两个固氮相关的植物基因对烟草和水稻的转化及其表达

豆科植物凝集素基因和血红蛋白基因在对根瘤菌的识别作用和类菌体在低氧分压下的共生固氮中起重要作用。本文的目的是试图将这两个基因转移到非豆料植物烟草和水稻，使其能识别根瘤菌，探讨非豆科植物的共生和联合固氮的可能性。 构建了含有豌豆凝集素（P－Lec）基因、Parasponia andersonii血红蛋白基因、gus基因及植物选择标记潮霉素磷酸转移酶基因（hpt）的两个植物表达载体pCBHL和pCBHUL;同时，还构建了含有P－Lec基因、gus基因及植物选择标记PPT乙酰转移酶基因（bar）的植物表达载体pBBUL。在pCBHL中，CaMV35S启动子调控P－Lec基因的表达，而在pCBHUL和pBBUL中，该基因由玉米Ubiquitin 1启动子调控。 用农杆菌法将pCBHL导入烟草，得到53株再生植株，PCR检测表明转化频率为88％。用基因枪法分别将pCBHUL和pBBUL导入水稻幼胚或幼胚诱导的愈伤组织。转pCBHUL的材料共得到40株再生植株，经分子检测有18株分转基因植株，转化频率为0.9%。转pBBUL的幼胚愈伤组织经PPT筛选，只得到能分化出小芽的抗性愈伤组织。 PCR检测、Southern杂交表明P-Lec基因和Paraspoina血红蛋白基因都已经整合到转基因烟草及水稻的基因组中，转基因水稻植株中两个外源目的基因的拷贝数较高。Western杂交分析转基因植物中P-Lec基因的表达情况，结果表明该基因在转基因的烟草和水稻叶片中得到正确地表达。同时，GUS组织化学染色表明转基因烟草的嫩茎和幼根，转基因水稻的嫩叶和幼根中都有gus基因的表达。转基因烟草中外源基因的表达频率高于转基因水稻。T1代转基因烟草幼根的蛋白原位免疫杂交显示P-Lec正确定位于正在生长的幼根根毛的顶端，与对照豌豆中的P-Lec基因表达部位相一致。关于Parasponia血红蛋白基因，以前本实验室对转基因烟草和水稻的研究表明有转录水平的表达，国外实验室证实转基因烟草中有转译表达。 上述结果有可能为进一步研究转基因非豆科植物与根瘤菌的相互作用奠定一定的基础。

根瘤菌、铵态氮、光照强度对大豆固氮和光合作用影响的研究

生物固氮和植物光合作用作为全球生态系统的两个基本生物学过程, 在碳氮循环、自然生态系统的维持和演替，以及农业生产中起了重要作用。尽管过去关于共生固氮与光合作用的研究取得了巨大成就，但是，很少将两者直接联系起来。本研究通过比较低光效和高光效大豆接种高效固氮根瘤菌后固氮与光合作用的差异，比较接种根瘤菌和施用铵态氮肥对大豆光合生理的影响或光照强度对大豆光合固氮的影响，以及C4基因转化C3 豆科植物—苜蓿的研究，试图将两者偶联起来。研究获得以下结果： 1．用nifA和dct工程根瘤菌接种低光效和高光效大豆后，与出发菌株比，均提高了大豆的固氮和光合作用。两者相比，nifA工程菌对低光效大豆黑农37号发挥了比较好的作用，大豆的光合作用参数，固氮活性和植物株高、株重等产量参数比dct工程菌好;dct工程菌接种高光效大豆黑农40号后，尽管固氮酶活性与nifA工程菌相比没有明显差异，但是大豆光合作用和产量参数有了比较明显的提高。 2．光照培养条件下，对大豆进行了接种根瘤菌（108细菌/ mL）、低氮（5 mmol/L (NH4)2SO4）和高氮（30 mmol/L (NH4)2SO4）处理。测定的大豆生长状况和光合作用系列参数结果表明：低氮处理的最好，接种根瘤菌的次之，高氮处理的最差。由此说明单纯接种根瘤菌满足不了大豆发育过程中的氮营养要求，其光合作用和生长受到不利影响。但是，高氮处理也并没有提高大豆的光合作用，其生长发育甚至受到抑制。该结果为生产实践中合理施肥提供了光合生理方面的参考。 3．接根瘤菌和不接根瘤菌的大豆在正常光强（150μmol photons m-2s-1）下生长三周后进行遮光（15μmol photons m-2s-1，7天）和复光（正常光强，7天）处理，大豆的光合作用有下降和回复。测定的一系列光合参数、叶绿素荧光参数，以及植物的生长生理参数结果表明：接根瘤菌大豆与不接根瘤菌的大豆对遮光的响应有不同。正常光照下，接种根瘤菌能促进大豆生长与光合作用;遮光处理后，根瘤菌对大豆的促进作用不显著。 4．获得了不同苜蓿品种的愈伤组织及其诱导的再生植株。并作了用小米、甘蔗的PEPC基因转化苜蓿的研究。由于在实验过程中，考虑转基因植物的安全性，着重于用甘露糖筛选转化体系的研究工作，忽略了用抗生素筛选转化体。用PCR法从苜蓿中扩增出甘露糖异构酶基因（pmi），表明苜蓿体内含有自己的甘露糖异构酶基因，使得甘露糖筛选没有成功。

