Association of MMP-2 polymorphisms with severe and very severe COPD: a case control study of MMPs-1, 9 and 12 in a European population.

BACKGROUND: Genetic factors play a role in chronic obstructive pulmonary disease (COPD) but are poorly understood. A number of candidate genes have been proposed on the basis of the pathogenesis of COPD. These include the matrix metalloproteinase (MMP) genes which play a role in tissue remodelling and fit in with the protease--antiprotease imbalance theory for the cause of COPD. Previous genetic studies of MMPs in COPD have had inadequate coverage of the genes, and have reported conflicting associations of both single nucleotide polymorphisms (SNPs) and SNP haplotypes, plausibly due to under-powered studies. METHODS: To address these issues we genotyped 26 SNPs, providing comprehensive coverage of reported SNP variation, in MMPs- 1, 9 and 12 from 977 COPD patients and 876 non-diseased smokers of European descent and evaluated their association with disease singly and in haplotype combinations. We used logistic regression to adjust for age, gender, centre and smoking history. RESULTS: Haplotypes of two SNPs in MMP-12 (rs652438 and rs2276109), showed an association with severe/very severe disease, corresponding to GOLD Stages III and IV. CONCLUSIONS: Those with the common A-A haplotype for these two SNPs were at greater risk of developing severe/very severe disease (p = 0.0039) while possession of the minor G variants at either SNP locus had a protective effect (adjusted odds ratio of 0.76; 95% CI 0.61 - 0.94). The A-A haplotype was also associated with significantly lower predicted FEV1 (42.62% versus 44.79%; p = 0.0129). This implicates haplotypes of MMP-12 as modifiers of disease severity.

