Hypophosphatémie après résection hépatique

Introduction : L’hypophosphatémie survient couramment après hépatectomie partielle. La régénération du foie était l’explication initiale. Cependant, les pertes rénales de phosphate observées récemment suggèrent que l’hypophosphatémie est probablement d’origine rénale. Nous avons donc mesuré la fraction d’excrétion urinaire de phosphate (FePO4) après hépatectomie partielle et nous avons étudié le rôle de la parathormone (PTH) et des phosphatonines dans cette hypophosphatémie. Méthodes : Les taux sériques de phosphate, de calcium ionisé, de PTH intacte, de « fibroblast growth factor- 23 » (FGF-23) intact et carboxyle-terminal, de FGF-7, de la « frizzled-related protein-4 » (FRP-4) et de HCO3- ainsi que le pH et la FePO4 ont été mesurés avant la chirurgie et aux jours postopératoires (po) 1, 2, 3, 5 et 7, chez 18 patients ayant subi une résection hépatique partielle. Résultats : Le phosphate sérique était à son plus bas niveau (0,66 ± 0,33 mmol/l; p < 0,001) au jour po 2. La FePO4 culminait à 25,07 ± 2,26 % au jour po 1 (p < 0,05) et était associée avec le taux de la parathormone intacte (r = 0,65; p = 0,006). Le calcium ionisé sérique diminuait à 1,1 ± 0,01 mmol/l, (p < 0,01) en même temps que la parathormone intacte s’élevait à 8,8 ± 0,9 pmol/l, (p < 0,01) au jour po 1; ces deux paramètres étaient inversement corrélés (r = -0,062; p = 0,016). Le FGF-23 intact atteignait son plus bas niveau à 7,8 ± 6,9 pg/ml (p < 0,001), au jour po 3; les valeurs de FGF-23 étaient corrélées avec la diminution du phosphate sérique aux jours po 0, 3, 5 et 7 (p < 0,001). Le FGF-23 carboxyle-terminal, le FGF-7 et la FRP-4 n’étaient pas reliés au phosphate sérique ni à la FePO4. Conclusion : L’hypophosphatémie observée après résection hépatique partielle est liée à une augmentation de la FePO4 qui est sans aucune relation avec les FGF-23 intact ou carboxyle-terminal, le FGF-7 et la FRP-4. La PTH intacte était associée avec la FePO4 uniquement au jour po 1. L’hypophosphatémie après résection hépatique est secondaire à d’autres facteurs non encore identifiés.

Molecular interactions of arbuscular mycorrhizal fungi with mycotoxin-producing fungi and their role in plant defense responses

