Identification, purification, and molecular cloning of autonomously replicating sequence-binding protein 1 from fission yeast Schizosaccharomyces pombe.

Autonomously replicating sequence (ARS) elements of the fission yeast Schizosaccharomyces pombe contain multiple imperfect copies of the consensus sequence reported by Maundrell et al. [Maundrell K., Hutchison, A. & Shall, S. (1988) EMBO J. 7, 2203-2209]. When cell free extracts of S. pombe were incubated with a dimer or tetramer of an oligonucleotide containing the ARS consensus sequence, several complexes were detected using a gel mobility-shift assay. The proteins forming these complexes also bind ars3002, which is the most active origin in the ura4 region of chromosome III of S. pombe. One protein, partly responsible for the binding activity observed with crude extracts, was purified to near homogeneity. It is a 60-kDa protein and was named ARS-binding protein 1 (Abp1). Abp1 preferentially binds to multiple sites in ARS 3002 and to the DNA polymer poly[d(A.T)]. The cloning and sequence of the gene coding for Abp1 revealed that it encodes a protein of 59.8 kDa (522 amino acids). Abp1 has significant homology (25% identity, 50% similarity) to the N-terminal region (approximately 300 amino acids) of the human and mouse centromere DNA-binding protein CENP-B. Because centromeres of S. pombe contain a high density of ARS elements, Abp1 may play a role connecting DNA replication and chromosome segregation.

Characterization of the wild-type form of 4a-carbinolamine dehydratase and two naturally occurring mutants associated with hyperphenylalaninemia.

The characterization of 4a-carbinolamine dehydratase with the enzymatically synthesized natural substrate revealed non-Michaelis-Menten kinetics. A Hill coefficient of 1.8 indicates that the dehydratase exists as a multisubunit enzyme that shows cooperativity. A mild form of hyperphenylalaninemia with high 7-biopterin levels has been linked to mutations in the human 4a-carbinolamine dehydratase gene. We have now cloned and expressed two mutant forms of the protein based on a patient's DNA sequences. The kinetic parameters of the mutant C82R reveal a 60% decrease in Vmax but no change in Km (approximately 5 microM), suggesting that the cysteine residue is not involved in substrate binding. Its replacement by arginine possibly causes a conformational change in the active center. Like the wild-type enzyme, this mutant is heat stable and forms a tetramer. The susceptibility to proteolysis of C82R, however, is markedly increased in vitro compared with the wild-type protein. We have also observed a decrease in the expression levels of C82R protein in transfected mammalian cells, which could be due to proteolytic instability. The 18-amino acid-truncated mutant GLu-87--> termination could not be completely purified and characterized due to minute levels of expression and its extremely low solubility as a fusion protein. No dehydratase activity was detected in crude extracts from transformed bacteria or transfected mammalian cells. Considering the decrease in specific activity and stability of the mutants, we conclude that the patient probably has less than 10% residual dehydratase activity, which could be responsible for the mild hyperphenylalaninemia and the high 7-biopterin levels.

Reversible phosphorylation controls the activity of cyclosome-associated cyclin-ubiquitin ligase.

Cyclin B/cdc2 is responsible both for driving cells into mitosis and for activating the ubiquitin-dependent degradation of mitotic cyclins near the end of mitosis, an event required for the completion of mitosis and entry into interphase of the next cell cycle. Previous work with cell-free extracts of rapidly dividing clam embryos has identified two specific components required for the ubiquitination of mitotic cyclins: E2-C, a cyclin-selective ubiquitin carrier protein that is constitutively active during the cell cycle, and E3-C, a cyclin-selective ubiquitin ligase that purifies as part of a approximately 1500-kDa complex, termed the cyclosome, and which is active only near the end of mitosis. Here, we have separated the cyclosome from its ultimate upstream activator, cdc2. The mitotic, active form of the cyclosome can be inactivated by incubation with a partially purified, endogenous okadaic acid-sensitive phosphatase; addition of cdc2 restores activity to the cyclosome after a lag that reproduces that seen previously in intact cells and in crude extracts. These results demonstrate that activity of cyclin-ubiquitin ligase is controlled by reversible phosphorylation of the cyclosome complex.

