Superprodução, purificação e caracterização parcial de complexos proteína-polissacáridos inovadores a partir de estirpes de basidiomicetos

O presente trabalho teve como objectivo o estudo de meios de cultura, tendo em vista a superprodução de complexos proteína-polissacáridos, intracelulares e extracelulares, a partir dos basidiomicetos Pleurotus ostreatus e Lentinula edodes. O meio de cultura suplementado com soro de leite apresentou diversas vantagens para a obtenção dessas macromoléculas biológicas, face aos restantes meios analisados, pelo que foi seleccionado para a produção em fermentador de laboratório em regime descontínuo. O crescimento da cultura foi efectuado a 28°C, 200 rpm e durante 10 dias, e as produtividades de complexos proteína-polissacáridos obtidas para o Pleurotus ostreatus foram de 0,008 ± 8,12 x 10-5 g/(L.dia) e de 0,324 ± 0,005 g/(L.dia), para os complexos precipitados a partir da biomassa e do caldo de fermentação, respectivamente. Posteriormente, os complexos intracelulares e extracelulares foram purificados por cromatografia de filtração em gel e parcialmente caracterizados, revelando concentrações de polissacáridos superiores à concentração proteica, pseudo-actividade de superóxido dismutase, e valores de Mr entre 64 e 9 000kDa. As amostras de complexos proteína-polissacáridos foram caracterizadas por HPLC e apresentaram picos de UV e IR com tempos de retenção de aproximadamente 6 e 12 minutos, respectivamente. Após hidrólise ácida, os complexos heteropolissacáridos obtidos apresentaram na sua constituição glucose, ramnose e arabinose. Adicionalmente, a análise dos complexos proteína-polissacáridos por FT-IR revelou bandas de absorção características destas macromoleculas biológicas, designadamente, a 846,5; 1032,3; 1186,4; 1471,0; 1648,8; 2739,6 e 3419,3 cm-1 para o Pleurotus ostreatus e 862,3; 1044,1; 1474,9; 1644,8; 2372,0; 2992,5; e 3415,4 cm-1 para Lentinula edodes.

Avaliação da contaminação bacteriana em desinfetantes de uso domiciliar

OBJETIVO: Avaliar desinfetantes de uso domiciliar, identificando a presença de bactérias contaminantes, e conhecer o nível de tolerância dessas bactérias ao cloreto de benzalcônio. MÉTODOS: Foram adquiridas aleatoriamente no comércio da região metropolitana de São Paulo, SP, Brasil, 52 amostras de desinfetantes de uso domiciliar para análise quanto à presença de bactérias contaminantes. O nível de tolerância dessas bactérias ao cloreto de benzalcônio foi determinado pelo método da macrodiluição em caldo. RESULTADOS: De 52 amostras, 16 (30,77%) estavam contaminadas por bactérias Gram negativas, com contagens variando entre 10(4) e 10(6) UFC/ml. Esses contaminantes foram identificados como Alcaligenes xylosoxidans, Burkholderia cepacia e Serratia marcescens. As Concentrações Inibitórias Mínimas (CIM: mg/ml) do cloreto de benzalcônio para S. marcescens, A. xylosoxidans e B. cepacia foram: 2,48, 1,23 e 0,30, respectivamente. CONCLUSÕES Os desinfetantes de uso domiciliar à base de compostos de amônio quaternário são passíveis de contaminação por bactérias. As CIM do cloreto de benzalcônio para as bactérias contaminantes estavam abaixo das concentrações do princípio ativo presente nos desinfetantes, indicando que a tolerância ao biocida não é estável, podendo ser perdida com o cultivo das bactérias em meios de cultura sem o biocida.

