Identification de facteurs nucléaires modifiant l'activité des cellules souches hématopoïétiques

Les cellules souches hématopoïétiques (CSH) sont rares, mais indispensables pour soutenir la production des cellules matures du sang, un tissu en constant renouvellement. Deux caractéristiques principales les définissent; la propriété d’auto-renouvellement (AR), ou la capacité de préserver leur identité cellulaire suivant une division, et la multipotence, ce potentiel de différentiation leur permettant de générer toutes les lignée hématopoïétiques. De par leurs attributs, les CSH sont utilisée en thérapie cellulaire dans le domaine de la transplantation. Une organisation tissulaire hiérarchique est aussi préservée dans la leucémie, ou cancer du sang, une masse tumorale hétérogène devant être maintenue par une fraction de cellules au potentiel prolifératif illimité, les cellules souches leucémiques (CSL). Les travaux présentés dans ce manuscrit visent à explorer les bases moléculaires de l’AR, encore mal définies. Certains membres de la famille des facteurs de transcription à homéodomaine HOX sont impliqués dans la régulation de l’hématopoïèse normale, et leur dérégulation peut contribuer à la transformation leucémique. En particulier, la surexpression du gène Hoxb4 dans les CSH influence leur destin cellulaire, favorisant des divisions d’auto-renouvellement et leur expansion en culture et in vivo. En général, les CSH s’épuisent rapidement lorsque maintenue hors de leur niche ex vivo. Différents facteurs interagissent avec les HOX et modulent leur liaison à l’ADN, dont la famille des protéines TALE (Three Amino acid Loop Extension), comme MEIS1 et PBX1. En utilisant une stratégie de surexpression combinée de Hoxb4 et d’un anti-sens de Pbx1 dans les CSH, générant ainsi des cellules Hoxb4hiPbx1lo, il est possible de majorer encore d’avantage leur potentiel d’AR et leur expansion in vitro. Les CSH Hoxb4hiPbx1lo demeurent fonctionnellement intactes malgré une modulation extrême de leur destin cellulaire en culture. Les niveaux d’expressions de facteurs nucléaires, seules ou en combinaison, peuvent donc s’avérer des déterminants majeurs du destin des CSH. Afin d’identifier d’autres facteurs nucléaires potentiellement impliqués dans le processus d’AR des CSH, une stratégie permettant d’évaluer simultanément plusieurs gènes candidats a été élaborée. Les progrès réalisés en termes de purification des CSH et de leur culture en micro-puits ont facilité la mise au point d’un crible en RNAi (interférence de l’ARN), mesurant l’impact fonctionnel d’une diminution des niveaux de transcrits d’un gène cible sur l’activité des CSH. Les candidats sélectionnés pour cette étude font partie du grand groupe des modificateurs de la chromatine, plus précisément la famille des histones déméthylases (HDM) contenant un domaine catalytique Jumonji. Ce choix repose sur la fonction régulatrice de plusieurs membres de complexes méthyl-transférases sur l’AR des CSH, dont l’histone méthyl-transférases MLL (Mixed Lineage Leukemia). Cette stratégie a aussi été utilisée dans le laboratoire pour étudier le rôle de facteurs d’asymétrie sur le destin des CSH, en collaboration. Ces études ont permis d’identifier à la fois des régulateurs positifs et négatifs de l’activité des CSH. Entre autre, une diminution de l’expression du gène codant pour JARID1B, une HDM de la lysine 4 de l’histone H3 (H3K4), augmente l’activité des CSH et s’accompagne d’une activation des gènes Hox. En conclusion, divers déterminants nucléaires, dont les facteurs de transcription et les modificateurs de la chromatine peuvent influencer le destin des CSH. Les mécanismes sous-jacents et l’identification d’autres modulateurs de l’AR demeurent des voies à explorer, pouvant contribuer éventuellement aux stratégies d’expansion des CSH ex vivo, et l’identification de cibles thérapeutiques contre les CSL. Mots-clés : cellules souches hématopoïétiques, Hoxb4, Pbx1, auto-renouvellement, histone déméthylases, RNAi

L’utilisation de l’échographie pulmonaire dans la prise en charge des patients de soins critiques

En démontrant sa capacité d’identifier les pneumothorax, de différencier les différentes causes d’insuffisance respiratoire chez les patients dyspnéiques et de confirmer la position d’un tube endotrachéal lors d’une intubation endotrachéale, l’échographie pulmonaire a pris une place prépondérante dans la prise en charge des patients de soins critiques. La majorité des études, notamment celles sur l’intubation endotrachéale, ont évalué la performance de cliniciens possédant une expérience considérable en échographie pulmonaire et souvent dans un cadre idéal permettant des examens d’une durée prolongée. Considérant la disponibilité grandissante de l’échographie ciblée lors des situations de stabilisation et de réanimation des patients de soins critiques, nous voulions évaluer la capacité d’un groupe de clinicien hétérogène en termes de formation échographique à identifier la présence ou l’absence de glissement pleural sur de courtes séquences (comparable à la durée probable d’un examen lors de condition de réanimation) d’échographie pulmonaire enregistrées chez des patients intubés. Un total de 280 courtes séquences (entre 4 et 7 secondes) d’échographie pulmonaire démontrant la présence ou l’absence de glissement pleural chez des patients intubés en salle d’opération ont été enregistrées puis présentées de façon aléatoire à deux groupes de cliniciens en médecine d’urgence. Le deuxième groupe avait la possibilité de s’abstenir advenant une incertitude de leur réponse. Nous avons comparé la performance selon le niveau de formation académique et échographique. Le taux moyen d’identification adéquate de la présence ou l’absence du glissement pleural par participant était de 67,5% (IC 95% : 65,7-69,4) dans le premier groupe et 73,1% (IC 95% : 70,7-75,5) dans le second (p<0,001). Le taux médian de réponse adéquate pour chacune des 280 séquences était de 74,0% (EIQ : 48,0-90,0) dans le premier groupe et 83,7% (EIQ : 53,3-96,2) dans le deuxième (p=0,006). Le taux d’identification adéquate de la présence ou absence d’un glissement pleural par les participants des deux groupes était nettement supérieur pour les séquences de l’hémithorax droit par rapport à celles de l’hémithorax gauche (p=0,001). Lorsque des médecins de formation académique et échographique variable utilisent de courtes séquences d’échographie pulmonaire (plus représentatives de l’utilisation réelle en clinique), le taux d’identification adéquate de la présence ou l’absence de glissement pleural est plus élevé lorsque les participants ont la possibilité de s’abstenir en cas de doute quant à leur réponse. Le taux de bonnes réponses est également plus élevé pour les séquences de l’hémithorax droit, probablement dû à la présence sous-jacente du cœur à gauche, la plus petite taille du poumon gauche et l’effet accru du pouls pulmonaire dans l’hémithorax gauche. Considérant ces trouvailles, la prudence est de mise lors de l’utilisation de l’identification du glissement pleural sur de courtes séquences échographique comme méthode de vérification de la position d’un tube endotrachéal lors d’une intubation endotrachéale, et ce, particulièrement pour l’hémithorax gauche. Aussi, une attention particulière devrait être mise sur la reconnaissance du pouls pulmonaire lors de l’enseignement de l’échographie pulmonaire.