Immunology of viral disease, how to curb persistent infection

1. 1. Summaries 1.1. Preamble and extended abstract The present thesis dissertation addresses the question of antiviral immunity from the particular standpoint of the adaptive T cell-mediated immune response. The experimental work is presented in the form of three published articles (two experimental articles and one review article, see sections 4.1, 4.2 and 4.3 on pages 73, 81 and 91, respectively), describing advances both in our understanding of viral control by CD8 T lymphocytes, and in vaccine development against the Human Immunodeficiency Virus Type 1 (HIV-1). Because the articles focus on rather specialized areas of antiviral immunity, the article sections are preceded by a general introduction (section 3) on the immune system in general, and on four viruses that were addressed in the experimental work, namely HIV-1, Cytomegalovirus (CMV), Epstein Barr Virus (EBV) and Influenzavirus (Flu). This introduction section is aimed at providing a glimpse on viral molecular biology and immunity, to help the hypothetical non-expert reader proceeding into the experimental part. For this reason, each section is presented as individual entity and can be consulted separately. The four viruses described are of peculiar relevance to immunity because they induce an array of opposite host responses. Flu causes a self limiting disease after which the virus is eradicated. CMV and EBV cause pauci-symptomatic or asymptomatic diseases after which the viruses establish lifelong latency in the host cells, but are kept in check by immunity. Eventually, HIV-1 establishes both latency - by inserting its genome into the host cell chromosome - and proceeds in destroying the immune system in a poorly controlled fashion. Hence, understanding the fundamental differences between these kinds of viral host interactions might help develop new strategies to curb progressive diseases caused by viruses such as HIV-1. Publication #1: The first article (section 4.1, page 73) represents the main frame of my laboratory work. It analyses the ability of CD8 T lymphocytes recovered from viral-infected patients to secrete interferon γ (IFN-γ) alone or in conjunction with interleukin 2 (IL-2) when exposed in vitro to their cognate viral antigens. CD8 T cells are instrumental in controlling viral infection. They can identify infected cells by detecting viral antigens presented at the surface of the infected cells, and eliminate both the cell and its infecting virus by triggering apoptosis and/or lysis of the infected cell. Recognition of these antigens triggers the cognate CD8 cells to produce cytokines, including IFN-γ and IL-2, which in turn attract and activate other pro-inflammatory cells. IFN-γ triggers both intrinsic antiviral activity of the infected cells and distant activation of pro-inflammatory cells, which are important for the eradication of infection. IL-2 is essential for clonal expansion of the antigen (Ag)-specific CD8 T cell. Hence the existence of Ag-specific CD8 cells secreting both IFN-γand IL-2 should be beneficial for controlling infection. In this first work we determined the percentage of IFN-y/IL-2 double positive and single IFN-γsecreting CD8 T cells against antigens HIV-1, CMV, EBV and Flu in three groups of subjects: (i) HIV-1 infected patients progressing to disease (progressors), (ii) HIV-1-infected subjects not progressing to disease (long-term non progressors or LTNP), and (iii) HIV negative blood donors. The results disclosed a specific IFN-y/IL-2 double positive CD8 response in all subjects able to control infection. In other words, IFN-y/IL-2 double positive CD8 cells were present in virus-specific CD8 T cells against Flu, CMV and EBV as well against HIV-1 in LTNP. In contrast, progressors only had single IFN-γsecreting CD8 T cells. Hence, the ability to develop an IFN-y/IL-2 double positive response might be critical to control infection, independently of the nature of the virus. Additional experiments helped identify the developmental stage of the missing cells (using different markers such as CD45RA and CCR7) and showed a correlation between the absence of IL-2 secreting CD8 T cells and a failure in the proliferation capacity of virus-specific CD8 T cells. Addition of exogenous IL-2 could restore clonal expansion of HIV-1 specific CD8 T cells, at least in vitro. It could further been shown, that IL-2 secreting CD8 T cells are sufficient to support proliferation even in absence of CD4 help. However, the reason for the missing IFN-y/IL-2 double positive CD8 T cell response in HIV-1 progessors has yet to be determined. Publication #2: The second article (section 4.2, page 81) explores new strategies to trigger CD8 T cell immunity against specific HIV-1 proteins believed to be processed and exposed as "infection signal" at the surface of infected cells. Such signals consist of peptide fragments (8- 13 amino acids) originating from viral proteins and presented to CD8 T cells in the frame of particular cell surface molecules of the major histocompatibility complex class I* (MHC I). To mimic "natural" viral infection, the HIV-1 polyprotein Gagpolnef was inserted and expressed in either of two attenuated viruses i.e. vaccinia virus (MVA) or poxvirus (NYVAC). Mice were infected with these recombinant viruses and specific CD8 T cell response to Gagpolnef peptides was sought. Mice could indeed mount a CD8 T cell response against the HIV-1 antigens, indicating that the system worked, at least in this animal model. To further test whether peptides from Gagpolnef could also be presented in the frame of the human MHC class I proteins, a second round of experiments was performed in "humanized" transgenic mice expressing human MHC molecules. The transgenic mice were also able to load Gagpolnef peptides on their human MHC molecule, and these cells could be detected and destroyed by Ag-specific CD8 T cells isolated from HIV-1-infected patients. Therefore, expressing Gagpolnef on attenuated recombinant viruses might represent a valid strategy for anti-HIV-1 immunization in human. Publication #3: This is a review paper (section 4.3, page 91) describing the immune response to CMV and newly developed methods to detect this cellular immune response. Some of it focuses on the detection of T cells by using in vitro manufactured tetramers. These consist of four MHC class I molecules linked together and loaded with the appropriate antigenic peptide. The tetramer can be labeled with a fluorochrome and analyzed with a fluorescence-activated cell sorter. Taken together, the work presented indicates that (i) an appropriate CD8 T cell response consisting of IFN-y/IL-2 double positive effectors, can potentially control viral infection, including HIV-1 infection, (ii) such a response might be triggered by recombinant viral vaccines, and (iii) CD8 T cell response can be monitored by a variety of techniques, including recently-developed MHC class I tetramers. 1. 2. Préambule et résumé élargi Le présent travail de thèse s'intéresse à l'immunité antivirale du point de vue particulier de la réponse adaptative des cellules T. Le travail expérimental est présenté sous la forme de trois articles publiés (2 articles expérimentaux et 1 article de revue, voir sections 4.1, 4.2 et 4.3, pages 58, 66 et 77, respectivement), décrivant des progrès dans la compréhension du contrôle de l'infection virale par les lymphocytes T CD8, ainsi que dans le développement de nouveaux vaccins contre le Virus d'Immunodéficience de Humaine de type 1 (VIH-1). En raison du caractère spécialisé de l'immunité antivirale de type cellulaire, les articles sont précédés par une introduction générale (section 3), dont le but est de pourvoir le lecteur non avisé avec des bases nécessaire à une meilleure appréhension du travail expérimental. Cette introduction présente les grandes lignes du système immunitaire, et décrit de façon générale les 4 virus utilisés dans le travail expérimental: à savoir le virus VIH-1, le Cytomégalovirus (CMV), le virus Epstein Barr (EBV) et le virus Influenza A (Flu). Toutes les sections sont présentées de façon individuelle et peuvent être consultées séparément. La description des 4 virus a une pertinence particulière quant à leur interaction avec le système immun. En effet, ils induisent une panoplie de réponses immunitaires s'étendant aux extrêmes de la réaction de l'hôte. Influenza A est à l'origine d'une maladie cytopathique aiguë, au décours de laquelle le virus est éradiqué par l'hôte. CMV et EBV sont classiquement à l'origine d'infections pauci-symptomatiques, voire