Les trichothécènes de Fusarium appartiennent au groupe des sesquiterpènes qui sont des inhibiteurs la synthèse des protéines des eucaryotes. Les trichothécènes causent d’une part de sérieux problèmes de santé aux humains et aux animaux qui ont consommé des aliments infectés par le champignon et de l’autre part, elles sont des facteurs importants de la virulence chez plantes. Dans cette étude, nous avons isolé et caractérisé seize isolats de Fusarium de la pomme de terre infectée naturellement dans un champs. Les tests de pathogénicité ont été réalisés pour évaluer la virulence des isolats sur la pomme de terre ainsi que leur capacité à produire des trichothécènes. Nous avons choisi F. sambucinum souche T5 comme un modèle pour cette étude parce qu’il était le plus agressif sur la pomme de terre en serre en induisant un flétrissement rapide, un jaunissement suivi de la mort des plantes. Cette souche produit le 4,15-diacétoxyscirpénol (4,15-DAS) lorsqu’elle est cultivée en milieu liquide. Nous avons amplifié et caractérisé cinq gènes de biosynthèse trichothécènes (TRI5, TRI4, TRI3, TRI11, et TRI101) impliqués dans la production du 4,15-DAS. La comparaison des séquences avec les bases de données a montré 98% et 97% d'identité de séquence avec les gènes de la biosynthèse des trichothécènes chez F. sporotrichioides et Gibberella zeae, respectivement. Nous avons confrenté F. sambucinum avec le champignon mycorhizien à arbuscule Glomus irregulare en culture in vitro. Les racines de carotte et F. sambucinum seul, ont été utilisés comme témoins. Nous avons observé que la croissance de F. sambucinum a été significativement réduite avec la présence de G. irregulare par rapport aux témoins. Nous avons remarqué que l'inhibition de la croissance F. sambucinum a été associée avec des changements morphologiques, qui ont été observés lorsque les hyphes de G. irregulare ont atteint le mycélium de F. sambucinum. Ceci suggère que G. irregulare pourrait produire des composés qui inhibent la croissance de F. sambucinum. Nous avons étudié les patrons d’expression des gènes de biosynthèse de trichothécènes de F. sambucinum en présence ou non de G. irregulare, en utilisant le PCR en temps-réel. Nous avons observé que TRI5 et TRI6 étaient sur-exprimés, tandis que TRI4, TRI13 et TRI101 étaient en sous-exprimés en présence de G. irregulare. Des analyses par chromatographie en phase-gazeuse (GC-MS) montrent clairement que la présence de G. irregulare réduit significativement la production des trichothécènes par F. sambucinum. Le dosage du 4,15-DAS a été réduit à 39 μg/ml milieu GYEP par G. irregulare, comparativement à 144 μg/ml milieu GYEP quand F. sambucinum est cultivé sans G. irregulare. Nous avons testé la capacité de G. irregulare à induire la défense des plants de pomme de terre contre l'infection de F. sambucinum. Des essais en chambre de croissance montrent que G. irregulare réduit significativement l’incidence de la maladie causée par F. sambucinum. Nous avons aussi observé que G. irregulare augmente la biomasse des racines, des feuilles et des tubercules. En utilisant le PCR en temps-réel, nous avons étudié les niveaux d’expression des gènes impliqué dans la défense des plants de pommes de terre tels que : chitinase class II (ChtA3), 1,3-β-glucanase (Glub), peroxidase (CEVI16), osmotin-like protéin (OSM-8e) et pathogenèses-related protein (PR-1). Nous avons observé que G. irregulare a induit une sur-expression de tous ces gènes dans les racines après 72 heures de l'infection avec F. sambucinum. Nous avons également trové que la baisse provoquée par F. sambucinum des gènes Glub et CEVI16 dans les feuilles pourrait etre bloquée par le traitement AMF. Ceci montre que l’inoculation avec G. irregulare constitut un bio-inducteur systémique même dans les parties non infectées par F. sambucinum. En conclusion, cette étude apporte de nouvelles connaissances importantes sur les interactions entre les plants et les microbes, d’une part sur les effets directs des champignons mycorhiziens sur l’inhibition de la croissance et la diminution de la production des mycotoxines chez Fusarium et d’autre part, l’atténuation de la sévérité de la maladie dans des plantes par stimulation leur défense. Les données présentées ouvrent de nouvelles perspectives de bio-contrôle contre les pathogènes mycotoxinogènes des plantes.

Les répercussions de l’insuffisance rénale chronique sur le transport des médicaments

L’insuffisance rénale chronique (IRC) affecte 13 % de la population américaine et son incidence ne cesse d’augmenter. Malgré un ajustement des doses de médicaments administrés en fonction du taux de filtration glomérulaire du patient urémique, près de 40 % des patients reçoivent une dose trop élevée en raison de modifications de l’élimination extrarénale des médicaments chez ces patients. Il est connu que l’IRC affecte l’élimination métabolique des médicaments par les cytochromes P450 et les enzymes de biotransformation de phase II. Nous avons aussi démontré, chez le rat, que l’IRC affecte l’expression et l’activité de transporteurs de médicaments intestinaux entraînant une augmentation de la biodisponibilité de certains médicaments. On retrouve des transporteurs de médicaments dans de nombreux organes comme le foie, les reins et la barrière hématoencéphalique (BHE) où ils jouent des rôles importants dans les éliminations biliaire et rénale et la pénétration des médicaments au cerveau. Le but de ce travail était de mesurer, chez des rats néphrectomisés, les impacts de l’IRC sur l’expression protéique et génique et l’activité des transporteurs de médicaments hépatiques, rénaux et cérébraux. Les transporteurs étudiés sont de la famille des transporteurs ABC (P-glycoprotéine, multidrug-resistance related protein, breast cancer resistance protein) ou des solute carriers (organic anion transporter, organic anion transporting protein). Aussi, une étude réalisée chez l’humain visait à évaluer la pharmacocinétique de deux médicaments : la fexofénadine, un médicament majoritairement transporté, et le midazolam, un substrat du cytochrome P450 3A4, chez des sujets dialysés. Nos résultats montrent que, chez le rat, l’IRC entraîne des modulations de l’expression des transporteurs d’influx et d’efflux hépatiques pouvant entraîner des diminutions du métabolisme hépatique et de l’excrétion biliaire des médicaments. Dans le rein, nous avons démontré des modulations de l’expression des transporteurs de médicaments. Nous avons aussi démontré que l’IRC diminue l’élimination urinaire de la rhodamine 123 et favorise l’accumulation intrarénale de médicaments transportés comme la benzylpénicilline et la digoxine. À la BHE, nous avons démontré des diminutions de l’expression des transporteurs de médicaments. Toutefois, nous n’avons pas observé d’accumulation intracérébrale de trois substrats utilisés (digoxine, doxorubicine et vérapamil) et même une diminution de l’accumulation intracérébrale de la benzylpénicilline. Il semble donc que, malgré les modulations de l’expression des différents transporteurs de médicaments, l’intégrité et la fonction de la BHE soient conservées en IRC. Chez l’humain, nous avons démontré une augmentation de la surface sous la courbe de la fexofénadine chez les sujets dialysés, comparativement aux témoins, suggérant une altération des mécanismes de transport des médicaments chez ces patients. Nous n’avons, toutefois, pas observé de modification de la pharmacocinétique du midazolam chez les patients dialysés, suggérant une activité métabolique normale chez ces patients. Un ou des facteurs s’accumulant dans le sérum des sujets urémiques semblent responsables des modulations de l’expression et de l’activité des transporteurs de médicaments observées chez le rat et l’humain. Ces travaux mettent en évidence une nouvelle problématique chez les sujets urémiques. Nous devons maintenant identifier les mécanismes impliqués afin d’éventuellement développer des stratégies pour prévenir la toxicité et la morbidité chez ces patients.

