Function and regulation of the scaffold protein IB1/JIP-1 in the uro-genital tract.

RESUME Ce mémoire de thèse traite de l'étude de la « scaffold »protéine ou protéine «échafaud», « Islet-Brain1/ JNK Interacting Protein 1 » (IB1/JIP-1) dans la vessie et la prostate, deux organes importants de l'appareil uro-genital. Cette protéine, mise en évidence dans notre laboratoire à la fin des année 90, a été reconnue pour réguler la voie de signalisation des « Mitogen-Activated Protein Kinases » (MAPKs), et en particulier de la MAPK appelée c-Jun N-terminal Kinase (JNK). Le réseau de voie de signalisation permet aux cellules de percevoir les changements dans le milieu extracellulaire et de permettre une réponse appropriée à ces différents stimuli. La connaissance des voies de signalisation a permis de mettre en évidence leur rôle crucial tant dans l'homéostase des tissus sains que dans des processus pathologiques comme l'oncogenèse. Parmi une vingtaine de voie de signalisation, la voie de signalisation des «MAPKinases » est une des plus importantes et a été montrée pour participer à diverses fonctions cellulaires telles que la différentiation, la motilité, la division et la mort cellulaire. La voie de signalisation des « MAPKinases » est typiquement constituée d'un module de trois kinases qui s'activent séquentiellement par phosphorylation. On note la présence d'une MAPK, d'un activateur de MAPK et d'un activateur de l'activateur de MAPK. Une fois la MAPK activée, elle permettra la régulation de différentes cibles dont certain facteur de transcription. Chez les mammifères, il existe 3 grands groupes de MAPKs : the extracellular signal-regulated kinase 1 and 2 (ERK 1/2) cascade, qui régule préférentiellement la croissance et la différentiation cellulaire, ainsi que les cascades JNK et p38 qui régulent préférentiellement la réponse à différents stress cellulaires telle que l'inflammation ou l'apoptose. JNK est activé par différents stress cellulaire telle que les cytokines inflammatoires. JNK est également requis au cours du développement embryonnaire et contribue à la mort (apoptose) ou à la prolifération cellulaire. Plusieurs études ont mis en évidence le rôle de JNK durant le processus tumoral, sans que son rôle soit clairement identifié. JNK pourrait avoir des fonctions différentes durant l'initiation puis de la progression tumorale. Chez les mammifères, les voies de signalisation intracellulaires forment un réseau complexe et elles interagissent entre elles, ce qui permet aux cellules une réponse adéquate aux multitudes de stimuli existants dans les organismes pluricellulaires. Parmi plusieurs mécanismes de régulation, les protéines dites « scaffold » ou «échafaud » jouent un rôle crucial dans l'homéostase de la voie de signalisation des «MAPKinase ». L'introduction revoit brièvement ces différents aspects, de la voie de signalisation des «MAPKinase et des connaissance sur IB1/JIP-1. Les premières études effectuées sur IB1/JIP-1 ont montré une expression relativement spécifique de cette protéine dans certains types de neurones ainsi que dans la cellule beta-sécrétrice d'insuline. IB1/JIP-1 régule la voie de signalisation JNK par interaction avec les différents composants du module, modifiant ainsi le spectre de substrats activés par JNK. La fonction précise de IB1/JIP-1 n'était pas encore élucidée, mais plusieurs travaux mettaient en lumière un rôle dans la régulation, et la sous-location cellulaire des composants de la voie de signalisation JNK, ainsi que dans la survie cellulaire à certain stress. Cette expression relativement spécifique est intrigante car elle suggère que sa présence serait nécessaire à une régulation spécifique de la MAPKinase JNK ou à certaines autres fonctions cellulaires également spécifiques de certains tissus. Le premier but de ce travail a consisté à mettre en évidence l'expression de IB1/JIP-1 dans l'appareil uro-génital et plus particulièrement dans la