Enforcing dendritic cell vaccines by manipulating the MHC II antigen presentation pathway

Les vaccins à base de cellules dendritiques (DCs) constituent une avenue très populaire en immunothérapie du cancer. Alors que ces cellules peuvent présenter des peptides exogènes ajoutés au milieu, l’efficacité de chargement de ces peptides au le complexe majeur d'histocompatibilité (CMH) de classe II est limitée. En effet, la majorité des molécules du CMH II à la surface des DCs sont très stable et l’échange de peptide spontané est minime. Confinée aux vésicules endosomales, HLA-DM (DM) retire les peptides des molécules du CMH II en plus de leur accorder une conformation réceptive au chargement de peptides. Il est possible, cependant, de muter le signal de rétention de DM de façon à ce que la protéine s’accumule en surface. Nous avons émis l’hypothèse que ce mutant de DM (DMY) sera aussi fonctionnel à la surface que dans la voie endosomale et qu’il favorisera le chargement de peptides exogènes aux DCs. Nous avons utilisé un vecteur adénoviral pour exprimer DMY dans des DCs et avons montrer que la molécule augmente le chargement de peptides. L’augmentation du chargement peptidique par DMY est autant qualitatif que quantitatif. DMY améliore la réponse T auxiliaire (Th) du coté Th1, ce qui favorise l’immunité anti-cancer. Du côté qualitatif, le chargement de peptides résulte en des complexes peptide-CMHII (pCMH) d’une conformation supérieure (conformère). Ce conformère (Type A) est le préféré pour la vaccination et DMY édite avec succès les complexes pCMH à la surface en éliminant ceux de type B, lesquels sont indésirables. La fonction de DM est régulée par HLA-DO (DO). Ce dernier inhibe l’habilité de DM à échanger le peptide CLIP (peptide dérivée de la chaîne invariante) en fonction du pH, donc dans les endosomes tardifs. Mes résultats indiquent que la surexpression de DO influence la présentation des superantigènes (SAgs) dépendants de la nature du peptide. Il est probable que DO améliore indirectement la liaison de ces SAgs au pCMH dû à l’accumulation de complexe CLIP-CMH, d’autant plus qu’il neutralise la polarisation Th2 normalement observée par CLIP. Ensemble, ces résultats indiquent que DMY est un outil intéressant pour renforcer le chargement de peptides exogènes sur les DCs et ainsi générer des vaccins efficaces. Un effet inattendu de DO sur la présentation de certains SAgs a aussi été observé. Davantage de recherche est nécessaire afin de résoudre comment DMY et DO influence la polarisation des lymphocytes T auxiliaires. Cela conduira à une meilleure compréhension de la présentation antigénique et de son étroite collaboration avec le système immunitaire.