Análise química e atividades biológicas de Guatteria elliptica R. E. Fries (Annonaceae)

A espécie endêmica G. elliptica R. E. Fries não apresentava estudos fitoquímicos e biológicos detalhados na literatura. Assim, o objetivo desse trabalho foi avaliar a composição química e as propriedades biológicas dos óleos essenciais, extratos brutos, alcaloides totais, tortas, frações das tortas, amostras isoladas dessa espécie. O material vegetal foi coletado em Paranapiacaba (Santo André, SP, Brasil). O óleo essencial extraído das folhas por destilação à vapor apresentou um rendimento de 0,2%. A análise histológica das folhas encontrou óleo em células oleíferas localizadas no parênquima esponjoso. A composição do óleo (CG-EM) indicou espatulenol e óxido de cariofileno como compostos majoritários. Os alcaloides totais foram obtidos dos extratos brutos das folhas e dos galhos e analisados por CG-EM, identificando quatro aporfinas (nornuciferina, estefarina, corituberina e asimilobina) e duas protoberberinas (discretamina e caseadina). Os alcaloides totais foram fracionados em coluna cromatográfica ou por Extração em Fase Sólida e purificados por cromatografia em camada preparativa, originando duas amostras (Amostra 9 e 10). Na Amostra 9, foram identificados dois alcaloides aporfinicos nornuciferina e asimilobina (CG-EM e RMN-1H). Na Amostra 10, foram identificados (LC-EM/EM) cinco alcaloides aporfínicos (desidronantenina, glaunidina, liriodenina, N-óxido de oliverina e telikovina) e um alcaloide protoberberínico (caseadina). Caseadina, glaunidina, N-óxido de oliverina e telikovina não foram previamente identificados em Guatteria. Os resíduos dos extratos brutos livres de alcaloides foram fracionados pelo método de partição com solventes de polaridade crescente. Os extratos brutos e as frações acetato de etila e butanólicas de folhas e galhos apresentaram flavonoides (NP-PEG). Nos ensaios biológicos, a melhor atividade antioxidante (sequestro do radical DPPH) foi encontrada para a fração clorofórmica dos galhos (EC50=24,25±1,14 µg/mL) e a torta dos galhos (EC50=26,23±4,20 µg/mL). No ensaio antimicrobiano pelo método turbidimétrico a atividade mais importante foi obtida contra Staphylococcus aureus (ATCC 6538) para os alcaloides totais dos galhos (CIM/CBM=0,12±0,01/0,26 mg/mL) e das folhas (CIM/CBM=0,21±0,01/0,28 mg/mL), e fração hexânica das folhas (CIM/CBM=0,24±0,02/>1 mg/mL). Uma alta atividade antitumoral foi observada frente a células humanas de mama (MCF-7) para Amostra 10 (IC50=2,28±0,18 µg/mL), fração de acetato de etila das folhas (IC50=4,47±0,40 µg/mL), óleo essencial (IC50=7,01±0,23 µg/mL) e os alcaloides totais das folhas (IC50=9,32±0,36 µg/mL). Para as células de próstata (PC-3), foi encontrada atividade para a Amostra 10 (IC50=1,37±0,36 µg/mL) e o óleo essencial (IC50=5,32±0,35 µg/mL). A futura aplicação dos extratos e frações de G. elliptica como um agente antitumoral parece ser segura, pois mantiveram uma viabilidade celular maior do que 90% no ensaio de citotoxicidade com culturas de fibroblasto murino (BALB/c 3T3, ATCC CCL-163) nas concentrações onde a atividade antitumoral foi promissora (<30 µg/mL) contra MCF-7 e/ou PC-3.

