La génétique de l'hypertension: rôle des gènes CYP3A5 et ABCB1 dans le contrôle de la tension artérielle

Des données récentes suggèrent que les gènes ABCB1 et CYP3A5 sont impliqués dans le contrôle de la tension artérielle chez l'homme. Les gènes ABCB1 et CYP3A5 sont bien connus pour interagir l'un avec l'autre dans le métabolisme et le transport de nombreux médicaments, mais on sait peu de choses sur leurs rôles dans les processus physiologiques endogènes chez l'homme. Si les gènes ABCB1 et CYP3A5 influencent la tension artérielle par leur action sur des substrats endogènes, comme l'aldostérone, cela pourrait avoir des conséquences importantes pour le traitement des sujets hypertendus ainsi que dans le domaine de la pharmacogénétique. Ces gènes semblent influencer la tension artérielle par l'intermédiaire du système rénine-angiotensin- aldostérone via la réabsorption tubulaire rénale de sodium. Ces résultats soulignent l'importance de tenir compte des interactions gène-gène et le rôle clé de la consommation en sel comme modificateur d'effet en génétique de l'hypertension. Si ces résultats sont confirmés dans plusieurs études indépendantes, cela ouvre la voie vers un nouveau mécanisme de contrôle de la tension artérielle chez l'homme.

Dibenzofuran degradation by Sphingomonas wittichii RW1 under environmental stresses

Sphingomonas wittichii is a gram-negative Alpha-proteobacterium, capable of degrading xenobiotic compounds such as dibenzofuran (DBF), dibenzo-p-dioxin, carbazole, 2-hydroxybiphenyl or nitro diphenyl ether herbicides. The metabolism of strain RW1 has been the subject of previous studies and a number of genes involved in DBF degradation have been characterized. It is known that RW1 posseses a unique initial DBF dioxygenase (encoded by the dxnAl gene) that catalyzes the first step in the degradation pathway. None of the organisms known to be able to degrade DBF have a similar dioxygenase, the closest match being the DBF dioxygenase from Rhodococcus sp. with an overall amino acid similarity of 45%. Genes participating in the conversion of the metabolite salicylate via the ortho-cleavage pathway to TCA cycle intermediates were identified as well. Apart from this scarce information, however, there is a lack of global knowledge on the genes that are involved in DBF degradation by strain RW1 and the influence of environmental stresses on DBF-dependent global gene expression. A global analysis is necessary, because it may help to better understand the behaviour of the strain under field conditions and suggest improvements for the current bioaugmentation practice. Chapter 2 describes the results of whole-genome analysis to characterize the genes involved in DBF degradation by RW1. Micro-array analysis allowed us to detect differences in gene transcription when strain RW1 was exposed to DBF. This was complemented by ultra-high throughput sequencing of mutants no longer capable of growing on salicylate and DBF. Some of the genes of the ortho-cleavage pathway were induced 2 to 4 times in the presence of DBF, as well as the initial DBF dioxygenase. However two gene clusters, named 4925 and 5102 were induced up to 19 times in response to DBF induction. The cluster 4925 is putatively participating in a meta-cleavage pathway while the cluster 5102 might be part of a gentisate pathway. The three pathways, ortho-cleavage, meta-cleavage and gentisate pathway seem to be active in parallel when strain RW1 is exposed to DBF, presenting evidence for a redundancy of genes for DBF degradation in the genome of RW1. Chapter 3 focuses on exploiting genetic tools to construct bioreporters representative for DBF degradation in RW1. A set of basic tools for genetic manipulation in Sphingomonas wittichii RW1 was tested and optimized. Both plasmids and mini-transposons were evaluated for their ability to be maintained in RW1 with or without antibiotic selection pressure, and for their ability to lead to fluorescent protein expression in strain RW1 from a constitutive promoter. Putative promoter regions of three of the previously found DBF-induced genes (Swit_4925, Swit_5102 and Swit_4897-dxnAl) were then used to construct eg/^-bioreporters in RW1. Chapter 4 describes the use of the constructed RW1-based bioreporter strains for examining the expression of the DBF degradation pathway genes under microcosm conditions. The bioreporter strains were first exposed to different carbon sources in liquid culture to calibrate the egfp induction. Contrary to our expectations from micro-array analysis only the construct with the promoter from gene cluster 4925 responded to DBF, whereas the other two constructs did not show specific induction with DBF. The response from the bioreporters was subsequently tested for sensitivity to water stress, given that this could have an important impact in soils. Exposure to liquid cultures with decreasing water potential, achieved by NaCl or PEG addition to the growth media, showed that eGFP expression in RW1 from the promoter regions 4925 and 5102 was not directly influenced by water stress, but only through an overall reduction in growth rate. In contrast, expression of eGFP from the dxnAl or an uspA promoter was also directly dependent on the extent of water stress. The RW1 with the 4925 construct was subsequently used in soil microcosms to evaluate DBF bioavailability to the cells in presence or absence of native microbiota or other contaminated material. We found that RW1 could grow on DBF added to soil, but bioreporter expression suggested that competition with native microbiota for DBF intermediates may limit its ability to proliferate to a maximum. Chapter 5 describes the results from the experiments carried out to more specifically detect genes of RW1 that might be implicated in water stress resistance. Hereto we created transposon mutagenesis libraries in RW1, either with a classical mini-Tn5 or with a variant that would express egfp when the transposon would insert in a gene induced under water stress. Classical mutant libraries were screened by replica plating under high and low water stress conditions (achieved by adding NaCl to the agar medium). In addition, we screened for smaller microcolonies formed by mutants in agarose beads that could be analized with flow cytometry. A number of mutants impaired to grow on NaCl-supplemented media were recovered and the transposon insertion sites sequenced. In a second procedure we screened by flow cytometry for mutants with a higher eGFP production after exposure to growth medium with higher NaCl concentrations. Mutants from both libraries rarely overlapped. Discovered gene functions of the transposon insertions pointed to compatible solute synthesis (glutamate and proline), cell membrane synthesis and modification of cell membrane composition. The results obtained in the present study give us a