Mécanismes d'action des antioestrogènes totaux

Le cancer du sein est le cancer qui a la plus forte fréquence au Canada. En 2012, on estime que 23 200 nouveaux cas de cancer du sein seront diagnostiqués. Deux tiers des tumeurs mammaires expriment ou surexpriment le récepteur des oestrogènes α (ERα). De même, les oestrogènes sont importants pour la croissance de ces tumeurs. La présence des récepteurs hormonaux est un critère qui détermine le choix de la thérapie; à cet égard, le ciblage des récepteurs des oestrogènes par les antioestrogènes a pour but d’inactiver ces récepteurs et diminuer leur contribution à la croissance tumorale. Les antioestrogènes sont des inhibiteurs compétitifs de ERα. Tamoxifene est le médicament le plus utilisé pour traiter les tumeurs mammaires ER+ de tous les stades, avant ou après la ménopause. Tamoxifene est antioestrogène partiel ou SERM qui a un profile mixte d’activités agonistes et antagonistes. Fulvestrant ou ICI 182, 780 est un antioestrogène de type total ou SERD dépourvu de toute activité agoniste. Ce composé est utilisé en clinique chez les femmes après la ménopause ayant des tumeurs mammaires avancées. Fulvestrant constitue, donc, une deuxième ligne thérapeutique en cas de rechute après à un traitement par Tamoxifene. Afin de comprendre le potentiel thérapeutique de Fulvestrant, il est primordial d’étudier son impact sur ERα. Actuellement, la polyubiquitination et la dégradation de ERα sont les mécanismes les plus connus pour expliquer l’inactivation de ERα par Fulvestrant. Par ailleurs, en utilisant des modèles cellulaires ER+ et ER-; nous avons montré que les antioestrogènes totaux induisent une insolubilité de ERα indépendamment de leur capacité à induire sa dégradation. L’insolubilité corrèle avec l’association de ERα avec la matrice nucléaire et avec l’inhibition de sa transactivation. L’hélice H12 du domaine de liaison du ligand joue un rôle important dans l’insolubilité et l’inactivation de ERα par les antioestrogènes totaux. Par ailleurs, les antioestrogènes totaux se distinguent par leur capacité à induire la SUMOylation de ERα par SUMO1 et SUMO2/3. La SUMOylation est rapide et précède la dégradation de ERα dans cellules ER+. À l’aide de dérivés de l’antioestrogène total ICI 164, 384, nous avons montré que la chaine latérale des antioestrogènes totaux est à la base de l’induction de la SUMOylation et de l’inactivation de ERα. De plus, la SUMOylation semble être une marque d’inhibition, car la déSUMOylation restaure une activité de ERα en présence des antioestrogènes totaux. L’hélice H12 du LBD et le domaine de liaison à l’ADN sont requis pour l’induction de la SUMOylation. La recherche de protéines impliquées dans l’inactivation et dans la SUMOylation a permis d’identifier le facteur de remodelage de la chromatine ACF dans le même complexe que ERα. De manière similaire à la SUMOylation, le recrutement de ACF est précoce et constitue une propriété spécifique des antioestrogènes totaux. D’autre part, Fulvestrant induit le recrutement de ACF au niveau du promoteur du gène cible des oestrogènes pS2, ce qui suggère une contribution du remodelage de la chromatine dans les mécanismes d’action des antioestrogènes totaux. La surexpression de la DéSUMOylase SENP1 abolit le recrutement de ACF ce qui indique un rôle de la SUMOylation dans le recrutement de ACF. De même, l’hélice H12 du LBD de ERα constitue un lien entre l’inactivation de ERα et le recrutement de ACF. L’insolubilité, la SUMOylation et l'interaction du complexe ACF sont le reflet des mécanismes d’action des antioestrogènes totaux. Ces observations peuvent être utilisées comme des critères fonctionnels pour identifier d’autres composés avec de meilleures propriétés pharmacologiques que Fulvestrant.

Localisation et fonction de CHK2 en mitose

Les centrosomes dont le rôle principal est d’organiser le cytosquelette de microtubules et le fuseau mitotique servent aussi de sites d’interaction pour plusieurs protéines régulatrices du cycle cellulaire et de la réponse aux dommages à l’ADN. Une de ces protéines est la kinase CHK2 et plusieurs publications montrent une sous-population de CHK2 localisée aux centrosomes dans les cellules en interphase et en mitose. Toutefois, la localisation de CHK2 aux centrosomes demeure controversée, car des doutes subsistent en ce qui concerne la spécificité des anticorps utilisés en immunocytochimie. En utilisant des lignées cellulaires du cancer du côlon, les cellules HCT116 sauvages et HCT116 CHK2-/- ainsi que différentes lignées d’ostéosarcome humain dans lesquelles l’expression de CHK2 a été inhibée par ARN interférence, nous montrons que les anticorps anti-CHK2 qui donnent un signal centrosomal sont non spécifiques et reconnaissent un antigène inconnu sur les centrosomes. Cependant, par des expériences d’immunofluorescence réalisées avec des cellules U2OS qui expriment les protéines de fusion GFP-CHK2 ou FLAG-CHK2, nous révélons une localisation centrosomale de CHK2 dans les cellules en mitose, mais pas en interphase. Ce résultat a été confirmé par vidéomicroscopie dans les cellules vivantes exprimant GFP-CHK2. Pour déterminer le ou les rôles potentiels de CHK2 en mitose nous avons réalisé des expériences pour explorer le rôle de CHK2 dans la progression de la mitose, la nucléation des microtubules aux centrosomes et la progression de la mitose en présence de problèmes d’attachement des chromosomes où de lésions génotoxiques. Nos données suggèrent que CHK2 n’est pas impliquée dans la régulation de la mitose dans les cellules U2OS.

Étude de la régulation des activités transcriptionnelle, réplicative et de l’instabilité de la protéine régulatrice E2 des papillomavirus