植物个体的生理生态动力学模型

GCTE（全球变化和陆地生态系统），作为IGBP的核心计划之一，其目的是研究陆地生态系统与全球气候变化及人类社会经济和土地利用改变之间相互作用的耦合机理关系，预测生态系统结构、功能的未来变化。其中，植物个体水平的生理生态学模型研究是GCTE中必不可少的重要环节，它不仅可以揭示植物在个体水平上对全球变化的动态响应机制，而且可通过揭示大尺度响应所隐含的微观生物学机理，为大尺度研究提供重要的生理学参数和规律，在全球变化各尺度研究中发挥着不可替代的作用。本文主要围绕植物个体的生理生态学模型开展了如下研究：在开顶式气室CO2倍增大豆生长实验基础上，建立描述植物主要生理过程的生理生态模型，分析植物个体的光合作用、气孔传导度、蒸腾作用以及水分利用效率在全球场变化下的动态响应机制;在此基础上，建立起以统计性天气模型驱动的植物个体生长发育系统动力学模型，通过敏感度分析探讨植物个体的生理生态特性，如光合、呼吸、绿色及非绿色生物量等，对全球变化，特别是对CO2增加，气温升高及降水改变共同作用的响应机制;针对固氮植物的特点，将前一模型发展成为基于共生固氮和同化过程相互作用机制的植物个体生理生态系统动力学模型，模拟不同CO2浓度、气候变化以及固氮与不固氮条件下植物个体生物量的动态响应，并分析CO2浓度、气候条件和是否具固氮能力在对植物生长发育影响方面的相互作用;以中间锦鸡儿为研究材料进行水分控制实验，观测水分对植物同化物分配等过程的影响;将水分利用效率模型应用到NECT样带的主要植物种，得出各植物种的描述其水分利用效率特性的参数，结合样带上各植被类型的结构特征，得到沿样带各植被类型在植物种类组成方面的水分利用效率参数;应用系统聚类分析、因子分析等多元统计方法对样带上锡林河流域122种植物的化学成分与植物类群和所处生境的关系进行了定量分析。结果表明： 1）CO2倍增情况下，净光合速率提高45%，其中光量子效率显著增加，而CO2传导系数略有下降;气孔传导度、蒸腾速率下降约30%;水分利用效率随CO2浓度增加几乎呈线性增长，倍增后提高近一倍。（当气温，水分适宜，光合有效辐射为1000μmol photons m-2 s-1); 2）在北京地区仅CO2倍增而气候条件维持现状的情况下可导致大豆总生物量峰值提高70%，绿色部分提高56%，其中，全生育期内总净光合量增加，而单位干重的暗呼吸速率下降;由于受同化物分配中物候因素的影响，绿色生物量比总生物量提前10日左右到达其峰值。 3）CO2浓度增加和具固氮能力在模拟范围内对植物生长均产生正效应;而在水分为植物生长限制因子的干旱半干旱地区，降水增加对植物生长产生正效应，气温升高则具负效应; 4）随着C供给条件的好转，具固氮能力对植物生长的影响增强;反之随植物吸收N能力的提高，C供给对植物生长的作用加剧。 5）气温、降水在对植物生长发育影响方面，随着一方条件的好转，另一方对植物生长产生的效应增强; 6）具固氮能力对植物生长的正效应随气候条件的好转而增强，气候变化对植物生长的影响随植物具备了固氮能力而加剧; 7）气候条件越恶劣，如在此半干旱区变得更为干旱，CO2浓度增加对植物生长的正效应越加显著;且随CO2浓度的增加，气候因子的效应逐渐减弱。这主要是因CO2增加提高了植物个体的水分利用效率，从而使得CO2的正效应在水分胁迫下更为明显;同时由于水分利用效率的提高，使得植物个体抵御和适应外界环境变化，特别是由气温、降水改变导致的水分条件变化，的能力得到增强。 8）锦鸡儿水分生理生态实验的初步结果表明，土壤水分状况影响着植物的同化物分配，随着水分胁迫的加剧，同化物分配向根部集中，植物的根冠比增加。 9）沿样带水分递减梯度，植被类型在植物种类组成方面的反映水分利用效率特性的参数kv逐渐增加，从而显示出随着水分条件的不足，植被类型中耐旱品种，尤其是C4种增加;人为活动干扰，主要是对草场等的过度利用而导致的盐渍化、沙化，使得退化了的植被类型中k_v值显著提高，表明原有的植物种逐渐被耐旱、耐盐碱的品种，特别是C4植物所代替;在样带动上，这种由于人为活动干扰所引起的植被类型在植物种类组成方面反映水分利用效率特性的参数kv的变化明显大于因样带水分梯度改变而带来的变化。 10）锡林河流域草原植物化学成分一方面与植物类群有关，受自身历史演化的决定，另一方面更受到所处生境条件的极度大影响和制约。其中，禾本科、豆科植物分别具有明显的化学成分特征;撂荒地群落与自然群落中植物、沙质与非沙质生境中植物化学成分差异较显著;因子分析中认为存在大量元素与微量元素两个公共因子，豆科与禾本科相比，豆科植物因其固氮能力，所含大量元素水平较高，而禾本科植物因细胞壁硅质化，含微量元素稍高;沙质生境因其养分贫瘠，植物的大量与微量元素均较非沙质生境中的低;特别是本区地带性土壤-栗钙土与特异性生境沙带中的疏林沙土相比，疏林沙土上植物大量与微量元素含量较栗钙土区植物明显偏低。