more complete picture of the mechanisms of DBF degradation by S. wittichii RW1, how it reacts to different DBF availability and how the DBF catabolic activity may be affected by the conditions found in contaminated environments. - Sphingomonas wittichii est une alpha-protéobactérie gram-négative, capable de dégrader des composés xénobiotiques tels que le dibenzofurane (DBF), la dibenzo-p-dioxine, le carbazole, le 2-hydroxybiphényle ou les herbicides dérivés du nitro-diphényléther. Le métabolisme de la souche RW1 a fait l'objet d'études antérieures et un certain nombre de gènes impliqués dans la dégradation du DBF ont été caractérisés. Il est connu que RW1 possède une unique dioxygénase DBF initiale (codée par le gène dxnAl) qui catalyse la première étape de la voie de dégradation. Aucun des organismes connus pour être capables de dégrader le DBF n'a de dioxygénase similaire. L'enzyme la plus proche étant la DBF dioxygénase de Rhodococcus sp. avec 45% d'acides aminés conservés. Les gènes qui participent à la transformation du salicylate en métabolites intermédiaires du cycle de Krebs par la voie ort/io-cleavage ont aussi été identifiés. Outre ces informations lacunaires, il y a un manque de connaissances sur l'ensemble des gènes impliqués dans la dégradation du DBF par la souche RW1 ainsi que l'effet des stress environnementaux sur l'expression génétique globale, en présence du DBF. Une analyse globale est nécessaire, car elle peut aider à mieux comprendre le comportement de la souche dans les conditions de terrain et de proposer des améliorations pour l'utilisation de la bio-augmentation comme technique de bio-remédiation. Le chapitre 2 décrit les résultats de l'analyse du génome pour caractériser les gènes impliqués dans la dégradation du DBF par RW1. Une analyse de micro-arrays nous a permis de détecter des différences dans la transcription des gènes lorsque la souche RW1 a été exposée au DBF. L'analyse a été complétée par le criblage à ultra-haut débit de mutants qui n'étaient plus capables de croître avec le salicylate ou le DBF comme seule source de carbone. Certains des gènes de la voie ortho-cleavage, dont la DBF dioxygénase initiale, ont xî été induits 2 à 4 fois, en présence du DBF. Cependant, deux groupes de gènes, nommés 4925 et 5102 ont été induits jusqu'à 19 fois en réponse au DBF. Le cluster 4925 participe probablement dans une voie de meta-cleavage tandis que le cluster 5102 pourrait faire partie d'une voie du gentisate. Les trois voies, ortho-cleavage, meta-cleavage et la voie du gentisate semblent être activées en parallèle lorsque la souche RW1 est exposée au DBF, ce qui représente une redondance de voies pour la dégradation du DBF dans le génome de RW1. Le chapitre 3 se concentre sur l'exploitation des outils génétiques pour la construction de biorapporteurs de la dégradation du DBF par RW1. Un ensemble d'outils de base pour la manipulation génétique dans Sphingomonas wittichii RW1 a été testé et optimisé. Deux plasmides et mini-transposons ont été évalués pour leur capacité à être maintenu dans RW1 avec ou sans pression de sélection par des antibiotiques, et pour leur capacité à exprimer la protéine fluorescente verte (eGFP) dans la souche RW1. Les trois promoteurs des gènes Swit_4925, Swit_5102 et Swit_4897 (dxnAl), induits en réponse au DBF, ont ensuite été utilisés pour construire des biorapporteurs dans RW1. Le chapitre 4 décrit l'utilisation des souches biorapportrices construites pour l'analyse de l'expression des gènes de la voie de dégradation du DBF dans des microcosmes avec différents types de sols. Les souches biorapportrices ont d'abord été exposées à différentes sources de carbone en cultures liquides afin de calibrer l'induction de la eGFP. La construction avec le promoteur du gène 4925 a permis une réponse au DBF. Mais contrairement à nos attentes, basées sur les résultats de l'analyse des micro-arrays, les deux autres constructions n'ont pas montré d'induction spécifique au DBF. La réponse des biorapporteurs a ensuite été testée pour la sensibilité au stress hydrique, étant donné que cela pourrait avoir un impact important dans les microcosmes. La diminution du potentiel hydrique en culture liquide est obtenue par addition de NaCl ou de PEG au milieu de croissance. Nous avons montré que l'expression de la eGFP contrôlée par les promoteurs 4925 et 5102 n'était pas directement influencée par le stress hydrique, mais seulement par une réduction globale des taux de croissance. En revanche, l'expression de la eGFP dépendante des promoteurs dxnAl et uspA était aussi directement dépendante de l'ampleur du stress hydrique. La souche avec la construction 4925 a été utilisée par la suite dans des microcosmes avec différents types de sols pour évaluer la biodisponibilité du DBF en présence ou absence des microbes indigènes et d'autres composés contaminants. Nous avons constaté que RW1 pouvait se développer si le DBF a été ajouté au sol, mais l'expression de la eGFP par le biorapporteur suggère que la compétition avec la microbiota indigène pour les métabolites intermédiaires du DBF peut limiter sa capacité à proliférer de manière optimale. Le chapitre 5 décrit les résultats des expériences réalisées afin de détecter spécifiquement les gènes de RW1 qui pourraient être impliquées dans la résistance au stress hydrique. Ici on a crée des bibliothèques de mutants de RW1 par transposon, soit avec un mini-Tn5 classique ou avec une variante qui exprime la eGFP lorsque le transposon s'insère dans un gène induit par le stress hydrique. Les bibliothèques de mutants ont été criblées par la méthode classique de repiquage sur boîtes, dans des conditions de stress hydrique élevé (obtenu par l'addition de NaCl dans les boîtes). En outre, nous avons criblé des micro¬colonies dans des billes d'agarose qui ont pu être analysées par cytométrie de flux. Un certain nombre de mutants déficients à croître sur des milieux supplémentés avec du NaCl ont été isolés et les sites d'insertion du transposon séquencés. Dans une deuxième procédure nous avons criblé par cytométrie de flux des mutants avec une production de eGFP supérieure, après exposition à un milieu de croissance avec une concentration élevée de NaCl. Les mutants obtenus dans les deux bibliothèques n'étaient pas similaires. Les fonctions des gènes où se trouvent les insertions de transposons sont impliqués dans la synthèse de solutés compatibles (glutamate et de la proline), dans la synthèse de la membrane cellulaire et dans la modification de la composition de la membrane cellulaire. Les résultats obtenus dans la présente étude nous donnent une image plus complète des mécanismes de dégradation du DBF par S. wittichii RW1, comment cette souche réagit à la disponibilité du DBF et comment l'activité catabolique peut être affectée par les conditions rencontrées dans des environnements contaminés.

