Identification des canaux TRPC impliqués dans la potentialisation à long terme des interneurones de la région CA1 de l'hippocampe chez le rat

Le réseau neuronal de l’hippocampe joue un rôle central dans la mémoire en modifiant de façon durable l’efficacité de ses synapses. Dans les interneurones de la couche oriens/alveus (O/A), l’induction de la potentialisation à long terme (PLT) requiert les courants postsynaptiques excitateurs évoqués par les récepteurs métabotropes du glutamate de sous-type 1a (CPSEmGluR1a) et l’entrée subséquente de Ca2+ via des canaux de la famille des transient receptor potential (TRP). Le but de ce projet était d’identifier les canaux TRP responsables des CPSEmGluR1a et d’explorer les mécanismes moléculaires régulant leur ouverture. Nous avons déterminé par des enregistrements électrophysiologiques que les CPSEmGluR1a étaient spécifiques aux interneurones O/A et qu’ils étaient indépendants de la phospholipase C. Nous avons ensuite examiné l’expression des TRPC et leur interaction avec mGluR1a par les techniques de RT-PCR, d’immunofluorescence et de co-immunoprécipitation. Nos résultats montrent que TRPC1 et mGluR1a s’associent dans l’hippocampe et que ces deux protéines sont présentes dans les dendrites des interneurones O/A. En revanche, TRPC4 ne semble s’associer à mGluR1a qu’en système recombinant et leur colocalisation paraît limitée au corps cellulaire. Finalement, nous avons procédé à des enregistrements d’interneurones dans lesquels l’expression des TRPC a été sélectivement supprimée par la transfection d’ARN interférant et avons ainsi démontré que TRPC1, mais non TRPC4, est une sous-unité obligatoire du canal responsable des CPSEmGluR1a. Ces travaux ont permis de mieux comprendre les mécanismes moléculaires à la base de la transmission synaptique des interneurones O/A et de mettre en évidence un rôle potentiel de TRPC1 dans la PLT.

Les terrains vacants et la lisibilité du centre-ville de Montréal.

Les terrains vacants sont, à Montréal, des éléments indéniables dans la composition de la trame urbaine. Leur présence soutenue intéresse déjà depuis longtemps de nombreux auteurs et décideurs municipaux. Toutefois, il s’avère que l’on connaît peu les caractéristiques paysagères de ces espaces. Cette recherche en aménagement vise à compléter nos connaissances sur cette typologie d’espace urbain. Elle porte sur la caractérisation paysagère des terrains vacants du centre-ville de Montréal et sur l’étude de leur potentiel visuel à mettre en valeur les attributs significatifs du paysage urbain. Ces deux études doivent permettre de comprendre le rôle joué par ces vides dans la perception du paysage urbain. Cette démarche s’interroge sur la possibilité que certains vides puissent être justifiés et légitimés en regard de la notion de lisibilité du paysage urbain (Lynch, 1976, 1982). Les terrains joueraient un rôle important au niveau de la perception des paysages urbains. Il s’agit de démontrer le potentiel des espaces vacants dans la mise en valeur du paysage urbain, dans l’optique, pour certains d’entre eux, de légitimer le vide ou une partie du vide qui les définit, de les rendre structurants dans la composition urbaine. Grâce à un travail d’observation des caractéristiques urbaines, contextuelles, visuelles et physiques, l’étude a pu à la fois dresser le portrait de ces espaces en attente de développement urbain et démontrer leur implication dans la lisibilité urbaine. Ce travail présente l’intérêt d’offrir un énoncé sur la planification du développement des terrains vacants du centre-ville de Montréal en regard de la notion de lisibilité urbaine partie prenante dans la qualité urbaine.