Les papillomavirus sont de petits virus à ADN double brin qui infectent les cellules de l’épithélium de la peau et des muqueuses d’une variété de vertébrés causant des lésions bénignes telles des verrues. Certains de ces virus sont également associés au développement de lésions malignes, notamment le cancer du col utérin. La protéine régulatrice E2 des papillomavirus est impliquée dans diverses fonctions contribuant à l’établissement de l’infection par ces virus. Entre autre, E2 régule la transcription des gènes viraux, participe à l’initiation de la réplication de l’ADN viral en s’associant à l’hélicase virale E1 et est responsable du maintien et de la ségrégation de l’épisome viral au cours de la division cellulaire. Toutes ces activités sont attribuables à la capacité de E2 à s’associer au génome viral et à interagir avec des protéines virales et cellulaires. De plus, ces fonctions sont elles-mêmes régulées par des modifications post-traductionnelles de la protéine E2. Plusieurs études ont été réalisées afin de découvrir les mécanismes de régulation des fonctions de E2 mais le rôle exact des différents domaines de E2 dans ces contrôles reste à être défini. En premier lieu, nous nous sommes intéressés à l’interaction entre E2 et Brd4(L) qui avait été définie comme étant essentielle à la ségrégation de l’épisome. Plusieurs caractéristiques associées à la protéine Brd4(L) telles que sa capacité à lier les lysines acétylées des histones, son interaction avec le complexe Mediator et sa participation à l’activation de la transcription en formant un complexe avec pTEFb, nous ont permis d’émettre l’hypothèse que l’interaction E2-Brd4(L) est nécessaire à l’activité transcriptionnelle de E2. Nous avons démontré que la protéine Brd4(L) interagit avec le domaine de transactivation de E2 de divers types de papillomavirus. De plus, cette interaction implique les résidus de E2 essentiels à son activité transcriptionnelle. Ainsi, ces résultats proposent que l’association E2-Brd4(L) serve à la régulation de la transcription des gènes viraux. Dans un second temps, nos recherches se sont concentrées sur l’existence d’une interface de dimérisation au sein du domaine de transactivation de E2 et de son implication dans les activités transcriptionnelles et réplicatives de la protéine. Nos études ont aussi mis en évidence que l’intégrité de la structure de ce domaine contribue au bon fonctionnement de la réplication du génome viral. Cette découverte suggère que la dimérisation de E2 peut réguler l’initiation de la réplication et propose l’existence d’un niveau de régulation additionnel impliquant l’état de la structure quaternaire de la protéine E2 et une modulation de l’interaction entre E1 et E2 à cette étape du cycle viral. Finalement, l’étude de l’instabilité de la protéine E2 nous a permis de définir une région importante dans le domaine flexible de la protéine, nécessaire à sa dégradation par le protéasome. De plus, la présence de résidus conservés localisés dans ce domaine, sont associés à la dégradation et portent la signature d’un signal de localisation nucléaire de type PY-NLS, suggérant que la stabilité de la protéine E2 est régulée par sa localisation au sein de la cellule. Ces études démontrent l’existence de nouvelles stratégies de régulation des activités transcriptionnelle et réplicative de la protéine E2 des papillomavirus. La compréhension de ces mécanismes nous permet de mieux cerner les étapes favorisant l’établissement et la progression du cycle viral et d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques contre les infections aux papillomavirus.

Sensibilité des cellules leucémiques aux immunoconjugués anti-CD33

La leucémie myéloïde aigue (LMA), cancer du sang causé par une prolifération excessive des précurseurs myéloïdes à un stade précoce de maturation, est associée à une survie variant entre 20 et 30% à cinq ans en dépit des traitements de chimiothérapie les plus intensifs. L’antigène CD33 est exprimé chez les cellules malignes dans 90% des LMA ce qui en fait une cible de choix pour le développement d’immunoconjugué (IC). Trois IC composés d’un anticorps monoclonal anti-CD33 couplé à la maytansine, une toxine s’attaquant aux fuseaux mitotiques, ont été créés. Nous avons étudié l’effet de ces IC sur des cellules primaires et des lignées cellulaires LMA et étudier les mécanismes pouvant expliquer différents niveaux de sensibilité. Les études effectuées ont permis de déterminer que le niveau d’expression du CD33 n’explique pas la variation de sensibilité face aux IC. Il a été démontré que les IC anti-CD33 sont internalisés rapidement par la cellule et que le conjugué est retrouvé au niveau de l’endosome en premier lieu. Il a été confirmé que le lysosome est essentiel à l’effet anti-mitotique induit par le conjugué. Aussi, il est proposé que la protéine SOCS3 pourrait jouer un rôle dans la résistance aux IC anti-CD33 en dirigeant le complexe IC-CD33-SOCS3 vers le protéasome et ainsi empêcher la libération du composé toxique par le lysosome. Nous avons aussi conclu que les variations d’agent de liaison et l’augmentation du nombre de molécules toxiques entre les 3 IC n’ont pas été suffisantes pour augmenter leur efficacité à éliminer les cellules LMA. L’évaluation de ces IC ainsi que l’identification des mécanismes de résistance permettra de cibler les patients les plus susceptibles de bénéficier de ce type de traitement et potentiellement d’identifier de nouvelles voies pour améliorer l’efficacité des traitements.

Étude des œstrogènes sur la repolarisation cardiaque et de la grossesse sur l’électrocardiographie chez la souris