内蒙古草原地耳和发菜的固氮特性及在氮素循环中的作用

以内蒙古干旱半干旱草原上的固氮蓝藻－普通念珠藻和发状念珠藻为研究对象，对其分布、生态特点、形态结构、生物量及不同条件下的固氮活性进行了研究，并根据降水与气温状况对其年固氮量进行了估算。结果表明：同发状念珠藻相比，普通念珠藻的分布更为广泛，其形态也有较大的差异。普通念珠藻的生物量在以禾本科为主的退化草场和沙地上较大，在pH值偏碱、含水量300％和温度30℃的情况下，其固氮活性较高，达2500nmolC2H2/g•h（干重）以上，年固氮量也高达4.19kg/h.m2，占草原氮素总输出的10％左右。由此可见，在维持干旱半干旱草原与荒漠草原生态系统的氮素平衡中，固氮蓝藻这类低等固氮植物可能起着重要作用。

豆科植物及其在内蒙古锡林河流域放牧草原生态系统中作用的研究

内蒙古锡林河流域是我国典型温带草原分布地区，也是我国重点牧区之一。近年来，由于人口增加、过度放牧以及管理不善等原因导致草原退化加剧，草原生态系统养分输入输出失衡，草地生产力下降。 豆科植物不仅是高蛋白优质牧草，而且具有生物固氮能力，对维持草地生态系统中土壤-植物-动物之间的氮平衡有重要作用。本论文主要调查研究了内蒙古锡林河流域放牧草原生态系统中豆科植物的分布、固氮能力、微生物状况，并探讨了目前草原大量出现的豆科植物小叶锦鸡儿灌丛在养分供给上对草原生态系统的影响。 豆科植物的分布调查采用样线法在4 种草原植被类型7 个植物群落进行，包括典型草原（羊草群落、大针茅群落及小叶锦鸡儿群落和冷蒿群落2 个退化草原群落）、草甸草原（贝加尔针茅群落）、河漫滩草甸（灰脉苔草群落）及沙地（榆树疏林群落），除榆树疏林群落仅放牧处理外，其他群落均包括放牧和不放牧对照处理。结果显示，豆科植物共有12 属，16 种。放牧总体上降低了豆科植物种群在群落中的数量特征（平均高度、密度、频度）和种类组成，但在退化草原群落中有不同的变化趋势。小叶锦鸡儿在典型草原中分布广、密度大、出现频率高；尤其在小叶锦鸡儿群落放牧样地，出现频度为95%，密度近4 株•m-2。花苜蓿在4 种草原植被类型中均有分布。 典型草原4 个群落在放牧和不放牧条件下土壤微生物碳氮含量和微生物呼吸速率的测定结果显示，放牧影响了豆科植物根际土壤的微生物量和微生物呼吸速率，但各群落变化规律不一致。放牧后小叶锦鸡儿分布最为广泛的小叶锦鸡儿群落在放牧条件下微生物碳含量和微生物呼吸速率都显著增加。小叶锦鸡儿灌丛与其他草本豆科植物相比，根际土壤的微生物量和微生物呼吸速率较高。土壤水分对微生物呼吸速率以及微生物碳氮含量有重要作用，存在极显著的正相关关系。 采用15N 自然丰度法评估野外条件下小叶锦鸡儿和花苜蓿的固氮百分率，计算结果高于100%，这主要是由野外植物叶片δ15N 值低于室内无氮培养的B 值引起的。15N 自然丰度法是否适用于评估草原植物的固氮能力还有待深入研究，但从野外δ15N 测定中也得到了一些有趣的结果。优势豆科和非豆科植物之间的δ15N 差异很大。小半灌木木地肤δ15N 值最高，并在放牧后显著下降，杂类草、禾本科大针茅与之变化趋势相同；具有潜在固氮能力的豆科植物和禾本科羊草在放牧后无显著差异或显著增加；豆科植物小叶锦鸡儿、乳白花黄芪和花苜蓿的叶片δ15N 值均为偏低负值，显著低于非豆科植物。研究结果说明不同植物的氮利用方式不同，豆科植物和羊草的生物固氮可能同时为受氮限制的内蒙古草原提供氮源。 小叶锦鸡儿灌丛影响了周围土壤的有效氮含量。灌丛内部土壤硝态氮和氨态氮有高于外部土壤的趋势。土壤含水量与硝态氮浓度显著正相关。土壤有效氮含量变异系数平均高于50%，土壤资源表现出很强的空间异质性。灌丛内部植物体内全氮含量高于灌丛外，而灌丛斑块发育时间对植物化学元素没有显著影响。

Regulation by hetC of genes required for heterocyst differentiation and cell division in Anabaena sp strain PCC 7120