Caractérisation de la SERPINA1, une antiprotéase différentiellement exprimée dans le cancer épithélial de l’ovaire

Le cancer épithélial de l’ovaire est le cancer gynécologique le plus létal. La survie à 5 ans est de 30-40% chez les patientes atteintes d’une tumeur invasive (TOV), comparativement à 95% chez les patientes diagnostiquées pour une tumeur à faible potentiel de malignité ou borderline (LMP). Au laboratoire, l’analyse de l’expression des gènes de la micropuce à ADN U133 d’Affymetrix a révélé que la SERPINA1 est un gène dont l’expression varie entre les tumeurs LMP et TOV. La validation par Q-PCR nous a confirmé que cette antiprotéase est majoritairement surexprimée dans les tumeurs LMP, par rapport aux tumeurs bénignes (BOV) et aux tumeurs TOV. Nous avons donc surexprimé la SERPINA1 dans les lignées cellulaires invasives TOV 112D et TOV 1946 du cancer de l’ovaire et dérivé des clones stables. Les résultats obtenus nous indiquent que la surexpression de la SERPINA1 a un effet sur la capacité d’invasion et de migration cellulaire et non au niveau de la croissance cellulaire et la formation de structures tridimensionnelles. Les résultats issus de l’étude in vivo dans les souris SCID nous permettront de déterminer si la surexpression de la SERPINA1 a un effet sur la tumorigénèse ovarienne. Ainsi, la SERPINA1 demeure à notre avis un candidat d’intérêt pour tenter de mieux comprendre les différences biologiques entre les tumeurs LMP et TOV, ainsi que le rôle des protéases et de leurs inhibiteurs dans la progression tumorale du cancer de l’ovaire.

Évaluation du risque cancérigène associé à la contamination de l’eau potable de puits municipaux par les nitrates/nitrites dans certaines régions rurales du Québec

La spécialisation des techniques agricoles que nous connaissons ces dernières décennies, particulièrement dans les régions rurales, est à l’origine de l’abus de fertilisants. Ces derniers sont actuellement reconnus comme étant les causes principales de la contamination de l’eau souterraine par les nitrates. Suite à leur ingestion via l’eau potable, les nitrates sont transformés en nitrites par la flore buccale. Une fois dans l’estomac les nitrites réagissent avec certaines amines provenant de l’alimentation pour générer des nitrosamines cancérogènes. L’objectif de notre étude était d’estimer quantitativement l’excès de risque de cancer (ER) pour les populations de sept régions rurales du Québec qui consomme l’eau potable provenant de réseaux municipaux alimentés en eau souterraine. Le territoire à l’étude était caractérisé par une agriculture intensive d’élevage. Les médianes (et 95e centiles) régionales des concentrations de nitrates mesurées dans les réseaux de ces régions étaient de : 0,18 (2,74); 0,48 (10,35); 0,15 (1,28); 0,32 (11); 0,05 (0,76); 0,10 (4,69); 0,09 (2,13) mg N-NO3-/l. Nous avons envisagé un scénario de transformation complète des nitrites et de certaines amines (diméthylamine, diéthylamine, n-butylamine, méthyléthylamine) en nitrosamines spécifiques : N-diméthylnitrosamine (NDMA), N-diéthylnitrosamine (NDEA), N-n-dibutylnitrosamine (NDBA) et N-méthyléthylnitrosamine (NMEA). Pour estimer la concentration de nitrites formés dans l’estomac, nous avons considéré une consommation définie d’eau potable, le volume de l’estomac et un taux de transformation des nitrates en nitrites. Supposant les quantités de nitrites et de chaque amine constantes pendant 1h, nous avons considéré la constante de nitrosation spécifique à chaque amine pour évaluer la dose d’exposition journalière à chaque nitrosamine équivalente formée. Par la suite, la combinaison de cette dose à un estimateur de potentiel cancérogène qhumain spécifique à chaque nitrosamine, nous a permis d’évaluer l’ER associé à chacune d’elles. Globalement l’analyse a démontré que les ER les plus élevés, estimés pour le NDBA, étaient de l’ordre de 10-6, ne contribuant pas de façon significative à une augmentation du risque de cancer pour ces populations.