asymptomatiques, après lesquelles les virus persistent de façon latente dans la cellule hôte. Cependant, ils restent sous le contrôle du système immun, qui peut prévenir une éventuelle réactivation. Enfin, VIH-1 s'établit à la fois en infection latente - par l'insertion de son génome dans le chromosome des cellules hôtes - et en infection productive et cytopathique, échappant au contrôle immunitaire et détruisant ses cellules cibles. La compréhension des différences fondamentales entre ces différents types d'interactions virus-hôte devraient faciliter le développement de nouvelles stratégies antivirales. Article 1: Le premier article (section 4.1 Page 58) représente l'objet principal de mon travail de laboratoire. Il analyse la capacité des lymphocytes T CD8 spécifiques de différent virus à sécréter de l'interféron gamma (IFN-y) et/ou de l'interleukine 2 (IL-2) après stimulation par leur antigène spécifique. Les cellules T CD8 jouent un rôle crucial dans le contrôle des infections virales. Elles identifient les cellules infectées en détectant des antigènes viraux présentés à la surface de ces mêmes cellules, et éliminent à la fois les cellules infectées et les virus qu'elles contiennent en induisant l'apoptose et/ou la lyse des cellules cibles. Parallèlement, l'identification de l'antigène par la cellule T CD8 la stimule à sécréter des cytokines. L'IFN-γen est un exemple. L'IFN-γ stimule les cellules infectées à développer une activé antivirale intrinsèque. De plus, il attire sur place d'autres cellules de l'inflammation, et active leur fonction d'éradication des pathogènes. L'IL-2 est un autre exemple. L'IL-2 est essentielle à l'expansion clonale des cellules T CD8 spécifiques à un virus donné. Elle est donc essentielle à augmenter le pool de lymphocytes antiviraux. En conséquence, la double capacité de sécréter de l'IFN-γ et de IL-2 pourrait être un avantage pour le contrôle antiviral par les cellules T CD8. Dans ce travail nous avons comparé les proportions de lymphocytes T CD8 doubles positifs (IFN-γ/IL-2) et simples positifs (IFN-γ) chez trois groupes de sujets: (i) des patients infectés par VIH-1 qui ne contrôlent pas l'infection (progresseurs), (ii) des patients infectés par VIH-1, mais contrôlant l'infection malgré l'absence de traitement ("long term non progressors" [LTNP]) et (iii) des donneurs de sang négatifs pour l'infection à VIH-1. Les résultats ont montré que les individus capables de contrôler une infection possédaient des cellules T CD8 doubles positifs (IFN-γ/IL-2), alors que les patients ne contrôlant pas l'infection procédaient prioritairement des CD8 simples positifs (IFN-γ). Spécifiquement, les lymphocytes T spécifiques pour Flu, CMV, EBV, et VII-1-1 chez les LTNP étaient tous IFN-γ/IL-2 doubles positifs. Au contraire, les lymphocytes T CD8 spécifique à VIH-1 étaient IFN-γ simples positifs chez les progresseurs. La capacité de développer une réponse IFN-γ/IL-2 pourraient être primordiale pour le contrôle de l'infection, indépendamment de la nature du virus. En effet, il a été montré que l'absence de sécrétion d'IL2 par les lymphocytes T CD8 corrélait avec leur incapacité de proliférer. Dans nos mains, cette prolifération a pu être restaurée in vitro par l'adjonction exogène d'IL-2. Toutefois, la faisabilité de ce type de complémentation in vivo n'est pas claire. Des expériences additionnelles ont permis de préciser de stade de développement des lymphocytes doubles positifs et simples positifs par le biais des marqueurs CD45RA et CCR7. Il reste maintenant à comprendre pourquoi certains lymphocytes T CD8 spécifiques sont incapables à sécréter de l'IL-2. Article 2: Le deuxième article explore des nouvelles stratégies pour induire une immunité T CD8 spécifique aux protéines du VIH-1, qui sont édités et exposés à la surface des cellules infectées. Ces signaux consistent en fragments de peptide de 8-13 acide aminés provenant de protéines virales, et exposées à la surface des cellules infectées dans le cadre des molécules spécialisées d'histocompatibilité de classe I (en anglais "major histocompatibility class I" ou MHC I). Pour mimer une infection virale, la polyprotéine Gagpolnef du VIH-1 a été insérée et exprimée dans deux vecteurs viraux atténués, soit MVA (provenant de vaccinia virus) ou NYVAC (provenant d'un poxvirus). Ensuite des souris ont été infectées avec ces virus recombinants et la réponse T CD8 aux peptides issus de Gagpolnef a été étudiée. Les souris ont été capables de développer une réponse de type CD8 T contre ces antigènes du VIH-1. Pour tester si ces antigènes pouvaient aussi être présentés par dans le cadre de molécules MHC humaines, des expériences supplémentaires ont été faites avec des souris exprimant un MHC humain. Les résultats de ces manipulations ont montré que des cellules T CD8 spécifique aux protéines du VIH pouvaient être détectées. Ce travail ouvre de nouvelles options quant à l'utilisation des virus recombinants exprimant Gagpolnef comme stratégie vaccinale contre le virus VIH-I chez l'homme. Article 3: Ces revues décrivent la réponse immunitaire à CMV ainsi que des nouvelles méthodes pouvant servir à sa détection. Une partie du manuscrit décrit la détection de cellule T à l'aide de tétramères. Il s'agit de protéines chimériques composées de 4 quatre molécules MHC liées entre elles. Elles sont ensuite "chargées" avec le peptide antigénique approprié, et utilisée pour détecter les cellules T CD8 spécifiques à ce montage. Elles sont aussi marquées par un fluorochrome, qui permet une analyse avec un cytomètre de flux, et l'isolement ultime des CD8 d'intérêt. En résumé, le travail présenté dans cette thèse indique que (i) une réponse T CD8 appropriée - définie par la présence des cellules effectrices doublement positives pour l'IFN-γ et l'IL-2 - semble indispensable pour le contrôle des infections virales, y compris par le VIH-1, (ii) une telle réponse peut être induite par des vaccin viral recombinant, et (iii) la réponse T CD8 peut être analysée et suivie grâce à plusieurs techniques, incluant celle des tétramères de MHC class I. 1.3. Résumé pour un large public Le système immunitaire humain est composé de différents éléments (cellules, tissus et organes) qui participent aux défenses de l'organisme contre les pathogènes (bactéries, virus). Parmi ces cellules, les lymphocytes T CD8, également appelés cellules tueuses, jouent un rôle important dans la réponse immunitaire et le contrôle des infections virales. Les cellules T CD8 reconnaissent de manière spécifique des fragments de protéines virales qui sont exposés à la surface des cellules infectées par le virus. Suite à cette reconnaissance, les cellules T CD8 sont capables de détruire et d'éliminer ces cellules infectées, ainsi que les virus qu'elles contiennent. Dans le contexte d'une infection par le virus de l'immunodéficience humaine (VIH), le virus responsable du SIDA, il a pu être montré que la présence des cellules T CD8 est primordiale. En effet, en l'absence de ces cellules, les individus infectés par le VIH progressent plus rapidement vers le SIDA. Au cours de la vie, l'Homme est exposé à plusieurs virus. Mais à l'opposé du VIH, certains d'entre eux ne causent pas des maladies graves : par exemple le virus de la grippe (Influenza), le cytomégalovirus ou encore le virus d'Epstein-Barr. Certains de ces virus peuvent être contrôlés et éliminés de l'organisme (p. ex. le virus de la grippe), alors que d'autres ne sont que contrôlés par notre système immunitaire et restent présents en petite quantité dans le corps sans avoir d'effet sur notre santé. Le sujet de mon travail de thèse porte sur la compréhension du mécanisme de contrôle des infections virales par le système immunitaire : pourquoi certains virus peuvent être contrôlés ou même éliminés de l'organisme alors que d'autres, et notamment le VIH, ne le sont pas. Ce travail a permis de démontrer que les cellules T CD8 spécifiques du VIH ne sécrètent pas les mêmes substances, nécessaires au développement d'une réponse antivirale efficace, que les cellules T CD8 spécifiques des virus contrôlés (le virus de la grippe, le cytomégalovirus et le virus d'Epstein-Barr). Parallèlement nous avons également observé que les lymphocytes T CD8 spécifiques du VIH ne possèdent pas la capacité de se diviser. Ils sont ainsi incapables d'être présents en quantité suffisante pour assurer un combat efficace contre le virus du SIDA. La (les) différence(s) entre les cellules T CD8 spécifiques aux virus contrôlés (grippe, cytomégalovirus et Epstein-Barr) et au VIH pourront peut-être nous amener à comprendre comment restaurer une immunité efficace contre ce dernier.