vessie et la prostate. Nos résultats ont montré que IB1/JIP-1 est spécifiquement exprimé au niveau de l'urothélium vésical, mais pas dans le muscle lisse. Il en est de même au niveau de la prostate où IB1/JIP-1 est exprimé spécifiquement au niveau de l'épithélium sécrétoire et absent au niveau du stroma fibro-musculaire. La vessie et la prostate sont des organes ou l'activité JNK pourrait être crucial tant dans l' homeostase tissulaire que dans le développement de pathologies bénignes ou malignes. La vessie et la prostate sont le siège fréquent de tumeur. La base pour le développement du cancer est complexe et implique plusieurs anomalies génétiques. Ce processus complexe lié au développement tumoral est encore loin d`être complètement élucidé, raison pour laquelle il est crucial de poursuivre l'étude des différents gènes pouvant être impliqué dans ces processus ou pouvant être utilisé comme outil thérapeutique. Dans l'urothelium de la vessie, la fonction de la MAPK JNK n'a été que très peu étudiée. Il existe quelques études, in vitro, suggérant une implication possible de cette voie de signalisation dans des processus telle que le développement ou la progression tumorale. Le chapitre 1 décrit une étude in vivo dans la vessie un modèle de stress mécanique, connu pour activer les MAPKinase. La dilatation vésicale, due à une obstruction urétrale, a mis en évidence une diminution de l'expression de IB1/JIP-1 ainsi qu'une activation de la MAPKinase JNK. Dans ce modèle, la régulation de IB1/JIP-1, par l'intermédiaire d'un vecteur viral, a permis de démontrer que IB1/JIP-1 régulait l'activité de JNK dans ce tissu. Pour poursuivre l'étude de cette fonction d' IB1/JIP-1 dans l'urothélium, nous avons investigué l'activité JNK dans des souris génétiquement modifiées et porteuse d'une délétion de 1 des 2 allèles du gène codant pour IB1/JIP-1, avec un contenu en IB1/JIP-1 diminué de moitié. L'activation de JNK est également augmentée dans l'urothelium au repos de ces souris, ce qui confirme la fonction régulatrice de JNK par IB1/JIP-1. Ces résultats ont permis de mettre en évidence un rôle critique de celle-ci dans l'homéostase de I`urothelium et suggère une nouvelle cible pour réguler la voie de signalisation dans ce tissu. En outre, la modulation des niveaux d'expression d'IB1/JIP-1 dans la vessie, in vivo, par l'intermédiaire de vecteurs viraux s'est révélée réalisable et indique un moyen élégant pour développer une thérapie génique dans cet organe. Un autre élément de ce travail de thèse, révélée au chapitre 2, a été d'étudier la régulation dans la vessie de rat de la communication intercellulaire de type « GAP ». Les cellules adjacentes partagent des ions, messagers secondaires et des petits métabolites par l'intermédiaire de canaux intercellulaire qui forment les jonctions de type « GAP ». Ce type de communications intercellulaire permet une activité cellulaire coordonnée, une caractéristique importante pour l'homéostase des organismes multicellulaire. Ce type de communication intercellulaire est formé de 2 demi-canaux appelés connexons. Chaque connexon est formé de six protéines appelées connexins (Cx). Il existe environ vingt connexines différentes nommées par leur poids moléculaire respectif. Les jonctions de type canaux "GAP" permettent aux cellules de communiquer avec les cellules voisines au quelles elles sont mécaniquement ou électriquement couplées. La vessie peut être particulièrement dépendante de la communication intercellulaire par les canaux « Gap » qui permettrait de coordonner la réponse de la musculature ainsi que de l'urothélium à l'augmentation de la pression transmurale du à l'accumulation d'urine, situation fréquemment observée dans le cadre de l'hyperplasie bénigne de la prostate. Dans la vessie de rat, la connexine26 est exprimée uniquement dans l'urothelium. La Cx26, a été montrée pour être un possible « tumor suppressor gene » dans le cancer de vessie. Une