Régulation de la fonction ovarienne par la voie de signalisation des WNTs

Les WNTs sont des glycoprotéines sécrétées impliquées dans plusieurs processus tels que la spécification cellulaire, la prolifération, la différenciation, et beaucoup d’autres. Pour transmettre leur signal, les WNTs se lient aux récepteurs Frizzled (FZD) et au co-récepteur « Low-density-lipoprotein receptor Related Protein » (LRP) 6 ou 5, activant ainsi l’une des trois principales voies de signalisation: la voie de signalisation WNT/β-caténine (voie canonique), la voie « Planar Cell Polarity » (PCP) et la voie WNT/Ca2+ (voies non-canoniques). Des antagonistes de cette voie, les « Secreted Frizzled Related Protein » (SFRPs), peuvent aussi se lier aux WNTs pour empêcher leur liaison aux récepteurs FZDs. Bien que des rôles importants aient été associés à plusieurs composants de la voie des WNTs lors de la régulation de l’ovaire adulte, le fonctionnement exact de cette signalisation reste nébuleux. L’objectif global de cette thèse visait donc à mieux comprendre la voie de signalisation des WNTs au niveau de l’ovaire adulte de souris, par la caractérisation de deux autres composants de cette voie, FZD1 et SFRP4. La création et l’analyse de souris Fzd1 et Sfrp4 KO ont démontré que FZD1 est nécessaire pour la régulation des gènes associés à l’expansion du cumulus, dans le complexe ovocyte-cumulus (COC). Nous avons aussi constaté que SFRP4 avait un rôle à jouer lors de la régulation des gènes associés à l’expansion du cumulus mais cette fois, au niveau des cellules de la granulosa. Finalement, les résultats in vivo et in vitro de cette étude ont suggéré que la voie PCP, contrairement à la voie canonique, pourrait être modulée dans les cellules de la granulosa des souris Sfrp4 KO, possiblement grâce au signal induit par WNT4 et WNT5a. Ces données ont permis de créer un modèle hypothétique représentant la régulation de la signalisation ovarienne par les WNTs. Ce modèle servira de base pour l’élaboration de futurs projets de recherche visant à comprendre davantage la signalisation ovarienne et les possibles effets de sa dérégulation lors de processus pathologiques. Ces connaissances pourront ensuite être appliquées chez l’humain afin de traiter plusieurs maladies ou dérèglements ovariens.

Caractérisation de nouveaux mécanismes transcriptionnels impliqués dans la biologie osseuse