Role of the hypocretin system in cocaine- and alcohol-related behaviors : evidence from hypocretin-deficient mice

RésuméL'addiction aux drogues est une maladie multifactorieile affectant toutes les strates de notre société. Cependant, la vulnérabilité à développer une addiction dépend de facteurs environnementaux, génétiques et psychosociaux. L'addiction aux drogues est décrite comme étant une maladie chronique avec un taux élevé de rechutes. Elle se caractérise par un besoin irrépressible de consommer une drogue et une augmentation progressive de la consommation en dépit des conséquences néfastes. Les mécanismes cérébraux responsables des dépendances aux drogues ne sont que partiellement élucidés, malgré une accumulation croissante d'évidences démontrant des adaptations au niveau moléculaire et cellulaire au sein des systèmes dopaminergique et glutamatergique. L'identification de nouveaux facteurs neurobiologiques responsables de la vulnérabilité aux substances d'abus est cruciale pour le développement de nouveaux traitements thérapeutiques capables d'atténuer et de soulager les symptômes liés à la dépendance aux drogues.Au cours des dernières années, de nombreuses études ont démontré qu'un nouveau circuit cérébral, le système hypocrétinergique, était impliqué dans plusieurs fonctions physiologiques, tel que l'éveil, le métabolisme énergétique, la motivation, le stress et les comportements liés aux phénomènes de récompense. Le système hypocrétinergique est composé d'environ 3000-4000 neurones issus de l'hypothalamus latéral projetant dans tout ie cerveau. Des souris transgéniques pour le gène des hypocrétines ont été générées et leur phénotype correspond à celui des animaux sauvages, excepté le fait qu'elles soient atteintes d'attaques de sommeil similaires à celles observées chez les patients narcoleptiques. H semblerait que les hypocrétines soient requises pour l'acquisition et l'expression de la dépendance aux drogues. Cependant, le mécanisme précis reste encore à être élucidé. Dans ce rapport, nous rendons compte des comportements liés aux phénomènes de récompense liés à l'alcool et à la cocaine chez les souris knock-out (KO), hétérozygotes (HET) et sauvages (WT).Nous avons, dans un premier temps, évalué l'impact d'injections répétées de cocaïne (15 mg/kg, ip) sur la sensibilisation locomotrice et sur le conditionnement place préférence. Nous avons pu observer que les souris WT, HET et KO exprimaient une sensibilisation locomotrice induite par une administration chronique de cocaïne, cependant les souris déficientes en hypocrétines démontraient une sensibilisation retardée et atténuée. Π est intéressant de mentionner que les mâles HET exprimaient une sensibilisation comportementale intermédiaire. Après normalisation des données, toutes les souris exprimaient une amplitude de sensibilisation similaire, excepté les souris mâles KO qui affichaient, le premier jour de traitement, une sensibilisation locomotrice réduite et retardée, reflétant un phénotype hypoactif plutôt qu'une altération de la réponse aux traitements chroniques de cocaïne. Contre toute attente, toutes les souris femelles exprimaient un pattern similaire de sensibilisation locomotrice à la cocaïne. Nous avons ensuite évalué l'effet d'un conditionnement comportemental à un environnement associé à des injections répétées de cocaine (15 mg / kg ip). Toutes les souris, quelque soit leur sexe ou leur génotype, ont manifesté une préférence marquée pour l'environnement apparié à la cocaïne. Après deux semaines d'abstinence à la cocaïne, les mâles et les femelles déficientes en hypocrétines n'exprimaient plus aucune préférence pour le compartiment précédemment associé à la cocaïne. Alors que les souris WT et HET maintenaient leur préférence pour le compartiment associé à la cocaïne. Pour finir, à l'aide d'un nouveau paradigme appelé IntelliCage®, nous avons pu évaluer la consommation de liquide chez les femelles WT, HET et KO. Lorsqu'il n'y avait que de l'eau disponible, nous avons observé que les femelles KO avaient tendance à moins explorer les quatre coins de la cage. Lorsque les souris étaient exposées à quatre types de solutions différentes (eau, ImM quinine ou 0.2% saccharine, alcool 8% et alcool 16%), les souris KO avaient tendance à moins consommer l'eau sucrée et les solutions alcoolisées. Cependant, après normalisation des données, aucune différence significative n'a pu être observée entre les différents génotypes, suggérant que la consommation réduite d'eau sucrée ou d'alcool peut être incombée à l'hypoactivité des souris KO.Ces résultats confirment que le comportement observé chez les souris KO serait dû à des compensations développementales, puisque la sensibilisation locomotrice et le conditionnement comportemental à la cocaïne étaient similaires aux souris HET et WT. En ce qui concerne la consommation de liquide, les souris KO avaient tendance à consommer moins d'eau sucrée et de solutions alcoolisées. Le phénotype hypoactif des souris déficientes en hypocrétine est probablement responsable de leur tendance à moins explorer leur environnement. Il reste encore à déterminer si l'expression de ce phénotype est la conséquence d'un état de vigilance amoindri ou d'une motivation diminuée à la recherche de récompense. Nos résultats suggèrent que les souris déficientes en hypocrétine affichent une motivation certaine à la recherche de récompense lorsqu'elles sont exposées à des environnements où peu d'efforts sont à fournir afin d'obtenir une récompense.AbstractDrug addiction is a multifactorial disorder affecting human beings regardless their education level, their economic status, their origin or even their gender, but the vulnerability to develop addiction depends on environmental, genetic and psychosocial dispositions. Drug addiction is defined as a chronic relapsing disorder characterized by compulsive drug seeking, with loss of control over drug intake and persistent maladaptive decision making in spite of adverse consequences. The brain mechanisms responsible for drug abuse remain partially unknown despite accumulating evidence delineating molecular and cellular adaptations within the glutamatergic and the dopaminergic systems. However, these adaptations do not fully explain the complex brain disease of drug addiction. The identification of other neurobiological factors responsible for the vulnerability to substance abuse is crucial for the development of promising therapeutic treatments able to alleviate signs of drug dependence.For the past few years, growing evidence demonstrated that a recently discovered brain circuit, the hypocretinergic system, is implicated in many physiological functions, including arousal, energy metabolism, motivation, stress and reward-related behaviors. The hypocretin system is composed of a few thousands neurons arising from the lateral hypothalamus and projecting to the entire brain. Hypocretin- deficient mice have been generated, and unexpectedly, their phenotype resembles that of wild type mice excepting sleep attacks strikingly similar to those of human narcolepsy patients. Evidence suggesting that hypocretins are required for the acquisition and the expression of drug addiction has also been reported; however the precise mechanism by which hypocretins modulate drug seeking behaviors remains a matter of debate. Here, we report alcohol and cocaine reward-related behaviors in hypocretin-deficient mice (KO), as well as heterozygous (HET) and wild type (WT) littermates.We first evaluated the impact of repeated cocaine injections (15 mg/kg, ip) on locomotor sensitization and conditioned place preference. We observed that WT, HET and KO mice exhibited behavioral sensitization following repeated cocaine administrations, but hypocretin deficient males displayed a delayed and attenuated response to chronic cocaine administrations. Interestingly, HET males exhibited an intermediate pattern of behavioral sensitization. However, after standardization of the post-injection data versus the period of habituation prior to cocaine injections, all mice displayed similar amplitudes of behavioral sensitization, except a reduced response in KO males on the first day, suggesting that the delayed and reduced cocaine-induced locomotor sensitization may reflect a hypoactive phenotype and probably not an altered response to repeated cocaine administrations. Unexpectedly, all female mice exhibited similar patterns of cocaine-induced behavioral sensitization. We then assessed the behavioral conditioning for an environment repeatedly paired with cocaine injections (15 mg/kg ip). All mice, whatever their gender or genotype, exhibited a robust preference for the environment previously paired with cocaine administrations. Noteworthy, following two weeks of cocaine abstinence, hypocretin-deficient males and females no longer exhibited any preference for the compartment previously paired with cocaine rewards whereas both WT and HET mice continued manifesting a robust preference. We finally assessed drinking behaviors in WT, HET and KO female mice using a novel paradigm, the IntelliCages®. We report here that KO females tended to less explore the four cage comers where water was easily available. When exposed to four different kinds of liquid solutions (water, ImM quinine or saccharine 0.2%, alcohol 8% and alcohol 16%), KO mice tended to less consume the sweet and the alcoholic beverages. However, after data standardization, no significant differences were noticed between genotypes suggesting that the hypoactive phenotype is most likely accountable for the trend regarding the reduced sweet or alcohol intake in KO.Taken together, the present findings confirm that the behavior seen in Hcrt KO mice likely reflects developmental compensations since only a slightly altered cocaine-induced behavioral sensitization and a normal behavioral conditioning with cocaine were observed in these mice compared to HET and WT littermates. With regards to drinking behaviors, KO mice barely displayed any behavioral changes but a trend for reducing sweet and alcoholic beverages. Overall, the most striking observation is the constant hypoactive phenotype seen in the hypocretin-deficient mice that most likely is accountable for their reduced tendency to explore the environment. Whether this hypoactive phenotype is due to a reduced alertness or reduced motivation for reward seeking remains debatable, but our findings suggest that the hypocretin-deficient mice barely display any altered motivation for reward seeking in environments where low efforts are required to access to a reward.

