Intracellular trafficking of protease : Activated Receptor 2 (PAR2) by members of sorting nexins family

Le dogme voulant que les récepteurs couplés aux protéines G (GPCRs) activent des voies de signalisation seulement lorsqu’ils sont localisés à la membrane plasmatique, a récemment été remis en question. Des données récentes indiquent que certains GPCRs peuvent également induire une réponse intracellulaire à partir des compartiments intracellulaires dont le noyau. Les récepteurs activés par la protéase (PAR) sont des membres de la famille GPCR. Les PARs sont activés par le clivage de la partie N–terminale du récepteur ce qui permet au ligand attaché sur le récepteur de se lier à sa poche réceptrice. Quatre PARs ont été décrits : PAR1, PAR2, PAR3 et PAR4. PAR2 peut susciter des effets mitogéniques et participer aux processus comme l’angiogenèse et l'inflammation. Alors que beaucoup d'effets intracellulaires de PAR2 peuvent être expliqués lorsqu’il est localisé à la membrane plasmatique, une fonction intracrine de PAR2 a aussi été proposée. Pourtant les mécanismes par lesquels PAR2 peut provoquer l’expression de gènes ciblés sont toujours inconnus. Le but de notre étude était de vérifier l’existence d’une population nucléaire de PAR2. Nous avons également émis l’hypothèse que les voies activées par l’activation de PAR2 dépendent de sa localization cellulaire. En utilisant des techniques de microscopie confocale et de "Western Blot" nous avons démontré la présence d’une population nucléaire de PAR2. À la suite de la stimulation de PAR2, nous avons observé une augmentation de la translocation du récepteur de la membrane plasmatique au noyau. En utilisant la technique de "RT – PCR", nous avons observé des rôles différents de PAR2 à la surface de la cellule et du noyau dans l’initiation de l’expression des gènes. Afin d’identifier les mécanismes responsables de la translocation nucléaire de PAR2, nous avons évalué l’implication des membres de la famille de "Sorting Nexins (SNX)" dans la translocation nucléaire de PAR2. "Sorting Nexins" est un groupe de protéines avec des fonctions de transport bien établies. SNX1 et SNX2 ont été identifiés comme responsables du transfert de PAR1 vers les lysosomes. SNX11 n'a pas encore été étudié et nous avons émis l’hypothèse qu'il pourrait être un autre membre de la famille des SNX impliqué dans la signalisation de PAR2. Pour ce faire, nous avons développé des "knockdowns" stables pour SNX1, SNX2 et SNX11 dans les cellules HEK293. En utilisant les essais d’immunofluorescence, "Western Blot" et de cytométrie en flux, nous avons déterminé que tous les trois membres du groupe SNX sont des partenaires d'interaction de PAR2. Toutefois, seul SNX11 se co-localise avec son partenaire au noyau et est responsable de sa translocation nucléaire. Les expériences de "RT - PCR" sur les lignées de cellule de SNXs "knockdowns" ont démontré que la fonction de PAR2 nucléaire dépend surtout de SNX11; néanmoins SNX1 et SNX2 peuvent aussi l’influencer, suggérant qu'ils font aussi partie du réseau signalétique de PAR2. En conclusion, PAR2 est déplacé de la membrane plasmatique à la membrane nucléaire après sa stimulation avec un agoniste. La translocation nucléaire de PAR2 par un mécanisme impliquant SNX11, initie des effets intracellulaires différents de sa signalisation membranaire. Mots clés : récepteurs couplés à la protéine G, “Sorting Nexins”, récepteurs activés par la protéase, translocation nucléaire, membrane nucléaire, signal nucléaire.

Structure quaternaire des récepteurs de chimiokines CXCR4 et CCR2 et interaction avec leurs effecteurs

Thèse réalisée en cotutelle avec l'université Montpellier2 dans le laboratoire de pharmacologie moléculaire de Jean-Philippe Pin à l'institut de génomique fonctionnelle (IGF), Montpellier, France.