augmentation de la Cx26 ainsi que du couplage des cellules urothéliales a été démontré dans notre modèle de stress mécanique sur la vessie de rat et est dépendante de 2 éléments de réponses connues pour interagir avec AP-1. La régulation de IB1/JIP-1 a permis de montrer que celle-ci régulait l'activité JNK, ainsi que l'activité du facteur de transcription AP-1, composé de c-Jun lui-même cible de JNK. Cette réduction de l'activité de AP-1 est associée à une diminution de l'expression du transcipt de la Cx26. En résumé, la Cx26 pourrait être régulée par le complexe AP-1 lui-même dépendant du contenu en IB1/JIP-1. Dans le chapitre 3, l'étude de IB1/J1P-1 s'est portée sur la prostate. Cet organe, siège fréquent de pathologie telle que le cancer ou l'hyperplasie bénigne de la prostate, exprime IB1/JIP-1 au niveau de son épithélium sécrétoire. Cette expression est maintenue dans une lignée cellulaire humaine largement étudiée est reconnue comme un modèle adéquat de cellules tumorales de type androgène-sensible. IB1/JIP-1 a été investigué dans un modèle in vitro d'apoptose en réponse à un agent appelé N-(4-hydroxyphenyl)retinamide (4-HPR) qui induit une activation de la MAPK JNK ainsi que également un diminution du contenu en IB1/JIP-1. La surexpression de IB1/JIP-1 en utilisant à nouveau des virus comme vecteur a démontré que IB1/JIP-1 était capable de réguler l'activité de JNK ainsi que les taux d'apoptose. Dans le cancer de la prostate, certains travaux ont montré que la différentiation neuroendocrine des cellules tumorales est associée à la progression tumorale et à la perte de sensibilité aux androgènes. Ce travail a permis de dévoiler l'augmentation d'expression de IB1/JIP-1 dans un modèle de neurodifferentiation des cellules d'une lignée prostatique humaine (LNCaP). Les mécanismes qui permettent une expression spécifique de IB1/JIP-1 ont été partiellement investiguée dans notre laboratoire. Son promoteur humain contient un « Neuron Restricive Silencer Element » (NRSE) connu pour se lier a répresseur transcriptionel appelé « RE-1 Silencer Transcription Factor » ou « Neuron Restrictive Silencer Factor » (REST/NRSF). NRSF/REST est capable de réprimer l'expression de gènes neuronaux en dehors du système neuronal. Il prend part à la différentiation terminale des gènes neuronaux. Dans le chapitre 3, on observe que l'activité de REST/NRSF est diminuée dans les cellules LNCaP qui se transdifferencient de manière neuroendocrine, et que REST/NRSF est capable de moduler l'expression de ces gènes cibles dans ce type cellulaire. Ces travaux laissent suggérer que NRSF/REST participe à l'acquisition du phénotype neuroendocrinien et pourrait être une cible pour réguler ce phénomène. En conclusion, ce travail de thèse présente l'expression de IB1/JIP-1 dans 2 organes de l'appareil uro-génital ; la vessie et la prostate. La fonction de IB1/JIP-1 a été étudiée in vivo dans la vessie de rat, ce qui a mis en évidence sa fonction régulatrice de l'activité de la MAPKinase JNK, et de l'activité du facteur de transcription AP-1 ; ainsi que sa possible implication régulatrice de gène cible tel que la Connexin 26 (Cx26). AP-1 et la Cx26 pourraient jouer un rôle dans le processus oncologique, tant dans le control de l'invasion cellulaire ou le control de la croissance cellulaire. Dans la prostate, IB1/JIP-1 régule également l'activité JNK; crucial dans la transmission de certains stimulis pro-apoptotiques. Dans un modèle de transdifférenciation neuroendocrinienne, phénotype possiblement lié au caractère agressif du cancer de la prostate, l'expression de IB1/JIP-1 est augmenté, suggérant soit un rôle possible dans le développement du phénotype neuronal ou une implication dans une fonction anti-apoptotique. Ce travail a donc permis d'élargir nos connaissances sur la régulation et le control de la voie de signalisation des MAPKinases par IB1/JIP-1, qui pourrait avoir encore d'autres fonctions dans ces tissus.

