Sensibilidade toxicológica e especificidade do teste de microfixação de complemento na detecção de toxinas botulínicas C e D em meio de cultura e fígado de camundongos

No presente estudo pretendeu-se verificar a sensibilidade toxicológica e especificidade do Teste de Microfixação de Complemento (MCF) na detecção de toxinas botulínicas C e D no sobrenadante de cultivos bacterianos e em fígados de camundongos inoculados com doses letais e subletais. As toxinas foram produzidas em meio de cultura Hemoline, tituladas através da determinação da DL50 pelo Bioensaio em Camundongo e diluídas nas concentrações de 10, 1, 0,1, 0,01 e 0,001 DL50. Desta forma, foram utilizadas em dois modelos experimentais, onde foi determinada a sensibilidade toxicológica do MCF no sobrenadante do meio de cultura com as diluições descritas acima e ainda em extratos hepáticos de camundongos com peso corporal de 20g, inoculados com as mesmas diluições. A tentativa de evidenciação das toxinas botulínicas nos extratos hepáticos de camundongos foi realizada através da sua extração após a morte pela administração das doses letais e ainda pelo sacrifício dos animais inoculados com doses subletais, em intervalos de 5 dias. Os resultados evidenciaram uma sensibilidade toxicológica para o MCF de 100% para os dois tipos de toxinas ao nível de 0,01 DL50, quando testados os sobrenadantes de meio de cultura, portanto 100 vezes superior ao Bioensaio em Camundongo. A sensibilidade toxicológica do MCF, quando examinados extratos hepáticos de camundongos inoculados com 1 e 10 DL50 de toxinas botulínicas C e D, foi inferior, com valores de 100, 80, 89 e 72%, respectivamente. Pelo teste foi possível detectar toxinas botulínicas tipos C e D nos extratos hepáticos de camundongos inoculados com doses subletais até 15 dias após a sua inoculação. A especificidade do MCF foi de 88 e 92%, quando testados extratos hepáticos de camundongos sadios, e confrontados com as antitoxinas C e D; e 100% no sobrenadante do meio de cultura. Os resultados apontam para uma possível utilização do teste como importante instrumento de pesquisa e ainda na eventual substituição dos testes in vivo pelas suas implicações éticas e limitações práticas.

Scrapie e seu diagnóstico diferencial em ovinos no Mato Grosso do Sul

Scrapie é uma doença infecciosa, neurodegenerativa fatal, causada pelo príon scrapie (PrPsc). Apresenta-se tanto na forma clássica em ovinos e caprinos geneticamente susceptíveis quanto na forma atípica em ovinos. A primeira notificação oficial do Brasil à Organização Mundial de Saúde Animal (OIE), um caso da forma clássica diagnosticado no Rio Grande do Sul ocorreu em 1985, mas a doença já havia sido diagnosticada no mesmo Estado em 1978. Este trabalho objetivou descrever dois surtos de Scrapie em ovinos em Mato Grosso do Sul (MS), Brasil e investigar, por meio de imuno-histoquímica (IHQ) a presença de PrPsc no Sistema Nervoso Central (SNC) de ovinos examinados entre 2003 e 2010. Na primeira parte observaram-se dois ovinos com sinais clínicos típicos de scrapie, detalhando-se os sinais neurológicos, dados epidemiológicos, histopatológicos e amostras teciduais em duplicata desses ovinos foram encaminhadas para realização de diagnóstico de Raiva e para diagnóstico IHQ para príon. Na segunda parte realizou-se levantamento de laudos de necropsia e diagnósticos histopatológicos de ovinos, no período de maio de 2003 a março de 2010. Amostras de sistema nervoso central de 51 casos foram selecionados, incluindo os dois já com diagnóstico de Scrapie mencionados acima; os tecido de todos esses ovinos foram submetidos à IHQ para detecção de proteína priônica. Os 49 ovinos avaliados apresentaram resultado negativo na IHQ para príon.