Association study of lipoprotein(a) genetic markers, traditional risk factors, and coronary heart disease in HIV-1-infected patients.

Objectives: General population studies have shown associations between copy number variation (CNV) of the LPA gene Kringle-IV type-2 (KIV-2) coding region, single-nucleotide polymorphism (SNP) rs6415084 in LPA and coronary heart disease (CHD). Because risk factors for HIV-infected patients may differ from the general population, we aimed to assess whether these potential associations also occur in HIV-infected patients. Methods: A unicenter, retrospective, case-control (1:3) study. Eighteen HIV-patients with confirmed diagnosis of acute myocardial infarction (AMI) were adjusted for age, gender, and time since HIV diagnosis to 54 HIV-patients without CHD. After gDNA extraction from frozen blood, both CNV and SNP genotyping were performed using real-time quantitative PCR. All genetic and non-genetic variables for AMI were assessed in a logistic regression analysis. Results: Our results did not confirm any association in terms of lipoprotein(a) LPA structural genetic variants when comparing KIV-2 CNV (p = 0.67) and SNP genotypes (p = 0.44) between AMI cases and controls. However, traditional risk factors such as diabetes mellitus, hypertension, and CD4(+) T cell count showed association (p < 0.05) with CHD. Conclusion: Although significant associations of AMI with diabetes, hypertension and CD4(+) T cell count in HIV-patients were found, this study could not confirm the feasibility neither of KIV-2 CNV nor rs6415084 in LPA as genetic markers of CHD in HIV-infected patients.Highlights:● Individuals with HIV infection are at higher risk of coronary heart disease (CHD) than the non-infected population.● Our results showed no evidence of LPA structural genetic variants associated with CHD in HIV-1-infected patients.● Associations were found between diabetes mellitus, arterial hypertension, CD4(+) T cell count, and CHD.● The clinical usefulness of these biomarkers to predict CHD in HIV-1-infected population remains unproven.● Further studies are needed to assess the contribution of common genetic variations to CHD in HIV-infected individuals.

Gene flow and gene flux shape evolutionary patterns of variation in Drosophila subobscura

Gene flow (defined as allele exchange between populations) and gene flux (defined as allele exchange during meiosis in heterokaryotypic females) are important factors decreasing genetic differentiation between populations and inversions. Many chromosomal inversions are under strong selection and their role in recombination reduction enhances the maintenance of their genetic distinctness. Here we analyze levels and patterns of nucleotide diversity, selection and demographic history, using 37 individuals of Drosophila subobscura from Mount Parnes (Greece) and Barcelona (Spain). Our sampling focused on two frequent O-chromosome arrangements that differ by two overlapping inversions (OST and O3+4), which are differentially adapted to the environment as observed by their opposing latitudinal clines in inversion frequencies. The six analyzed genes (Pif1A, Abi, Sqd, Yrt, Atpa and Fmr1) were selected for their location across the O-chromosome and their implication in thermal adaptation. Despite the extensive gene flux detected outside the inverted region, significant genetic differentiation between both arrangements was found inside it. However, high levels of gene flow were detected for all six genes when comparing the same arrangement among populations. These results suggest that the adaptive value of inversions is maintained, regardless of the lack of genetic differentiation within arrangements from different populations, and thus favors the Local Adaptation hypothesis over the Coadapted Genome hypothesis as the basis of the selection acting on inversions in these populations.

Spatiotemporal variability in radial growth of trees in the Central Pyrenees: climatic and site influences.

To understand how tree growth has responded to recent climate warming, an understanding of the tree-climate-site complex is necessary. To achieve this, radial growth variability among 204 trees established before 1850 was studied in relation to both climatic and site factors. Seventeen forest stands were sampled in the Spanish Central Pyrenees. Three species were studied: Pinus uncinata, Abies alba, and Pinus sylvestris. For each tree, a ring-width residual chronology was built. All trees cross-dated well, indicating a common influence of the regional climate. For the 1952-1993 period, the radial growth of all species, especially P. uncinata, was positively correlated with warm Novembers during the year before ring formation and warm Mays of the year the annual ring formed. Differences in species-stand elevation modulated the growth-climate associations. Radial growth in P. uncinata at high elevation sites was reduced when May temperatures were colder and May precipitation more abundant. In the 20th century, two contrasting periods in radial growth were observed: one (1900-1949) with low frequency of narrow and wide rings, low mean annual sensitivity, and low common growth variation; and another (1950-1994) with the reverse characteristics. The increased variability in radial growth since the 1950s was observed for all species and sites, which suggests a climatic cause. The low shared variance among tree chronologies during the first half of the 20th century may result from a"relaxation" of the elevation gradient, allowing local site conditions to dominate macroclimatic influence. These temporal trends may be related to the recently reported increase of climatic variability and warmer conditions. This study emphasizes the need to carefully assess the relationships between radial growth and site conditions along ecological gradients to improve dendroclimatic reconstructions.

Multiplicative interaction of functional inflammasome genetic variants in determining the risk of gout.

INTRODUCTION: The acute gout flare results from a localised self-limiting innate immune response to monosodium urate (MSU) crystals deposited in joints in hyperuricaemic individuals. Activation of the caspase recruitment domain-containing protein 8 (CARD8) NOD-like receptor pyrin-containing 3 (NLRP3) inflammasome by MSU crystals and production of mature interleukin-1β (IL-1β) is central to acute gouty arthritis. However very little is known about genetic control of the innate immune response involved in acute gouty arthritis. Therefore our aim was to test functional single nucleotide polymorphism (SNP) variants in the toll-like receptor (TLR)-inflammasome-IL-1β axis for association with gout. METHODS: 1,494 gout cases of European and 863 gout cases of New Zealand (NZ) Polynesian (Māori and Pacific Island) ancestry were included. Gout was diagnosed by the 1977 ARA gout classification criteria. There were 1,030 Polynesian controls and 10,942 European controls including from the publicly-available Atherosclerosis Risk in Communities (ARIC) and Framingham Heart (FHS) studies. The ten SNPs were either genotyped by Sequenom MassArray or by Affymetrix SNP array or imputed in the ARIC and FHS datasets. Allelic association was done by logistic regression adjusting by age and sex with European and Polynesian data combined by meta-analysis. Sample sets were pooled for multiplicative interaction analysis, which was also adjusted by sample set. RESULTS: Eleven SNPs were tested in the TLR2, CD14, IL1B, CARD8, NLRP3, MYD88, P2RX7, DAPK1 and TNXIP genes. Nominally significant (P < 0.05) associations with gout were detected at CARD8 rs2043211 (OR = 1.12, P = 0.007), IL1B rs1143623 (OR = 1.10, P = 0.020) and CD14 rs2569190 (OR = 1.08; P = 0.036). There was significant multiplicative interaction between CARD8 and IL1B (P = 0.005), with the IL1B risk genotype amplifying the risk effect of CARD8. CONCLUSION: There is evidence for association of gout with functional variants in CARD8, IL1B and CD14. The gout-associated allele of IL1B increases expression of IL-1β - the multiplicative interaction with CARD8 would be consistent with a synergy of greater inflammasome activity (resulting from reduced CARD8) combined with higher levels of pre-IL-1β expression leading to increased production of mature IL-1β in gout.