Unlike those of the wild-type strain, proheterocysts of the Anabaena sp. strain PCC 7120 hetC strain keep dividing. ftsZ, the most critical cell division gene, is up-regulated in hetC proheterocysts. Heterocyst differentiation genes hglD, hglE, patB, nijB, and xisA are no longer expressed in the hetC mutant. hetC also regulates the expression of patA, a pattern formation gene.

Nutrient dynamics and the eutrophication of shallow lakes Kasumigaura (Japan), Donghu (PR China), and Okeechobee (USA)

We compared the nutrient dynamics of three lakes that have been heavily influenced by point and non-point source pollution and other human activities. The lakes, located in Japan (Lake Kasumigaura), People's Republic of China (Lake Donghu), and the USA (Lake Okeechobee), all are relatively large(>30 km(2)), very shallow (<4 m mean depth), and eutrophic. In all three lakes we found strong interactions among the sediments, water column, and human activities. Important processes affecting nutrient dynamics included nitrogen fixation, light limitation due to resuspended sediments, and intense grazing on algae by cultured fish. As a result of these complex interactions, simple empirical models developed to predict in-lake responses of total phosphorus and algal biomass to external nutrient loads must be used with caution. While published models may provide 'good' results, in terms of model output matching actual data, this may not be due to accurate representation of lake processes in the models. The variable nutrient dynamics that we observed among the three study lakes appears to be typical for shallow lake systems. This indicates that a greater reliance on lake-specific research may be required for effective management, and a lesser role of inter-lake generalization than is possible for deeper, dimictic lake systems. Furthermore, accurate predictions of management impacts in shallow eutrophic lakes may require the use of relatively complex deterministic modeling tools. (C) 2000 Elsevier Science Ltd. All rights reserved.