Interactions protéiques et relation dynamique entre phosphorylation / sumoylation / ubiquitination des protéines TIF1α, β et PML: détection in vivo par BRET

Trois protéines de la famille TRIM (Motif TRIpartite), TIF1α, β (Transcriptional Intermediary Factor 1) et PML (ProMyelocytic Leukaemia¬), font l’objet de cette étude. TIF1α est connu comme un coactivateur des récepteurs nucléaires et TIF1β comme le corépresseur universel des protéines KRAB-multidoigt de zinc dont le prototype étudié ici est ZNF74. PML possède divers rôles dont le plus caractérisé est celui d’être l’organisateur principal et essentiel des PML-NBs (PML-Nuclear Bodies), des macrostructures nucléaires très dynamiques regroupant et coordonnant plus de 40 protéines. Il est à noter que la fonction de TIF1α, β et PML est régulée par une modification post-traductionnelle, la sumoylation, qui implique le couplage covalent de la petite protéine SUMO (Small Ubiquitin like MOdifier) à des lysines de ces trois protéines cibles. Cette thèse propose de développer des méthodes utilisant le BRET (Bioluminescence Resonance Energy Transfert) afin de détecter dans des cellules vivantes et en temps réel des interactions non-covalentes de protéines nucléaires mais aussi leur couplage covalent à SUMO. En effet, le BRET n’a jamais été exploré jusqu’alors pour étudier les interactions non-covalentes et covalentes de protéines nucléaires. L’étude de l’interaction de protéines transcriptionnellement actives est parfois difficile par des méthodes classiques du fait de leur grande propension à agréger (famille TRIM) ou de leur association à la matrice nucléaire (ZNF74). L’homo et l’hétérodimérisation de TIF1α, β ainsi que leur interaction avec ZNF74 sont ici testées sur des protéines entières dans des cellules vivantes de mammifères répondant aux résultats conflictuels de la littérature et démontrant que le BRET peut être avantageusement utilisé comme alternative aux essais plus classiques basés sur la transcription. Du fait de l’hétérodimérisation confirmée de TIF1α et β, le premier article présenté ouvre la possibilité d’une relation étroite entre les récepteurs nucléaires et les protéines KRAB- multidoigt de zinc. Des études précédentes ont démontré que la sumoylation de PML est impliquée dans sa dégradation induite par l’As2O3 et dépendante de RNF4, une E3 ubiquitine ligase ayant pour substrat des chaînes de SUMO (polySUMO). Dans le second article, grâce au développement d’une nouvelle application du BRET pour la détection d’interactions covalentes et non-covalentes avec SUMO (BRETSUMO), nous établissons un nouveau lien entre la sumoylation de PML et sa dégradation. Nous confirmons que le recrutement de RNF4 dépend de SUMO mais démontrons également l’implication du SBD (Sumo Binding Domain) de PML dans sa dégradation induite par l’As2O3 et/ou RNF4. De plus, nous démontrons que des sérines, au sein du SBD de PML, qui sont connues comme des cibles de phosphorylation par la voie de la kinase CK2, régulent les interactions non-covalentes de ce SBD mettant en évidence, pour la première fois, que les interactions avec un SBD peuvent dépendre d’un évènement de phosphorylation (“SBD phospho-switch”). Nos résultats nous amènent à proposer l’hypothèse que le recrutement de PML sumoylé au niveau des PML-NBs via son SBD, favorise le recrutement d’une autre activité E3 ubiquitine ligase, outre celle de RNF4, PML étant lui-même un potentiel candidat. Ceci suggère l’existence d’une nouvelle relation dynamique entre phosphorylation, sumoylation et ubiquitination de PML. Finalement, il est suggéré que PML est dégradé par deux voies différentes dépendantes de l’ubiquitine et du protéasome; la voie de CK2 et la voie de RNF4. Enfin une étude sur la sumoylation de TIF1β est également présentée en annexe. Cette étude caractérise les 6 lysines cibles de SUMO sur TIF1β et démontre que la sumoylation est nécessaire à l’activité répressive de TIF1β mais n’est pas impliquée dans son homodimérisation ou son interaction avec la boîte KRAB. La sumoylation est cependant nécessaire au recrutement d’histones déacétylases, dépendante de son homodimérisation et de l’intégrité du domaine PHD. Alors que l’on ne connaît pas de régulateur physiologique de la sumoylation outre les enzymes directement impliquées dans la machinerie de sumoylation, nous mettons en évidence que la sumoylation de TIF1β est positivement régulée par son interaction avec le domaine KRAB et suggérons que ces facteurs transcriptionnels recrutent TIF1β à l’ADN au niveau de promoteur et augmentent son activité répressive en favorisant sa sumoylation.