The long form of FLIP is an activator of caspase-8 at the Fas death-inducing signaling complex.

Death receptors, such as Fas and tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand receptors, recruit Fas-associated death domain and pro-caspase-8 homodimers, which are then autoproteolytically activated. Active caspase-8 is released into the cytoplasm, where it cleaves various proteins including pro-caspase-3, resulting in apoptosis. The cellular Fas-associated death domain-like interleukin-1-beta-converting enzyme-inhibitory protein long form (FLIP(L)), a structural homologue of caspase-8 lacking caspase activity because of several mutations in the active site, is a potent inhibitor of death receptor-induced apoptosis. FLIP(L) is proposed to block caspase-8 activity by forming a proteolytically inactive heterodimer with caspase-8. In contrast, we propose that FLIP(L)-bound caspase-8 is an active protease. Upon heterocomplex formation, a limited caspase-8 autoprocessing occurs resulting in the generation of the p43/41 and the p12 subunits. This partially processed form but also the non-cleaved FLIP(L)-caspase-8 heterocomplex are proteolytically active because they both bind synthetic substrates efficiently. Moreover, FLIP(L) expression favors receptor-interacting kinase (RIP) processing within the Fas-signaling complex. We propose that FLIP(L) inhibits caspase-8 release-dependent pro-apoptotic signals, whereas the single, membrane-restricted active site of the FLIP(L)-caspase-8 heterocomplex is proteolytically active and acts on local substrates such as RIP.

n-3 PUFAs modulate T-cell activation via protein kinase C-alpha and -epsilon and the NF-kappaB signaling pathway.

We elucidated the mechanisms of action of two n-3 PUFAs, eicosapentaenoic acid (EPA) and docosahexaenoic acid (DHA), in Jurkat T-cells. Both DHA and EPA were principally incorporated into phospholipids in the following order: phosphatidylcholine < phosphatidylethanolamine < phosphatidylinositol/phosphatidylserine. Furthermore, two isoforms of phospholipase A(2) (i.e., calcium-dependent and calcium-independent) were implicated in the release of DHA and EPA, respectively, during activation of these cells. The two fatty acids inhibited the phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)-induced plasma membrane translocation of protein kinase C (PKC)-alpha and -epsilon. The two n-3 PUFAs also inhibited the nuclear translocation of nuclear factor kappaB (NF-kappaB) and the transcription of the interleukin-2 (IL-2) gene in PMA-activated Jurkat T-cells. Together, these results demonstrate that DHA and EPA, being released by two isoforms of phospholipase A(2), modulate IL-2 gene expression by exerting their action on two PKC isoforms and NF-kappaB in Jurkat T-cells.

The death domain-containing protein Unc5CL is a novel MyD88-independent activator of the pro-inflammatory IRAK signaling cascade.

The family of death domain (DD)-containing proteins are involved in many cellular processes, including apoptosis, inflammation and development. One of these molecules, the adapter protein MyD88, is a key factor in innate and adaptive immunity that integrates signals from the Toll-like receptor/interleukin (IL)-1 receptor (TLR/IL-1R) superfamily by providing an activation platform for IL-1R-associated kinases (IRAKs). Here we show that the DD-containing protein Unc5CL (also known as ZUD) is involved in a novel MyD88-independent mode of IRAK signaling that culminates in the activation of the transcription factor nuclear factor kappa B (NF-κB) and c-Jun N-terminal kinase. Unc5CL required IRAK1, IRAK4 and TNF receptor-associated factor 6 but not MyD88 for its ability to activate these pathways. Interestingly, the protein is constitutively autoproteolytically processed, and is anchored by its N-terminus specifically to the apical face of mucosal epithelial cells. Transcriptional profiling identified mainly chemokines, including IL-8, CXCL1 and CCL20 as Unc5CL target genes. Its prominent expression in mucosal tissues, as well as its ability to induce a pro-inflammatory program in cells, suggests that Unc5CL is a factor in epithelial inflammation and immunity as well as a candidate gene involved in mucosal diseases such as inflammatory bowel disease.

Ubiquitination and the Ubiquitin-Proteasome System as regulators of transcription and transcription factorsin epithelial mesenchymal transition of cancer.