慢生型大豆根瘤菌GX201与固氮相关的putA、lrp基因的研究

该研究运用分子生物学方法，克隆并测定了慢生型大豆根瘤菌的putA、lrp基因序列，通过BLAST软件分析发现，lrp基因存在putA基因的上游且转录方向相反.将含有gus报告基因的转座子Tn5gusA5转座到以pLAFR3为载体的重组质粒pGXN300后，利用pLAFR3与pPHIJI质粒的不相容性建立了一套适合于慢生型大豆根瘤菌的转座子诱变体系，应用该体系诱变慢生型大豆根瘤菌GX201，成功地构建了putA、lrp基因的突变体GX20108和GX20120.根据已测定的慢生型大豆根瘤菌的putA、lrp基因序列，设计一对核苷酸引物，PCR扩增putA基因的调控调区，研究lrp基因与putA基因的相互作用机制，离体试验证明putA基因的启动子区存在一个与lrp基因相关蛋白结合区域.

生物土壤结皮的生态功能

Biological soil crust exists in desertification-prone areas.This paper focuses on ecological function of biological soil crust,including water relations,soil stabilization,carbon and nitrogen fixation,albedo and effects on vascular plants.Some preliminary suggestions are given for further understanding the relationship between biological soil crust and revegetation of degraded ecosystem in desertification-prone areas in Northwestern China.

Effects of inoculated Microcoleus vaginatus on the structure and function of biological soil crusts of desert

Microcoleus vaginatus Gom., the dominant species in biological soil crusts (BSCs) in desert regions, plays a significant role in maintaining the BSC structure and function. The BSC quality is commonly assessed by the chlorophyll a content, thickness, and compressive strength. Here, we have studied the effect of different proportions of M. vaginatus, collected from the Gurbantunggut Desert in northwestern China, on the BSC structure and function under laboratory conditions. We found that when M. vaginatus was absent in the BSC, the BSC coverage, quantified by the percentage of BSC area to total land surface area, was low with a chlorophyll a content of 4.77 x 10(-2) mg g(-1) dry soil, a thickness of 0.86 mm, and a compressive strength of 12.21 Pa. By increasing the percentage of M. vaginatus in the BSC, the BSC coverage, chlorophyll a content, crust thickness, and compressive strength all significantly increased (P < 0.01). The maximum chlorophyll a content (13.12 mg g(-1)dry soil), the highest crust thickness, and the compressive strength (1.48 mm and 36.60 Pa, respectively) occurred when the percentage of inoculated M. vaginatus reached 80% with a complex network of filaments under scanning electron microscope. The BSC quality indicated by the above variables, however, declined when the BSC was composed of pure M. vaginatus (monoculture). In addition, we found that secretion of filaments and polymer, which stick sands together in the BSC, increased remarkably with the increase of the dominant species until the percentage of M. vaginatus reached 80%. Our results suggest that not only the dominant species but also the accompanying taxa are critical for maintaining the structure and functions of the BSC and thus the stability of the BSC ecosystems.

CULTIVO e uso do Estilosantes-campo-grande.