Compostos fenólicos de resíduos agroindustriais: identificação, propriedades biológicas e aplicação em matriz alimentar de base lipídica

A geração de resíduos sólidos pelas atividades agroindustriais tem criado a demanda por um reaproveitamento tecnológico desses materiais. Assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar o potencial bioativo e tecnológico de resíduos agroindustriais, como fontes naturais de compostos fenólicos com atividade antioxidante. Foram analisados resíduos agroindustriais vinícolas, de indústrias produtoras de polpas congeladas de frutas (açaí, cajá, cupuaçu e graviola) e provenientes do beneficiamento de café e de laranja. Inicialmente, foi realizado um estudo para a determinação das condições ótimas de extração, empregando planejamento experimental multivariado com delineamento composto central rotacional, cujos resultados foram avaliados empregando a técnica de superfície de resposta. Na sequência, foram feitos a triagem dos resíduos, baseada na atividade antioxidante, e a caracterização fenólica dos extratos hidroalcoólicos obtidos dos resíduos agroindustriais. De acordo com os resultados de atividade antioxidante, engaço de uva da variedade Chenin Blanc (EC) e semente de açaí (SA) foram os resíduos selecionados, os quais seguiram para as etapas de concentração e fracionamento bioguiado de sua(s) molécula(s) bioativa(s), as quais foram posteriormente identificadas por UHPLC-ESI-LTQ-MS. Extratos brutos e concentrados foram avaliados in vitro quanto à capacidade de desativação de espécies reativas de oxigênio (radicais peroxila, ânion superóxido e ácido hipocloroso) e então, aplicados em óleo de soja, emulsão e suspensão de lipossomos, a fim de se avaliar a efetividade desses extratos como antioxidante natural em matrizes lipídicas. Concentrações intermediárias de etanol (40-60%) e alta temperatura (96°C), exceto para semente de açaí (25°C), foram as condições ótimas para a extração de antioxidantes dos resíduos agroindustriais. Epicatequina, ácido gálico, catequina e procianidina B1 foram os compostos de maior ocorrência, quando avaliados pela técnica de HPLC-DAD. O EC apresentou a maior atividade antioxidante global e SA a maior atividade entre os resíduos de polpas de frutas, laranja e café. A concentração dos extratos brutos de EC e SA, pela resina Amberlite XAD®-2, produziu aumento significativo da atividade antioxidante. Além disso, extratos brutos e concentrados apresentaram atividade antiproliferativa e anti-inflamatória. Os extratos concentrados foram fracionados por meio de Sephadex LH-20, a partir da qual foi possível identificar quatro frações de maior bioatividade para o EC e três para o SA. Procianidina B1, catequina, epicatequina e resveratrol foram identificados no extrato concentrado e frações de EC. Dezoito procianidinas poliméricas, catequina, epicatequina foram os principais compostos identificados em SA, por meio de UHPLC-ESI-LTQ-MS. Resveratrol também foi encontrado em SA pela primeira vez. Quando avaliados em óleo de soja, EC e SA demonstraram atividade pro-oxidante. Contudo, elevada atividade antioxidante foi verificada quando essas amostras foram aplicadas em sistemas lipídicos coloidais, pois retardaram o consumo de oxigênio em uma emulsão óleo/água e o período de indução na produção de dienos conjugados em uma suspensão de lipossomos. Portanto, os resíduos agroindustriais EC e SA possuem potencial tecnológico de reaproveitamento industrial podendo ser considerados possíveis matérias-primas para a obtenção de extratos ricos em antioxidantes ou pela extração de antioxidantes naturais de uso pelas indústrias farmacêutica e/ou de alimentos.

Chemical deterrence of a marine cyanobacterium against sympatric and non-sympatric consumers

This study investigates the influence of mesograzer prior exposure to toxic metabolites on palatability of the marine cyanobacterium, Lyngbya majuscula. We examined the palatability of L. majuscula crude extract obtained from a bloom in Moreton Bay, South East Queensland, Australia, containing lyngbyatoxin-a (LTA) and debromoaplysiatoxin (DAT), to two groups: (1) mesograzers of L. majuscula from Guam where LTA and DAT production is rare; and (2) macro- and mesograzers found feeding on L. majuscula blooms in Moreton Bay where LTA and DAT are often prevalent secondary metabolites. Pair-wise feeding assays using artificial diets consisting of Ulva clathrata suspended in agar (control) or coated with Moreton Bay L. majuscula crude extracts (treatment) were used to determine palatability to a variety of consumers. In Guam, the amphipods, Parhyale hawaiensis and Cymadusa imbroglio; the majid crab Menaethius monoceros; and the urchin Echinometra mathaei were significantly deterred by the Moreton Bay crude extract. The sea hares, Stylocheilus striatus, from Guam were stimulated to feed by treatment food whereas S. striatus collected from Moreton Bay showed no discrimination between food types. In Moreton Bay, the cephalaspidean Diniatys dentifer and wild caught rabbitfish Siganus fuscescens were significantly deterred by the crude extract. However, captive-bred S. fuscescens with no known experience with L. majuscula did not clearly discriminate between food choices. Lyngbya majuscula crude extract deters feeding by most mesograzers regardless of prior contact or association with blooms.