Développement d'un biosenseur BRET permettant le criblage de drogues qui causent l'activation de canaux Kir3 via les récepteurs couplés aux protéines G

Les récepteurs couplés aux protéines G forment des complexes multimériques comprenant protéines G et effecteurs. Nous cherchons à caractériser de tels complexes comprenant les récepteurs opioïdes delta (DOR) et les canaux Kir3, qui nous sont d’intérêt vu leur implication dans l’analgésie des opioïdes. Des expériences d’immunopurification, de BRET et de liaison GTPgS ont été réalisées à l’intérieur de cellules HEK293 transfectées. Les canaux Kir3 ont été co-immunopurifiés avec les DOR, suggérant une interaction spontanée entre récepteur et effecteur. Des essais BRET ont corroboré que l’interaction était présente dans des cellules vivantes et nous ont permis d’identifier une interaction spontanée et spécifique entre DOR/Gg et Gg/Kir3, indiquant leur coexistence en un même complexe. Puisque l’activation du récepteur implique la présence de changements conformationnels à l’intérieur de celui-ci, nous étions intéressés à vérifier si l’information conformationnelle circule à partir du récepteur lié au ligand jusqu’à l’effecteur en aval. Ainsi, nous avons déterminé l’effet de différents ligands sur le signal BRET généré par les paires suivantes : DOR/Gbg, DOR/Kir3 et Kir3/Gbg. Nous avons constaté une modulation de l’interaction DOR/Gbg et Gbg/Kir3 suivant l’ordre d’efficacité des ligands à stimuler la protéine G, ce que nous n’avons pas observé entre DOR et Kir3. Donc, nous concluons que l’information conformationnelle circule du récepteur au canal Kir3 via la protéine Gbg. Ces résultats nous ont permis de développer un biosenseur BRET (EYFP-Gg2/Kir3.1-Rluc) qui pourrait être utilisé dans le criblage à haut débit afin de détecter de nouvelles molécules ayant une grande efficacité à activer les canaux Kir3.

Développement de modulateurs allostériques peptidiques inhibiteurs de l’activité des récepteurs de l’interleukine 1 et de la vasopressine

L’approche Module X a été créée dans le but de concevoir de petits peptides modulateurs ayant des propriétés allostériques. Module X reproduit de petites parties des portions extracellulaires flexibles des récepteurs. Ces petits peptides vont interagir en s’interposant entre deux sous unités ou entre deux régions de la même sous-unité qui interagissent par des liens hydrogènes, des ponts salins ou des liens disulfure. Ces régions sont spécialement choisies à l’extérieur du domaine de liaison du ligand orthostérique et sont situées dans les régions inter domaines, la portion juxta membranaire ou dans les boucles. Étant donné que les boucles sont exposées durant les changements de conformation, une séquence peptidique reproduisant certaines régions de ces boucles pourrait s’insérer à un endroit approprié dans la structure où se lier à son partenaire de signalisation dans le complexe protéique, ce qui aurait comme effet de déplacer l’équilibre de l’ensemble vers un état particulier et modulerait ainsi la signalisation. De cette façon, certaines voies de signalisation pourraient être partiellement inhibées tandis que d’autres voies ne seraient pas touchées puisque le ligand orthostérique pourrait toujours se lier au récepteur. Dans une première étude, nous avons conçu des peptides inhibiteurs du récepteur de l’interleukine 1 (IL-1R/IL-1RAcP) plus précisément en reproduisant des régions flexibles de la protéine accessoire, sous-unité signalisatrice du récepteur. IL-1 est un médiateur majeur de l’inflammation, mais le seul antagoniste disponible est l’analogue naturel de IL-1, IL-1Ra qui compétitionne avec IL-1 pour le site de liaison sur le récepteur. Nous avons conçu plusieurs peptides à partir des boucles de la protéine accessoire. Un de ces peptides, rytvela (101.10) a démontré des propriétés de non-compétitivité et de sélectivité fonctionnelle caractéristiques des modulateurs allostériques. 101.10 bloque la prolifération des thymocytes et la synthèse de PGE2 avec un IC50 de 1 nM mais une efficacité de 100 % et 45 % respectivement et ne déplace pas IL-1 radioactif dans des essais de radioliaisons. De plus, 101.10 n’a qu’un effet minime sur l’affinité de IL-1 pour son récepteur. 101.10 démontre, de plus, une activité inhibitrice in vivo dans des modèles d’inflammation de l’intestin chez le rat (efficacité supérieure aux corticostéroïdes et à IL-1Ra) et de dermatite chez la souris de même que dans un modèle d’hyperthermie induite par IL-1. La deuxième étude démontre que Module X peut être utilisé pour concevoir des inhibiteurs pour une autre grande famille de récepteurs : les récepteurs couplés aux protéines G. La vasopressine joue un rôle important dans l’équilibre hydro-osmotique et un moindre rôle dans la vasomotricité. Six peptides ont été conçus à partir de régions juxta membranaires du récepteur de la vasopressine V2R. Le peptide le plus actif, VRQ397 (IC50 = 0,69 nM dans un modèle de vasorelaxation du crémastère), a démontré de la sélectivité fonctionnelle en inhibant la synthèse de prostacycline mais sans inhiber l’activation de la protéine Gs et la génération d’ AMP cyclique. Le peptide VRQ397 ne pouvait déplacer le ligand naturel AVP marqué radioactivement; de même VRQ397 radioactif ne se liait que sur V2R et non pas sur d’autres récepteurs de la même famille tel que V1R (récepteur de la vasopressine de type I). Ces études décrivent la caractérisation de petits peptides modulateurs de la signalisation de IL-1R et V2R et présentant des propriétés de modulateurs allostériques.