Régulation de l’expression du gène Six6 par les facteurs de transcription Lhx2 et Pax6 dans le contexte des cellules souches rétiniennes

La rétinogésèse des vertébrés est la culmination de processus biologiques complexes parfaitement exécutés. Cette délicate orchestration est principalement contrôlée par les facteurs de transcription qui permettent aux progéniteurs rétiniens de proliférer, de s’auto-renouveler et de se différencier de façon appropriée. Les facteurs de transcription à homéodomaine sont les protéines qui sont responsables de la démarcation du site du primordium optique et participeront même à la différenciation tardive des différents types cellulaires de la rétine. Le contrôle génétique concernant l‘activation de l’expression de facteurs de transcription est peu connu. Nous avons étudié les séquences génomique avoisinant le gène Six6 afin d’identifier et mieux comprendre son promoteur. Des expériences d’immunoprécipitation de chromatine et des essais luciférases ont confirmé la liaison et la transactivation synergique du promoteur potentiel de Six6 par Lhx2 et Pax6 in vitro. Cette présente étude confirme et précise également le rôle de Lhx2 au niveau du développement précoce de l’oeil. La compréhension détaillée des réseaux génétiques régulant les progéniteurs rétiniens à former une rétine fonctionnelle est essentielle. En effet, lorsque ces connaissances seront acquises, nous serons en mesure d’appliquer les thérapies cellulaires pour rétablir les fonctions rétiniennes lors de pathologies dégénératives.

Assistance de l’enseignement de la conception architecturale par la modélisation de savoir-faire des référents

Dans une époque de changements des moyens de représentation et communication en architecture, cette recherche porte sur l’enseignement de la conception architecturale et plus spécifiquement sur l’apport que l’informatique pourrait avoir dans ce processus. En nous basant sur une méthodologie qualitative, exploratoire et participative, nous y procédons par enchainement de questions, celle de départ étant la suivante: Comment l’enseignement de la conception architecturale pourrait tirer avantage des moyens numériques? Notre objectif est de proposer des méthodes et des outils d’apprentissage aux étudiants en architecture pour enrichir leurs démarches de conception grâce à l’ordinateur. Après une revue de la littérature dans le domaine, et un approfondissement de l’étude sur le rôle des référents architecturaux et sur la conception intégrée, nous avons procédé à une observation exploratoire du travail des étudiants en atelier d’architecture. Ces premières étapes de la recherche ont permis de dégager des discordances entre les positions théoriques et la pratique en l’atelier, pour concrétiser ultérieurement la question de recherche. Dans le but de discerner des méthodes efficaces et innovatrices pour répondre aux discordances identifiées, nous avons engagé une étude de la littérature sur les théories cognitives par rapport aux connaissances, l’apprentissage et la conception. Certaines stratégies ont pu être définies, notamment la nécessité de représentation multimodale des référents architecturaux, l’importance de représenter le processus et non seulement le résultat, ainsi que l’avantage d’inciter les étudiants à travailler dans leur ‘zone proximale’ de développement. Suite à ces recherches, une méthode d’enseignement complémentaire a été définie. Elle propose aux étudiants des explorations de l’objet en conception basées sur la manipulation des savoir-faire architecturaux. Cette méthode a été opérationnalisée d’un point de vue pédagogique ainsi que didactique et mise à l’épreuve auprès des étudiants en atelier. Un prototype de librairie de référents architecturaux interactifs (LibReArchI) a été créé dans ce but. Elle a été conçue en tant qu’environnement de conception et espace de partage de savoir-faire entre étudiants et enseignants. Les principaux résultats de cette recherche démontrent le rôle positif de la méthode proposée pour le transfert des savoir-faire architecturaux lors de l’apprentissage en atelier. Son potentiel d’assister la conception intégrée et de stimuler l’émergence d’idées a été constaté. Au niveau théorique, un modèle d’un cycle du processus de design avec le numérique a été esquissé. En conclusion, des avenues de développements futurs de cette recherche sont proposées.