Identification and evaluation of agents isolated from traditionally used herbs against Ophiophagus hannah venom

The aim of this study was firstly to identify active molecules in herbs, that are traditionally used for the treatment of snake bite, such as Curcuma antinaia, Curcuma contravenenum, Andrographis paniculata, and Tanacetum parthenium; secondly to test similar structurally related molecules and finally to prepare and evaluate an efficient formulation against Ophiophagus hannah venom intoxification. Three labdane based compounds, including labdane dialdehyde, labdane lactone, and labdane trialdehyde and two lactones including 14-deoxy-11,12-didehydroandrographolide and parthenolide were isolated by column chromatography and characterised. Using the isolated rat phrenic nerve-hemidiaphragm preparation, the antagonistic effect of crude extracts, isolated compounds and prepared formulations were measured in vitro on the inhibition of the neuromuscular transmission. Inhibition on muscle contraction, produced by the 5 μg/mL venom, was reversed by test agents in organ bath preparations. A labdane trialdehyde, isolated from C. contravenenum, was identified as the best antagonising agent in the low micromolar range. Tests on formulations of the most potent C. contravenenum extract showed, that the suppository with witepsol H15 was an effective medicine against O. hannah venom. This study elucidated the active compounds, accounting for the antivenin activity of traditionally used herbs and suggested the most suitable formulation, which may help to develop potent medicines for the treatment of snake bite in the future.

Biological activities of compounds from Piper species

It is well established that secondary metabolites play an important role in plant chemical defense. In an effort to find natural herbicides research on plant growth regulatory activity of secondary metabolites has received more and more attention recently. The genus Piper has been an important source for useful secondary metabolites.^ Crude extracts from Piper species inhibited gram-positive bacteria and higher plant growth under laboratory conditions. Bioassay-guided isolation and purification lead to the identification of safrole, a phenylpropene, as the responsible agent for the inhibitory activity. Safrole was found to leach from naturally fallen leaves with water. Mechanisms of plant growth inhibition by safrole were investigated. Disassociation of cell membrane from cell walls was determined to be a major cause.^ Phenylpropenes structurally similar to safrole had similar phytogrowth inhibitory activity. It is postulated that phenylpropanoids are an important group of naturally occurring secondary metabolites in plant-plant interactions. ^

An ethnopharmacological approach to multidrug -resistant Staphylococcus aureus: Evaluation of Italian plants used in the traditional healing of skin disease

One-third of botanical remedies from southern Italy are used to treat skin and soft tissue infections (SST's). Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA), a common cause of SSTIs, is responsible for increased morbidity and mortality from infections. Therapeutic options are limited by antibiotic resistance. Many plants possess potent antimicrobial compounds for these disorders. Validation of traditional medical practices is important for the people who rely on medicinal plants. Moreover, identification of novel antibiotics and anti-pathogenic agents for MRSA is important to global healthcare.^ I took an ethnopharmacological approach to understand how Italian medicinal plants used for the treatment of SSTIs affect MRSA growth and virulence. My hypothesis was that plants used in folk remedies for SSTI would exhibit lower cytotoxicity and greater inhibition of bacterial growth, biofilm formation and toxin production in MRSA than plants used for remedies unrelated to the skin or for plants with no ethnomedical application. The field portion of my research was conducted in the Vulture-Alto Bradano area of southern Italy. I collected 104 plant species and created 168 crude extracts. In the lab, I screened samples for activity against MRSA in a battery of bioassays. Growth inhibition was analyzed using broth microtiter assays for determination of the minimum inhibitory concentration. Interference with quorum-sensing (QS) processes, which mediate pathogenicity, was quantified through RP-HPLC of δ-toxin production. Interference with biofilm formation and adherence was assessed using staining methods. The mammalian cytotoxicity of natural products was analyzed using MTT cell proliferation assay techniques.^ Although bacteriostatic activity was limited, extracts from six plants used in Italian folk medicine (Arundo donax, Ballota nigra, Juglans regia, Leopoldia comosa, Marrubium vulgare, and Rubus ulmifolius ) significantly inhibited biofilm formation and adherence. Moreover, plants used to treat SSTI demonstrated significantly greater anti-biofilm activity when compared to plants with no ethnomedical application. QSI activity was evident in 90% of the extracts tested and extracts from four plants ( Ballota nigra, Castanea saliva, Rosmarinus officinalis, and Sambucus ebulus) exhibited a significant dose-dependent response. Some of the plant remedies for SSTI identified in this study can be validated due to anti-MRSA activity.^