Identification des gènes responsables des hyperplasies surrénaliennes macronodulaires bilatérales familiales avec récepteurs aberrants

La majorité des hyperplasies macronodulaires bilatérales des surrénales avec syndrome de Cushing ACTH-indépendant (AIMAH) est due à l’expression aberrante de divers récepteurs hormonaux au niveau du cortex surrénalien. Les gènes responsables des AIMAH familiales avec récepteurs aberrants n’ont pas été identifiés. Le but de ce projet est de les identifier. Une étude de liaison, visant à identifier la ou les régions du génome comprenant le ou les gènes pouvant être en cause dans les AIMAH familiales, a été réalisée en utilisant l’ADN des membres d’une famille (10 malades et 7 sains) originaire du Québec, atteinte d’AIMAH et syndrome de Cushing et caractérisée par l’expression des récepteurs β-adrénergique et V1-vasopressine. Diverses régions chromosomiques entre les personnes atteintes et non-atteintes de la famille ont été soulignées. Un total de 707453 SNPs a été obtenu, et après analyse statistique, 159 SNPs significatifs, pouvant être associés au phénotype, ont été mis en évidence entre les deux groupes. Il a été constaté que la majorité de ces SNPs se situaient sur les régions chromosomiques 1q32.1 et 16q12.2. Une étude du transcriptome a aussi été réalisée en utilisant l’ADN des tumeurs de deux patients de la famille, ainsi que l’ADN d'autres tumeurs surrénaliennes. Les analyses statistiques ont permis d’identifier 15 gènes susceptibles d’être reliés à la maladie (11 surexprimés et 4 sous-exprimés). En utilisant les données de ces deux études, nous avons ciblé six gènes du chromosome 1 (ATP2B4, PPP1R12B, SOX13, CACNA1S, ADORA1et PHLDA3), un du chromosome 16 (CHD9) et un du chromosome 13 (SPRY2), afin de rechercher la présence de mutations. Le séquençage n’a révélé aucun changement de nucléotide dans les gènes PPP1R12B et SOX13. Dans les gènes ATP2B4, CACNA1S, ADORA1et PHLDA3, le séquençage a révélé des changements de nucléotides n’entrainant soit pas de changement d’acide aminé soit un changement d’acide aminé jugé « non pertinent », du fait qu’il ne permettait pas de différencier les sujets sains des sujets atteints. Pour ce qui est de CHD9 et SPRY2, le séquençage a permis d’identifier des changements de nucléotides entrainant des changements d’acides aminés de façon plus fréquente chez les sujets atteints par rapport aux sujets sains. En conclusion, nos travaux nous ont donc permis d’identifier, par étude de liaison et par analyse du transcriptome, des gènes candidats qui pourraient être responsables de cette pathologie. Le séquençage de ces gènes candidats a révélé des mutations de CHD9 et SPRY2. Ces résultats s’avèrent prometteurs puisque ces deux gènes produisent des protéines impliquées dans le remodelage de la chromatine et dans la régulation de la signalisation des protéines kinases. Le phénotypage et le génotypage des patients atteints doivent être poursuivis pour vérification.