Study of linkage between miniature and singed genes in Drosophila melanogaster

We have developed a practical exercise for undergraduate students whose main aim is to identify, using genetic crosses, a pair of D. melanogaster mutations (miniature and singed). Each student receives a vial with the problem strain containing two unknown mutations. The first step is to observe and describe both mutations. Then, the students carry out genetic crosses between mutant and normal strains: (P) ♀ mutant strain × ♂ normal strain (P) ♀ normal strain × ♂ mutant strain A different offspring is expected in these crosses: in the first one we will obtain normal females and m sn males, whereas in the second all individuals will present normal phenotype. It is possible to deduce that both are sex linked mutations. With this information and to simplify the amount of work, only F1 individuals from the first cross will be used (m+sn+ / m sn × m sn / Y chrom.) to obtain the F2 generation. By counting the number of miniature (recombinant type), singed (recombinant type), miniature-singed (parental type) and normal (parental type) flies it is possible to estimate the recombination frequency between both genes. Knowing the phenotype, their chromosomal location (X chromosome) and the genetic distance between both mutations, it is possible to identify them by finding all this information in a Drosophila melanogaster genetic map. Additionally, a statistical analysis can be carried out to compare the number of expected F2 individuals with those observed in the experiment. As the distance between both genes is 15.1 m.u., then the expected percentages for each phenotype would be: normal (42.45%), miniature-signed (42.45%), miniature (7.55%) and singed (7.55%). Multiplying the frequency of each class by the total number of individuals obtained in the F2 it is possible to estimate the expected number of flies for each class. Finally, a χ2 test can be computed to ascertain whether there are significant differences between expected and observed number of individuals.

Cryptic mosaicism involving a second chromosome X in patients with Turner syndrome

The high abortion rate of 45,X embryos indicates that patients with Turner syndrome and 45,X karyotype could be mosaics, in at least one phase of embryo development or cellular lineage, due to the need for the other sex chromosome presence for conceptus to be compatible with life. In cases of structural chromosomal aberrations or hidden mosaicism, conventional cytogenetic techniques can be ineffective and molecular investigation is indicated. Two hundred and fifty patients with Turner syndrome stigmata were studied and 36 who had female genitalia and had been cytogenetically diagnosed as having "pure" 45,X karyotype were selected after 100 metaphases were analyzed in order to exclude mosaicism and the presence of genomic Y-specific sequences (SRY, TSPY, and DAZ) was excluded by PCR. Genomic DNA was extracted from peripheral blood and screened by the human androgen receptor (HUMARA) assay. The HUMARA gene has a polymorphic CAG repeat and, in the presence of a second chromosome with a different HUMARA allele, a second band will be amplified by PCR. Additionally, the CAG repeats contain two methylation-sensitive HpaII enzyme restriction sites, which can be used to verify skewed inactivation. Twenty-five percent (9/36) of the cases showed a cryptic mosaicism involving a second X and approximately 14% (5/36), or 55% (5/9) of the patients with cryptic mosaicism, also presented skewed inactivation. The laboratory identification of the second X chromosome and its inactivation pattern are important for the clinical management (hormone replacement therapy, and inclusion in an oocyte donation program) and prognostic counseling of patients with Turner syndrome.

Association of polymorphisms at the ADIPOR1 regulatory region with type 2 diabetes and body mass index in a Brazilian population with European or African ancestry

Association studies between ADIPOR1 genetic variants and predisposition to type 2 diabetes (DM2) have provided contradictory results. We determined if two single nucleotide polymorphisms (SNP c.-8503G>A and SNP c.10225C>G) in regulatory regions of ADIPOR1 in 567 Brazilian individuals of European (EA; N = 443) or African (AfA; N = 124) ancestry from rural (quilombo remnants; N = 439) and urban (N = 567) areas. We detected a significant effect of ethnicity on the distribution of the allelic frequencies of both SNPs in these populations (EA: -8503A = 0.27; AfA: -8503A = 0.16; P = 0.001 and EA: 10225G = 0.35; AfA: 10225G = 0.51; P < 0.001). Neither of the polymorphisms were associated with DM2 in the case-control study in EA (SNP c.-8503G>A: DM2 group -8503A = 0.26; control group -8503A = 0.30; P = 0.14/SNP 10225C>G: DM2 group 10225G = 0.37; control group 10225G = 0.32; P = 0.40) and AfA populations (SNP c.-8503G>A: DM2 group -8503A = 0.16; control group -8503A = 0.15; P = 0.34/SNP 10225C>G: DM2 group 10225G = 0.51; control group 10225G = 0.52; P = 0.50). Similarly, none of the polymorphisms were associated with metabolic/anthropometric risk factors for DM2 in any of the three populations, except for HDL cholesterol, which was significantly higher in AfA heterozygotes (GC = 53.75 ± 17.26 mg/dL) than in homozygotes. We conclude that ADIPOR1 polymorphisms are unlikely to be major risk factors for DM2 or for metabolic/anthropometric measurements that represent risk factors for DM2 in populations of European and African ancestries.