Epithelial to Mesenchymal Transition (EMT) in cancer is a process that allows cancer cells to detach from neighboring cells, become mobile and metastasize and shares many signaling pathways with development. Several molecular mechanisms which regulate oncogenic properties in neoplastic cells such as proliferation, resistance to apoptosis and angiogenesis through transcription factors or other mediators are also regulators of EMT. These pathways and downstream transcription factors are, in their turn, regulated by ubiquitination and the Ubiquitin-Proteasome System (UPS). Ubiquitination, the covalent link of the small 76-amino acid protein ubiquitin to target proteins, serves as a signal for protein degradation by the proteasome or for other outcomes such as endocytosis, degradation by the lysosome or directing these proteins to specific cellular compartments. This review discusses aspects of the regulation of EMT by ubiquitination and the UPS and underlines its complexity focusing on transcription and transcription factors regulating EMT and are being regulated by ubiquitination.

Dosage-dependent effects of Akt1/protein kinase Balpha (PKBalpha) and Akt3/PKBgamma on thymus, skin, and cardiovascular and nervous system development in mice.

Akt/protein kinase B (PKB) plays a critical role in the regulation of metabolism, transcription, cell migration, cell cycle progression, and cell survival. The existence of viable knockout mice for each of the three isoforms suggests functional redundancy. We generated mice with combined mutant alleles of Akt1 and Akt3 to study their effects on mouse development. Here we show that Akt1-/- Akt3+/- mice display multiple defects in the thymus, heart, and skin and die within several days after birth, while Akt1+/- Akt3-/- mice survive normally. Double knockout (Akt1-/-) Akt3-/-) causes embryonic lethality at around embryonic days 11 and 12, with more severe developmental defects in the cardiovascular and nervous systems. Increased apoptosis was found in the developing brain of double mutant embryos. These data indicate that the Akt1 gene is more essential than Akt3 for embryonic development and survival but that both are required for embryo development. Our results indicate isoform-specific and dosage-dependent effects of Akt on animal survival and development.

The Transcription Factor NFATc2 Controls Apoptosis and Activation of T Cells by IL-6 in Colitis

The nuclear factor of activated T cells (NFAT) family of transcription factors controls calcium signaling in T lymphocytes. In this study, we have identified a crucial regulatory role of the transcription factor NFATc2 in T cell-dependent experimental colitis. Similar to ulcerative colitis in humans, the expression of NFATc2 was up-regulated in oxazolone-induced chronic intestinal inflammation. Furthermore, NFATc2 deficiency suppressed colitis induced by oxazolone administration. This finding was associated with enhanced T cell apoptosis in the lamina propria and strikingly reduced production of IL-6, -13, and -17 by mucosal T lymphocytes. Further studies using knockout mice showed that IL-6, rather than IL-23 and -17, are essential for oxazolone colitis induction. Administration of hyper-IL-6 blocked the protective effects of NFATc2 deficiency in experimental colitis, suggesting that IL-6 signal transduction plays a major pathogenic role in vivo. Finally, adoptive transfer of IL-6 and wild-type T cells demonstrated that oxazolone colitis is critically dependent on IL-6 production by T cells. Collectively, these results define a unique regulatory role for NFATc2 in colitis by controlling mucosal T cell activation in an IL-6-dependent manner. NFATc2 in T cells thus emerges as a potentially new therapeutic target for inflammatory bowel diseases.

The δ-Opioid Receptor Affects Epidermal Homeostasis via ERK-Dependent Inhibition of Transcription Factor POU2F3.

Neuropeptides and their receptors are present in human skin, and their importance for cutaneous homeostasis and during wound healing is increasingly appreciated. However, there is currently a lack of understanding of the molecular mechanisms by which their signaling modulates keratinocyte function. Here, we show that δ-opioid receptor (DOPr) activation inhibits proliferation of human keratinocytes, resulting in decreased epidermal thickness in an organotypic skin model. DOPr signaling markedly delayed induction of keratin intermediate filament (KRT10) during in vitro differentiation and abolished its induction in the organotypic skin model. This was accompanied by deregulation of involucrin (IVL), loricrin, and filaggrin. Analysis of the transcription factor POU2F3, which is involved in regulation of KRT10, IVL, and profilaggrin expression, revealed a DOPr-mediated extracellular signal-regulated kinase (ERK)-dependent downregulation of this factor. We propose that DOPr signaling specifically activates the ERK 1/2 mitogen-activated protein kinase pathway to regulate keratinocyte functions. Complementing our earlier studies in DOPr-deficient mice, these data suggest that DOPr activation in human keratinocytes profoundly influences epidermal morphogenesis and homeostasis.