Controlo de qualidade microbiológica na indústria farmacêutica

O presente Relatório de Estágio teve como objectivo analisar e discutir as competências adquiridas e desenvolvidas, durante o estágio, no controlo da qualidade microbiológica na indústria farmacêutica O estágio, foi realizado no Laboratório de Microbiologia dos Laboratórios Atral, Grupo AtralCipan, localizado na Vala do Carregado, Castanheira do Ribatejo. Este teve a duração de aproximadamente dez meses e meio, com data de início a 21 de Setembro de 2011 e final de 10 de Agosto de 2012. Numa fase inicial, foram adquiridas as aptidões necessárias para a aplicação das metodologias realizadas no laboratório de microbiologia com o estudo das normas, procedimento e legislação aplicada, com foco na importância das farmacopeias na indústria farmacêutica e formação para a realização de ensaios em Áreas de Processamento Asséptico, conhecendo e compreendendo os procedimentos a ter nestas. Uma das principais metodologias realizadas, e desenvolvida neste relatório, compreendeu a análise de produtos farmacêuticos estéreis, com a aplicação de Testes de Esterilidade, pelo método de STERITEST e método Directo, com resultados que demonstraram a importância destas técnicas, da avaliação do ambiente em que são realizadas e do operador que as executa. Os Testes de Promoção de Crescimento, foram também explorados neste trabalho, realizados não só para avaliação dos meios de cultura, onde foi possível analisar os requisitos e resultados obtidos, como também para validação de metodologias, nomeadamente, na validação de meios e fluidos de marcas diferentes para utilização no método STERITEST e na validação do método de filtração de membrana para Enumeração Microbiana de um produto não estéril. Estas validações possibilitaram a redução de custos e melhoria das condições da análise e metodologias aplicadas. Com a realização do estágio foi possível adquirir aptidões práticas, que aliadas ao conhecimento teórico obtido no mestrado, proporcionaram um crescimento a nível pessoal, científico e profissional.

Isolamento de amebas de vida livre potencialmente patogênicas em poeira de hospitais

OBJETIVO: Observar a ocorrência de amebas de vida livre dos gêneros Acanthamoeba e Naegleria em amostras de poeira coletadas em hospitais. MÉTODOS: Foram coletadas 132 amostras de poeira em dois hospitais do município de Presidente Prudente, São Paulo. Os locais da coleta foram: Unidade de Terapia Intensiva, Centro Cirúrgico, Isolamento de Moléstias Infecciosas, Berçário, Emergência e Cozinha. As amostras foram semeadas em três meios de cultura: meio de ágar não nutriente com Escherichia coli, meio de ágar infusão de soja e microcultivo em meio de Pavlova modificado por Giazzi. As amebas isoladas foram identificadas segundo critérios morfológicos. RESULTADOS: O índice geral de positividade para amebas de vida livre, potencialmente patogênicas, dos gêneros Acanthamoeba e Naegleria, foi de 45,5%, sendo positivas 41,6% das amostras de poeira coletadas no hospital universitário e 50% no hospital estadual. Obtiveram-se 45,5% de positividade do gênero Acanthamoeba e 3,8% para amebas do gênero Naegleria. CONCLUSÕES: As amebas de vida livre, potencialmente patogênicas, estavam presentes em todos os ambientes estudados dos dois hospitais, sendo que as espécies do gênero Acanthamoeba foram as isoladas com maior freqüência.

Efeito do glicerol e do telurito de potássio sôbre os grânulos metacromáticos e a morfologia do bacilo diftérico

Após ter-se salientado a importância da preservação da morfologia convencional do bacilo diftérico, para os propósitos do diagnóstico presuntivo de difteria, faz-se um estudo comparativo dos aspectos morfológicos de 10 amostras de Corynebacterium em quatro meios de uso mais comum para o isolamento dêsses germes, modificando êsses mesmos meios, em cada caso, pela inclusão de glicerol, de teluríto de potássio e de glicerol e telurito, em comparação com a fórmula original. Descreve-se uma técnica simples para a incorporação do telurito de potássio nos meios preparados por coagulação de proteínas animais (Loeffler e Pai). A apreciação da morfologia e da evidenciação de grânulos de volutina destacam o meio de Pai, com cêrca de 7 porcento de glicerol, entre 16 variações de meios de cultura estudadas, como o mais favorável para a demonstração da morfologia considerada típica no diagnóstico do bacilo diftérico.