Rings, Group Rings, and Their Graphs

We associate some graphs to a ring R and we investigate the interplay between the ring-theoretic properties of R and the graph-theoretic properties of the graphs associated to R. Let Z(R) be the set of zero-divisors of R. We define an undirected graph ᴦ(R) with nonzero zero-divisors as vertices and distinct vertices x and y are adjacent if xy=0 or yx=0. We investigate the Isomorphism Problem for zero-divisor graphs of group rings RG. Let Sk denote the sphere with k handles, where k is a non-negative integer, that is, Sk is an oriented surface of genus k. The genus of a graph is the minimal integer n such that the graph can be embedded in Sn. The annihilating-ideal graph of R is defined as the graph AG(R) with the set of ideals with nonzero annihilators as vertex such that two distinct vertices I and J are adjacent if IJ=(0). We characterize Artinian rings whose annihilating-ideal graphs have finite genus. Finally, we extend the definition of the annihilating-ideal graph to non-commutative rings.

Endothelin-1 and H2O2-induced signaling in vascular smooth muscle cells : modulation by CaMKII and Nitric oxide

L’endothéline-1 (ET-1) est un peptide vasoactif extrêmement puissant qui possède une forte activité mitogénique dans les cellules du muscle lisse vasculaire (VSMCs). Il a été démontré que l’ET-1 est impliquée dans plusieurs maladies cardio-vasculaires, comme l’athérosclérose, l'hypertension, la resténose après l'angioplastie, l’insuffisance cardiaque et l'arythmie. L’ET-1 exerce ses effets via plusieurs voies de signalisation qui incluent le Ca2+, les protéines kinases activées par les mitogènes (MAPKs) y compris les kinases régulées par les signaux extracellulaires (ERK1/2) et la voie de la phosphatidylinositol 3-kinase (PI-3K)/protein kinase B (PKB). Plusieurs études ont démontré que les dérivés réactifs de l'oxygène (ROS) peuvent jouer un rôle important dans la signalisation d’ERK1/2 et de PKB induite par plusieurs facteurs de croissance et hormones. Nous avons précédemment montré que l'ET-1 produit des ROS qui agissent comme médiateur de la signalisation cellulaire induite par l’ET-1. Le peroxyde d’hydrogène (H2O2), une molécule qui appartient à la famille des ROS, peut activer les voies de la MAPK et de la PKB dans les VSMCs. Par ailleurs, nos résultats suggèrent également que le Ca2+ et la calmoduline (CaM) sont essentiels pour la phosphorylation d’ERK1/2, de p38 et de PKB induite par le H2O2 dans les VSMCs. La Ca2+/CaM-dependent protein kinases II (CaMKII) est une sérine/thréonine protéine kinase multifonctionnelle activée par le Ca2+/CaM. Il a été montré que la CaMKII est impliquée dans les voies de signalisation induite par le H2O2 dans les cellules endothéliales. Cependant, le rôle de la CaMKII dans la phosphorylation d’ERK1/2, de PKB et de la proline-rich tyrosine kinase 2 (Pyk2) induite par l’ET-1 et le H2O2, de même que son rôle dans l’effet hypertrophique et prolifératif de l’ET-1 dans les VSMCs demeure inexploré. Le monoxyde d’azote (NO) est une molécule vasoactive impliquée dans la régulation de plusieurs réponses hormonales. Le NO peut moduler la signalisation contrôlant la croissance cellulaire induite par plusieurs agonistes d’où son rôle protecteur dans le système vasculaire. Des études ont montré que le NO peut inhiber la voie de Ras/Raf/ERK1/2 et la voie de PKB induite par le facteur de croissance endothélial (EGF) et l’angiotensine II (Ang II). Beaucoup d’autres travaux ont mis en évidence un cross-talk entre les voies de signalisation activées par l’ET-1 et le NO. La capacité du NO à inhiber la signalisation intracellulaire induite par l’ET-1 dans les VSMCs demeure inconnue. Le travail présenté dans cette thèse vise à déterminer le rôle du système Ca2+-CaM-CaMKII dans la phosphorylation d’ERK1/2, de PKB et de Pyk2 induite par l’ET-1 et le H2O2 ainsi que son rôle dans la croissance et la prolifération cellulaire induites par l’ET-1 dans les VSMCs. Nous avons également testé le rôle du NO dans la phosphorylation d’ERK1/2, de PKB et de Pyk2 ainsi que la synthèse protéique induite par l’ET-1. Dans la première partie de notre étude, nous avons examiné le rôle de la CaMKII dans la phosphorylation d’ERK1/2 et de PKB induite par l’ET-1 dans les VSMCs en utilisant trois approches différentes i.e. l'usage d'inhibiteurs pharmacologiques, un peptide auto-inhibiteur de la CaMKII (CaMKII AIP) et la technique de siRNA. Nous avons démontré que la CaMKII est impliquée dans la phosphorylation d’ERK1/2 et de PKB induite par l’ET-1 dans les VSMCs. Des études précédentes ont montré à l’aide d’inhibiteurs pharmacologiques comme le KN-93 que l'Ang II et les agents induisant une augmentation de la concentration en Ca2+ intracellulaire comme l’ionomycine, provoquent la phosphorylation d’ERK1/2 via la CaM dans les VSMCs. Cependant, en utilisant différentes approches, nos études ont montré pour la première fois une implication de la CaMKII dans la phosphorylation d’ERK1/2 et de PKB induite par l’ET-1 dans les VSMCs. Nous avons également rapporté pour la première fois, un rôle crucial de la CaMKII dans la pathophysiologie vasculaire associée à l’ET-1 puisque l’activation de la CaMKII joue un rôle important dans l’hypertrophie et la croissance cellulaire. Dans la deuxième partie, à la lumière des études précédentes qui montraient que les ROS agissent comme médiateurs de la signalisation induite par l’ET-1 dans les VSMCs, nous avons examiné si la CaMKII est également impliquée dans l’activation des voies d’ERK1/2 et de PKB induite par le H2O2. En utilisant des approches pharmacologiques et moléculaires, nous avons montré, comme pour l’ET-1, que la CaMKII joue un rôle critique en amont de la phosphorylation d’ERK1/2, de PKB et de Pyk2 induite par le H2O2. Nous avons précédemment montré que la transactivation du récepteur de type I de l’insulin-like growth factor (IGF-1R) est nécessaire à l’activation de PKB induite par le H2O2. Pour cette raison, nous avons examiné l'effet de l'inhibition de la CaMKII par l’inhibiteur pharmacologique ou par le knock-down de la CaMKII sur la phosphorylation d’IGF-1R induite par le H2O2. Les résultats démontrent que la CaMKII joue un rôle critique en amont de la phosphorylation d’ERK1/2, de PKB et d’IGF-1R induite par le H2O2. Dans la troisième partie de notre étude, nous avons également examiné le mécanisme moléculaire par lequel le NO exerce ses effets anti-mitogéniques et anti-hypertrophiques dans la signalisation induite par l’ET-1. En testant l'effet de deux différents donneurs de NO (S-nitroso-N-acetylpenicillamine (SNAP), sodium nitroprusside (SNP)) et un inhibiteur de NO synthase, le N (G)-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME) dans la phosphorylation d’ERK1/2, de PKB et de Pyk2 induite par l’ET-1, nous avons observé que le NO a un effet inhibiteur sur la signalisation induite par l’ET-1 dans les VSMCs. Par ailleurs, le 8-Br-GMPc, un analogue du GMPc, a un effet similaire à celui des deux donneurs du NO, tandis que l’oxadiazole quinoxaline (ODQ), un inhibiteur de la guanylate cyclase soluble, inverse l'effet inhibiteur du NO. Nous concluons que le NO diminue la phosphorylation d’ERK1/2, de PKB et de Pyk2 induite par l’ET-1 d’une manière dépendante du GMPc. Le NO inhibe aussi les effets hypertrophiques de l’ET-1 puisque le traitement avec le SNAP diminue la synthèse des protéines induite par l’ET-1. En résumé, les études présentées dans cette thèse démontrent que l’ET-1 et le H2O2 sont des activateurs de la phosphorylation d’ERK1/2, de PKB et de Pyk2 dans les VSMCs et que la CaMKII s’avère nécessaire pour ce processus, en agissant en amont de l’activation de IGF-1R induite par le H2O2 dans les VSMCs. Elles montrent également que le NO inhibe la phosphorylation d’ERK1/2, de PKB et de Pyk2 induite par l’ET-1. Enfin, nos travaux suggèrent aussi que l’activation de la CaMKII stimule la synthèse des protéines et de l’ADN induites par l’ET-1 alors que le NO inhibe la synthèse des protéines induite par ET-1. Mots clés: Endothéline ; Peroxyde d'hydrogène ; CaMKII ; Monoxyde d’azote ; Système vasculaire ; PKB; ERK1/2; IGF-1R; Hypertrophie.