Le développement et l'homéostasie des os requièrent l'orchestration spatio-temporelle d'un grand nombre de signaux moléculaires. Ces signaux entraînent l'activation ou l'inhibition de différents facteurs de transcription, lesquels sont en mesure de contrôler la prolifération et la différenciation des ostéoblastes et des chondrocytes. L'intégrité de ces différents mécanismes se doit d'être maintenu tout au long de la vie. Ainsi, une anomalie dans l'un de ces mécanismes conduit à l'apparition de pathologies osseuses et métaboliques telles qu’une hypophosphatémie, l'ostéoporose ou l'ostéoarthrite (OA). Afin d'en apprendre davantage sur la biologie osseuse, le projet décrit dans cette thèse a pour objectif de caractériser de nouveaux mécanismes de régulation transcriptionnelle pour deux gènes importants dans le développement des os et le maintien de leur intégrité. Il s’agit du Paired-like Homeodomain Transcription Factor 1 (PITX1) et du Phosphate-regulating gene with homology to endopeptidase on the X chromosome (PHEX). Le premier mécanisme présenté dans cette thèse concerne la régulation transcriptionnelle du gène PITX1, un facteur de transcription à homéodomaine nécessaire, notamment, au développement des os des membres inférieurs et au maintien de l'intégrité du cartilage articulaire chez l'adulte. Ainsi, dans les chondrocytes articulaires, on note que l'expression de PITX1 est assurée par le recrutement du facteur de transcription E2F1 à deux éléments de réponse présents dans la région proximale du promoteur de PITX1. Aussi, dans les chondrocytes articulaires de patients souffrant d'OA, dans lesquels l'expression de PITX1 est fortement diminuée, un mécanisme de répression transcriptionnelle, lequel implique la protéine multifonctionnelle Prohibitin (PHB1), semble être activé. En effet, dans ces chondroytes, on note une forte accumulation nucléaire de PHB1 comparativement aux chondrocytes articulaires de sujets sains. Le second mécanisme présenté dans cette thèse concerne la répression transcriptionnelle de PHEX, la peptidase mutée dans le syndrome d'hypophosphatémie lié au chromosome X (X-Linked Hypophosphatemia, XLH), lequel se caractérise par une hypophosphatémie et une ostéomalacie. Le traitement d'ostéoblastes à la Parathyroid hormone-related protein (PTHrP) permet d’observer la répression de PHEX. Afin de caractériser le mécanisme responsable de cette répression, des expériences de gènes rapporteurs ont révélé la présence de deux éléments de réponse pour le répresseur transcriptionnel E4BP4 dans le promoteur de PHEX. La suppression de l'expression d'E4BP4 par l'utilisation d'ARN d'interférence a permis de valider que ce facteur de transcription est responsable de la répression de PHEX suite au traitement d'ostéoblastes à la PTHrP. En somme ces nouveaux mécanismes de régulation transcriptionnelle permettent de mieux comprendre la régulation de l'expression de PITX1 et de PHEX. Aussi, cette nouvelle implication de PHB1 dans la pathogenèse de l'OA offre de nouvelles possibilités de traitement et pourrait servir pour le diagnostic précoce de cette pathologie. Enfin, la caractérisation d'E4BP4 en tant que médiateur pour la répression de PHEX par la PTHrP suggère que ce répresseur transcriptionnel pourrait être impliqué dans le contrôle de la minéralisation des os et des niveaux de phosphate sanguin.

Investigating the thymopoiesis stimulating property of interleukin-21 in aging mice

La vaccination est largement utilisée pour la génération de lymphocytes T spécifiques contre les tumeurs. Malheureusement, cette stratégie n'est pas adaptée aux personnes âgées car leur thymus régresse avec l'âge conduisant ainsi à une baisse dans la production de cellules T et à l'accumulation de cellules immunitaires âgées ayant des défauts liés à leurs stimulations. Comme il a été démontré auparavant que L’IL-21 est capable d’induire des fonctions thymiques, nous avons émis l’hypothèse que l’injection d’IL-21 à des souris âgées stimulera la thymopoïèse. Nos résultats montrent que l’administration de l’IL-21 augmente le nombre absolu de thymocytes chez les souris âgées et augmente la migration de ces cellules vers la périphérie ou ils contribuent à la diversité du TCR. De plus les cellules T en périphérie expriment un niveau plus élevé de miR181-a, et par conséquent moins de phosphatase comme SHP2, DUSP5/6 qui inhibent le TCR. En vaccinant des souris âgées avec le peptide Trp2, les souris traitées avec l’IL-21 montrent un retard dans la croissance des cellules B16 tumorales. Cette étude montre que l’IL-21 pourrait être utilisé comme stratégie pour le rétablissement du systeme immunitaire chez les personnes âgées.