Functional Analysis of Nuclear beta-Adrenergic Receptors in the Myocardium

Récemment plusieurs récepteurs couplés aux protéines G (RCPGs) ont été caractérisés au niveau des membranes intracellulaires, dont la membrane nucléaire. Notre objectif était de déterminer si les sous-types de récepteurs β-adrénergiques (βAR) et leurs machineries de signalisation étaient fonctionnels et localisés à la membrane nucléaire des cardiomyocytes. Nous avons démontré la présence des β1AR et β3AR, mais pas du β2AR à la membrane nucléaire de myocytes ventriculaires adultes par immunobuvardage, par microscopie confocale, et par des essais fonctionnels. De plus, certains partenaires de signalisation comme les protéines GαS, Gαi, l’adénylate cyclase II, et V/VI y étaient également localisés. Les sous-types de βAR nucléaires étaient fonctionnels puisqu'ils pouvaient lier leurs ligands et activer leurs effecteurs. En utilisant des noyaux isolés, nous avons observé que l'agoniste non-sélectif isoprotérénol (ISO), et que le BRL37344, un ligand sélectif du β3AR, stimulaient l'initiation de la synthèse de l’ARN, contrairement à l'agoniste sélectif du β1AR, le xamotérol. Cette synthèse était abolie par la toxine pertussique (PTX). Cependant, la stimulation des récepteurs nucléaires de type B de l’endothéline (ETB) causaient une réduction de l'initiation de la synthèse d’ARN. Les voies de signalisations impliquées dans la régulation de la synthèse d’ARN par les RCPGs ont ensuite été étudiées en utilisant des noyaux isolés stimulés par des agonistes en présence ou absence de différents inhibiteurs des voies MAP Kinases (proteines kinases activées par mitogènes) et de la voie PI3K/PKB. Les protéines impliquées dans les voies de signalisation de p38, JNK, ERK MAP Kinase et PKB étaient présents dans les noyaux isolés. L'inhibition de PKB par la triciribine, inhibait la synthèse d’ARN. Nous avons ensuite pu mettre en évidence par qPCR que la stimulation par l’ISO entrainait une augmentation du niveau d'ARNr 18S ainsi qu’une diminution de l'expression d’ARNm de NFκB. En contraste, l’ET-1 n’avait aucun effet sur le niveau d’expression de l’ARNr 18S. Nous avons ensuite montré que la stimulation par l’ISO réduisait l’expression de plusieurs gènes impliqués dans l'activation de NFκB, tandis que l’inhibition de ERK1/2 et PKB renversait cet effet. Un microarray global nous a ensuite permis de démontrer que les βARs et les ETRs nucléaires régulaient un grand nombre de gènes distincts. Finalement, les βARs et ETRs nucléaires augmentaient aussi une production de NO de noyaux isolés, ce qui pouvait être inhibée par le LNAME. Ces résultats ont été confirmés dans des cardiomyocytes intacts en utilisant des analogues cagés et perméables d’ISO et de l'ET-1: l'augmentation de NO nucléaire détectée par DAF2-DA, causée par l'ET-1 et l'ISO, pouvait être prévenue par le LNAME. Finalement, l’augmentation de l’initiation de la transcription induite par l'ISO était aussi bloquée par le L-NAME ou par un inbitheur de PKG, le KT5823, suggérant que la voie NO-GC-PKG est impliquée dans la régulation de la transcription par les βAR. En conclusion, les βARs et les ETRs nucléaires utilisent des voies de signalisation différentes et exercent ainsi des effets distincts sur l’expression des gènes cardiaques. Ils représentent donc une avenue intéressante pour le développement de drogues pharmacologiques.