Purificação, modelagem e simulação da adsorção de bioprodutos por troca iônica em coluna de leito expandido

A produção de proteínas através de microrganismos tornou-se uma técnica muito importante na obtenção de compostos de interesse da indústria farmacêutica e alimentícia. Extratos brutos nos quais as proteínas são obtidas são geralmente complexos, contendo sólidos e células em suspensão. Usualmente, para uso industrial destes compostos, é necessário obtê-los puros, para garantir a sua atuação sem interferência. Um método que vem recebendo destaque especialmente nos últimos 10 anos é o uso da cromatografia de troca iônica em leito expandido, que combina em uma única etapa os passos de clarificação, concentração e purificação da molécula alvo, reduzindo assim o tempo de operação e também os custos com equipamentos para realização de cada etapa em separado. Combinado a este fato, a última década também é marcada por trabalhos que tratam da modelagem matemática do processo de adsorção de proteínas em resinas. Está técnica, além de fornecer informações importantes sobre o processo de adsorção, também é de grande valia na otimização da etapa de adsorção, uma vez que permite que simulações sejam feitas, sem a necessidade de gasto de tempo e material com experimentos em bancada, especialmente se é desejado uma ampliação de escala. Dessa forma, o objetivo desta tese foi realizar a modelagem e simulação do processo de adsorção de bioprodutos em um caldo bruto na presença de células, usando inulinase e C-ficocianina como objeto de estudo e purificar C-ficocianina utilizando resina de troca iônica em leito expandido. A presente tese foi então dividida em quatro artigos. O primeiro artigo teve como objeto de estudo a enzima inulinase, e a otimização da etapa de adsorção desta enzima em resina de troca iônica Streamline SP, em leito expandido, foi feita através da modelagem matemática e simulação das curvas de ruptura em três diferentes graus de expansão (GE). As máximas eficiências foram observadas quando utilizadas maiores concentrações de inulinase (120 a 170 U/mL), e altura de leito entre 20 e 30 cm. O grau de expansão de 3,0 vezes foi considerado o melhor, uma vez que a produtividade foi consideravelmente superior. O segundo artigo apresenta o estudo das condições de adsorção de C-ficocianina em resina de troca iônica, onde foi verificado o efeito do pH e temperatura na adsorção e após construída a isoterma de adsorção. A isoterma de adsorção da C-ficocianina em resina Streamline Q XL feita em pH 7,5 e a 25°C (ambiente), apresentou um bom ajuste ao modelo de Langmuir (R=0,98) e os valores qm (capacidade máxima de adsorção) e Kd (constante de equilíbrio) estimados pela equação linearizada da isoterma, foram de 26,7 mg/mL e 0,067mg/mL. O terceiro artigo aborda a modelagem do processo de adsorção de extrato não clarificado de C-ficocianina em resina de troca iônica Streamline Q XL em coluna de leito expandido. Três curvas de ruptura foram feitas em diferentes graus de expansão (2,0, 2,5 e 3,0). A condição de adsorção de extrato bruto não clarificado de C-ficocianina que se mostrou mais vantajosa, por apresentar maior capacidade de adsorção, é quando se alimenta o extrato até atingir 10% de saturação da resina, em grau de expansão 2,0, com uma altura inicial de leito de 30 cm. O último artigo originado nesta tese foi sobre a purificação de C-ficocianina através da cromatografia de troca iônica em leito expandido. Uma vez que a adsorção já havia sido estudada no artigo 2, o artigo 4 enfoca na otimização das condições de eluição, visando obter um produto com máxima pureza e recuperação. A pureza é dada pela razão entre a absorbância a 620 nm pela absorbância a 280 nm, e dizse que quando C-ficocianina apresenta pureza superior a 0,7 ela pode ser usada em como corante em alimentos. A avaliação das curvas de contorno indicou que a faixa de trabalho deve ser em pH ao redor de 6,5 e volumes de eluição próximos a 150 mL. Tais condições combinadas a uma etapa de pré-eluição com 0,1M de NaCl, permitiu obter C-ficocianina com pureza de 2,9, concentração 3 mg/mL, e recuperação ao redor de 70%.