Genomics of "chlamydia"-related bacteria

AbstractThe Chlamydiales order is an important bacterial phylum that comprises some of the most successful human pathogens such as Chlamydia trachomatis, the leading infectious cause of blindness worldwide. Since some years, several new bacteria related to Chlamydia have been discovered in clinical or environmental samples and might represent emerging pathogens. The genome sequencing of classical Chlamydia has brought invaluable information on these obligate intracellular bacteria otherwise difficult to study due to the lack of tools to perform basic genetic manipulation. The recent emergence of high-throughput sequencing technologies yielding millions of reads in a short time lowered the costs of genome sequencing and thus represented a unique opportunity to study Chlamydia-re\ated bacteria. Based on the sequencing and the analysis of Chlamydiales genomes, this thesis provides significant insights into the genetic determinants of the intracellular lifestyle, the pathogenicity, the metabolism and the evolution of Chlamydia-related bacteria. A first approach showed the efficacy of rapid sequencing coupled to proteomics to identify immunogenic proteins. This method, particularly useful for an emerging pathogen such as Parachlamydia acanthamoebae, enabled us to discover good candidates for the development of diagnostic tools that would permit to evaluate at larger scale the role of this bacterium in disease. Second, the complete genome of Waddlia chondrophila, a potential agent of miscarriage, encodes numerous virulence factors to manipulate its host cell and resist to environmental stresses. The reconstruction of metabolic pathways showed that the bacterium possesses extensive capabilities compared to related organisms. However, it is still incapable of synthesizing some essential components and thus has to import them from its host. Third, the genome comparison of Protochlamydia naegleriophila to its closest known relative Protochlamydia amoebophila revealed a particular evolutionary dynamic with the occurrence of an unexpected genome rearrangement. Fourth, a phylogenetic analysis of P. acanthamoebae and Legionella drancourtii identified several genes probably exchanged by horizontal gene transfer with other intracellular bacteria that might occur within their amoebal host. These genes often encode mechanisms for resistance to metal or toxic compounds. As a whole, the analysis of the different genomes enabled us to highlight a large diversity in size, GC percentage, repeat content as well as plasmid organization. The abundant genomic data obtained during this thesis have a wide impact since they provide the necessary bases for detailed investigations on countless aspects of the biology and the evolution of Chlamydia-related bacteria, whether in wet lab or by bioinformatical analyses.RésuméL'ordre des Chlamydiales est un important phylum bactérien qui comprend de nombreuses espèces pathogènes pour l'homme et les animaux, dont Chlamydia trachomatis, responsable du trachome, la cause majeure de cécité d'origine infectieuse à travers le monde. Durant ces dernières décennies, de nombreuses bactéries apparentées aux Chlamydia ont été découvertes dans des échantillons environnementaux ou cliniques mais leur éventuel rôle pathogène dans le développement de maladies reste peu connu. Ces bactéries sont des intracellulaires obligatoires car elles ont besoin d'une cellule hôte pour se multiplier, ce qui rend leur étude particulièrement difficile. Le développement de nouvelles technologies permettant de séquencer le génome d'un organisme rapidement et à moindre coût ainsi que l'essor des méthodes d'analyse s'y rapportant représentent une opportunité exceptionnelle d'étudier ces organismes. Dans ce contexte, cette thèse démontre l'utilité de la génomique pour développer de nouveaux outils diagnostiques ainsi que pour étudier le métabolisme de ces bactéries, leurs facteurs de virulence et leur évolution.Ainsi, une première approche a illustré l'utilité d'un séquençage rapide pour obtenir les informations nécessaires à l'identification de protéines qui sont reconnues par des anticorps humains ou animaux. Cette méthode, particulièrement utile pour un pathogène émergent tel que Parachlamydia acanthamoebae, a permis de découvrir de bons candidats pour le développement d'un outil diagnostique qui permettrait d'évaluer à plus large échelle le rôle de cette bactérie notamment dans la pneumonie. L'analyse du contenu génique de Waddlia chondrophila, un autre germe qui pourrait être impliqué dans les avortements et tes fausses-couches, a en outre mis en évidence la présence de nombreux facteurs connus qui lui permettent de manipuler son hôte. Cette bactérie possède de plus grandes capacités métaboliques que les autres Chlamydia, mais elle est incapable de synthétiser certains composants et doit donc les importer de son hôte pour subvenir à ses besoins. La comparaison du génome de Protochlamydia naegleriophila à son plus proche parent, Protochlamydia amoebophila, a dévoilé une évolution dynamique particulière avec l'occurrence d'un réarrangement majeur inattendu après la séparation de ces deux espèces. En outre, ces études ont montré l'occurrence de plusieurs transferts de gène avec d'autres organismes plus éloignés, notamment d'autres intracellulaires d'amibes, souvent pour l'acquisition de mécanismes de résistances à des composés toxiques. Les données génomiques acquises durant ce travail posent les fondements nécessaires a de nombreuses analyses qui permettront progressivement de mieux comprendre de nombreux aspects de ces bactéries fascinantes.