Leishmaniose tegumentar americana

A leishmaniose tegumentar americana permanence endêmica em vastas áreas da América Latina. Os agentes causadores da doença são a L. (Viannia) braziliensis, L. (L. mexicana), L. (V.) panamensis, e outras espécies relacionadas. A apresentação clínica da doença varia dentro de um espectro amplo, incluindo úlceras cutâneas múltiplas ou única, leishmaniose cutânea difusa e lesões mucosas. Os principais reservatórios da L. (V.) braziliensis e da L. (Viannia) spp. são os pequenos roedores silvestres. A doença acomete mais freqüentemente os trabalhadores que invadem as florestas tropicais ou moram próximo a elas. O período de incubação varia de duas semanas a vários meses. As lesões cutâneas constituem úlceras rasas, circulares com bordas elevadas e bem definidas e com o assoalho da úlcera de aspecto granular. Nas infecções pela L. (V.) braziliensis a linfoadenopatia regional geralmente precede o surgimento das úlcerações por uma a doze semanas. O diagnóstico definitivo depende da identificação de amastigotas em tecido ou promastigotas em meios de cultura. Os anticorpos anti-leishmania podem ser identificados no soro utilizando-se as técnicas de ELISA, imunofluorescência e testes de aglutinação mas os títulos revelam-se baixos na maioria dos casos. A intradermorreação de Montenegro torna-se positiva durante a evolução da doença. Os antimoniais pentavalentes continuam sendo as drogas de escolha no tratamento da leishmaniose. A anfotericina B encontra indicação nos casos mais graves ou nos indivíduos que não respondem ao tratamento com os antimoniais. A imunoterapia e a imunoprofilaxia constituem alternativas promissoras no tratamento e profilaxia da leishmaniose tegumentar americana.

Avaliação da presença de Staphylococcus aureus nos leitos do Centro de Terapia Intensiva do Hospital Escola da Faculdade de Medicina do Triângulo Mineiro, em relação à posição no colchão antes e após a limpeza

Através de meios de cultura, foi pesquisada a posição de colônias de Staphylococcus aureus em colchões, visando avaliar a eficácia do procedimento de limpeza e desinfecção dos leitos do Hospital Escola da Faculdade de Medicina do Triângulo Mineiro (Uberaba). Foram analisadas amostras de 50 colchões no período de 22 de outubro de 2000 a 16 de janeiro de 2001. As amostras foram coletadas e semeadas, pela técnica de esgotamento, em dois meios de cultivo (ágar sangue e manitol) com posterior realização de provas de catalase e coagulase . Na análise estatística, foram utilizados os testes não paramétricos Mann-Whitney, Kruswkal- Wallis e Wilcoxon Matched Pairs Test com nível de significância p < 0,05. Foram utilizadas 600 placas de meio de cultivo. Houve crescimento em 94 (15,6%), sendo 82 (87,2%) antes e 12 (12,8%) após a limpeza e desinfecção. Em relação à posição no leito, as amostras semeadas no meio de cultivo com manitol mostraram que não houve redução significativa na posição inferior do leito (p>0,05). Os resultados apontam e alertam para falhas no procedimento de limpeza e desinfecção dos leitos hospitalares por nós estudados.

Seleção de microalgas com potencial de produção de biocombustíveis

Dissertação de mestrado em Bioengenharia

Controle microbiológico em valvas cardíacas humanas

OBJETIVO: Avaliar, sob o aspecto microbiológico, valvas processadas pelo Banco de Valvas Cardíacas Humanas da Irmandade da Santa Casa de Misericórdia de Curitiba, para serem utilizadas em cirurgias cardiovasculares. MÉTODOS: Foi avaliado o processamento de 1.671 valvas, no período de junho de 1999 a junho de 2004. Das valvas e soluções envolvidas no processo foram coletadas amostras e semeadas nos meios de cultura: meio líquido tioglicolato, caldo soja tripticaseína e caldo Sabouraud, com quatorze dias de incubação, utilizando a metodologia modificada baseada na Farmacopéia Brasileira 1998 e USP 1990 (United States Pharmacopeia). Nas amostras que apresentaram crescimento foram realizadas as identificações microbianas. RESULTADOS: Em um total de 1.671 amostras analisadas, 92% foram consideradas próprias para utilização, sob o aspecto microbiológico, uma vez que não apresentaram contaminação microbiana. Somente 8% não foram liberadas para uso clínico por motivo de contaminação em alguma etapa do processamento da valva. CONCLUSÃO: Analisando os resultados, observou-se a importância do controle microbiológico em enxertos humanos, evitando a utilização de valvas com contaminação microbiológica em pacientes submetidos à cirurgia cardiovascular.