Les mécanismes synaptiques et intrinsèques qui sous-tendent l’activité des cellules réticulospinales (RS) en réponse à une stimulation sensorielle de type cutané chez la lamproie

Chez diverses espèces animales, les informations sensorielles peuvent déclencher la locomotion. Ceci nécessite l’intégration des informations sensorielles par le système nerveux central. Chez la lamproie, les réseaux locomoteurs spinaux sont activés et contrôlés par les cellules réticulospinales (RS), système descendant le plus important. Ces cellules reçoivent des informations variées provenant notamment de la périphérie. Une fois activées par une brève stimulation cutanée d’intensité suffisante, les cellules RS produisent des dépolarisations soutenues de durées variées impliquant des propriétés intrinsèques calcium-dépendantes et associées à l’induction de la nage de fuite. Au cours de ce doctorat, nous avons voulu savoir si les afférences synaptiques ont une influence sur la durée des dépolarisations soutenues et si l’ensemble des cellules RS partagent des propriétés d’intégration similaires, impliquant possiblement les réserves de calcium internes. Dans un premier temps, nous montrons pour la première fois qu’en plus de dépendre des propriétés intrinsèques des cellules réticulospinales, les dépolarisations soutenues dépendent des afférences excitatrices glutamatergiques, incluant les afférences spinales, pour perdurer pendant de longues périodes de temps. Les afférences cutanées ne participent pas au maintien des dépolarisations soutenues et les afférences inhibitrices glycinergique et GABAergiques ne sont pas suffisantes pour les arrêter. Dans un deuxième temps, nous montrons que suite à une stimulation cutanée, l’ensemble des cellules RS localisées dans les quatre noyaux réticulés possèdent un patron d’activation similaire et elles peuvent toutes produire des dépolarisations soutenues dont le maintien ne dépend pas des réserves de calcium internes. Enfin, les résultats obtenus durant ce doctorat ont permis de mieux comprendre les mécanismes cellulaires par lesquels l’ensemble des cellules RS intègrent une brève information sensorielle et la transforment en une réponse soutenue associée à une commande motrice.

Genes involved in the metabolism of fatty acids and risk for Crohn's disease in children: a candidate gene study

Contexte - La prévalence de la maladie de Crohn (MC), une maladie inflammatoire chronique du tube digestif, chez les enfants canadiens se situe parmi les plus élevées au monde. Les interactions entre les réponses immunes innées et acquises aux microbes de l'hôte pourraient être à la base de la transition de l’inflammation physiologique à une inflammation pathologique. Le leucotriène B4 (LTB4) est un modulateur clé de l'inflammation et a été associé à la MC. Nous avons postulé que les principaux gènes impliqués dans la voie métabolique du LTB4 pourrait conférer une susceptibilité accrue à l'apparition précoce de la MC. Dans cette étude, nous avons exploré les associations potentielles entre les variantes de l'ADN des gènes ALOX5 et CYP4F2 et la survenue précoce de la MC. Nous avons également examiné si les gènes sélectionnés montraient des effets parent-d'origine, influençaient les phénotypes cliniques de la MC et s'il existait des interactions gène-gène qui modifieraient la susceptibilité à développer la MC chez l’enfant. Méthodes – Dans le cadre d’une étude de cas-parents et de cas-témoins, des cas confirmés, leurs parents et des contrôles ont été recrutés à partir de trois cliniques de gastro-entérologie à travers le Canada. Les associations entre les polymorphismes de remplacement d'un nucléotide simple (SNP) dans les gènes CYP4F2 et ALOX5 ont été examinées. Les associations allélique et génotypiques ont été examinées à partir d’une analyse du génotype conditionnel à la parenté (CPG) pour le résultats cas-parents et à l’aide de table de contingence et de régression logistique pour les données de cas-contrôles. Les interactions gène-gène ont été explorées à l'aide de méthodes de réduction multi-factorielles de dimensionnalité (MDR). Résultats – L’étude de cas-parents a été menée sur 160 trios. L’analyse CPG pour 14 tag-SNP (10 dans la CYP4F2 et 4 dans le gène ALOX5) a révélé la présence d’associations alléliques ou génotypique significatives entre 3 tag-SNP dans le gène CYP4F2 (rs1272, p = 0,04, rs3093158, p = 0.00003, et rs3093145, p = 0,02). Aucune association avec les SNPs de ALOX5 n’a pu être démontrée. L’analyse de l’haplotype de CYP4F2 a montré d'importantes associations avec la MC (test omnibus p = 0,035). Deux haplotypes (GAGTTCGTAA, p = 0,05; GGCCTCGTCG, p = 0,001) montraient des signes d'association avec la MC. Aucun effet parent-d'origine n’a été observé. Les tentatives de réplication pour trois SNPs du gene CYP4F2 dans l'étude cas-témoins comportant 225 cas de MC et 330 contrôles suggèrent l’association dans un de ceux-ci (rs3093158, valeur non-corrigée de p du test unilatéral = 0,03 ; valeur corrigée de p = 0.09). La combinaison des ces deux études a révélé des interactions significatives entre les gènes CYP4F2, ALOX et NOD2. Nous n’avons pu mettre en évidence aucune interaction gène-sexe, de même qu’aucun gène associé aux phénotypes cliniques de la MC n’a pu être identifié. Conclusions - Notre étude suggère que la CYP4F2, un membre clé de la voie métabolique LTB4 est un gène candidat potentiel pour MC. Nous avons également pu mettre en évidence que les interactions entre les gènes de l'immunité adaptative (CYP4F2 et ALOX5) et les gènes de l'immunité innée (NOD2) modifient les risques de MC chez les enfants. D'autres études sur des cohortes plus importantes sont nécessaires pour confirmer ces conclusions.