Receptor activator for NF-κB ligand in acute myeloid leukemia: expression, function, and modulation of NK cell immunosurveillance.

The TNF family member receptor activator for NF-κB ligand (RANKL) and its receptors RANK and osteoprotegerin are key regulators of bone remodeling but also influence cellular functions of tumor and immune effector cells. In this work, we studied the involvement of RANK-RANKL interaction in NK cell-mediated immunosurveillance of acute myeloid leukemia (AML). Substantial levels of RANKL were found to be expressed on leukemia cells in 53 of 78 (68%) investigated patients. Signaling via RANKL into the leukemia cells stimulated their metabolic activity and induced the release of cytokines involved in AML pathophysiology. In addition, the immunomodulatory factors released by AML cells upon RANKL signaling impaired the anti-leukemia reactivity of NK cells and induced RANK expression, and NK cells of AML patients displayed significantly upregulated RANK expression compared with healthy controls. Treatment of AML cells with the clinically available RANKL Ab Denosumab resulted in enhanced NK cell anti-leukemia reactivity. This was due to both blockade of the release of NK-inhibitory factors by AML cells and prevention of RANK signaling into NK cells. The latter was found to directly impair NK anti-leukemia reactivity with a more pronounced effect on IFN-γ production compared with cytotoxicity. Together, our data unravel a previously unknown function of the RANK-RANKL molecule system in AML pathophysiology as well as NK cell function and suggest that neutralization of RANKL with therapeutic Abs may serve to reinforce NK cell reactivity in leukemia patients.

Membrane mu poly(A) signal and 3' flanking sequences function as a transcription terminator for immunoglobulin-encoding genes.

Developmentally regulated mechanisms involving alternative RNA splicing and/or polyadenylation, as well as transcription termination, are implicated in controlling the levels of secreted mu (mu s), membrane mu (mu m) and delta immunoglobulin (Ig) heavy chain mRNAs during B cell differentiation (mu gene encodes the mu heavy chain). Using expression vectors constructed with genomic DNA segments composed of the mu m polyadenylation signal region, we analyzed poly(A) site utilization and termination of transcription in stably transfected myeloma cells and in murine fibroblast L cells. We found that the gene segment containing the mu m poly(A) signals, along with 536 bp of downstream flanking sequence, acted as a transcription terminator in both myeloma cells and L cell fibroblasts. Neither a 141-bp DNA fragment (which directed efficient polyadenylation at the mu m site), nor the 536-bp flanking nucleotide sequence alone, were sufficient to obtain a similar regulation. This shows that the mu m poly(A) region plays a central role in controlling developmentally regulated transcription termination by blocking downstream delta gene expression. Because this gene segment exhibited the same RNA processing and termination activities in fibroblasts, it appears that these processes are not tissue-specific.

Hog1 bypasses stress-mediated down-regulation of transcription by RNA polymerase II redistribution and chromatin remodeling

Cells are subjected to dramatic changes of gene expression upon environmental changes. Stresscauses a general down-regulation of gene expression together with the induction of a set of stress-responsivegenes. The p38-related stress-activated protein kinase Hog1 is an important regulator of transcription uponosmostress in yeast. Genome-wide localization studies of RNA polymerase II (RNA Pol II) and Hog1 showed that stress induced major changes in RNA Pol II localization, with a shift toward stress-responsive genes relative to housekeeping genes. RNA Pol II relocalization required Hog1, which was also localized to stress-responsive loci. In addition to RNA Pol II-bound genes, Hog1 also localized to RNA polymerase III-bound genes, pointing to a wider role for Hog1 in transcriptional control than initially expected. Interestingly, an increasing association of Hog1 with stressresponsive genes was strongly correlated with chromatin remodeling and increased gene expression. Remarkably, MNase-Seq analysis showed that although chromatin structure was not significantly altered at a genome-wide level in response to stress, there was pronounced chromatin remodeling for those genes that displayed Hog1 association. Hog1 serves to bypass the general down-regulation of gene expression that occurs in response to osmostress, and does so both by targeting RNA Pol II machinery and by inducing chromatin remodeling at stressresponsive loci.

