépendante de l’ARN avec le ribosome et cofractionner tant avec la sous-unité 40S qu’avec la sous-unité 60S du ribosome dans un gradient de saccharose. L’implication de Stau1 dans un mécanisme permettant la dérépression traductionnelle de certains ARNm chez les mammifères était donc une voie d’investigation intéressante. Nous avons donc décidé de vérifier si Stau1 mammifère avait la capacité de stimuler la traduction d’un ARNm cellulaire via un mécanisme régulé. Au moment où cette thèse a été entreprise, aucun ARNm cellulaire lié par Stau1 n’avait été identifié chez les mammifères. Des structures d’ARN double-brin ont donc été employées afin de réprimer la traduction d’un ARNm rapporteur. C’est ainsi que nous avons montré que Stau1 peut stimuler la traduction d’un ARNm lorsqu’il lie celui-ci dans sa région 5’ non-traduite. Par la suite, en employant des micropuces d’ADN, nous avons identifié des messagers cellulaires dont la distribution dans les polysomes lourds est modifiée par Stau1. En effet, un groupe de messagers est enrichi dans les polysomes lourds suite à une surexpression de Stau1, ce qui suggère que Stau1 stimule la traduction de cette population d’ARNm. Afin d’identifier un mécanisme potentiel de régulation de l’activité traductionnelle de Stau1, nous nous sommes intéressés à la capacité d’auto-association de cette protéine. Nous avons montré que Stau1, tout comme plusieurs protéines liant l’ARN double-brin, est en mesure de s’associer à lui-même, et ce, d’une façon indépendante de l’ARN. Nous avons identifié les déterminants impliqués mettant ainsi au jour un nouveau mécanisme pouvant influencer les activités cellulaires de Stau1. Les résultats présentés dans cette thèse suggèrent donc que Stau1 est en mesure de stimuler la traduction d’une sous-population précise d’ARN messagers au sein de la cellule permettant ainsi de jeter un regard nouveau sur l’implication de cette protéine dans divers phénomènes au sein de l’organisme.