A "Trojan horse" strategy to reverse drug-resistance in brain tumors

Los gliomas malignos representan una de las formas más agresivas de los tumores del sistema nervioso central (SNC). De acuerdo con la clasificación de los tumores cerebrales de la Organización Mundial de la Salud (OMS), los astrocitomas han sido categorizados en cuatro grados, determinados por la patología subyacente. Es así como los gliomas malignos (o de alto grado) incluyen el glioma anaplásico (grado III) así como el glioblastoma multiforme (GBM, grado IV),estos últimos los más agresivos con el peor pronóstico (1). El manejo terapéutico de los tumores del SNC se basa en la cirugía, la radioterapia y la quimioterapia, dependiendo de las características del tumor, el estadio clínico y la edad (2),(3), sin embargo ninguno de los tratamientos estándar es completamente seguro y compatible con una calidad de vida aceptable (3), (4). En general, la quimioterapia es la primera opción en los tumores diseminados, como el glioblastoma invasivo y el meduloblastoma de alto riesgo o con metástasis múltiple, pero el pronóstico en estos pacientes es muy pobre (2),(3). Solamente nuevas terapias dirigidas (2) como las terapias anti-angiogénicas (4); o terapias génicas muestran un beneficio real en grupos limitados de pacientes con defectos moleculares específicos conocidos (4). De este modo, se hace necesario el desarrollo de nuevas terapias farmacológicas para atacar los tumores cerebrales. Frente a las terapias los gliomas malignos son con frecuencia quimioresistentes, y esta resistencia parece depender de al menos dos mecanismos: en primer lugar, la pobre penetración de muchas drogas anticáncer a través de la barrera hematoencefálica (BBB: Blood Brain Barrier), la barrera del fluido sangre-cerebroespinal (BCSFB: Blood-cerebrospinal fluid barrier) y la barrera sangre-tumor (BTB: blood-tumor barrier). Dicha resistencia se debe a la interacción de la droga con varios transportadores o bombas de eflujo de droga ABC (ABC: ATP-binding cassette) que se sobre expresan en las células endoteliales o epiteliales de estas barreras. En segundo lugar, estos transportadores de eflujo de drogas ABC propios de las células tumorales confieren un fenotipo conocido como resistencia a multidrogas (MDR: multidrug resistance), el cual es característico de varios tumores sólidos. Este fenotipo también está presente en los tumores del SNC y su papel en gliomas es objeto de investigación (5). Por consiguiente el suministro de medicamentos a través de la BBB es uno de los problemas vitales en los tratamientos de terapia dirigida. Estudios recientes han demostrado que algunas moléculas pequeñas utilizadas en estas terapias son sustratos de la glicoproteína P (Pgp: P-gycoprotein), así como también de otras bombas de eflujo como las proteínas relacionadas con la resistencia a multidrogas (MRPs: multidrug resistance-related proteins (MRPs) o la proteína relacionada con cáncer de seno (BCRP: breast-cancer resistance related protein)) que no permiten que las drogas de este tipo alcancen el tumor (1). Un sustrato de Pgp y BCRP es la DOXOrubicina (DOXO), un fármaco utilizado en la terapia anti cáncer, el cual es muy eficaz para atacar las células del tumor cerebral in vitro, pero con un uso clínico limitado por la poca entrega a través de la barrera hematoencefálica (BBB) y por la resistencia propia de los tumores. Por otra parte las células de BBB y las células del tumor cerebral tienen también proteínas superficiales, como el receptor de la lipoproteína de baja densidad (LDLR), que podría utilizarse como blanco terapéutico en BBB y tumores cerebrales. Es asi como la importancia de este estudio se basa en la generación de estrategias terapéuticas que promuevan el paso de las drogas a través de la barrera hematoencefalica y tumoral, y a su vez, se reconozcan mecanismos celulares que induzcan el incremento en la expresión de los transportadores ABC, de manera que puedan ser utilizados como blancos terapéuticos.Este estudio demostró que el uso de una nueva estrategia basada en el “Caballo de Troya”, donde se combina la droga DOXOrubicina, la cual es introducida dentro de un liposoma, salvaguarda la droga de manera que se evita su reconocimiento por parte de los transportadores ABC tanto de la BBB como de las células del tumor. La construcción del liposoma permitió utilizar el receptor LDLR de las células asegurando la entrada a través de la BBB y hacia las células tumorales a través de un proceso de endocitosis. Este mecanismo fue asociado al uso de estatinas o drogas anticolesterol las cuales favorecieron la expresión de LDLR y disminuyeron la actividad de los transportadores ABC por nitración de los mismos, incrementando la eficiencia de nuestro Caballo de Troya. Por consiguiente demostramos que el uso de una nueva estrategia o formulación denominada ApolipoDOXO más el uso de estatinas favorece la administración de fármacos a través de la BBB, venciendo la resistencia del tumor y reduciendo los efectos colaterales dosis dependiente de la DOXOrubicina. Además esta estrategia del "Caballo de Troya", es un nuevo enfoque terapéutico que puede ser considerado como una nueva estrategia para aumentar la eficacia de diferentes fármacos en varios tumores cerebrales y garantiza una alta eficiencia incluso en un medio hipóxico,característico de las células cancerosas, donde la expresión del transportador Pgp se vió aumentada. Teniendo en cuenta la relación entre algunas vías de señalización reconocidas como moduladores de la actividad de Pgp, este estudio presenta no solo la estrategia del Caballo de Troya, sino también otra propuesta terapéutica relacionada con el uso de Temozolomide más DOXOrubicina. Esta estrategia demostró que el temozolomide logra penetrar la BBB por que interviene en la via de señalización de la Wnt/GSK3/β-catenina, la cual modula la expresión del transportador Pgp. Se demostró que el TMZ disminuye la proteína y el mRNA de Wnt3 permitiendo plantear la hipótesis de que la droga al disminuir la transcripción del gen Wnt3 en células de BBB, incrementa la activación de la vía fosforilando la β-catenina y conduciendo a disminuir la β-catenina nuclear y por tanto su unión al promotor del gen mdr1. Con base en los resultados este estudio permitió el reconocimiento de tres mecanismos básicos relacionados con la expresión de los transportadores ABC y asociados a las estrategias empleadas: el primero fue el uso de las estatinas, el cual condujo a la nitración de los transportadores disminuyendo su actividad por la via del factor de transcripción NFκB; el segundo a partir del uso del temozolomide, el cual metila el gen de Wnt3 reduciendo la actividad de la via de señalización de la la β-catenina, disminuyendo la expresión del transportador Pgp. El tercero consistió en la determinación de la relación entre el eje RhoA/RhoA quinasa como un modulador de la via (no canónica) GSK3/β-catenina. Se demostró que la proteína quinasa RhoA promovió la activación de la proteína PTB1, la cual al fosforilar a GSK3 indujo la fosforilación de la β-catenina, lo cual dio lugar a su destrucción por el proteosoma, evitando su unión al promotor del gen mdr1 y por tanto reduciendo su expresión. En conclusión las estrategias propuestas en este trabajo incrementaron la citotoxicidad de las células tumorales al aumentar la permeabilidad no solo de la barrera hematoencefálica, sino también de la propia barrera tumoral. Igualmente, la estrategia del “Caballo de Troya” podría ser útil para la terapia de otras enfermedades asociadas al sistema nervioso central. Por otra parte estos estudios indican que el reconocimiento de mecanismos asociados a la expresión de los transportadores ABC podría constituir una herramienta clave en el desarrollo de nuevas terapias anticáncer.