Calmodulin kinase IV: expression and function during rat brain development.

The expression of calmodulin kinase IV (CaMKIV) can be induced by the thyroid hormone T3 in a time- and concentration-dependent manner at a very early stage of brain differentiation using a fetal rat telencephalon primary cell culture system which can grow and differentiate under chemically defined conditions (Krebs et al. (1996) J. Biol. Chem. 271, 11055-11058). After the induction of CaMKIV by T3 we examined the influence of prolonged absence of T3 from the culture medium on the expression of CaMKIV. We could demonstrate that after the T3-dependent induction of CaMKIV, omission of the hormone, even for 8 days, from the medium did not downregulate the expression of CaMKIV indicating that different regulatory mechanisms became important for the expression of the enzyme. We further showed that CaMKIV could be involved in the Ca(2+) -dependent expression of the immediate early gene c-fos, probably via phosphorylation of the transcription factor CREB. Convergence of signal transduction pathways on this transcription factor by using different protein kinases may explain the importance of CREB for the regulation of different cellular processes.

Neurobiology of addiction: the role of transcription factors CREB and C/EBP as well as that of their coactivators

Résumé Le présent travail de thèse a fait face au défi de lier les changements transcriptionnels dans les neurones du système nerveux central au développement de l'addiction aux drogues. I1 est connu que l'apprentissage induit des modifications au niveau de la structure du cerveau, principalement en changeant la manière dont les neurones sont interconnectés par des synapses. De plus en plus d'évidences soutiennent un scénario selon lequel l'activité neuronale déclenche des cascades de signalisation intracellulaire qui ciblent des facteurs de transcription. Ces derniers peuvent activer la transcription de gènes spécifiques qui codent pour des protéines nécessaires au renforcement des synapses mémorisant ainsi la nouvelle information. Puisque l'addiction peut être considérée comme une forme aberrante d'apprentissage, et que les modifications synaptiques sont connues pour être impliquées dans le processus d'addiction, nous essayons de décrire des mécanismes transcriptionels étant à la base des changements synaptiques induits par les drogues. Comme modèle nous utilisons des cultures primaires des neurones de striatum, d'hippocampe et de cortex de souris ainsi que des tranches de cerveau de rat. Une des caractéristiques communes de quasiment toutes les substances addictives est de pouvoir activer le système mésolimbique dopaminergique provoquant la libération de dopamine sur les neurones du striatum (du noyau accumbens). Dans ce travail de thèse nous démontrons que dans des cultures du striatum, la dopamine induit le facteur de transcription C/EBPβ qui, à son tour, provoque l'expression du gène codant pour la substance P. Ce mécanisme pourrait potentiellement contribuer à la tolérance envers les drogues puisqu'il fait partie d'une rétroaction (feed-back) sur les cellules produisant la dopamine. Etant donné que ces résultats montrent l'importance de C/EBPβ dans la psychopathologie de l'addiction, nous avons également décidé d'étudier les mécanismes fondamentaux de l'activation de la transcription par C/EBPβ. Nos expériences démontrent que trois isoformes activatrices de la famille C/EBP recrutent le coactivateur CBP et provoquent en même temps sa phosphorylation. Enfin, nous montrons que les coactivateurs nommés TORC, nouvellement découverts et clonés, sont capables de détecter la coïncidence d'un signal cAMP et d'une entrée de calcium dans des neurones. Par conséquent les TORCs pourraient contribuer à détecter la coïncidence d'un signal glutamate et d'un signal dopamine dans les neurones de striatum, ce qui pourrait être important pour associer les effets hédonistes de la drogue à l'information contextuelle (par exemple à l'environnement où la drogue a été consommée). Nous sommes les premiers à observer que les TORCs sont nécessaires pour la potentiation à long terme dans l'hippocampe. Summary The present thesis work faced the challenge to link the development of drug addiction to transcriptional changes in the neurons of the central nervous system. Experience and learning are known to induce structural modifications in the brain, and these changes are thought to occur mainly in the way neurons are interconnected by synapses. More and more evidences point to a scenario in which neuronal activity would activate signalization cascades that impinge on transcription factors, which, in turn, would activate genes necessary for the reinforcement of synapses coding for new informations. Given that drug addiction can be considered as an aberrant form of learning and is thought to involve synaptic modifications, we try to elucidate some of the transcriptional mechanisms that could underlie drug-induced synaptic changes. As a model system, we use primary cultures of striatal, cortical and hippocampal neurons dissected from mouse embryos as well as brain slices from rats. One of the common features of virtually all drugs of abuse is to activate the mesocorticolimbic dopaminergic system that results in the release of dopamine onto the neurons of the striatum (nucleus accumbens). In this thesis work we show that in striatal cultures, dopamine induces the transcription factor C/EBPβ that in turn drives the expression of the gene coding for substance P. This mechanism is likely to be important for the drug-induced tolerance in the brain since it might be a part of a feedback acting on dopaminergic neurons. Given the suspected importance of C/EBPβ in drug addiction, we also try to elucidate some aspects of the basic mechanisms by which the C/EBP family activates transcription. We show that three activating members of the C/EBP family recruit the coactivator CBP and trigger its phosphorylation. Finally, we demonstrate that the newly discovered and cloned transcriptional coactivators, named TORCs (transducers of regulated CREB activity) are able to detect the coincidence of a calcium and a cAMP signal in the central nervous system. This way, TORCs could contribute to the detection of a coincidence between a glutamate and a dopamine signal in striatal neurons - a process that is suggested to be important for an association between the rewarding effect of a drug and contextual information (such as the environment where the drug had been taken). We demonstrate that TORCs are required for hippocampal LTP.