Equipe multidisciplinar: Ademir Hugo Zimmer, CNPGC; Armindo Neivo Kichel, CNPGC; Bela Grof; Carlos Maurício Soares de Andrade; Celso Dornelas Fernandes, CNPGC; Francisco Assis Rolim Pereira; Haroldo Pires Queiroz, CNPGC; Hortência Maria Abranches Purcino; Jaqueline Rosemeire Verzignassi, CNPGC; José Alexandre Agiova da Costa, CNPGC; José Marcelino Sobrinho (in memorian); José Marques da Silva, CNPGC; José Raul Valério, CNPGC; Leônidas da Costa Schalcher Valle; Manuel Cláudio Motta Macedo, CNPGC; Maria José D´Ávila Charchar; Maria do Socorro Bona Nascimento; Marta Pereira da Silva; Rosângela Maria Simeão Resende; Roza Maria Shunke. Histórico e descrição da cultivar. Principais atributos do estilosantes-campo-grande. Fixação biológica de nitrogênio e valor nutritivo. Desempenho animal. Ssutentabilidade de sistemas. Adaptação ao clima. Exigência de solo e adubação. Estabelecimento do estilosantes-campo-grande. Preparo da área para semeadura. Preparo mínimo ou plantio direto. Semeadura. Manejo de plantas daninhas nas pastagens consorciadas com o estilosantes-campo-grande. Manejo do pastejo para o estabelecimento do consórcio. Manejo da pastagem visando à persistência do consórcio. Pragas. Doenças. Outros usos do estilosantes-campo-grande. Uso correto do estilosantes-campo-grande.

Fixação de nitrogênio pela soja em sistemas de cultivo contínuo e rotacionado com pecuária nos Cerrados.

Quantificou-se a contribuição da fixação biológica de N2 (FBN) na cultura da soja em um Latossolo Vermelho-Escuro, utilizando-se a técnica da abundância natural do isótopo 15N. Foram estudados cinco tratamentos: 1) soja de primeiro ano em solo cultivado por quatro anos com Brachiaria decumbens, sob pastejo, e preparado mecanicamente (arado, grade pesada e niveladora); 2) mesmas condições anteriores, mas com plantio direto da soja; 3) soja em cultivo contínuo por cinco anos, como cultura de verão, sem plantio de milheto no outono/ inverno, e solo preparado de forma convencional (arado, grade pesada e niveladora); 4) soja com cultivo contínuo por cinco anos, com cultivo de outono/inverno de milheto (Pennisetum atropurpureum) e preparo de solo conservacionista (arado de disco, aiveca e subsolador); 5) mesmas condições anteriores, mas com plantio direto. Amostras de plantas foram coletadas no estádio vegetativo, enchimento de grãos, na maturação, e na colheita final de grãos. Em cada coleta analisaram-se as produções de matéria seca (MS) e teores de N e 15N. As produções de MS e N total acumulado foram semelhantes no estádio vegetativo, mas as plantas no plantio direto mostraram taxas de FBN acima de 50%, enquanto que as de plantio convencional estavam abaixo de 40%. No enchimento de grãos, as produções de MS, N total e as taxas de FBN(entre 60% e 68%) foram semelhantes em todos os sistemas de preparo do solo. Na maturação dos grãos, o preparo de solo convencional resultou numa maior produção de MS do que no plantio direto. Os grãos apresentaram a maior parte do N fixado (66% a 82%), ficando entre 51% e 68% para a parte aérea e entre 15% e 32% para as raízes. No balanço do N total obtido por FBN e o que foi alocado aos grãos, obtiveram-se valores indicativos de que a maior parte do N fixado seria retirada do sistema na colheita de grãos, o que foi confirmado na colheita final. A soja de plantio direto mostrou um balanço ligeiramente mais positivo do que a soja de plantio convencional. Como a soja é pouco dependente do N do solo, usando eficientemente o N de fixação, este seria poupado como resíduo para uso de culturas subseqüentes, o que explicaria o efeito benéfico imediato observado na prática em sistemas produtivos de rotação de cultura entre soja e cereais ou pastagem. No entanto, os resultados obtidos indicam que a soja, que tem um índice de colheita alto (proporção do N total nos grãos em relação ao N total da planta), não contribui significativamente para aumento dos teores de N total do solo capazes de beneficiar por longo tempo as culturas em sucessão.

Inoculação de sementes de soja: efeito da dose de inoculante turfoso e do uso de açúcar como aderente da turfa.

1999

Metodos de aplicacao de micronutrientes na nodulacao e na fixacao biologica do N2 em soja.

1999

Efeito do tratamento de sementes de soja com fungicidas na nodulacao e fixacao simbiotica do N2.

1999