Cross-talk between glutamate and potassium regulation at the astrocyte membrane

Astrocytes play a central role in the brain by regulating glutamate and extracellular potassium concentrations ([K+]0), both released by neurons into the extracellular space during neuronal activity. Glutamate uptake is driven by the inwardly directed sodium gradient across the astrocyte membrane and involves the influx of three sodium ions and one proton and the efflux of one K+ ion per glutamate molecule. The glutamate transport induced rise in intracellular sodium stimulates the Na+/K+-ATPase which leads to significant energetic costs in astrocytes. To evaluate how these two fundamental functions of astrocytes, namely glutamate transport and K+ buffering, which are directly associated with neuronal activity, coexist and if they influence each other, in this thesis work we examined different cellular parameters of astrocytes. We therefore investigated the impact of altered [K+]0 on glutamate transporter activity. To assess this question we measured intracellular sodium fluctuations in mouse primary cultured astrocytes using dynamic fluorescence imaging. We found that glutamate uptake was tightly modulated both in amplitude and kinetics by [K+]0. Elevated [K+]0 strongly decreased glutamate transporter activity, with significant consequences on the cells energy metabolism. To ultimately evaluate potential effects of [K+]0 and glutamate on the astrocyte mitochondrial energy production we extended these studies by investigating their impact on the cytosolic and mitochondrial pH. We found that both [K+],, and glutamate strongly influenced cytosolic and mitochondrial pH, but in opposite directions. The effect of a simultaneous application of K+ and glutamate, however, did not fit with the arithmetical sum of each individual effects, suggesting that an additional non¬linear process is involved. We also investigated the impact of [K+]0 and glutamate transport, respectively, on intracellular potassium concentrations ([K+]0 in cultured astrocytes by characterizing and applying a newly developed Insensitive fluorescent dye. We observed that [K+]i followed [K+]0 changes in a nearly proportional way and that glutamate superfusion caused a reversible, glutamate-concentration dependent drop of [K+],, Our study shows the powerful influence of [K+]u on glutamate capture. These findings have strong implications for our understanding of the tightly regulated interplay between astrocytes and neurons in situations where [K+]0 undergoes large activity-dependent fluctuations. However, depending on the extent of K+ versus glutamate extracellular rise, energy metabolism in astrocytes will be differently regulated. Moreover, the novel insights obtained during this thesis work help understanding some of the underlying processes that prevail in certain pathologies of central nervous system, such as epilepsy and stroke. These results will possibly provide a basis for the development of novel therapeutic strategies. -- Les astrocytes jouent un rôle central dans le cerveau en régulant les concentrations de potassium (K+) et de glutamate, qui sont relâchés par les neurones dans l'espace extracellulaire lorsque ceux- ci sont actifs. La capture par les astrocytes du glutamate est un processus secondairement actif qui implique l'influx d'ions sodium (Na+) et d'un proton, ainsi que l'efflux d'ions K+, ce processus entraîne un coût métabolique important. Nous avons évalué comment ces fonctions fondamentales des astrocytes, la régulation du glutamate et du K+ extracellulaire, qui sont directement associés à l'activité neuronale, coexistent et si elles interagissent, en examinant différents paramètres cellulaires. Dans ce projet de thèse nous avons évalué l'impact des modifications de la concentration de potassium extracellulaire ([K+],,) sur le transport du glutamate. Nous avons mesuré le transport du glutamate par le biais des fluctuations internes de Na+ grâce à un colorant fluorescent en utilisant de l'imagerie à fluorescence dynamique sur des cultures primaires d'astrocytes. Nous avons trouvé que la capture du glutamate était étroitement régulée par [K+]0 aussi bien dans son amplitude que dans sa cinétique. Par la suite, nous avons porté notre attention sur l'impact de [K+]0 et du glutamate sur le pH cytosolique et mitochondrial de l'astrocyte dans le but, in fine, d'évaluer les effets potentiels sur la production d'énergie par la mitochondrie. Nous avons trouvé qu'autant le K+ que le glutamate, de manière individuelle, influençaient fortement le pH, cependant dans des directions opposées. Leurs effets individuels, ne peuvent toutefois pas être additionnés ce qui suggère qu'un processus additionnel non-linéaire est impliqué. En appliquant une nouvelle approche pour suivre et quantifier la concentration intracellulaire de potassium ([K+]0 par imagerie à fluorescence, nous avons observé que [K+]i suivait les changements de [K+]0 de manière quasiment proportionnelle et que la superfusion de glutamate induisait un décroissement rapide et réversible de [K+]i, qui dépend de la concentration de glutamate. Notre étude démontre l'influence de [K+]0 sur la capture du glutamate. Ces résultats permettent d'améliorer notre compréhension de l'interaction entre astrocytes et neurones dans des situations où [K+]0 fluctue en fonction de l'activité neuronale. Cependant, en fonction de l'importance de l'augmentation extracellulaire du K+ versus le glutamate, le métabolisme énergétique des astrocytes va être régulé de manière différente. De plus, les informations nouvelles que nous avons obtenues durant ce travail de thèse nous aident à comprendre quelques- uns des processus sous-jacents qui prévalent dans certaines pathologies du système nerveux central, comme par exemple l'épilepsie ou l'accident vasculaire cérébral. Ces informations pourront être importantes à intégrer dans la cadre du développement de nouvelles stratégies thérapeutiques.

Uncovering a role for micro-RNAs in sleep homeostasis and energy metabolism

Micro-RNAs (miRNAs) are key, post-transcriptional regulators of gene expression and have been implicated in almost every cellular process investigated thus far. However, their role in sleep, in particular the homeostatic aspect of sleep control, has received little attention. We here assessed the effects of sleep deprivation on the brain miRNA transcriptome in the mouse. Sleep deprivation affected miRNA expression in a brain-region specific manner. The forebrain expression of the miRNA miR-709 was affected the most and in situ analyses confirmed its robust increase throughout the brain, especially in the cerebral cortex and the hippocampus. The hippocampus was a major target of the sleep deprivation affecting 37 miRNAs compared to 52 in the whole forebrain. Moreover, independent from the sleep deprivation condition, miRNA expression was highly region-specific with 45% of all expressed miRNAs showing higher expression in hippocampus and 55% in cortex. Next we demonstrated that down-regulation of miRNAs in Com/c2o-expressing neurons of adult mice, through a conditional and inducible Dicer knockout mice model (cKO), results in an altered homeostatic response after sleep deprivation eight weeks following the tamoxifen-induced recombination. Dicer cKO mice showed a larger increase in the electro-encephalographic (EEG) marker of sleep pressure, EEG delta power, and a reduced Rapid Eye Movement sleep rebound, compared to controls, highlighting a functional role of miRNAs in sleep homeostasis. Beside a sleep phenotype, Dicer cKO mice developed an unexpected, severe obesity phenotype associated with hyperphagia and altered metabolism. Even more surprisingly, after reaching maximum body weight 5 weeks after tamoxifen injection, obese cKO mice spontaneously started losing weight as rapidly as it was gained. Brain transcriptome analyses in obese mice identified several obesity-related pathways (e.g. leptin, somatostatin, and nemo-like kinase signaling), as well as genes involved in feeding and appetite (e.g. Pmch, Neurotensin). A gene cluster with anti-correlated expression in the cerebral cortex of post-obese compared to obese mice was enriched for synaptic plasticity pathways. While other studies have identified a role for miRNAs in obesity, we here present a unique model that allows for the study of processes involved in reversing obesity. Moreover, our study identified the cortex as a brain area important for body weight homeostasis. Together, these observations strongly suggest a role for miRNAs in the maintenance of homeostatic processes in the mouse, and support the hypothesis of a tight relationship between sleep and metabolism at a molecular - Les micro-ARNS (miARNs) sont des régulateurs post-transcriptionnels de l'expression des gènes, impliqués dans la quasi-totalité des processus cellulaires. Cependant, leur rôle dans la régulation du sommeil, et en particulier dans le maintien de l'homéostasie du sommeil, n'a reçu que très peu d'attention jusqu'à présent. Dans cette étude, nous avons étudié les conséquences d'une privation de sommeil sur l'expression cérébrale des miARNs chez la souris, et observé des changements dans l'expression de nombreux miARNs. Dans le cerveau antérieur, miR-709 est le miARN le plus affecté par la perte de sommeil, en particulier dans le cortex cérébral et l'hippocampe. L'hippocampe est la région la plus touchée avec 37 miARNs changés comparés à 52 dans le cerveau entier. Par ailleurs, indépendamment de la privation de sommeil, certains miARNs sont spécifiquement enrichis dans certaines aires cérébrales, 45% des miARNs étant surexprimés dans l'hippocampe contre 55% dans le cortex. Dans une seconde étude, nous avons observé que la délétion de DICER, enzyme essentielle à la biosynthèse des miARNs, et la perte subséquente des miARNs dans les neurones exprimant la protéine CAMK2a altère la réponse homéostatique à une privation de sommeil, 8 semaines après l'induction de la recombinaison génétique par le tamoxifen. Les souris sans Dicer (cKO) ont une plus large augmentation de l'EEG delta power, le principal marqueur électro-encéphalographique du besoin de sommeil, comparée aux contrôles, ainsi qu'un rebond en sommeil paradoxal plus petit. De façon surprenante, les souris Dicer cKO développent une obésité rapide, sévère et transitoire, associée à de l'hyperphagie et une altération de leur métabolisme énergétique. Après avoir atteint un pic maximal d'obésité, les souris cKO entrent spontanément dans une période de perte de poids rapide. L'analyse du transcriptome cérébral des souris obèses nous a permis d'identifier des voies associées à l'obésité (leptine, somatostatine et nemo-like kinase), et à la prise alimentaire (Pmch, Neurotensin), tandis que celui des souris post-obèses a révélé un groupe de gènes liés à la plasticité synaptique. Au-delà des nombreux modèles d'obésité existant chez la souris, notre étude présente un modèle unique permettant d'étudier les mécanismes sous-jacent la perte de poids. De plus, nous avons mis en évidence un rôle important du cortex cérébral dans le maintien de la balance énergétique. En conclusion, toutes ces observations soutiennent l'idée que les miARNs sont des régulateurs cruciaux dans le maintien des processus homéostatiques et confortent l'hypothèse d'une étroite relation moléculaire entre le sommeil et le métabolisme.