Étude de facteurs génétiques prédictifs dans le neuroblastome, en particulier les anomalies du chromosmoe 14q

Le neuroblastome (NB) représente 8% de tous les cancers pédiatriques et est caractérisé par sa grande hétérogénéité clinique. Afin d’évaluer son pronostic, plusieurs facteurs génétiques sont utilisés : amplification de MYCN, délétion 1p, gain 11q et gain 17q. Les buts de notre travail étaient d’abord de vérifier si l’hybridation in situ en fluorescence (FISH) permet une analyse complète de ces anomalies et ensuite, en utilisant une analyse globale du génome telle le polymorphisme nucléotidique simple (SNP), de vérifier la concordance avec les résultats de la FISH et le pronostic potentiel des anomalies du 14q, en particulier du gène AKT. Nous avons donc établi un panel de sondes pour la FISH qui a été appliqué sur 16 tumeurs non-fixées. Après isolation de l’ADN de 36 tumeurs, nous avons effectué une analyse génotypique par SNP utilisant les puces « Affymetrix Genome-Wide Human SNP Array 6.0 » contenant 945,826 sondes non polymorphiques et 906,000 sondes polymorphiques. Nos résultats ont démontré que la FISH permet l’évaluation complète des anomalies génétiques importantes du NB et que les anomalies déséquilibrées sont détectées très précisément par SNP. Les anomalies du 14q tendent à être associées avec des facteurs cliniques comme le grade et l’évolution, contrairement aux anomalies d’AKT. L’analyse du 14q a révélé trois gènes d’intérêt, MAX, BCL11B et GPHN, qui devraient être analysés sur un plus grand échantillon. Ainsi, l’étude par FISH semble adaptée pour détecter les anomalies génétiques classiques du NB, alors que celles retrouvées en 14q représentent de potentielles cibles thérapeutiques pour cette tumeur.

Régions de susceptibilité dans les remaniements du chromosome Y et mosaïcisme : facteurs de risque du développement sexuel anormal

Le développement sexuel est un processus complexe qui dépend de nombreux gènes, une mutation pouvant entraîner un développement sexuel anormal. Par ailleurs, des anomalies chromosomiques peuvent avoir des répercussions importantes sur la détermination gonadique, surtout lorsqu'il s'agit du chromosome Y puisqu'il porte le gène clé du développement sexuel masculin. Premièrement, nous avons identifié par cytogénétique moléculaire le point de cassure chez 5 patients avec une translocation X;Y et 10 patients avec un chromosome Y isodicentrique. Nous avons ainsi démontré que certaines régions sont plus à risque d'être remaniées, notamment lorsqu'elles contiennent des palindromes ou d'autres séquences répétées. Nous avons également établi une relation entre la distance séparant le centromère et le point de cassure et l'instabilité des chromosomes Y isodicentriques lors des divisions cellulaires. Deuxièmement, nous avons étudié en cytogénétique les gonades de 22 patients avec un chromosome Y normal ou remanié et présentant un développement sexuel anormal. Nous avons mis en évidence la perte du chromosome Y remanié dans une majorité de cellules gonadiques des 10 patients étudiés, expliquant leur phénotype sexuel anormal. Cependant, chez 11 des 12 patients avec un chromosome Y normal, aucun mosaïcisme expliquant clairement leur détermination gonadique anormale n'a été retrouvé. Finalement, nous avons analysé par immunohistochimie les gonades dysgénésiques de 30 patients avec une anomalie du développement sexuel et un chromosome Y normal ou remanié. Nos travaux ont montré la présence de cellules germinales immatures au sein de cordons sexuels primitifs sous forme de tissu gonadique indifférencié dans 15 gonades, dont 9 ont évolué en tumeur gonadique. Dans 13 autres gonades, ces cellules germinales immatures avaient disparues par apoptose. Dans l'ensemble, notre recherche met en évidence la susceptibilité du chromosome Y à subir des remaniements et à être instable lors des divisions cellulaires, et indique que le mosaïcisme peut avoir des répercussions sur la détermination gonadique. Nos travaux montrent également que le tissu gonadique indifférencié peut évoluer vers deux entités, une tumeur gonadique ou une bandelette suite à l'apoptose des cellules germinales, mettant en lumière la nécessité d'analyser le tissu gonadique des patients XY avec dysgénésie gonadique dont les gonades sont laissées en place.