Étude de l’activité de Staufen1 dans la régulation traductionnelle de certains ARNm

Le transport et la traduction localisée des ARN messagers sont observés chez plusieurs organismes et sont requis pour de multiples phénomènes tels la mémoire, la division cellulaire asymétrique et l’établissement des axes durant le développement. Staufen, une protéine liant l’ARN double-brin, a été identifié dans un premier temps chez la mouche à fruits Drosophila melanogaster. Il a été montré, chez cet organisme, que Staufen est requis pour la localisation des messagers bicoid et oskar aux pôles antérieur et postérieur de l’ovocyte, respectivement. Également, Staufen est requis afin que la répression traductionnelle du messager oskar soit levée une fois qu’il est bien localisé. Chez les mammifères, Stau1 est une protéine ubiquiste qui est présente dans des complexes prenant la forme de granules dans les dendrites des neurones. Également, Stau1 peut interagir de façon indépendante de l’ARN avec le ribosome et cofractionner tant avec la sous-unité 40S qu’avec la sous-unité 60S du ribosome dans un gradient de saccharose. L’implication de Stau1 dans un mécanisme permettant la dérépression traductionnelle de certains ARNm chez les mammifères était donc une voie d’investigation intéressante. Nous avons donc décidé de vérifier si Stau1 mammifère avait la capacité de stimuler la traduction d’un ARNm cellulaire via un mécanisme régulé. Au moment où cette thèse a été entreprise, aucun ARNm cellulaire lié par Stau1 n’avait été identifié chez les mammifères. Des structures d’ARN double-brin ont donc été employées afin de réprimer la traduction d’un ARNm rapporteur. C’est ainsi que nous avons montré que Stau1 peut stimuler la traduction d’un ARNm lorsqu’il lie celui-ci dans sa région 5’ non-traduite. Par la suite, en employant des micropuces d’ADN, nous avons identifié des messagers cellulaires dont la distribution dans les polysomes lourds est modifiée par Stau1. En effet, un groupe de messagers est enrichi dans les polysomes lourds suite à une surexpression de Stau1, ce qui suggère que Stau1 stimule la traduction de cette population d’ARNm. Afin d’identifier un mécanisme potentiel de régulation de l’activité traductionnelle de Stau1, nous nous sommes intéressés à la capacité d’auto-association de cette protéine. Nous avons montré que Stau1, tout comme plusieurs protéines liant l’ARN double-brin, est en mesure de s’associer à lui-même, et ce, d’une façon indépendante de l’ARN. Nous avons identifié les déterminants impliqués mettant ainsi au jour un nouveau mécanisme pouvant influencer les activités cellulaires de Stau1. Les résultats présentés dans cette thèse suggèrent donc que Stau1 est en mesure de stimuler la traduction d’une sous-population précise d’ARN messagers au sein de la cellule permettant ainsi de jeter un regard nouveau sur l’implication de cette protéine dans divers phénomènes au sein de l’organisme.