Mécanismes de régulation du trafic et de l’activité du récepteur GABAB

L’acide γ-aminobutyrique (GABA) est le principal neurotransmetteur inhibiteur du système nerveux central et est impliqué dans diverses pathologies incluant l’épilepsie, l’anxiété, la dépression et la dépendance aux drogues. Le GABA agit sur l’activité neuronale par l’activation de deux types de récepteurs; le canal chlorique pentamérique GABAA et l’hétérodimère obligatoire de récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) GABAB. Chacun des récepteurs est responsable de phases distinctes de la réponse cellulaire au GABA. Lors d’une stimulation par le GABA, il est essentiel pour la cellule de pouvoir contrôler le niveau d’activité des récepteurs et au besoin, de limiter leur activation par des mécanismes de désensibilisation et de régulation négative. La désensibilisation nécessite le découplage du récepteur de ses effecteurs, ainsi que sa compartimentation hors de la membrane plasmique dans le but de diminuer la réponse cellulaire à l’agoniste. Les mécanismes de contrôle de l’activité de GABAB semblent anormaux pour un RCPG et sont encore mal moléculairement caractérisés. L’objet de cette thèse est d’étudier la régulation du récepteur GABAB et de sa signalisation par la caractérisation de nouvelles protéines d’interactions étant impliquées dans la désensibilisation, l’internalisation et la dégradation du récepteur. Une première étude nous a permis d’identifier la protéine NSF (N-ethylmaleimide sensitive factor) comme interagissant avec le récepteur hétérodimérique. Nous avons caractérisé le site d’interaction au niveau du domaine coiled-coil de chacune des deux sous-unités de GABAB et constaté la dépendance de cette interaction au statut de l’activité ATPasique de NSF. Nous avons observé que cette interaction pouvait être dissociée par l’activation de GABAB, induisant la phosphorylation du récepteur par la protéine kinase C (PKC) parallèlement à la désensibilisation du récepteur. L’activation de PKC par le récepteur est dépendante de l’interaction NSF-GABAB, ce qui suggère une boucle de rétroaction entre NSF et PKC. Nous proposons donc un modèle où, à l’état basal, le récepteur interagit avec NSF, lui permettant d’activer PKC en réponse à la stimulation par un agoniste, et où cette activation permet à PKC de phosphoryler le récepteur, induisant sa dissociation de NSF et sa désensibilisation. Nous avons par la suite étudié la dégradation et l’ubiquitination constitutive de GABAB et la régulation de celles-ci par PKC et l’enzyme de déubiquitination USP14 (ubiquitin-specific protease 14). Au niveau basal, le récepteur est ubiquitiné, et présente une internalisation et une dégradation rapide. L’activation de PKC augmente l’ubiquitination à la surface cellulaire et l’internalisation, et accélère la dégradation du récepteur. USP14 est en mesure de déubiquitiner le récepteur suite à l’internalisation, mais accélère aussi la dégradation par un mécanisme indépendant de son activité enzymatique. Nos résultats suggèrent un mécanisme où l’ubiquitination promeut l’internalisation et où USP14 cible le récepteur ubiquitiné vers un processus de dégradation lysosomale. La troisième étude porte sur la régulation de la densité de récepteurs à la membrane plasmique par la protéine Grb2 (growth factor receptor-bound protein 2). Nous avons déterminé que Grb2 interagit avec GABAB1 au niveau de la séquence PEST (riche en proline, glutamate, sérine et thréonine) du domaine carboxyl-terminal, et que cette interaction module l’expression à la surface du récepteur hétérodimérique en diminuant l’internalisation constitutive par un mécanisme encore inconnu. Cette inhibition de l’internalisation pourrait provenir d’une compétition pour le site de liaison de Grb2 à GABAB1, ce site étant dans une région interagissant avec plusieurs protéines impliquées dans le trafic du récepteur, tels le complexe COPI et la sous-unité γ2S du récepteur GABAA (1, 2). En proposant de nouveaux mécanismes moléculaires contrôlant l’activité et l’expression à la membrane du récepteur GABAB par les protéines NSF, PKC, USP14 et Grb2, les études présentées dans cette thèse permettent de mieux comprendre les processus d’internalisation et de dégradation, ainsi que du contrôle de l’activité de GABAB par la désensibilisation, ouvrant la porte à une meilleure compréhension de la signalisation GABAergique.

Caractérisation des processus moléculaires impliqués dans l’activation de la protéine IKKbeta par l'angiotensine II et son rôle dans la réponse phénotypique des CMLV.