Avaliação da função diastólica por meio de Doppler tecidual pulsado e colorido em gatos da raça Maine Coon geneticamente testados para a mutação no gene MyBPC-A31P

A cardiomiopatia hipertrófica (CMH) é a principal cardiopatia dos felinos e é caracterizada por hipertrofia miocárdica concêntrica, sem dilatação ventricular. Disfunções miocárdicas ocorrem em gatos com CMH, mas pouco se conhece a respeito destas alterações nos estágios iniciais da afecção. Em gatos da raça Maine Coon, a mutação no gene MyBPC-A31P está relacionada com a CMH de origem familial, porém, a correlação exata entre o genótipo e o fenótipo ainda é inconclusiva. A ecocardiografia tecidual é uma modalidade não invasiva que permite avaliação da função miocárdica e é mais sensível que a ecocardiografia convencional. Para avaliar as funções sistólica e diastólica, antes ou após a ocorrência de hipertrofia ventricular, gatos da raça Maine Coon (n=57), geneticamente testados para a mutação, foram avaliados por meio de ecocardiografias convencional e tecidual (nas modalidades Doppler tecidual pulsado e Doppler tecidual colorido). Posteriormente, foram fenotipicamente classificados em: normais (n=45), suspeitos (n=7) e acometidos pela CMH (n=5); e genotipicamente classificados em: negativos (n=28), heterozigotos (n=26) e homozigotos para a mutação (n=3). Valores de velocidades miocárdicas (Doppler tecidual pulsado e colorido) medidos na região basal e média do septo interventricular (SIV), da parede livre do ventrículo esquerdo (PVE), da parede anterior do ventrículo esquerdo (PAVE), da parede posterior do ventrículo esquerdo (PPVE) e do segmento radial da PVE, foram comparados nos diferentes grupos. Observou-se que as velocidades longitudinais Em (Doppler tecidual pulsado) na região média da PVE foram menores nos gatos com CMH quando comparados com suspeitos e normais. Os valores de Em/Am (Doppler tecidual colorido), na região basal do SIV, foram inferiores nos gatos com CMH quando comparados com suspeitos e normais. A relação E/Em (Doppler tecidual colorido), na região basal do SIV, foi maior nos gatos com CMH em relação aos suspeitos e normais, enquanto que os valores de Sm (Doppler tecidual colorido), em região basal da PVE, foram menores nos gatos heterozigotos quando comparados com os negativos, ambos sem hipertrofia ventricular. Observou-se correlação positiva entre a ocorrência de fusão das ondas Em e Am e a frequência cardíaca, assim como correlação positiva entre valores de Sm e Em e a frequência cardíaca (Doppler tecidual pulsado e colorido). A ecocardiografia tecidual é uma nova modalidade ecocardiográfica reprodutível em gatos que, isoladamente, não permite diferenciar gatos portadores da mutação antes do desenvolvimento de hipertrofia ventricular. Apresenta utilidade como auxílio no diagnóstico em fases iniciais, mas, apesar da expectativa para a identificação precoce de indivíduos portadores da CMH, ainda há necessidade de estudos mais extensos e com maior número de indivíduos.

Simulação da soja geneticamente modificada tolerante ao glyphosate por meio do cultivo de explantes

O objetivo do experimento consistiu na simulação in vitro da soja transgênica tolerante ao glyphosate, através do cultivo de explantes em meios de cultura contendo aminoácidos aromáticos. As avaliações basearam-se nos efeitos do glyphosate sobre sementes oriundas de explantes de soja (Glycine max (L.) Merr.) cv. UFV-16. Para tanto, explantes de soja foram cultivados em meios de cultura líquidos com pH em torno de 5,0. Cada explante constou de um legume completamente expandido contendo duas sementes de aproximadamente 100 mg, conectada a um segmento de caule de 45 mm de comprimento. Os tratamentos testados foram: A = glutamina (Gln); B = Gln + fenilalanina (Phe) + tirosina (Tyr) + triptofano (Trp); C = Gln + glyphosate; D = Gln + Phe + Tyr + Trp + glyphosate. O experimento foi conduzido sob irradiância de 80 mmol-2s-1 a 25oC por 204 horas. Nos tratamentos que receberam aminoácidos aromáticos e glutamina, o herbicida não afetou as massas fresca e seca das sementes, como também, não afetou seus constituintes bioquímicos (proteínas, óleo, ácidos graxos, carboidratos e clorofilas). Portanto, a suplementação exógena de aminoácidos aromáticos suprime os efeitos fitotóxicos do glyphosate sobre explantes de soja, permitindo estudos sobre o seu modo de ação e metabolismo nas sementes, uma vez que os explantes se comportaram analogamente à soja transgênica não suscetível ao herbicida.