Les récepteurs nucléaires PPARs (Peroxisome Proliferator Activated Receptors) : Trois isotypes pour de multiples fonctions.

Les récepteurs nucléaires font partie d'une superfamille de facteurs de transcription qui regroupe en particulier les récepteurs des hormones stéroïdes et thyroïdiennes, de la vitamine D3 et des rétinoïdes [1]. Ces facteurs de transcription sont impliqués dans de nombreuses fonctions cellulaires comme le développement embryonnaire, la différenciation cellulaire et le contrôle du métabolisme. Ce sont des protéines importantes en recherche médicale puisque un grand nombre d'entre elles sont impliquées dans des pathologies telles que le cancer, le diabète ou les syndromes de résistance aux hormones. À ce jour, cette superfamille comprend différents membres, dont l'activité est modulée par la présence de ligands spécifiques. Néanmoins, pour nombre d'entre eux, aucun ligand endogène spécifique n'a encore été identifié. Ceux-là sont appelés récepteurs orphelins. Orphelins lors de leur découverte il y a dix ans, les PPARs (Peroxisome proliferator-activated receptors) ont été particulièrement étudiés depuis, permettant de leur attribuer des ligands et des fonctions qui les placent au coeur de nombreuses régulations métaboliques.

Gene expression mapping in neuropathic pain : molecular plasticity in nociceptors and superficial dorsal horn

RESUME : La douleur neuropathique est le résultat d'une lésion ou d'un dysfonctionnement du système nerveux. Les symptômes qui suivent la douleur neuropathique sont sévères et leur traitement inefficace. Une meilleure approche thérapeutique peut être proposée en se basant sur les mécanismes pathologiques de la douleur neuropathique. Lors d'une lésion périphérique une douleur neuropathique peut se développer et affecter le territoire des nerfs lésés mais aussi les territoires adjacents des nerfs non-lésés. Une hyperexcitabilité des neurones apparaît au niveau des ganglions spinaux (DRG) et de la corne dorsale (DH) de la moelle épinière. Le but de ce travail consiste à mettre en évidence les modifications moléculaires associées aux nocicepteurs lésés et non-lésés au niveau des DRG et des laminae I et II de la corne dorsale, là où l'information nociceptive est intégrée. Pour étudier les changements moléculaires liés à la douleur neuropathique nous utilisons le modèle animal d'épargne du nerf sural (spared nerve injury model, SNI) une semaine après la lésion. Pour la sélection du tissu d'intérêt nous avons employé la technique de la microdissection au laser, afin de sélectionner une sous-population spécifique de cellules (notamment les nocicepteurs lésés ou non-lésés) mais également de prélever le tissu correspondant dans les laminae superficielles. Ce travail est couplé à l'analyse à large spectre du transcriptome par puce ADN (microarray). Par ailleurs, nous avons étudié les courants électriques et les propriétés biophysiques des canaux sodiques (Na,,ls) dans les neurones lésés et non-lésés des DRG. Aussi bien dans le système nerveux périphérique, entre les neurones lésés et non-lésés, qu'au niveau central avec les aires recevant les projections des nocicepteurs lésés ou non-lésés, l'analyse du transcriptome montre des différences de profil d'expression. En effet, nous avons constaté des changements transcriptionnels importants dans les nocicepteurs lésés (1561 gènes, > 1.5x et pairwise comparaison > 77%) ainsi que dans les laminae correspondantes (618 gènes), alors que ces modifications transcriptionelles sont mineures au niveau des nocicepteurs non-lésés (60 gènes), mais important dans leurs laminae de projection (459 gènes). Au niveau des nocicepteurs, en utilisant la classification par groupes fonctionnels (Gene Ontology), nous avons observé que plusieurs processus biologiques sont modifiés. Ainsi des fonctions telles que la traduction des signaux cellulaires, l'organisation du cytosquelette ainsi que les mécanismes de réponse au stress sont affectés. Par contre dans les neurones non-lésés seuls les processus biologiques liés au métabolisme et au développement sont modifiés. Au niveau de la corne dorsale de la moelle, nous avons observé des modifications importantes des processus immuno-inflammatoires dans l'aire affectée par les nerfs lésés et des changements associés à l'organisation et la transmission synaptique au niveau de l'aire des nerfs non-lésés. L'analyse approfondie des canaux sodiques a démontré plusieurs changements d'expression, principalement dans les neurones lésés. Les analyses fonctionnelles n'indiquent aucune différence entre les densités de courant tétrodotoxine-sensible (TTX-S) dans les neurones lésés et non-lésés même si les niveaux d'expression des ARNm des sous-unités TTX-S sont modifiés dans les neurones lésés. L'inactivation basale dépendante du voltage des canaux tétrodotoxine-insensible (TTX-R) est déplacée vers des potentiels positifs dans les cellules lésées et non-lésées. En revanche la vitesse de récupération des courants TTX-S et TTX-R après inactivation est accélérée dans les neurones lésés. Ces changements pourraient être à l'origine de l'altération de l'activité électrique des neurones sensoriels dans le contexte des douleurs neuropathiques. En résumé, ces résultats suggèrent l'existence de mécanismes différenciés affectant les neurones lésés et les neurones adjacents non-lésés lors de la mise en place la douleur neuropathique. De plus, les changements centraux au niveau de la moelle épinière qui surviennent après lésion sont probablement intégrés différemment selon la perception de signaux des neurones périphériques lésés ou non-lésés. En conclusion, ces modulations complexes et distinctes sont probablement des acteurs essentiels impliqués dans la genèse et la persistance des douleurs neuropathiques. ABSTRACT : Neuropathic pain (NP) results from damage or dysfunction of the peripheral or central nervous system. Symptoms associated with NP are severe and difficult to treat. Targeting NP mechanisms and their translation into symptoms may offer a better therapeutic approach.Hyperexcitability of the peripheral and central nervous system occurs in the dorsal root ganglia (DRG) and the dorsal horn (DH) of the spinal cord. We aimed to identify transcriptional variations in injured and in adjacent non-injured nociceptors as well as in corresponding laminae I and II of DH receiving their inputs.We investigated changes one week after the injury induced by the spared nerve injury model of NP. We employed the laser capture microdissection (LCM) for the procurement of specific cell-types (enrichment in nociceptors of injured/non-injured neurons) and laminae in combination with transcriptional analysis by microarray. In addition, we studied functionál properties and currents of sodium channels (Nav1s) in injured and neighboring non-injured DRG neurons.Microarray analysis at the periphery between injured and non-injured DRG neurons and centrally between the area of central projections from injured and non-injured neurons show significant and differential expression patterns. We reported changes in injured nociceptors (1561 genes, > 1.5 fold, >77% pairwise comparison) and in corresponding DH laminae (618 genes), while less modifications occurred in non-injured nociceptors (60 genes) and in corresponding DH laminae (459 genes). At the periphery, we observed by Gene Ontology the involvement of multiple biological processes in injured neurons such as signal transduction, cytoskeleton organization or stress responses. On contrast, functional overrepresentations in non-injured neurons were noted only in metabolic or developmentally related mechanisms. At the level of superficial laminae of the dorsal horn, we reported changes of immune and inflammatory processes in injured-related DH and changes associated with synaptic organization and transmission in DH corresponding to non-injured neurons. Further transcriptional analysis of Nav1s indicated several changes in injured neurons. Functional analyses of Nav1s have established no difference in tetrodotoxin-sensitive (TTX-S) current densities in both injured and non-injured neurons, despite changes in TTX-S Nav1s subunit mRNA levels. The tetrodotoxin-resistant (TTX-R) voltage dependence of steady state inactivation was shifted to more positive potentials in both injured and non-injured neurons, and the rate of recovery from inactivation of TTX-S and TTX-R currents was accelerated in injured neurons. These changes may lead to alterations in neuronal electrogenesis. Taken together, these findings suggest different mechanisms occurring in the injured neurons and the adjacent non-injured ones. Moreover, central changes after injury are probably driven in a different manner if they receive inputs from injured or non-injured neurons. Together, these distinct and complex modulations may contribute to NP.