Le tamoxifène, un modulateur sélectif des récepteurs oestrogéniques, est un médicament largement utilisé depuis plus de vingt ans pour le traitement et la prévention du cancer du sein. Plusieurs études ont rapporté que l’administration aiguë du tamoxifène pouvait réduire certains courants K+ cardiaques. Cette observation suggère que les femmes traitées de façon chronique avec le tamoxifène risquent d’avoir une prolongation de leur intervalle QT, favorisant ainsi le développement de torsades de pointes. Puisque in vivo, le tamoxifène est largement métabolisé et son effet est attribué à celui du 4hydroxy-tamoxifène (4OH-tamoxifène), nous avons d'abord vérifié si les effets du tamoxifène sur la repolarisation pouvaient être dus au 4OH-tamoxifène. À l'aide de la méthode de patch-clamp, nous avons étudié l’effet aigu du 4OH-tamoxifène sur les courants K+ présents au niveau ventriculaire chez la souris femelle. En premier lieu, nous avons démontré que les souris traitées avec le 4OH-tamoxifène présentaient une diminution des courants K+ comparativement aux souris intactes. Fait intéressant, le prétraitement des myocytes avec l’antagoniste des récepteurs oestrogéniques, le ICI 182,780, ou l’inhibiteur de la synthèse protéique, l'actinomycine D, n’a pas modifié les effets du 4OH-tamoxifène. Ces résultats suggéraient que les effets du 4OH-tamoxifène sur les courants potassiques ne soient pas liés à la transcription génomique et n’implique pas les récepteurs aux œstrogènes. Bien que l’administration aiguë du 4OH-tamoxifène diminue les courants K+ cardiaques, l’absence de troubles au niveau du rythme cardiaque chez les femmes traitées à long terme exclu la possibilité de conclure que le traitement chronique avec le tamoxifène augmente la durée de l’intervalle QT. L'accès à des souris femelles et des cobayes nous a permis de démontrer que contrairement au traitement en aigu, les courants et les canaux K+ cardiaques sont augmentés en chronique. Les oestrogènes associés à une diminution des courants K+ d’une part et nos résultats obtenus avec le tamoxifène d’autre part suggèrent qu’en bloquant les récepteurs oestrogéniques, le tamoxifène puisse prévenir les effets inhibiteurs des oestrogènes sur les courants K+. Cette association œstrogènes- tamoxifène- récepteurs oestrogéniques et courants K+ nous a encouragées à approfondir encore nos études et vérifier l’influence des hormones sexuelles féminines sur la repolarisation ventriculaire. Une troisième étude a été ainsi réalisée chez des souris femelles ovariectomisées et des souris déficientes en récepteurs oestrogéniques α ou β afin de vérifier le rôle des oestrogènes et des récepteurs oestrogéniques sur la repolarisation ventriculaire. Nos résultats ont révélé clairement que l’absence des oestrogènes entraîne une augmentation de la densité du courant K+ transitoire indépendant du Ca2+ (Ito) et de l’expression du canal Kv4.3 et ces effets sont médiés par les REα. Ces données soutiennent davantage notre conclusion que l’inhibition des récepteurs oestrogéniques est responsable de l’augmentation des courants/canaux K+ et suggèrent fortement qu’ils jouent un rôle dans la régulation de la repolarisation ventriculaire. Elles soulignent aussi l'importance de vérifier le statut hormonal des animaux utilisés pour des études touchant l'électrophysiologie cardiaque. Dans la dernière partie de cette thèse nous avons vérifié les effets de la grossesse et du système nerveux autonome sur les différents paramètres électrocardiographiques et plus particulièrement sur le rythme cardiaque chez la souris. Nos données ont montré que, comme chez la femme enceinte, la grossesse est associée à une augmentation du rythme cardiaque. De plus, l'augmentation des niveaux des hormones féminines pourrait affecter l’automatisme et l’activité électrique cardiaque. Ces différentes études ont augmenté les connaissances sur la régulation hormonale de l'électrophysiologie cardiaque et aideront aux avancements des recherches chez les femmes.

Une nouvelle approche computationnelle pour la découverte des sites de fixation de facteurs de transcription à l’ADN, adaptée aux données de ChIP-chip et de ChIP-séquençage

Les facteurs de transcription sont des protéines spécialisées qui jouent un rôle important dans différents processus biologiques tel que la différenciation, le cycle cellulaire et la tumorigenèse. Ils régulent la transcription des gènes en se fixant sur des séquences d’ADN spécifiques (éléments cis-régulateurs). L’identification de ces éléments est une étape cruciale dans la compréhension des réseaux de régulation des gènes. Avec l’avènement des technologies de séquençage à haut débit, l’identification de tout les éléments fonctionnels dans les génomes, incluant gènes et éléments cis-régulateurs a connu une avancée considérable. Alors qu’on est arrivé à estimer le nombre de gènes chez différentes espèces, l’information sur les éléments qui contrôlent et orchestrent la régulation de ces gènes est encore mal définie. Grace aux techniques de ChIP-chip et de ChIP-séquençage il est possible d’identifier toutes les régions du génome qui sont liées par un facteur de transcription d’intérêt. Plusieurs approches computationnelles ont été développées pour prédire les sites fixés par les facteurs de transcription. Ces approches sont classées en deux catégories principales: les algorithmes énumératifs et probabilistes. Toutefois, plusieurs études ont montré que ces approches génèrent des taux élevés de faux négatifs et de faux positifs ce qui rend difficile l’interprétation des résultats et par conséquent leur validation expérimentale. Dans cette thèse, nous avons ciblé deux objectifs. Le premier objectif a été de développer une nouvelle approche pour la découverte des sites de fixation des facteurs de transcription à l’ADN (SAMD-ChIP) adaptée aux données de ChIP-chip et de ChIP-séquençage. Notre approche implémente un algorithme hybride qui combine les deux stratégies énumérative et probabiliste, afin d’exploiter les performances de chacune d’entre elles. Notre approche a montré ses performances, comparée aux outils de découvertes de motifs existants sur des jeux de données simulées et des jeux de données de ChIP-chip et de ChIP-séquençage. SAMD-ChIP présente aussi l’avantage d’exploiter les propriétés de distributions des sites liés par les facteurs de transcription autour du centre des régions liées afin de limiter la prédiction aux motifs qui sont enrichis dans une fenêtre de longueur fixe autour du centre de ces régions. Les facteurs de transcription agissent rarement seuls. Ils forment souvent des complexes pour interagir avec l’ADN pour réguler leurs gènes cibles. Ces interactions impliquent des facteurs de transcription dont les sites de fixation à l’ADN sont localisés proches les uns des autres ou bien médier par des boucles de chromatine. Notre deuxième objectif a été d’exploiter la proximité spatiale des sites liés par les facteurs de transcription dans les régions de ChIP-chip et de ChIP-séquençage pour développer une approche pour la prédiction des motifs composites (motifs composés par deux sites et séparés par un espacement de taille fixe). Nous avons testé ce module pour prédire la co-localisation entre les deux demi-sites ERE qui forment le site ERE, lié par le récepteur des œstrogènes ERα. Ce module a été incorporé à notre outil de découverte de motifs SAMD-ChIP.