Le système rénine-angiotensine-aldostérone (SRAA) régule l’homéostasie de la contraction des artères. Or, suivant la liaison de l’angiotensine II (Ang II) à son récepteur AT1, le SRAA est également impliqué dans l’activation de voies de signalisation à l’origine de l’inflammation et de l’hypertrophie des cellules musculaires lisses vasculaires (CMLV), soit deux processus participant au remodelage vasculaire caractéristique de diverses maladies cardiovasculaires, telles l’hypertension et l’athérosclérose. Ces pathologies sont les premières causes de mortalité naturelle en Amérique et les traitements les ciblant ne sont pas optimaux puisqu’ils visent seulement quelques facteurs de risque qui leur sont associés. Ainsi, la détermination des effecteurs intracellulaires régulant ces voies délétères est nécessaire à l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques. L’inflammation Ang II-dépendante dans les CMLV est attribuée au facteur de transcription nuclear factor-kappa B (NF-κB). Cependant, les processus moléculaires couplant le récepteur AT1 à son activation sont peu caractérisés. L’étude abordant cette question démontre in vitro que NF-κB est activé par la protéine IκB kinase β (IKKβ) dans les CMLV exposées à l’Ang II et que cette kinase est régulée par deux voies de signalisation indépendantes, mais complémentaires afin d’assurer son activation rigoureuse et soutenue. L’une des voies est précoce et dépend des seconds messagers ainsi que de deux nouveaux effecteurs sous-jacents au récepteur AT1, soit la E3 ligase TNF receptor-associated factor 6 (TRAF6) et la IKK kinase transforming growth factor-beta-activated kinase 1 (TAK1) tandis que la seconde est tardive et résulte de la signalisation mitogen-activated protein kinase kinase 1/2 (MEK1/2) - extracellular signal-regulated kinase 1/2 (ERK1/2) - ribosomal S6 kinase (RSK). L’inhibition conjointe de ces voies abroge complètement la réponse inflammatoire, ce qui indique qu’elles en sont la seule source. Ainsi, l’inhibition d’IKKβ pourrait suffire à contrer l’inflammation impliquée dans le remodelage vasculaire associé à une suractivation du SRAA. Une découverte des plus novatrices découle de cette étude, qui veut que la E3 ligase TRAF6 est un nouvel effecteur des récepteurs couplés aux protéines G et est à l’origine de la formation d’un nouveau type de second messager, soit des chaînes libres de poly-ubiquitines. Les mécanismes moléculaires à la base de l’hypertrophie Ang II-dépendante dans les CMLV sont également peu définis. Or, suivant la parution d’un article démontrant qu’IKKβ dans les cellules cancéreuses participe aux mécanismes d’initiation de la traduction en réponse au facteur de nécrose tumorale α (TNFα) via la phosphorylation de la protéine Tuberous sclerosis 1 (TSC1) et donc l’activation du complexe mammalian target of rapamycin (mTORC1), une hypothèse a été émise selon laquelle cette kinase serait impliquée dans la synthèse protéique Ang II-dépendante dans les CMLV. Les expériences effectuées in vitro dans des CMLV exposées à l’Ang II démontrent qu’IKKβ induit la phosphorylation de TSC1 ainsi que l’activation de mTORC1 et de ses substrats S6 kinase 1 (S6K1) et translational regulators eukaryotic translation initiation factor 4E-binding protein (4E-BP1), deux protéines impliquées directement dans l’hypertrophie. Par ailleurs, la synthèse protéique au niveau des CMLV exposées à l’Ang II est réduite de 75% suivant la diminution de l’expression d’IKKβ et suivant la surexpression d’un mutant de TSC1 dont le site consensus d’IKKβ a été modifié, faisant de cette kinase un médiateur majeur au niveau de ce processus. Ainsi, in vitro IKKβ en réponse à l’Ang II est en amont de deux processus impliqués dans un remodelage vasculaire à l’origine de maladies cardiovasculaires. De plus, plusieurs facteurs de risque de ces pathologies convergent à l’activation d’IKKβ, ce qui en fait une cible thérapeutique particulièrement attrayante. Qui plus est, l’administration d’un inhibiteur d’IKKβ à des rats diminue non seulement la synthèse protéique dépendante de l’Ang II au niveau de l’aorte et des artères mésentériques, mais également la synthèse de la protéine pro-inflammatoire VCAM-1 par les cellules composant l’aorte, ce qui confirme son envergure en tant que cible.

Role of Nuclear Angiotensin-II Receptor Mediated Signalling in Cardiovascular Remodelling