Glomevella cingulata (Stonem.) spauld. et v. schrenk. F. SP. phaseoli N.F., fase ascógena do agente causal da antracnose do feijoeiro

O presente trabalho versa sobre a obtenção da fase perfeita de Colletotriohum lindemuthianum (Sacc. et Magn.) Scrib., dirimindo duvidas quanto a sua existência, suscitada pelo primeiro relato feito por SHEAR e WOOD (1913). Após ter encontrado duas linhagens heterotálicas que formaram ascosporos em acasalamentos, os autores estudaram alguns fatores ambientais que favorecem a reprodução sexuada, chegando-se as seguintes conclusões: peritecios se formaram sobre varios meios de cultura semi-sintéticos em cuja composição entram glucose, Ca(N0(3))2.4H(2)0(, MgSO4.7H2O e KH2PO4, agar e água; a quantidade de glucose deve ser igual ou maior do que 4g/l, a de Ca(NO3)2.4H2O de 0,15 a 0,60 g/l e a relação C/N deve estar entre 29,8 a 89,6:1; a adição de vitaminas alterou levemente o nível de aproveitamento de Ca(NO3)2.4H2O, nao havendo boa produção de peritécio ao nível de 0,15 g/l mas permitindo-se ate o nível de 1 g/l, mantendo-se as relações C/N mais ou menos no mesmo nivel; a luz, nos estágios final ou inicial ou em períodos alternados acima de 8 horas, inibiu a formação de ascosporos, sendo, portanto, essencial a escuridão contínua; peritécios se formaram sob condições de pH variável de 4,0 a 6,0; peritécios ejetam ascosporos em condições de alta umidade; a temperatura em que foram obtidos os peritécios foi sempre de 209C. Do acasalamento de linhagens conidiais de C.lindemuthianum o autor obteve resultados a priori comparáveis aos de trabalhos genéticos feitos com G.cingulata, chegando-se a conclusão de que as linhagens usadas sao heterotãlicas possivelmente condicionadas por varios fatores genéticos. Isolamentos ascospóricos foram inoculados, sendo todos patogênicos ao feijoeiro, pelo menos para a variedade Michelite. Comparando morfológicamente a fase ascogena de C.lindemuthvanwn com G.cvngulata, o autor propõe o nome de Glomerelia cingulata (Stonem.) Spauld et v. Schrenk f.phaseoli n.f.