Seletividade de herbicidas pós-emergentes aplicados na soja geneticamente modificada

O experimento foi instalado em área de plantio comercial de soja Roundup Ready®, na região do Pontal do Paranapanema, no município de Euclides da Cunha Paulista-SP, localizada a 20º 43' 11'' S e 50º 10' 20'' W, com uma altitude de 270 m. A fase experimental foi conduzida de dezembro de 2006 a abril de 2007, sob sistema plantio direto, com uma temperatura média de 25 ºC e índice pluviométrico de 800 mm. O solo da área experimental apresenta classe textural franco-argilo arenosa. Objetivou-se com este trabalho avaliar a eficácia e seletividade de glyphosate na formulação Roundup Transorb®, associado aos herbicidas diclosulam, cloransulam-methyl, flumioxazina e S-metolachlor em duas modalidades de aplicação: única, com associação do glyphosate aos herbicidas; e uma sequencial apenas com glyphosate aos 15 DAA, no manejo das plantas daninhas trapoeraba (Commelina benghalensis) e corda-de-viola (Ipomoea triloba) durante o cultivo da soja. O experimento foi instalado no delineamento de blocos ao acaso, com 12 tratamentos e quatro repetições. Os tratamentos foram distribuídos em arranjo fatorial acrescido de duas testemunhas: sem capina manual e com capina manual. O arranjo fatorial 2 x 5 contemplou duas condições de aplicação dos herbicidas (única e sequencial) e cinco herbicidas (glyphosate, glyphosate + diclosulam, glyphosate + cloransulam-methyl, glyphosate + flumioxazin e glyphosate + S-metolachlor). Nas condições de produtos, épocas de aplicação e doses, os resultados mostraram que o herbicida glyphosate aplicado em dose única ou sequencial e suas combinações com diclosulam e cloransulam-methyl na primeira aplicação não promovem fitointoxicação nas plantas de soja. A combinação com flumioxazin e S-metolachlor promoveu atraso no crescimento das plantas e no fechamento da cultura, em razão do efeito na altura dos indivíduos e comprimento dos ramos. No tratamento com o S-metolachlor, isso pode ser explicado pelo fato de o herbicida ser registrado para controle em pré-emergência e ter sido aplicado em pós-emergência. Nenhum dos tratamentos influenciou significativamente a produção de grãos da cultura da soja. A aplicação única ou a complementação com aplicação sequencial de glyphosate promoveram excelente controle de Commelina benghalensis e Ipomoea triloba.

Resposta de biótipos de Euphorbia heterophylla a doses de glyphosate

A leiteira (Euphorbia heterophylla) é uma planta daninha de ciclo anual encontrada com frequência em lavouras de soja na região Sul do Brasil, controlada em lavouras de soja geneticamente modificada (Roundup Ready® - RR) com uso do herbicida glyphosate. Entretanto, nos últimos anos, o controle dessa espécie não tem sido satisfatório em alguns locais, provocando a suspeita de que foram selecionados biótipos resistentes ao herbicida. Diante disso, o objetivo deste trabalho foi avaliar, por meio de curvas de dose-resposta, biótipos de leiteira com suspeita de resistência ao glyphosate. O experimento foi realizado em casa de vegetação, em delineamento experimental completamente casualizado, com quatro repetições. Os tratamentos constituíram-se de doses crescentes de glyphosate (0, 90, 180, 360, 720, 1.080, 1.440 e 2.160 g e.a. ha-1), aplicadas sobre cinco biótipos de leiteira, oriundos de lavouras de soja RR do Estado do Rio Grande do Sul. As variáveis avaliadas foram controle e matéria seca da parte aérea. Os resultados evidenciam que os biótipos de leiteira avaliados são suscetíveis ao glyphosate.