Phosphoinositide (PI) 3-kinase assays

The regulation of phosphoinositide (PI) 3-kinase activities has been linked to many normal and disease-related processes, including cell survival, cell growth and proliferation, cell differentiation, cell motility, and intracellular vesicle trafficking. However, as the family of enzymes has now grown to include eight true members, in three functional classes, plus several related protein kinases that are also inhibited by the widely used PI 3-kinase selective inhibitors, wortmannin and LY294002, extended methodologies are required to identify which type of kinase is involved in a particular cellular process, or protein complex, under study. A robust in vitro PI 3-kinase assay, suitable for use with immunoprecipitates, or purified proteins, is described here together with a series of modifications of substrate and assay conditions that will aid researchers in the identification of the particular class and isoform of PI 3-kinase that is involved in a signaling process under investigation.

Differential uptake of subfractions of triglyceride-rich lipoproteins by THP-1 macrophages

It is well known that raised plasma triglycerides (TG) are positively linked to the development of coronary heart disease. However, triglycerides circulate in a range of distinct lipoprotein subtractions and the relative atherogenicity of these subtractions is not clear. In this study, three fractions of triglyceride rich lipoprotein (TRL) were isolated from normolipidaemic males according to their differing Svedberg flotation (S-f) rates: chylomicron (CM, S-f > 400), very low-density lipoprotein (VLDL)-1 (S-f 60-400) and VLDL-2 (S-f 20-60). These fractions were incubated with THP-1 monocyte-derived macrophages for determination of cholesterol and TG accumulation, in the presence and absence of the lipoprotein lipase (LPL) inhibitor orlistat. Expression of LDL receptor related protein (LRP) and apolipoprotein B48 receptor (apoB48R) was also examined in both differentiating monocytes, and monocyte-derived macrophages, incubated with TRL. VLDL-I caused a significantly greater accumulation of TG within macrophages compared to VLDL-2. Binding studies also tended to show a greater preference for VLDL-1. No change in expression of LRP or apoB48R was observed in fully differentiated macrophages incubated with VLDL-1, VLDL-2 or CM, although a greater expression of LRP mRNA was observed in differentiating monocytes exposed to VLDL-1, compared to those incubated with CM or VLDL-2. TG loading in response to all three TRL fractions was blocked by orlistat, suggesting that it is likely that the major pathway for uptake of TG was hydrolysis by LPL. Calculations suggested that direct uptake of particles accounts for between 12 and 25% of total TAG uptake. In conclusion, THP monocyte-derived macrophages demonstrate a preference for VLDL-1, both through the LPL pathway and by direct uptake of whole particles. (c) 2005 Elsevier Ireland Ltd. All rights reserved.

Saturated fat-induced changes in S-f 60-400 particle composition reduces uptake of LDL by HepG2 cells