Étude sur les fonctions in vivo des GEFs DOCK chez les mammifères

Dock1 (aussi nommé Dock180) est le membre prototypique de la famille Dock d’activateurs des petites GTPases de la famille Rho. Dock1 agit au sein d’une voie de signalisation conservée au cours de l’évolution et des études génétiques ont démontré que les orthologues de Dock1, myoblast city (mbc) chez la drosophile et Ced-5 chez le nématode, activent Rac dans divers processus biologiques. Notamment, mbc est un important régulateur de la fusion des myoblastes lors de la formation des fibres musculaires de drosophile. Mbc est aussi essentiel à la migration collective d’un groupe de cellules, appelées cellules de bordures, lors de leur migration dans la chambre de l’oeuf suite à l’activation de récepteurs à activité tyrosine kinase (RTK). La migration collective des cellules de bordures récapitule certains des événements observés lorsque des cellules tumorales envahissent le tissu environnant lors de la formation de métastases. Chez les mammifères, des études réalisées en lignées cellulaires suggèrent que Dock1 est aussi un régulateur du cytosquelette lors de la migration cellulaire. De plus, certaines études ont démontré que la voie Dock1/Rac agit en aval de RTKs lors de l’invasion de cellules de glioblastome. Néanmoins, les fonctions in vivo de Dock1 chez les mammifères demeurent méconnues et le but de cette thèse est d’identifier et de caractériser certaines de ses fonctions. Guidés par la fonction de mbc, nous démontrons dans l’objectif no 1 un rôle essentiel pour ce gène au cours du développement embryonnaire grâce à la caractérisation d’une souris Dock1 knock-out. Des défauts sévères de fusion des myoblastes sont observés en absence de l’expression de Dock1 et ils contribuent à la réduction de la masse musculaire des souris mutantes. De plus, nous avons constaté une contribution du gène Dock5, un membre de la famille Dock proche de Dock1, au développement des fibres musculaires. Dans l’objectif no 2, nous avons observé que des hauts niveaux d’expression de DOCK1 corrèlent avec un mauvais pronostic chez les patientes atteintes de cancer du sein possédant une forte expression du gène codant pour le RTK HER2. Une surexpression ou une amplification du locus codant pour le récepteur HER2 est associée à près de 20% des cas de cancer du sein. Les cancers de ces patientes développent fréquemment des métastases et sont associés à un mauvais pronostic. Des études biochimiques ont révélé que DOCK1 interagit avec le récepteur HER2 dans des cellules de cancer du sein. De plus, DOCK1 est essentiel à l’activation de RAC et à la migration cellulaire induite par HER2 dans ces cellules. L’utilisation d’un modèle de cancer du sein médié par HER2 chez la souris combiné avec l’inactivation du gène Dock1 dans les glandes mammaires, nous a permis d’identifier Dock1 et Rac comme de nouveaux effecteurs de la croissance tumorale et de la formation de métastases régulées par l’oncogène HER2. Nous concluons que l’utilisation de différents modèles de souris knock-out pour le gène Dock1 nous a permis d’identifier des fonctions clés de ce gène. Tout comme son orthologue mbc, Dock1 joue un rôle important lors du développement embryonnaire en régulant notamment la fusion des myoblastes. Nos études ont également contribué à démontrer un important degré de conservation des mécanismes moléculaires de fusion entre les espèces. De plus, DOCK1 agit en aval du RTK HER2 et son expression dans les cellules épithéliales de glandes mammaires contribue au développement tumoral et à la formation de métastases induits par cet oncogène.

Modélisation de la diffraction des ondes de cisaillement en élastographie dynamique ultrasonore

L'élastographie ultrasonore est une technique d'imagerie émergente destinée à cartographier les paramètres mécaniques des tissus biologiques, permettant ainsi d’obtenir des informations diagnostiques additionnelles pertinentes. La méthode peut ainsi être perçue comme une extension quantitative et objective de l'examen palpatoire. Diverses techniques élastographiques ont ainsi été proposées pour l'étude d'organes tels que le foie, le sein et la prostate et. L'ensemble des méthodes proposées ont en commun une succession de trois étapes bien définies: l'excitation mécanique (statique ou dynamique) de l'organe, la mesure des déplacements induits (réponse au stimulus), puis enfin, l'étape dite d'inversion, qui permet la quantification des paramètres mécaniques, via un modèle théorique préétabli. Parallèlement à la diversification des champs d'applications accessibles à l'élastographie, de nombreux efforts sont faits afin d'améliorer la précision ainsi que la robustesse des méthodes dites d'inversion. Cette thèse regroupe un ensemble de travaux théoriques et expérimentaux destinés à la validation de nouvelles méthodes d'inversion dédiées à l'étude de milieux mécaniquement inhomogènes. Ainsi, dans le contexte du diagnostic du cancer du sein, une tumeur peut être perçue comme une hétérogénéité mécanique confinée, ou inclusion, affectant la propagation d'ondes de cisaillement (stimulus dynamique). Le premier objectif de cette thèse consiste à formuler un modèle théorique capable de prédire l'interaction des ondes de cisaillement induites avec une tumeur, dont la géométrie est modélisée par une ellipse. Après validation du modèle proposé, un problème inverse est formulé permettant la quantification des paramètres viscoélastiques de l'inclusion elliptique. Dans la continuité de cet objectif, l'approche a été étendue au cas d'une hétérogénéité mécanique tridimensionnelle et sphérique avec, comme objectifs additionnels, l'applicabilité aux mesures ultrasonores par force de radiation, mais aussi à l'estimation du comportement rhéologique de l'inclusion (i.e., la variation des paramètres mécaniques avec la fréquence d'excitation). Enfin, dans le cadre de l'étude des propriétés mécaniques du sang lors de la coagulation, une approche spécifique découlant de précédents travaux réalisés au sein de notre laboratoire est proposée. Celle-ci consiste à estimer la viscoélasticité du caillot sanguin via le phénomène de résonance mécanique, ici induit par force de radiation ultrasonore. La méthode, dénommée ARFIRE (''Acoustic Radiation Force Induced Resonance Elastography'') est appliquée à l'étude de la coagulation de sang humain complet chez des sujets sains et sa reproductibilité est évaluée.