Oxidative and nonoxidative glucose metabolism following graded doses of oral glucose in man.

The oxidative and nonoxidative glucose metabolism represent the two major mechanisms of the utilization of a glucose load. Eight normal subjects were administered oral loads of 50, 100 and 150 g glucose and gas exchange measurements were performed for eight hours by means of computerized continuous indirect calorimetry. The glycemic peaks were almost identical with all three doses with a rise to between 141 and 147 mg/dl at 60 min. The fall back to basal level was reached later with the high than with the low glucose doses. The glucose oxidation rate rose to values between 223 and 253 mg/min after the three glucose doses, but while falling immediately after the peak at 120 min following the 50 g load, the glucose oxidation rate remained at its maximum rate until 210 min for the 100 g glucose load and plateaued up to 270 min for the 150 g glucose dose. The oxidation rates then fell gradually to reach basal levels at 270, 330 and 420 min according to the increasing size of the load. Altogether 55 +/- 3 g glucose were oxidized during the 8 hours following the 50 g glucose load, 75 +/- 3 g after the 100 g load and 80 +/- 5 g after the 150 g load. The nonoxidative glucose disposal, which corresponds essentially to glucose storage, varied according to the size of the glucose load, with uptakes of 20 +/- 1, 60 +/- 1 and 110 +/- 1 g glucose 180 min after the 50, 100 and 150 g glucose loads respectively.(ABSTRACT TRUNCATED AT 250 WORDS)

Surrogate markers for atheriosclerosis in overweight subjects with atherogenic dyslipidemia : the GEMS project

Rapport de synthèseLe syndrome métabolique (défini par les critères ATP III par la présence au minimum de 3 des facteurs suivants : taux plasmatiques d'HDL-cholestérol < 1,04 mmol/1 chez l'homme et < 1.29 mmol/1 chez la femme, taux plasmatiques de triglycérides > 1,69 mmol/1, tension artérielle > 130/85 mmHg, glycémie >6,1 mmol/1, tour de taille > 108 cm chez l'homme et > 88 cm chez la femme) représente une constellation de facteurs de risque majeurs pour le développement de maladies cardiovascu-laires. Il n'est pas encore établi actuellement quelle composante de ce syndrome contribue de manière plus marquée au risque de développer une athérosclérose. Dans le but d'éclaircir la pathogenèse de ce syndrome, une étude multicentrique intitulée GEMS (« Genetic Epidemiology of Metabolic Syndrome ») a été initiée afin de déterminer si la constellation d'une dyslipidémie avec HDL-C bas et TG élevé est un marqueur sensible de l'homogénéité génétique chez les individus atteints de syndrome métabolique.Dans l'étude menée à Lausanne (multicentrique), la contribution de la dyslipidémie avec HDL-C bas et TG élevé dans la pathogenèse de l'athérosclérose a été évaluée par 2 examens, reconnus comme marqueurs fiables de la vasculopathie : la mesure de l'épaisseur intima média carotidienne par ultrasonographic et l'évaluation de la dysfonction endothéliale de la microcirculation cutanée. Deux groupes de sujets comparables en terme d'âge et de sexe et souffrant d'un excès pondéral (BMI > 25 kg/m2) mais normoglycémiques ont été comparés. Ces deux groupes (étude cas-témoins) étaient uniquement discordants quant à leurs profils lipidiques. Ainsi, 120 cas, définis comme ayant un HDL-cholestérol bas (< 25 percentile pour l'âge et le sexe dans la population générale) et des TG élevés (> 75 percentile) ont été comparés à 120 contrôles avec un HDL-cholestérol haut (> 50 percentile) et des TG bas (< 50 percentile). Un doppler des artères carotides et fémorales a été effectué pour déterminer l'épaisseur de l'intima média et la présence ou non de plaques d'athérome. La fonction endothéliale a été évaluée par un laser doppler sur la micro-circulation cutanée (réponse hyperémique à une occlusion transitoire de la circulation de l'avant-bras par une manchette à pression et mesure de la vasodilatation induite par un échauffement local de la peau avec de l'eau). Un enregistrement de la pression artérielle ambulatoire sur la journée (Remler) a été pratiqué chez tous les sujets.Les résultats obtenus montrent que les cas ont une prévalence plus élevée de plaques d'athérome (médiane 1,5 ± 0,15 vs 0,8 > 0,15, p<.001), une épaisseur intima média plus importante (médiane 0,66 ± 0,15 vs 0,61 ± 0,15, p<.01), ainsi qu'une réduction significative de la vasodilatation endothéliale induite par la chaleur et post-ischémique comparativement aux contrôles.En conclusion, le profil lipidique associant un HDL-cholestérol bas et des triglycérides élevés représente un risque majeur de développer une maladie athéromateuse périphérique et est associée à une augmentation de l'épaisseur intima média et une altération de la fonction endothéliale chez les individus en surcharge pondérale. Bien qu'un HDL-cholestérol bas soit fréquemment associé à une hypertriglycéridémie, les résultats de notre étude peuvent suggérer un rôle potentiel de la fraction HDL-cholestérol comme un puissant agent anti-athérogénique.