O grupo pullorum-gallinarum em provas bacteriologicas comparativas

Foram examinadas 38 amostras de germens do grupo pullorumgallinarum, de origem européa, americana ou isoladas no Brasil, acompanhadas bacteriologicamente durante 3 annos, na fixidez de suas propriedades ou na possibilidade de sua transformação dum typo em outro. a) Distinguiram-se no estudo das propriedades cinco typos de germens no grupo pullorumgallinarum - 1) pullorum gazogeno, 2) pullorum não gazogeno, 3) intermedius, 4) gallinarum ou intermedius? gazogeno, 5) gallinarum não gazogeno. Os 2 primeiros e o 5º já bem cinhecidos e acceitos; o 4º admittido por Beck & Eber, em 1929, o 3º evidenciado por nós em 1935. b) O typo gallinarum gazogeno deve ser mais propriamente talvez considerado como typo intermedius gazogeno a vista de sua acção sobre sorbita e a xylose e sobre o meio de Jordan. c) O quadro final resume as caracteristicas mais importantes destes cinco typos, baseando-se a differenciação principalmente na alteração do vermelho neutro, na produção de H²S, na fermentação de glycerina, rhamnose, xylose, dulcita, sorbita e maltose, na acção sobre o tartaro, na producção de gaz e no aspecto das colonias na superficie de certos meios de cultura. d) Outras propriedades biologicas examinadas - acção sobre o leite, sôro de leite, dextrina, etc, admitidos por varios pesquizadores na differenciação, parecem distituidas de valor. e) As amostras mantiveram fixas as suas propriedades durante todo o tempo em que foram acompanhadas. A hypothese de uma possivel transformação de um typo em outro não foi confirmada em nenhuma das amostras estudadas, justificando a entidade dos varios typos admittidos. f) Discrepancias observadas na fermentação da maltose, referidas por varios pesquizadores com germens desse grupo, não foram confirmadas no presente trabalho. g) Encontrou-se no sôro sanguineo um factor capaz de transformar a maltose em glycose, tornando aquelle assucar fermentescivel. Essa substancia é thermo-estavel e resiste á acção de substancias antidiastasicas. h) A analyse sôrologica das amostras estudadas não permittiu differenciar os typos entre si.

Solubilização de fostatos por microrganismos na presença de fontes de carbono

O potencial de solubilização de fosfatos por bactérias e fungos cultivados em meio de cultura GEL (Glicose-Extrato de Levedura), suplementado com diferentes formas de fosfatos (cálcio, alumínio e ferro) e fontes de carbono (celulose, amido, sacarose, glicose, frutose e xilose), foi avaliado em laboratório. O crescimento, o diâmetro da área solubilizada e a relação halo/colônia variaram conforme o tipo de microrganismo e a fonte de fósforo e de carbono. Dos 57 isolados utilizados, 56 formaram halo na presença de fosfato de cálcio e cinco apenas na presença de fosfato de alumínio e nenhum foi capaz de solubilizar fosfato de ferro. Contudo, seis isolados cresceram melhor no meio com fosfato de ferro em comparação com o meio testemunha. As maiores colônias e halos foram observados nos isolados de Rhizopus e Aspergillus, enquanto as maiores relações halo/colônia foram encontradas em Paecilomyces e Penicillium. Todos os isolados cresceram no meio GEL base (testemunha sem açúcar), mas a solubilização ocorreu apenas na presença de carbono adicionado ao meio, destacando-se xilose, glicose, frutose e sacarose.

Densidade e diversidade fenotípica de bactérias diazotróficas endofíticas em solos de mineração de bauxita, em reabilitação

Bactérias diazotróficas endofíticas contribuem para o desenvolvimento das plantas por meio da fixação biológica do nitrogênio, produção e liberação de substâncias reguladoras do crescimento vegetal, podendo, assim, facilitar a revegetação de solos degradados por atividades antrópicas. No entanto, pouco se conhece sobre as populações destas bactérias em solos ou plantas de áreas de mineração. Objetivando avaliar o efeito de diferentes tipos de vegetação e tempo de reabilitação de áreas degradadas por mineração de bauxita na densidade e diversidade de algumas espécies de bactérias diazotróficas endofíticas, realizaram-se, em duas épocas, amostragens de solo, de dois ambientes distintos, submetidos a diferentes processos de reabilitação. A densidade, avaliada pelo número mais provável, utilizando os meios de cultura: NFb, JNFb e Fam, para Azospirillum brasilense e A. lipoferum, Herbaspirillum spp. e A. amazonense, respectivamente, variou de 0 a 2,0 x 10(4) bactérias por grama de solo e mostrou que o tipo de vegetação influiu nas populações destas bactérias. Foram encontradas densidades maiores em solos revegetados com gramíneas: braquiária (Brachiaria decumbens), capim-azevém (Lolium multiflorum) e capim-gordura (Melinis minutiflora). Contudo, estas densidades podem ser consideradas baixas, se comparadas às de solos agrícolas, e não apresentaram relação com o tempo de reabilitação da área. Foram encontrados 36 fenótipos culturais em meio batata, entre os 72 isolados obtidos dos três meios de cultura utilizados. A partir destes, foram formados sete grandes grupos com similaridade superior ou igual a 63 %, dos quais cinco, representando 62,5 % do total de isolados obtidos, continham as estirpes-tipo de Burkholderia brasilensis, Herbaspirillum seropedicae e Azospirillum spp. (A. brasilense, A. amazonense, A. lipoferum, A. irakense). Apesar da baixa densidade, este grupo de bactérias apresentou alta diversidade fenotípica no ambiente estudado.