Le remodelage cardiaque est le processus par lequel la structure ou la fonction cardiaque change en réponse à un déséquilibre pathophysiologique tel qu'une maladie cardiaque, un contexte d'arythmie prolongée ou une modification de l'équilibre hormonal. Le système rénine-angiotensine (SRA) est un système hormonal largement étudié et il est impliqué dans de nombreuses activités associées au remodelage cardiovasculaire. L’existence d'un système circulatoire couplé à un système de tissus locaux est une représentation classique, cependant de nouvelles données suggèrent un SRA indépendant et fonctionnellement actif à l'échelle cellulaire. La compréhension de l'activité intracellulaire du SRA pourrait mener à de nouvelles pistes thérapeutiques qui pourraient prévenir un remodelage cardiovasculaire défavorable. L'objectif de cette thèse était d'élucider le rôle du SRA intracellulaire dans les cellules cardiaques. Récemment, les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG), les protéines G et leurs effecteurs ont été détectés sur des membranes intracellulaires, y compris sur la membrane nucléaire, et les concepts de RCPG intracellulaires fonctionnels sont en voie d'être acceptés comme une réalité. Nous avons dès lors fait l'hypothèse que la signalisation du SRA délimitant le noyau était impliquée dans le contrôle de l'expression des gènes cardiaques. Nous avons démontré la présence de récepteurs d'angiotensine de type-1 (AT1R) et de type-2 (AT2R) nucléaires dans les cardiomyocytes ventriculaires adultes et dans une fraction nucléaire purifiée de tissu cardiaque. Des quantités d'Ang II ont été détectées dans du lysat de cardiomyocytes et des microinjections d'Ang-II-FITC ont donné lieu à des liaisons préférentielles aux sites nucléaires. L'analyse transcriptionnelle prouve que la synthèse d'ARN de novo dans des noyaux isolés stimulés à l'Ang-II, et l'expression des ARNm de NF-κB étaient beaucoup plus importants lorsque les noyaux étaient exposés à de l'Ang II par rapport aux cardiomyocytes intacts. La stimulation des AT1R nucléaires a engendré une mobilisation de Ca2+ via les récepteurs de l'inositol trisphosphate (IP3R), et le blocage des IP3R a diminué la réponse transcriptionnelle. Les méthodes disponibles actuellement pour l'étude de la signalisation intracrine sont limitées aux méthodes indirectes. L'un des objectifs de cette thèse était de synthétiser et caractériser des analogues d'Ang-II cellule-perméants afin d’étudier spécifiquement dans les cellules intactes l'activité intracellulaire du SRA. Nous avons synthétisé et caractérisé pharmacologiquement des analogues photosensibles Ang-II encapsulée en incorporant un groupement 4,5-diméthoxy-2-nitrobenzyl (DMNB) photoclivable sur les sites actifs identifiés du peptide. Chacun des trois analogues d'Ang II encapsulée synthétisés et purifiés: [Tyr(DMNB)4]Ang-II, Ang-II-ODMNB et [Tyr(DMNB)4]Ang-II-ODMNB a montré une réduction par un facteur deux ou trois de l'affinité de liaison envers AT1R et AT2R dans les dosages par liaison compétitive et une activité réduite dans la contraction de l'aorte thoracique. La photostimulation de [Tyr(DMNB)4]Ang-II dans des cellules HEK a augmenté la phosphorylation d'ERK1/2 (via AT1R) et la production de cGMP (via AT2R) alors que dans les cardiomyocytes isolés elle générait une augmentation de Ca2+ nucléoplasmique et initiait la synthèse d'ARNr 18S et d'ARNm du NF-κB. Les fibroblastes sont les principaux générateurs de remodelage cardiaque structurel, et les fibroblastes auriculaires sont plus réactifs aux stimuli profibrotiques que les fibroblastes ventriculaires. Nous avons émis l'hypothèse que l’Ang-II intracellulaire et l'activation des AT1R et AT2R nucléaires associés contrôlaient les profils d'expression des gènes des fibroblastes via des systèmes de signalisation distincts et de ce fait jouaient un rôle majeur dans le développement de la fibrose cardiaque. Nous avons remarqué que les fibroblastes auriculaires expriment l’AT1R et l’AT2R nucléaire et l'Ang-II au niveau intracellulaire. L’expression d'AT1R nucléaire a été régulés positivement dans les cas d’insuffisance cardiaque (IC), tandis que l'AT2R nucléaire a été glycosylé post-traductionnellement. La machinerie protéique des protéines G, y compris Gαq/11, Gαi/3, et Gβ, a été observée dans des noyaux isolés de fibroblastes. AT1R et AT2R régulent l'initiation de la transcription du fibroblaste via les voies de transduction de signal d'IP3R et du NO. La photostimulation de [Tyr(DMNB)4]Ang-II dans une culture de fibroblastes auriculaire déclenche la libération de Ca2+ nucléoplasmique, la prolifération, et la synthèse et sécrétion de collagène qui ne sont pas inhibées par les bloqueurs d'AT1R et/ou AT2R extracellulaires.

Oligomers of D-2 dopamine receptors - Evidence from ligand binding

There is increasing evidence that G protein-coupled receptors form oligomers and that this might be important for their function. We have studied this phenomenon for the D-2 dopamine receptor and have shown-using a variety of biochemical and biophysical techniques-that this receptor forms dimers or higher-order oligomers. Using ligand-binding studies, we have also found evidence that this oligomer formation has functional relevance. Thus, for the receptor expressed in either CHO cells or Sf 9 insect cells, the binding properties of several radioligands (in saturation, competition, and dissociation assays) do not conform to those expected for a monomeric receptor with a single binding site. We propose that the receptors exist in oligomers with homotropic and heterotropic negatively cooperative interactions between ligands.