Glutamatergic regulation of mitochondrial ion dynamics in astrocytes

Résumé grand public :Le cerveau se compose de cellules nerveuses appelées neurones et de cellules gliales dont font partie les astrocytes. Les neurones communiquent entre eux par signaux électriques et en libérant des molécules de signalisation comme le glutamate. Les astrocytes ont eux pour charge de capter le glucose depuis le sang circulant dans les vaisseaux sanguins, de le transformer et de le transmettre aux neurones pour qu'ils puissent l'utiliser comme source d'énergie. L'astrocyte peut ensuite utiliser ce glucose de deux façons différentes pour produire de l'énergie : la première s'opère dans des structures appelées mitochondries qui sont capables de produire plus de trente molécules riches en énergie (ATP) à partir d'une seule molécule de glucose ; la seconde possibilité appelée glycolyse peut produire deux molécules d'ATP et un dérivé du glucose appelé lactate. Une théorie couramment débattue propose que lorsque les astrocytes capturent le glutamate libéré par les neurones, ils libèrent en réponse du lactate qui servirait de base énergétique aux neurones. Cependant, ce mécanisme n'envisage pas une augmentation de l'activité des mitochondries des astrocytes, ce qui serait pourtant bien plus efficace pour produire de l'énergie.En utilisant la microscopie par fluorescence, nous avons pu mesurer les changements de concentrations ioniques dans les mitochondries d'astrocytes soumis à une stimulation glutamatergique. Nous avons démontré que les mitochondries des astrocytes manifestent des augmentations spontanées et transitoires de leur concentrations ioniques, dont la fréquence était diminuée au cours d'une stimulation avec du glutamate. Nous avons ensuite montré que la capture de glutamate augmentait la concentration en sodium et acidifiait les mitochondries des astrocytes. En approfondissant ces mécanismes, plusieurs éléments ont suggéré que l'acidification induite diminuerait le potentiel de synthèse d'énergie d'origine mitochondriale et la consommation d'oxygène dans les astrocytes. En résumé, l'ensemble de ces travaux suggère que la signalisation neuronale impliquant le glutamate dicte aux astrocytes de sacrifier temporairement l'efficacité de leur métabolisme énergétique, en diminuant l'activité de leurs mitochondries, afin d'augmenter la disponibilité des ressources énergétiques utiles aux neurones.Résumé :La remarquable efficacité du cerveau à compiler et propager des informations coûte au corps humain 20% de son budget énergétique total. Par conséquent, les mécanismes cellulaires responsables du métabolisme énergétique cérébral se sont adéquatement développés pour répondre aux besoins énergétiques du cerveau. Les dernières découvertes en neuroénergétique tendent à démontrer que le site principal de consommation d'énergie dans le cerveau est situé dans les processus astrocytaires qui entourent les synapses excitatrices. Un nombre croissant de preuves scientifiques a maintenant montré que le transport astrocytaire de glutamate est responsable d'un coût métabolique important qui est majoritairement pris en charge par une augmentation de l'activité glycolytique. Cependant, les astrocytes possèdent également un important métabolisme énergétique de type mitochondrial. Par conséquent, la localisation spatiale des mitochondries à proximité des transporteurs de glutamate suggère l'existence d'un mécanisme régulant le métabolisme énergétique astrocytaire, en particulier le métabolisme mitochondrial.Afin de fournir une explication à ce paradoxe énergétique, nous avons utilisé des techniques d'imagerie par fluorescence pour mesurer les modifications de concentrations ioniques spontanées et évoquées par une stimulation glutamatergique dans des astrocytes corticaux de souris. Nous avons montré que les mitochondries d'astrocytes au repos manifestaient des changements individuels, spontanés et sélectifs de leur potentiel électrique, de leur pH et de leur concentration en sodium. Nous avons trouvé que le glutamate diminuait la fréquence des augmentations spontanées de sodium en diminuant le niveau cellulaire d'ATP. Nous avons ensuite étudié la possibilité d'une régulation du métabolisme mitochondrial astrocytaire par le glutamate. Nous avons montré que le glutamate initie dans la population mitochondriale une augmentation rapide de la concentration en sodium due à l'augmentation cytosolique de sodium. Nous avons également montré que le relâchement neuronal de glutamate induit une acidification mitochondriale dans les astrocytes. Nos résultats ont indiqué que l'acidification induite par le glutamate induit une diminution de la production de radicaux libres et de la consommation d'oxygène par les astrocytes. Ces études ont montré que les mitochondries des astrocytes sont régulées individuellement et adaptent leur activité selon l'environnement intracellulaire. L'adaptation dynamique du métabolisme énergétique mitochondrial opéré par le glutamate permet d'augmenter la quantité d'oxygène disponible et amène au relâchement de lactate, tous deux bénéfiques pour les neurones.Abstract :The remarkable efficiency of the brain to compute and communicate information costs the body 20% of its total energy budget. Therefore, the cellular mechanisms responsible for brain energy metabolism developed adequately to face the energy needs. Recent advances in neuroenergetics tend to indicate that the main site of energy consumption in the brain is the astroglial process ensheating activated excitatory synapses. A large body of evidence has now shown that glutamate uptake by astrocytes surrounding synapses is responsible for a significant metabolic cost, whose metabolic response is apparently mainly glycolytic. However, astrocytes have also a significant mitochondrial oxidative metabolism. Therefore, the location of mitochondria close to glutamate transporters raises the question of the existence of mechanisms for tuning their energy metabolism, in particular their mitochondrial metabolism.To tackle these issues, we used real time imaging techniques to study mitochondrial ionic alterations occurring at resting state and during glutamatergic stimulation of mouse cortical astrocytes. We showed that mitochondria of intact resting astrocytes exhibited individual spontaneous and selective alterations of their electrical potential, pH and Na+ concentration. We found that glutamate decreased the frequency of mitochondrial Na+ transient activity by decreasing the cellular level of ATP. We then investigated a possible link between glutamatergic transmission and mitochondrial metabolism in astrocytes. We showed that glutamate triggered a rapid Na+ concentration increase in the mitochondrial population as a result of plasma-membrane Na+-dependent uptake. We then demonstrated that neuronally released glutamate also induced a mitochondrial acidification in astrocytes. Glutamate induced a pH-mediated and cytoprotective decrease of mitochondrial metabolism that diminished oxygen consumption. Taken together, these studies showed that astrocytes contain mitochondria that are individually regulated and sense the intracellular environment to modulate their own activity. The dynamic regulation of astrocyte mitochondrial energy output operated by glutamate allows increasing oxygen availability and lactate production both being beneficial for neurons.