Isolamento de uma quitinase extraída do cefalotórax do camarão marinho Litopenaeus schmitti (BURKENROAD, 1936) : avaliação de suas atividades antimicrobiana e larvicida

Chitinases are enzymes involved in degradation of chitin and are present in a range of organisms, including those that do not contain chitin, such as bacteria, viruses, plants and animals, and play important physiological and ecological roles. Chitin is hydrolyzed by a chitinolytic system classified as: endo-chitinases, exo-chitinases and N-acetyl-b-D-glucosaminidases. In this study a Litochitinase1 extracted from the cephalotorax of the shrimp Litopenaeus Schmitt was purified 987.32 times using ionexchange chromatography DEAE-Biogel and molecular exclusion Sephacryl S-200. These enzyme presented a molecular mass of about 28.5 kDa. The results, after kinetic assay with the Litochitinase1 using as substrate p-nitrophenyl-N-acetyl-b-Dglucosaminideo, showed apparent Km of 0.51 mM, optimal activity at pH ranging from 5.0 to 6.0, optimum temperature at 55°C and stability when pre-incubated at temperatures of 25, 37, 45, 50 and 55°C. The enzyme showed a range of stability at pH 4.0 to 5.5. HgCl2 inhibited Litochitinase1 while MgCl2 enhances its activity. Antimicrobial tests showed that Litochitinase1 present activity against gram-negative bacterium Escherichia coli in the 800 μg/mL concentration. The larvicidal activity against Aedes aegypti was investigated using crude extracts, F-III (50-80%) and Litochitinase1 at 24 and 48 hours. The results showed larvicidal activity in all these samples with EC50 values of 6.59 mg/mL for crude extract, 5.36 mg/mL for F-III and 0.71 mg/mL for Litochitinase1 at 24 hours and 3.22 and 0.49 mg/mL for the F-III and Litochitinase1 at 48 hours, respectively. Other experiments confirmed the presence of chitin in the midgut of Aedes aegypti larvae, which may be suffering the action of Litochitinase1 killing the larvae, but also the absence of contaminating proteins as serine proteinase inhibitors and lectins in the crude extract, F-III and Litochitinase1, indicating that the death of the larvae is by action of the Litochitinase1. We also observed that the enzymes extracted from intestinal homogenate of the larvae no have activity on Litochitinase1. These results indicate that the enzyme can be used as an alternative to control of infections caused by Escherichia coli and reducing the infestation of the mosquito vector of dengue.

Combinación de diferentes estrategias de aplicación de hongos entomopatógenos para el control de Spodoptera littoralis (Boisduval) (Lepidoptera: Noctuidae) y Bemisia tabaci (Gennadius) (Hemiptera:Aleyrodidae)