Functional coupling of the human dopamine D-2 receptor with G alpha(i1), G alpha(i2), G alpha(i3) and G alpha(o) G proteins: evidence for agonist regulation of G protein selectivity

1 The human dopamine D-2long (D-2L) receptor was expressed with four different G proteins in Sf9 cells using the baculovirus expression system. When co-expressed with G(i)/G(o) G proteins (G(i1)alpha, G(i2)alpha, G(i3)alpha, or G(o)alpha, plus Gbeta(1) and Ggamma(2)) the receptor displayed a high-affinity binding site for the agonists (dopamine and NPA), which was sensitive to GTP (100 mum), demonstrating interaction between the receptor and the different G proteins. 2 The receptor to G protein ratio (R: G ratio) was evaluated using [H-3]-spiperone saturation binding (R) and [S-35]-GTPgammaS saturation binding (G). R: G ratios of 1: 12, 1: 3, 1: 14 and 1: 5 were found for G(i1), G(i2), G(i3), and Go preparations, respectively. However, when R:G ratios of 1:2 and 1: 12 were compared for G(i2) and G(o), no difference was found for the stimulation of [S-35]-GTPgammaS binding. 3 Several agonists were tested for their ability to stimulate [S-35]-GTPgammaS binding to membranes co-expressing the receptor and various G proteins. All the compounds tested showed agonist activity in preparations expressing G(i3) and G(o). However, for G(i2) and G(i1) preparations, compounds such as S-(-)-3-PPP and p-tyramine were unable to stimulate [S-35]-GTPyS binding. 4 Most of the compounds showed higher relative efficacies (compared to dopamine) and higher potencies in the preparation expressing G(o). Comparison of the effects of different agonists in the different preparations showed that each agonist differentially activates the four G proteins. 5 We conclude that the degree of selectivity of G protein activation by the D-2L receptor can depend on the conformation of the receptor stabilised by an agonist.

Interaction of the D-2short dopamine receptor with G proteins: analysis of receptor G protein selectivity

The human D-2short (D-2S) dopamine receptor has been expressed together with the G proteins Gi2 and Go in insect cells using the baculovirus system. Levels of receptor were determined using [H-3]spiperone binding. Levels of G protein heterotrimer were determined using quantitative Western blot and using [S-35]GTPgammaS saturation binding experiments. Levels of the receptor and G protein and the receptor/G protein ratio were similar in the two preparations. Stimulation of [S-35]GTPgammaS binding by a range of agonists occurred with higher relative efficacy and in some cases higher potency in the preparation expressing Go, indicating that interaction of the D-2S receptor is more efficient with this G protein. The effects of various G protein-selective agents on 10,11-dihydroxy-N-n-propylnorapomorphine ([H-3]NPA) binding were used to examine the receptor/G protein complex in the two preparations. Suramin inhibited [H-3]NPA binding with slightly higher potency in the Gi2 preparation, whereas GppNHp inhibited [H-3]NPA binding with greater potency (similar to6-fold) in the Go preparation. This may imply that the G protein is more readily activated in the D-2S/Go preparation. [H-3]Spiperone binding occurred with an increased B-max in the presence of suramin in the Go preparation but not in the Gi2 preparation, suggesting a higher affinity interaction between the free receptor and this G protein. It is concluded that the higher efficiency activation of Go by the D-2S receptor may be a function of higher affinity receptor/G protein interaction as well as a greater ability to activate the G protein. (C) 2003 Elsevier Science Inc. All rights reserved.

Signaling mechanisms of GPCR ligands

G protein-coupled receptors constitute one of the major classes of drug targets, so understanding the mechanisms of signaling through these receptors is of great importance. This review covers some of the recent advances in G protein-coupled receptor signaling. A high resolution structure of the beta(2)-adrenergic receptor has been reported, as well as several molecular switches involved in receptor activation. It has also been realised that receptors and G proteins and their subunits may not always separate upon receptor activation. The definition of the ability of these receptors to signal has been expanded considerably with the realisation that some signaling may occur independently of G proteins, that some signaling events may differ in their pharmacological profiles and that formation of heterodimers of these receptors may provide new avenues for both signaling and drug design.

Oligomers of D-2 dopamine receptors: evidence from ligand binding

There is increasing evidence that G protein-coupled receptors form oligomers and that this might be important for their function. We have studied this phenomenon for the D-2 dopamine receptor and have shown-using a variety of biochemical and biophysical techniques-that this receptor forms dimers or higher-order oligomers. Using ligand-binding studies, we have also found evidence that this oligomer formation has functional relevance. Thus, for the receptor expressed in either CHO cells or Sf 9 insect cells, the binding properties of several radioligands (in saturation, competition, and dissociation assays) do not conform to those expected for a monomeric receptor with a single binding site. We propose that the receptors exist in oligomers with homotropic and heterotropic negatively cooperative interactions between ligands