Avaliação do uso de glyphosate em soja geneticamente modificada e sua relação com o ácido chiquímico

Com o aumento da comercialização de culturas geneticamente modificadas (GM) resistentes ao glyphosate, é importante investigar a relação entre o uso desse herbicida e seus efeitos no crescimento e desenvolvimento de plantas de soja GM, assim como sua relação com o ácido chiquímico. Nesse sentido, foi conduzido um ensaio de campo e outro em casa de vegetação, com o objetivo de verificar a influência do glyphosate no crescimento, no desenvolvimento e na qualidade dos grãos da soja GM, bem como sua exsudação radicular e posterior absorção por plântulas de soja convencional cultivada sob condições hidropônicas. O ensaio de campo foi realizado em Eng. Coelho-SP, em 2007/08, sob delineamento de blocos ao acaso com quatro repetições, com aplicações isoladas (720 e 960 g e.a. ha-1 equivalente ácido) e sequenciais de glyphosate, com intervalo de 15 dias (720/720, 960/720 e 960/720/720 g e.a. ha-1 ). Transcorridos 42 dias da última aplicação de glyphosate, foram avaliados os efeitos sobre a densidade, altura de plantas e produtividade do cv. BRS Valiosa RR. Avaliou-se também o teor de ácido chiquímico sete dias após a última aplicação de glyphosate e o conteúdo de óleo e proteína dos grãos. No ensaio em casa de vegetação, conduzido sob o delineamento inteiramente casualizado com três repetições, soja GM cv. M8045RR e soja convencional cv. Conquista foram mantidas crescendo conjuntamente em solução hidropônica após aplicação de 2.400 g e.a. ha-1 de glyphosate no cultivar transgênico. O acúmulo de ácido chiquímico foi medido por HPLC a 0, 1, 3, 7 e 10 dias após aplicação do glyphosate, determinando-se também sua concentração e de seu metabólito, ácido aminometilfosfônico (AMPA), na solução nutritiva, por GC-MS. Os resultados mostraram que nenhum parâmetro fitométrico nem a qualidade nutricional dos grãos foram alterados pelas aplicações de glyphosate. Houve acúmulo de ácido chiquímico nas plantas de soja transgênica no campo quando tratadas de forma isolada com glyphosate. Os resultados também mostraram exsudação radicular do glyphosate por soja transgênica, com posterior absorção por soja convencional. Foram detectados resíduos de glyphosate e ácido aminometilfosfônico na solução nutritiva.

Identificaçao de sementes de arroz transformado geneticamente resistente ao herbicida glufosinato de amônio

O presente trabalho teve como objetivo avaliar a técnica do bioteste , em análise de rotina, para a detecção de sementes de arroz (Oryza sativa L.) geneticamente modificado, resistente ao herbicida glufosinato de amônio. Foram conduzidos dois ensaios baseados no teste de germinação. No Ensaio 1 foi empregado substrato umedecido com herbicida e no Ensaio 2, embebição da semente em solução contendo o herbicida. Foram utilizadas sementes de arroz da cultivar BR-IRGA 410 e da linhagem geneticamente modificada ABR 15, que contém o gene bar. No Ensaio 1 utilizou-se concentrações de zero a 0,2% do princípio ativo glufosinato de amônio e na embebição da semente (Ensaio 2), de zero a 2,0%. Foram medidos os comprimentos das plântulas normais aos sete e quatorze dias. Conclui-se que a técnica do bioteste utilizando o substrato umedecido com herbicida e a embebição das sementes em solução aquosa do herbicida no teste de germinação são eficientes na identificação de sementes de arroz resistente ao herbicida glufosinato de amônio.

Detecção de sementes de soja geneticamente modificada tolerante ao herbicida glifosato