The ability of human postprandial triacylglycerol-rich lipoproteins (TRLs), isolated after meals enriched in saturated fatty acids (SFAs), n-6 PUFAs, and MUFAs, to inhibit the uptake of I-125-labeled LDL by the LDL receptor was investigated in HepG2 cells. Addition of TRLs resulted in a dose-dependent inhibition of heparin-releasable binding, cell-associated radioactivity, and degradation products of I-125-labeled LDL (P < 0.001). SFA-rich Svedberg flotation rate (S-f) 60-400 resulted in significantly greater inhibition of cell-associated radioactivity than PUFA-rich particles (P = 0.016) and total uptake of I-125-labeled LDL compared with PUFA- and MUFA-rich particles (P = 0.02). Normalization of the apolipoprotein (apo)E but not apoC-III content of the TRLs removed the effect of meal fatty acid composition, and addition of an anti-apoE antibody reversed the inhibitory effect of TRLs on the total uptake of I-125-labeled LDL. Real time RT-PCR showed that the SFA-rich Sf 60-400 increased the expression of genes involved in hepatic lipid synthesis (P < 0.05) and decreased the expression of the LDL receptor-related protein 1 compared with MUFAs (P = 0.008). In conclusion, these findings suggest an alternative or additional mechanism whereby acute fat ingestion can influence LDL clearance via competitive apoE-dependent effects of TRL on the LDL receptor.-Jackson, K. G., V. Maitin, D. S. Leake, P. Yaqoob, and C. M. Williams. Saturated fat-induced changes in Sf 60 400 particle composition reduces uptake of LDL by HepG2 cells.

Effect of feed restriction and supplemental dietary fat on gut peptide and hypothalamic neuropeptide mRNA concentrations in growing wethers

The objectives of the present study were 1) to evaluate the effects of supplemental fat and ME intake on plasma concentrations of glucagon-like peptide-1 (GLP-1), cholecystokinin (CCK), glucose-dependent insulinotropic polypeptide, ghrelin, and oxyntomodulin; and 2) to determine the association of these peptides with DMI and the hypothalamic concentration of mRNA for the following neuropeptides: neuropeptide Y (NPY), agouti-related peptide (AgRP), and proopiomelanocortin (POMC). In a completely randomized block design with a 2 x 2 factorial arrangement of treatments, 32 pens with 2 wethers each were restricted-fed (2.45 Mcal/lamb per day) or offered diets ad libitum (n = 16) with or without 6% supplemental fat (n = 16) for a period of 30 d. Dry matter intake was measured daily. On d 8, 15, 22, and 29, BW was measured before feeding, and 6 h after feeding, blood samples were collected for plasma measurement of insulin, GLP-1, CCK, ghrelin, glucose-dependent insulinotropic polypeptide, oxyntomodulin, glucose, and NEFA concentrations. On d 29, blood was collected 30 min before feeding for the same hormone and metabolite analyses. At the end of the experiment, wethers were slaughtered and the hypothalami were collected to measure concentrations of NPY, AgRP, and POMC mRNA. Offering feed ad libitum (resulting in greater ME intake) increased plasma insulin and NEFA concentrations (P = 0.02 and 0.02, respectively) and decreased hypothalamic mRNA expression of NPY and AgRP (P = 0.07 and 0.02, respectively) compared with the restricted-fed wethers. There was a trend for the addition of dietary fat to decrease DMI (P = 0.12). Addition of dietary fat decreased insulin and glucose concentrations (P < 0.05 and 0.01, respectively) and tended to increase hypothalamic mRNA concentrations for NPY and AgRP (P = 0.07 and 0.11, respectively). Plasma GLP-1 and CCK concentrations increased in wethers offered feed ad libitum compared with restricted-fed wethers, but the response was greater when wethers were offered feed ad libitum and had supplemental fat in the diet (fat x intake interaction, P = 0.04). The prefeeding plasma ghrelin concentration was greater in restricted-fed wethers compared with those offered feed ad libitum, but the concentrations were similar 6 h after feeding (intake x time interaction, P < 0.01). Supplemental dietary fat did not affect (P = 0.22) plasma ghrelin concentration. We conclude that insulin, ghrelin, CCK, and GLP-1 may regulate DMI in sheep by regulating the hypothalamic gene expression of NPY, AgRP, and POMC.

Effects of glucose, propionate and splanchnic hormones on neuropeptide mRNA concentrations in the ovine hypothalamus

The capacity for glucose, propionate or hormones of splanchnic origin to influence appetite by directly regulating the expression of neuropeptides in the feeding centres of the hypothalamus of the ruminant is not described. Therefore, our objective was to measure the direct effect of metabolites (glucose and propionate) or hormones [insulin, cholecystokinin (CCK), glucagon-like peptide-1 (GLP-1) and polypeptide YY (PYY)] on hypothalamic mRNA concentrations for neuropeptide Y (NPY), agouti-related peptide (AgRP) and proopiomelanocortin (POMC) following in vitro incubation. Hypothalamic tissue from 4- to 5-month-old lambs was obtained at slaughter and immediately incubated in culture media for 2 h at 36 °C. Treatments included a control Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) containing 1 mm glucose or DMEM with the following additions: 10 mm glucose, 1 mm propionate, 1 nm insulin, 120 pm GLP-1, 100 pm PYY, 80 pm CCK or 10 mm glucose plus 1 nm insulin. The abundance of mRNA for NPY, AgRP and POMC was measured using quantitative reverse transcriptase PCR. Fisher’s protected LSD test was used to compare changes in relative mRNA concentrations for the hypothalamus incubated in the control media vs. the rest of the treatments. The media containing glucose plus insulin increased POMC mRNA concentration (p < 0.05), but did not affect NPY or AgRP mRNA concentration. There were no effects observed for the other treatments (p > 0.20). Results of the present study are consistent with the concept that effects of propionate on feed intake in ruminants is not mediated through direct effects on the hypothalamus, and that insulin is required for an effect of glucose on hypothalamic POMC expression.