Los ascomicetos mitospóricos entomopatógenos, que actúan por vía tegumentaria, han sido utilizados para el control microbiano de plagas mediante distintas estrategias que permiten el contacto de sus conidios con los insectos diana. Sin embargo, se conocen nuevos aspectos sobre su función ecológica tales como su capacidad secretora de compuestos con actividad insecticida, así como su sorprendente comportamiento como endófitos, que complementan su empleo clásico y que pueden pantag ermitir el desarrollo de nuevas estrategias de control de plagas. El empleo conjunto de estos hongos y sus extractos para el control de un insecto polífago de importancia mundial Spodoptera littoralis (Boisduval) (Lepidoptera: Noctuidae) es abordado en el capítulo II, donde se pone de manifiesto la existencia de variación intra- e interespecífica en la virulencia y estrategias patogénicas de las cepas de Beauveria bassiana y Metarhizium brunneum evaluadas frente a larvas del noctuido. La aplicación conjunta de cepas con distintas estrategias patogénicas junto con sus extractos a larvas del lepidóptero tuvo efecto aditivo, y alguno antagónico, de lo que depende su empleo conjunto. Los capítulos III y IV revelan la existencia de colonización endofítica transitoria tras la aplicación foliar de suspensiones de conidios de cepas de las especies mencionadas en alfalfa, tomate y melón, así como el impacto de esta colonización sobre dos fitófagos con diferentes hábitos de alimentación, uno masticador S. littoralis y otro picador-suctor Bemisia tabaci (Gennadius) (Hemiptera: Aleyrodidae). El capítulo III muestra la contribución aditiva de la mortalidad causada por la alimentación de larvas de S. littoralis a expensas de material vegetal colonizado endofíticamente por cepas de B. bassiana y M. anisopliae con la debida al tratamiento tópico de las mismas con las suspensiones fúngicas. El origen de la mortalidad iniciada a través de la vía digestiva en larvas de este lepidóptero permanece incierto para las cepas de B. bassiana, pero podría estar asociado a la presencia en la planta de metabolitos fúngicos en las cepas de M. brunneum como denota la presencia de destruxina (dtx) A en el 11,0% de los cadáveres. El capítulo IV revela que cepas de ambas especies fúngicas pueden iniciar ciclos de infección en insectos picadores-suctores cuando se alimentan a expensas de sustrato vegetal colonizado endofíticamente, si bien, ambas especies presentan estrategias diferentes. Así, B. bassiana muestra una gran capacidad para colonizar el melón, incluso con efecto traslaminar, que causa la infección de ninfas de B. tabaci por contacto con el tegumento. Sin embargo, la mortalidad de las mismas causada por M. brunneum, de crecimiento mucho más localizado en la hoja, está relacionada una vez mas con la presencia de dtx A en el 43,0% de los cadáveres. Estos resultados deben ser considerados para la evaluación del impacto real de los tratamientos con hongos entomopatógenos, y abren nuevas vías en el control de plagas.

Estudo da imobilização das proteases aspárticas da flor de Cynara cardunculus L. Reologia da coalhada

Mestrado em Biotecnologia, Faculdade de Engenharia de Recursos Naturais, Univ. do Algarve, 2005

Plasma biochemical responses of the omnivorous crucian carp (Carassius auratus) to crude cyanobacterial extracts

Healthy crucian carp (Carassius auratus) were treated by intraperitoneal (i.p.) injection of crude cyanobacterial extracts at two doses, 50 and 200 mu g MC-LR equiv kg(-1) BW. High mortality (100%) was observed within 60 h post injection in the high-dose group. In the treated fish, activities of four plasma enzymes, alanine aminotransferase (ALT), alkaline phosphatase (ALP), aspartate aminotransferase (AST), and lactate dehydrogenase (LDH), all showed substantial increases, with both dose and time-dependent effects. These increases of enzyme activity indicate severe impairment occurred in the liver of crucian carp over time. Plasma concentrations of energy-related biomolecules including glucose (GLU), cholesterol (CHO), triglyceride (TG), and total protein (TP) showed marked changes in the high-dose group, possibly a nutritional imbalance correlated with the liver injury caused by intraperitoneal exposure to crude cyanobacterial extracts.

Analysis on Iridoid Glycosides in Crude and Processed Extracts from Cornus Officinals by Liquid Chromatography-electrospray Ionization Mass Spectrometry

The iridoid glycosides in crude and processed extracts from cornus officinals have been analyzed by high performance liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry. Samples were analyzed by a reversed-phase C18 column using a binary eluent under gradient conditions. Seven iridoid glycosides could be separated and detected. The [M-H](-) ions of iridoid glycosides in the negative ion mode were observed, which reflect their molecule mass information. An in-source collision induced dissociation (in-source CID) experiment was carried out in order to identify the structures and to measure the contents of iridoid glycosides. The epimers were discovered in the experiment for the first time, namely 7 alpha-O-ethyl-morroniside and 7 beta-O-ethylmorroniside.