Esta pesquisa teve por objetivos ajustar as metodologias de bioensaios para detecção de sementes de soja tolerante ao herbicida glifosato, estabelecendo o tempo mínimo necessário para uma avaliação segura, bem como a caracterização dos sintomas causados pelo herbicida nas plântulas não geneticamente modificadas. Foram conduzidos três bioensaios, baseados no teste de germinação. No Ensaio 1, as sementes foram pré-embebidas durante 16 horas em substrato umedecido com solução do herbicida. No Ensaio 2, o substrato foi mantido permanentemente umedecido em solução do herbicida. No Ensaio 3, as sementes foram imersas em solução do herbicida. Os parâmetros de avaliação foram: percentagem e velocidade de germinação, comprimentos da plântula, do hipocótilo e da raiz primária, percentagem de plântulas com raízes secundárias e caracterização morfológica. Concluiu-se que os bioensaios permitem detectar sementes de soja geneticamente modificada, tolerante ao glifosato, no prazo de cinco dias. As metodologias da semeadura em substrato umedecido com solução do herbicida, na concentração de 0,03% da formulação 480 g/L de i.a. e a da pré-embebição das sementes durante 16 horas, com solução contendo 0,4% e 0,6% de glifosato da formulação 480 g/L de i.a. são as recomendadas para utilização em rotina de Laboratório de Análise de Sementes. O glifosato causa anormalidade em plântulas de soja não geneticamente modificada. As plântulas apresentam engrossamento, estrias longitudinais e amarelecimento gradativo do hipocótilo, inibição do desenvolvimento da raiz primária e da emissão de raízes secundárias, sendo o hipocótilo proporcionalmente maior do que a raiz primária.

Detecção de soja geneticamente modificada tolerante ao glifosato por métodos baseados na atividade de enzimas

Avanços na engenharia genética permitiram a obtenção de plantas geneticamente modificadas tolerantes a determinados herbicidas. O uso de sementes de plantas geneticamente modificadas está aumentando rapidamente, havendo a necessidade de desenvolver métodos de identificação e detecção rápidos, práticos e de baixo custo, que possam ser padronizados.O objetivo desta pesquisa foi desenvolver um método bioquímico de deteccção de soja tolerante ao glifosato. Foram comparados dois genótipos de soja, um tolerante ao glifosato e seu parental não geneticamente modificado. As sementes foram submetidas a tratamentos de pré-embebição por 16 horas, em água e em solução de herbicida contendo 0,6% do ingrediente ativo e, mantidas a seguir em germinador à temperatura de 25°C por sete dias. Após, foi realizada a extração e a determinação da atividade da enzima peroxidase pela avaliação dos eletroforegramas e de reação colorimétrica. Os resultados obtidos permitiram concluir que é possível diferenciar cultivares de soja quanto à tolerância ao herbicida glifosato através da reação colorimétrica. Há diferença nos eletroforegramas de atividade da enzima peroxidase entre os cultivares tolerante e suscetível ao glifosato.

Bioensaios na detecção e quantificação de sementes de soja geneticamente modificada resistente ao glifosato

O cultivo mundial de soja geneticamente modificada (GM) resistente ao glifosato é crescente e a presença dessas sementes em lotes de sementes convencionais tornou-se um problema para o comércio internacional da soja. Reconhecendo a importância dos novos mercados e dos produtos GM, a Tecnologia de Sementes terá que assegurar a pureza genética dos produtos derivados da biotecnologia através de testes confiáveis, práticos e de baixo custo. Nesse contexto, os objetivos do trabalho foram verificar a eficiência do teste de germinação com herbicida no substrato (bioensaios) na detecção e na quantificação de misturas de cultivares GM em amostras de sementes convencionais. Amostras de sementes convencionais foram preparadas com 0, 1, 3 e 5% de sementes de soja GM e submetidas aos métodos de pré-embebição, substrato umedecido e imersão em herbicida, instaladas em bandejas plásticas contendo 25 sementes, com e sem associação ao kit de detecção de OGM. Na seqüência, amostras contaminadas com 0, 1, 3, 5 e 8% de sementes de soja GM foram semeadas em rolos de papel (25 e 50 sementes/rolo) e bandejas plásticas com 25 sementes seguindo o método de pré-embebição em herbicida. Aos seis dias após a instalação, avaliaram-se comprimento de hipocótilo, comprimento de raiz, número de raízes secundárias e comprimento da maior raiz secundária. O método de pré-embebição é o mais eficiente para a detecção e quantificação da presença de sementes de soja GM, permitindo 100% de acertos na detecção, independentemente da porcentagem de contaminantes nas amostras convencionais de sementes de soja e apresenta exatidão na quantificação da presença de até 3% de sementes de soja GM em amostras convencionais, sendo sua precisão condicionada ao porcentual de mistura presente na amostra.