Wnt-3a and Wnt-3 differently stimulate proliferation and neurogenesis of spinal neural precursors and promote neurite outgrowth by canonical signaling

Wnt factors regulate neural stem cell development and neuronal connectivity. Here we investigated whether Wnt-3a and Wnt-3, expressed in the developing spinal cord, regulate proliferation and the neuronal differentiation of spinal cord neural precursors (SCNP). Wnt-3a promoted a sustained increase of SCNP proliferation, whereas Wnt-3 enhanced SCNP proliferation transiently and increased neurogenesis through β-catenin signaling. Consistent with this, Wnt-3a and Wnt-3 differently regulate the expression of Cyclin-dependent kinase inhibitors. Furthermore, Wnt-3a and Wnt-3 stimulated neurite outgrowth in SCNP-derived neurons through ß-catenin and TCF4-dependent transcription. GSK-3ß inhibitors mimicked Wnt signaling and promoted neurite outgrowth in established cultures. We conclude that Wnt-3a and Wnt-3 signal through the canonical Wnt/β-catenin pathway to regulate different aspects of SCNP development. These findings may be of therapeutic interest for the treatment of neurodegenerative diseases and nerve injury.

Inducible nitric oxide synthase-dependent stimulation of PKGI and phosphorylation of VASP in human embryonic kidney cells.

Inducible nitric oxide synthase (iNOS) production of nitric oxide (NO) has been mostly associated with so-called nitrosative stress or interaction with superoxide anion. However, recent investigations have indicated that, as for the other isoenzymes producing NO, guanylyl cyclase (GC) is a very sensitive target of iNOS activity. To further investigate this less explored signaling, the NO-cyclic guanosine 3'-5'-monophosphate (NO-cGMP)-induced vasodilator-stimulated phosphoprotein (VASP) phosphorylation on serine 239 was investigated in human embryonic kidney 293 cells (HEK cells). First, the expression and activity of alpha2 and beta1 NO-sensitive GC subunits was determined by Western blot analysis, reverse transcription-polymerase chain reaction and NO donors administration. Then, the expression of a functional cGMP-dependent protein kinase I (PKGI) was verified by addition of 8-Br-cGMP followed by determination of phosphorylation of VASP on serine 239. Finally, iNOS activation of this signaling pathway was characterized after transfection of HEK cells with human iNOS cDNA. Altogether our data show that iNOS-derived NO activates endogenous NO-sensitive GC and leads to VASP phosphorylation in HEK cells.