Régulation de l’activité transcriptionnelle des récepteurs des estrogènes (ER) par le récepteur à chimiokine CXCR4 et les récepteurs à activité tyrosine kinase ErbB2 et ErbB3

La régulation de la transcription des gènes par les récepteurs des estrogènes ERα et ERβ joue un rôle important dans la croissance cellulaire et dans le développement du cancer du sein. Une augmentation de l’expression de CXCR4 et de son ligand SDF-1/CXCL12 corrèle avec un phénotype plus agressif du cancer du sein. Ici, nous démontrons un mécanisme de boucle de régulation positive entre la signalisation de CXCR4/SDF-1 et l’activité transcriptionnelle des ERs dans des cellules cancéreuses mammaires. L’activité transcriptionnelle de ER et l’expression de gènes cibles de ER, dont SDF-1 lui-même, sont augmentées dans la lignée cancéreuse mammaire MCF-7 en réponse à SDF-1. Ces effets sont bloqués par l’anti-estrogène fulvestrant et par la délétion de CXCR4. Par ailleurs, l’expression des gènes et la prolifération des cellules cancéreuses mammaires MCF-7 en réponse à l’estrogène sont altérées par l’inhibition de CXCR4. La signalisation par les facteurs de croissance joue un rôle important dans le cancer du sein. La surexpression et la dérégulation de la signalisation par le récepteur à activité tyrosine kinase ErbB2 corrèlent avec un phénotype tumoral mammaire plus agressif et un moins bon pronostic. Cependant, comment la signalisation de ErbB2 et de CXCR4 sont fonctionnellement reliées dans la régulation de la réponse de ER dans les cellules cancéreuses mammaires n’est pas connue. Nous démontrons ici que CXCR4 régule négativement l’expression protéique de ErbB2 et de son partenaire d’interaction ErbB3 ainsi que la phosphorylation de ErbB2. CXCR4 altère l’activation de la voie PI3-K/Akt par le dimère ErbB2/ErbB3 en réponse à héréguline alors qu’en présence de SDF-1, les niveaux d’activation sont récupérés. Nous avons trouvé que héréguline-β promouvoit la phosphorylation de la sérine 339 de CXCR4, un site important pour l’internalisation et la signalisation du récepteur. De plus, le recrutement de ErbB2 à CXCR4 est favorisé par ErbB3 et héréguline-β. L’activité transcriptionnelle ainsi que l’expression des gènes cibles de ER en réponse à l’héréguline sont relevées avec l’expression de CXCR4 et partiellement récupérées avec l’addition de SDF-1. Ces résultats démontrent que le recrutement de CXCR4 à ErbB2 altère la signalisation médiée par ErbB2/ErbB3 ainsi que l’activité hormonale de ER dans des cellules cancéreuses mammaires. Nous travaux ont permis d’identifier et de caractériser l’impact de la signalisation médiée par des récepteurs membranaires sur la réponse transcriptionnelle de ER dans des cellules cancéreuses mammaires. La signalisation membranaire est un facteur pouvant contribuer à la résistance aux thérapies endocriniennes et donc cibler les récepteurs impliqués s’avèrerait utile pour améliorer les traitements existants et mettre au point de nouvelles approches.

Histone H2B-R95A mutant identifies the pheromone pathway that signals cell cycle arrest during rapamycin response

La rapamycine est un immunosuppresseur utilisé pour traiter plusieurs types de maladies dont le cancer du rein. Son fonctionnement par l’inhibition de la voie de Tor mène à des changements dans des processus physiologiques, incluant le cycle cellulaire. Chez Saccharomyces cerevisiae, la rapamycine conduit à une altération rapide et globale de l’expression génique, déclenchant un remodelage de la chromatine. Nous proposons que les modifications des histones peuvent jouer un rôle crucial dans le remodelage de la chromatine en réponse à la rapamycine. Notre objectif principal est d’identifier d’une banque de mutants d’histone les variantes qui vont échouer à répondre à la rapamycine dans une tentative de réaliser une caractérisation des modifications d’histone critiques pour la réponse à cette drogue. Ainsi, nous avons réalisé un criblage d’une banque de mutants d’histone et identifié plusieurs mutants d‘histone dont la résistance à la rapamycine a été altérée. Nous avons caractérisé une de ces variantes d’histone, à savoir H2B, qui porte une substitution de l’alanine en arginine en position 95 (H2B-R95A) et démontré que ce mutant est extrêmement résistant à la rapamycine, et non à d’autres drogues. Des immunoprécipitations ont démontré que H2B-R95A est défectueux pour former un complexe avec Spt16, un facteur essentiel pour la dissociation de H2A et H2B de la chromatine, permetant la réplication et la transcription par les ADN et ARN polymérases, respectivement. Des expériences de ChIP-Chip et de micropuce ont démontré que l’arginine 95 de H2B est requise pour recruter Spt16 afin de permettre l’expression d’une multitude de gènes, dont certains font partie de la voie des phéromones. Des évidences seront présentées pour la première fois démontrant que la rapamycine peut activer la voie des phéromones et qu’une défectuosité dans cette voie cause la résistante à cette drogue.