Comparação de métodos na detecção de sementes de soja geneticamente modificada resistente ao glifosato

Pesquisas tem sido conduzidas visando determinar métodos de detecção de organismos geneticamente modificados (OGM), devido, principalmente, à importância sobre a atividade comercial. Atualmente, são utilizados bioensaios, que avaliam características fenotípicas das plântulas, testes de ELISA e Kits, que possibilitam identificar proteínas transgênicas específicas de DNA. O objetivo deste trabalho foi comparar a eficiência dos métodos para detectar sementes de soja Roundup Ready (RR). Amostras de sementes de soja geneticamente modificada (GM) resistente ao glifosato e de sementes do parental suscetível foram submetidas a bioensaios (pré-embebidas, umedecidas em substrato, imersas em solução contendo glifosato e pulverização de plântulas), Kit Trait Test e detecção pelo método da PCR. Os bioensaios são métodos mais eficientes comparando a relação custo/benefício na detecção de sementes de soja GM, sendo o método de pré-embebição o mais indicado e a análise das características morfológicas de plântulas é importante nos bioensaios para detecção de sementes de soja GM.

Bioensaio em casa-de-vegetação na detecção e quantificação de sementes de soja geneticamente modificada

Preocupações com os atributos intrínsecos e extrínsecos de qualidade nos alimentos têm crescido nas últimas décadas e a polêmica acirrou-se com a entrada no mercado dos alimentos geneticamente modificados (GM) de consumo global. Esta situação tem levado institutos de pesquisa, agências de inspeção e companhias de vários países a desenvolver estratégias e métodos para detecção de sementes de plantas GM. Nesse contexto, o objetivo deste trabalho foi verificar a eficiência de bioensaio em casa-de-vegetação na detecção e quantificação de misturas de sementes GM em amostras convencionais. Amostras de sementes convencionais foram preparadas com 0, 1, 3 e 5% de sementes de soja GM e semeadas em bandejas plásticas contendo areia peneirada. As bandejas foram mantidas em casa-de-vegetação climatizada e, após quinze dias da instalação do experimento, aplicou-se o herbicida glifosato sobre as plântulas. Catorze dias depois da aplicação do herbicida, avaliou-se o número de plântulas sobreviventes, sem sintomas da ação do glifosato, determinando se a plântula era ou não geneticamente modificada . O bioensaio em casa-de-vegetação é eficiente para detecção e estimativa da quantidade de sementes de soja GM em amostras de soja convencional.

Sistema hidropônico com uso de solução de herbicida na detecção de soja geneticamente modificada resistente ao glifosato

Os objetivos deste estudo foram verificar a eficiência do sistema hidropônico com uso de solução herbicida na detecção de cultivares de soja GM resistentes ao glifosato e convencionais e estabelecer um protocolo de detecção em sistema hidropônico. Foram utilizadas amostras de sementes de dois genótipos geneticamente modificados e os respectivos parentais não geneticamente modificados (não-GM). Foram realizados cinco ensaios para estabelecer o protocolo de detecção; nos ensaios I e II foi realizada a pré-germinação das sementes, seguida da colocação das plântulas em recipientes contendo solução nutritiva, com posterior transferência para solução de herbicida (as concentrações utilizadas foram 0; 0,12; 0,24; 0,36; 0,48% do equivalente ácido do glifosato), e finalmente, as plântulas retornaram para a solução nutritiva. Nos ensaios III, IV e V, as sementes foram colocadas diretamente em recipientes contendo solução de herbicida e depois transferidas para solução nutritiva. Os parâmetros avaliados foram porcentagem de plântulas normais, comprimento de plântula, de raiz e de parte aérea e número de raízes secundárias. O sistema hidropônico permite a detecção de sementes de soja resistente ao glifosato em 5 dias, após tratamento com solução de glifosato. O protocolo de detecção de sementes de soja GM em sistema hidropônico recomendado é a permanência das sementes em contato com a solução do herbicida na concentração de 0,12% do equivalente ácido do glifosato por quatro horas, seguido da transferência das sementes para a solução nutritiva até completar cinco dias, utilizando como parâmetro de avaliação o comprimento de plântulas e a presença de raízes secundarias das plântulas de soja GM.