Densidade e diversidade fenotípica de bactérias diazotróficas não simbióticas em solos da Reserva Biológica Serra dos Toledos, Itajubá (MG)

Bactérias diazotróficas não simbióticas (BDNS) atuam no desenvolvimento das plantas por meio da fixação biológica de nitrogênio e também pela produção e liberação de substâncias reguladoras do crescimento vegetal. Este estudo objetivou avaliar a densidade e diversidade fenotípica desse grupo de bactérias em fragmentos de solo da Reserva Biológica Serra dos Toledos e entorno, em Itajubá/MG. Essa reserva localiza-se na Área de Proteção Ambiental da Mantiqueira, constituindo-se em uma importante área de recarga e de abrigo à flora e fauna endêmicas. Amostras de solo superficial foram coletadas em áreas com diferentes declividades na reserva, em épocas representativas das estações de inverno (setembro/2006) e verão (abril/2007). A densidade, avaliada pelo número mais provável, utilizando os meios de cultura NFb, JNFb e Fam, para Azospirillum spp., Herbaspirillum spp. e A. amazonense, respectivamente, variou de 0,12 a 75,60 (NMP x 10(5)) bactérias g-1 solo seco. Foram obtidos 172 e 174 isolados, respectivamente para as amostras de inverno e verão, dos quais 30 e 55 % apresentaram similaridade igual ou superior a 70 % com as estirpes-tipo Azospirillum brasilense, A. amazonense, A. lipoferum, Herbaspirillum seropedicae e Burkholderia brasilensis. O resultado do comportamento dos isolados com base na tolerância à salinidade nem sempre foi semelhante ao obtido pelas características fenotípicas culturais a 70 % de similaridade, sendo indicado para estudos complementares de diversidade desses organismos. As BDNS apresentam potencial de utilização em estudos de avaliação da qualidade e sustentabilidade de ecossistemas. No entanto, apesar da alta densidade e diversidade fenotípica em solos da reserva, maiores valores foram obtidos no entorno, evidenciando o efeito positivo da cobertura vegetal do tipo gramíneas sobre elas, independentemente da variação climática.

Avaliação da interação micorrízica em cultivares de oliveira (Olea europea L.)

A maioria dos estudos com oliveira no Brasil e no mundo tem sido direcionada à produção e ao manejo. Apesar da importância para o crescimento vegetal e resistência a estresses diversos, não há estudos sobre a ocorrência de associação micorrízica em oliveira, no Brasil. O objetivo do presente trabalho foi avaliar a interação micorrízica em cultivares de oliveira na Fazenda Experimental de Maria da Fé - MG (FEMF - EPAMIG), a qual serve como ponto de partida na produção de inoculantes comerciais de fungos micorrízicos arbusculares para a cultura. Amostras de solo e de raízes de sete cultivares de oliveira foram coletadas para determinação do comprimento de micélio extrarradicular ativo e total e avaliação da percentagem e intensidade de colonização micorrízica, bem como da densidade e diversidade de esporos. Nas rizosferas das cultivares de oliveira, foram isoladas nove espécies de fungos micorrízicos: Acaulospora denticulata, Acaulospora scrobiculata, Acaulospora sp1, Acaulospora sp2, Entrophospora sp1, Gigaspora sp1, Glomus mosseae, Scutellospora pellucida e Scutellospora sp1. Os resultados comprovaram o micotrofismo da espécie. No entanto, não houve efeito das cultivares na distribuição dos propágulos de FMAs, os quais estiveram homogeneamente distribuídos nas diferentes rizosferas.