Regulation of actin assembly by SCAR/WAVE proteins.

Actin reorganization is a tightly regulated process that co-ordinates complex cellular events, such as cell migration, chemotaxis, phagocytosis and adhesion, but the molecular mechanisms that underlie these processes are not well understood. SCAR (suppressor of cAMP receptor)/WAVE [WASP (Wiskott-Aldrich syndrome protein)-family verprolin homology protein] proteins are members of the conserved WASP family of cytoskeletal regulators, which play a critical role in actin dynamics by triggering Arp2/3 (actin-related protein 2/3)-dependent actin nucleation. SCAR/WAVEs are thought to be regulated by a pentameric complex which also contains Abi (Abl-interactor), Nap (Nck-associated protein), PIR121 (p53-inducible mRNA 121) and HSPC300 (haematopoietic stem progenitor cell 300), but the structural organization of the complex and the contribution of its individual components to the regulation of SCAR/WAVE function remain unclear. Additional features of SCAR/WAVE regulation are highlighted by the discovery of other interactors and distinct complexes. It is likely that the combinatorial assembly of different components of SCAR/WAVE complexes will prove to be vital for their roles at the centre of dynamic actin reorganization.

Evidence that OGG1 glycosylase protects neurons against oxidative DNA damage and cell death under ischemic conditions

7,8-Dihydro-8-oxoguanine DNA glycosylase (OGG1) is a major DNA glycosylase involved in base-excision repair (BER) of oxidative DNA damage to nuclear and mitochondrial DNA (mtDNA). We used OGG1-deficient (OGG1(-/-)) mice to examine the possible roles of OGG1 in the vulnerability of neurons to ischemic and oxidative stress. After exposure of cultured neurons to oxidative and metabolic stress levels of OGG1 in the nucleus were elevated and mitochondria exhibited fragmentation and increased levels of the mitochondrial fission protein dynamin-related protein 1 (Drp1) and reduced membrane potential. Cortical neurons isolated from OGG1(-/-) mice were more vulnerable to oxidative insults than were OGG1(+/+) neurons, and OGG1(-/-) mice developed larger cortical infarcts and behavioral deficits after permanent middle cerebral artery occlusion compared with OGG1(+/+) mice. Accumulations of oxidative DNA base lesions (8-oxoG, FapyAde, and FapyGua) were elevated in response to ischemia in both the ipsilateral and contralateral hemispheres, and to a greater extent in the contralateral cortex of OGG1(-/-) mice compared with OGG1(+/+) mice. Ischemia-induced elevation of 8-oxoG incision activity involved increased levels of a nuclear isoform OGG1, suggesting an adaptive response to oxidative nuclear DNA damage. Thus, OGG1 has a pivotal role in repairing oxidative damage to nuclear DNA under ischemic conditions, thereby reducing brain damage and improving functional outcome. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism (2011) 31, 680-692; doi:10.1038/jcbfm.2010.147; published online 25 August 2010

Proteomic analysis reveals suppression of bark chitinases and proteinase inhibitors in citrus plants affected by the citrus sudden death disease

Citrus sudden death (CSD) is a disease of unknown etiology that greatly affects sweet oranges grafted on Rangpur lime rootstock, the most important rootstock in Brazilian citriculture. We performed a proteomic analysis to generate information related to this plant pathogen interaction. Protein profiles from healthy, CSD-affected and CSD-tolerant stem barks, were generated using two-dimensional gel electrophoresis. The protein spots were well distributed over a pI range of 3.26 to 9.97 and a molecular weight (MW) range from 7.1 to 120 kDa. The patterns of expressed proteins on 2-DE gels made it possible to distinguish healthy barks from CSD-affected barks. Protein spots with MW around 30 kDa and pI values ranging from 4.5 to 5.2 were down-regulated in the CSD-affected rootstock bark. This set of protein spots was identified as chitinases. Another set of proteins, ranging in pI from 6.1 to 9.6 with an MW of about 20 kDa, were also suppressed in CSD-affected rootstock bark; these were identified as miraculin-like proteins, potential trypsin inhibitors. Downregulation of chitinases and proteinase inhibitors in CSD-affected plants is relevant since chitinases are well-known pathogenesis-related protein, and their activity against plant pathogens is largely accepted.