Enantiopure 3-substituted piperidines via an aziridinium ion ring expansion

Ce mémoire décrit le développement d’une nouvelle méthodologie d’expansion de cycle irréversible à partir de N-alkyl-3,4-déhydroprolinols pour former des N-alkyl tétrahydropyridines 3-substituées en passant par un intermédiaire aziridinium bicyclique. Cette méthode permet l’introduction d’un vaste éventail de substituants à la position 3 et tolère bien la présence de groupements aux positions 2 et 6, donnant accès à des pipéridines mono-, di- ou trisubstituées avec un excellent diastéréocontrôle. De plus, il est démontré que l’information stéréogénique du 3,4-déhydroprolinol de départ est totalement transférée vers le produit tétrahydropyridine. Additionnellement, une méthodologie fut dévelopée pour la préparation des produits de départ 3,4-déhydroprolinols en forme énantiopure, avec ou sans substituants aux positions 2 et 5, avec un très bon stéréocontrôle. Le premier chapitre présente un résumé de la littérature sur le sujet, incluant un bref survol des méthodes existantes pour la synthèse de pipéridines 3-substituées, ainsi qu’une vue d’ensemble de la chimie des aziridiniums. L’hypothèse originale ainsi que le raisonnement pour l’entreprise de ce projet y sont également inclus. Le second chapitre traite de la synthèse des N-alkyl-3,4-déhydroprolinols utilisés comme produits de départ pour l’expansion de cycle vers les tétrahydropyridines 3-substituées, incluant deux routes synthétiques différentes pour leur formation. Le premier chemin synthétique utilise la L-trans-4-hydroxyproline comme produit de départ, tandis que le deuxième est basé sur une modification de la réaction de Petasis-Mannich suivie par une métathèse de fermeture de cycle, facilitant l’accès aux précurseurs pour l’expansion de cycle. Le troisième chapitre présente une preuve de concept de la viabilité du projet ainsi que l’optimisation des conditions réactionnelles pour l’expansion de cycle. De plus, il y est démontré que l’information stéréogénique des produits de départs est transférée vers les produits. iv Au quatrième chapitre, l’étendue des composés pouvant être synthétisés par cette méthodologie est présentée, ainsi qu’une hypothèse mécanistique expliquant les stéréochimies relatives observées. Une synthèse énantiosélective efficace et divergente de tétrahydropyridines 2,3-disubstituées est également documentée, où les deux substituants furent introduits à partir d’un intermédiaire commun en 3 étapes.

Analyse génotypique des cellules initiatrices de tumeurs exprimant CD133 dans le neuroblastome

Le neuroblastome (NB) est la tumeur solide extracranienne la plus fréquente et mortelle chez les jeunes enfants. Il se caractérise par une résistance à la chimiothérapie possiblement en partie dû à la présence de cellules initiatrices de tumeurs (TICs). Des études ont mis en évidence le rôle de CD133 comme un marqueur des TICs dans divers types de cancers. Les buts de notre travail étaient d’abord de démontrer les vertus de TICs des cellules exprimant CD133 et ensuite, en utilisant une analyse globale du génome avec des polymorphismes nucléotidiques simples (SNPs), d’effectuer une analyse différentielle entre les TICs et les autres cellules du NB afin d’en identifier les anomalies génétiques spécifiques. Des lignées cellulaires de NB ont été triées par cytométrie de flux afin d’obtenir deux populations: une enrichie en CD133 (CD133high), l’autre faible en CD133 (CD133low). Afin de déterminer si ces populations cellulaires présentent des propriétés de TICs, des essais sur les neurosphères, les colonies en agar mou et les injections orthotopiques de 500 cellules sélectionnées dans 11 souris ont été réalisées. Après une isolation de l’ADN des populations sélectionnées, nous avons effectué une analyse génotypique par SNP utilisant les puces « Affymetrix Genome-Wide Human SNP Array 6.0 ». Pour vérifier l’expression des gènes identifiés, des Western Blots ont été réalisés. Nos résultats ont démontré que la population CD133 avait des propriétés de TICs in vitro et in vivo. L’analyse génotypique différentielle a permis d’identifier deux régions communes (16p13.3 and 19p13.3) dans la population CD133high ayant des gains et deux autres régions (16q12.1 and 21q21.3) dans la population CD133low possédant des pertes d’hétérozygoties (LOH). Aucune perte n’a été observée. Parmi les gènes étudiés, l’expression protéique d’éphrine-A2 était corrélée à celle de CD133 dans 6 tumeurs et 2 lignées cellulaires de NB. De plus, l’augmentation de la concentration d’anticorps anti-éphrine-A2 dans le milieu diminue la taille des neurosphères. Ainsi, la population CD133high, qui a des vertus de TICs, possède des caractéristiques génotypiques différentes par rapport à celle CD133low. La présence d’éphrine-A2 dans les cellules exprimant CD133 souligne son importance dans le développement des TICs. Ces résultats suggèrent la présence de potentielle cible pour de nouvelles thérapeutiques ciblant les TICs mise en évidence par l’étude génomique.