Study of nuclear receptor dynamics by BRET

Les récepteurs nucléaires (RN) sont des facteurs de transcription ligand dépendants qui contrôlent une grande variété de processus biologiques de la physiologie humaine, ce qui a fait d'eux des cibles pharmacologiques privilégiées pour de nombreuses maladies. L'un de ces récepteurs, le récepteur de l’œstrogène alpha (ERα), peut activer la prolifération cellulaire dans certaines sections de l'épithélium mammaire tandis qu’un autre, le récepteur de l'acide rétinoïque alpha (RARα), peut provoquer un arrêt de la croissance et la différenciation cellulaire. La signalisation de ces deux récepteurs peut être altérée dans le cancer du sein, contribuant à la tumorigénèse mammaire. L’activité d’ERα peut être bloquée par les anti-oestrogènes (AE) pour inhiber la prolifération des cellules tumorales mammaires. Par contre, l’activation des voies de RARα avec des rétinoïdes dans un contexte clinique a rencontré peu de succès. Ceci pourrait résulter du manque de spécificité des ligands testés pour RARα et/ou de leur activité seulement dans certains sous-types de tumeurs mammaires. Puisque les récepteurs nucléaires forment des homo- et hétéro-dimères, nous avons cherché à développer de nouveaux essais pharmacologiques pour étudier l'activité de complexes dimériques spécifiques, leur dynamique d’association et la structure quaternaire des récepteurs des œstrogènes. Nous décrivons ici une nouvelle technique FRET, surnommée BRET avec renforcement de fluorescence par transferts combinés (BRETFect), qui permet de détecter la formation de complexes de récepteurs nucléaires ternaires. Le BRETFect peut suivre l'activation des hétérodimères ERα-ERβ et met en évidence un mécanisme allostérique d'activation que chaque récepteur exerce sur son partenaire de dimérisation. L'utilisation de BRETFect en combinaison avec le PCA nous a permis d'observer la formation de multimères d’ERα fonctionnels dans des cellules vivantes pour la première fois. La formation de multimères est favorisée par les AE induisant la dégradation du récepteur des oestrogènes, ce qui pourrait contribuer à leurs propriétés spécifiques. Ces essais de BRET apportent une nette amélioration par rapport aux tests de vecteurs rapporteur luciférase classique, en fournissant des informations spécifiques aux récepteurs en temps réel sans aucune interférence par d'autres processus tels que la transcription et de la traduction. L'utilisation de ces tests nous a permis de caractériser les propriétés de modulation de l’activité des récepteurs nucléaires d’une nouvelle classe de molécules hybrides qui peuvent à la fois lier ERa ou RAR et inhiber les HDACs, conduisant au développement de nouvelles molécules prometteuses bifonctionnelles telles que la molécule hybride RAR-agoniste/HDACi TTNN-HA.

Feedback regulation of Gab2-dependent signaling by the Ras/MAPK pathway

La voie de signalisation des Récepteurs Tyrosine Kinase (RTK) occupe un rôle central dans la régulation de la croissance cellulaire, la prolifération, la différentiation et la motilité. Une régulation anormale des RTKs mène à plusieurs maladies humaines telles que le cancer du sein, la seconde cause de mortalité chez les femmes à cause de l’amplification et la mutation fréquente de la protéine tyrosine kinase HER2 (ERBB2). Grb2-associated binder (Gab) 2 est une protéine adaptatrice qui agit en aval de plusieurs RTKs, y compris HER2, pour réguler de multiples voies de signalisation. En réponse à la stimulation par de nombreux facteurs de croissances et cytokines, Gab2 est recruté à la membrane plasmique où il potentialise l’activation des voies de signalisation Ras/mitogen-activated protein kinase (MAPK) et PI3K (phosphatidylinositol-3-kinase)/Akt (protein kinase B). En plus d’occuper un rôle essentiel durant le développement du système hématopoïétique, Gab2 est souvent amplifié dans les cancers, notamment le cancer du sein et les mélanomes. Cependant, les mécanismes moléculaires qui régulent le fonctionnement de Gab2 sont peu connus. Il est établi que lors de l’activation des RTKs, Gab2 est phosphorylé au niveau de plusieurs résidus Tyrosine, menant à l’association de différentes protéines comme p85 et Shp2. En plus de la phosphorylation en Tyrosine, notre laboratoire ainsi que d’autres groupes de recherche avons identifié que Gab2 est aussi phosphorylé au niveau de résidus Ser/Thr suite à l’activation de la voie de signalisation MAPK. Cependant, la régulation des fonctions de Gab2 par ces modifications post-traductionnelles est encore peu connue. Dans le but de comprendre comment Gab2 est régulé par la voie de signalisation MAPK, nous avons utilisé différentes approches. Dans la première partie de ma thèse, nous avons déterminé un nouveau mécanisme démontrant que la voie de signalisation Ras/MAPK, par le biais des protéines kinases RSK (p90 ribosomal S6 kinase), phosphoryle Gab2. Ce phénomène se produit à la fois in vivo et in vitro au niveau de trois résidus Ser/Thr conservés. Des mutations au niveau de ces sites de phosphorylation entrainent le recrutement de Shp2 menant à l’augmentation de la motilité cellulaire, ce qui suggère que les protéines RSK restreignent les fonctions dépendantes de Gab2. Ce phénomène est le résultat de la participation de RSK dans la boucle de rétroaction négative de la voie de signalisation MAPK. Dans la seconde partie de ma thèse, nous avons démontré que les protéines ERK1/2 phosphorylent Gab2 au niveau de plusieurs résidus pS/T-P à la fois in vitro et in vivo, entrainant l’inhibition du recrutement de p85. De plus, nous avons établi pour la première fois que Gab2 interagit physiquement avec ERK1/2 dans des cellules lors de l’activation de la voie de signalisation MAPK. Par ailleurs, nous avons montré un nouveau domaine d’attache du module ERK1/2 sur Gab2. Des mutations sur les résidus essentiels de ce domaine d’attache n’entrainent pas seulement la dissociation de ERK1/2 avec Gab2, mais diminuent également la phosphorylation dépendante de ERK1/2 sur Gab2. Ainsi, nos données montrent que la voie de signalisation MAPK régule les fonctions de la protéine Gab2 par le biais des kinases RSK et ERK1/2. Cette thèse élabore par ailleurs un schéma complet des fonctions de Gab2 dépendantes de la voie de signalisation MAPK dans le développement de nombreux cancers.