Les cellules stromales multipotentes accélèrent la guérison de plaies cutanées chez les souris irradiées via la sécrétion de la chimiokine SDF-1α

Le traitement du cancer à l’aide d’une exposition aux radiations ionisantes (RI) peut mener au développement de plusieurs effets secondaires importants, dont un retard de réparation et de régénération des tissus. Les mécanismes responsables de ces effets demeurent largement inconnus encore aujourd’hui, ce qui a pour effet de limiter le développement d’approches thérapeutiques. À l’aide d’un modèle de guérison de plaie cutanée chez la souris, nous avons cherché à déterminer les mécanismes par lesquels l’exposition aux RI limite la régénération de la peau. Nos résultats démontrent que l’induction de la "stromal-derived growth factor 1α" (SDF-1α), une cytokine normalement surexprimée dans les tissus hypoxiques, est sévèrement diminuée dans les plaies de souris irradiées versus non-irradiées. Ce défaut corrèle avec un retard de guérison des plaies et est encore évident plusieurs mois suivant l’exposition aux RI, suggérant qu’il y a une altération permanente de la capacité de la peau à se réparer. Parce que SDF-1α est secrété principalement par les fibroblastes du derme, nous avons évalué le potentiel des cellules stromales multipotentes (MSCs), qui sont reconnues pour secréter des niveaux élevés de SDF-1α, à accélérer la régénération de la peau chez les souris irradiées. L’injection de MSCs en périphéries des plaies a mené à une accélération remarquable de la guérison de la peau chez les souris exposées aux RI. Les actions des MSCs étaient principalement paracrines, dû au fait que les cellules n’ont pas migré à l’extérieur de leur site d’injection et ne se sont pas différentiées en kératinocytes. L’inhibition spécifique de l’expression de SDF-1α a mené à une réduction drastique de l’efficacité des MSCs à accélérer la fermeture de plaie indiquant que la sécrétion de SDF-1α par les MSCs est largement responsable de leur effet bénéfique. Nous avons découvert aussi qu’un des mécanismes par lequel SDF-1α accélère la guérison de plaie implique l’augmentation de la vascularisation au niveau de la peau blessée. Les résultats présentés dans ce mémoire démontrent collectivement que SDF-1α est une importante cytokine dérégulée au niveau des plaies cutanées irradiées, et que le déclin du potentiel de régénération des tissus qui est observé suivant une exposition au RI peut être renversé, s’il est possible de restaurer le microenvironnement de la blessure avec un support stromal adéquat.

Interventions thérapeutiques prometteuses dans un modèle in vivo de stéatohépatite non alcoolique

La stéatohépatite non alcoolique (NASH) est une pathologie du foie dont l’amplitude et les répercussions sont de plus en plus préoccupantes dans le monde médical ou biomédical. Elle est associée à l’obésité, au syndrome métabolique et au diabète sucré de type II. La recherche de la thérapie optimale pour le NASH est un domaine en plein essor puisqu’aucun traitement n’est suffisamment efficace à ce jour. La présente étude fait le point sur de nouvelles possibilités de traitements qui se sont avérés efficaces pour contrer les différentes lésions métaboliques et cellulaires rencontrées dans un modèle in vivo chez le rat où le NASH est induit par l’ingestion d’une diète riche en gras. Cette étude démontre, tout d’abord, que les traitements durant six semaines avec l’acide ursodéoxycholique (UDCA) et son dérivé le NCX 1000, possédant des propriétés donatrices de monoxyde d’azote, à doses équimolaires, protègent de manière équivalente le foie contre le stress oxydatif, l’hyperinsulinémie, l’inflammation et la fibrose causés par la stéatohépatite. De plus, la combinaison d’une plus faible dose de NCX 1000 avec un antioxydant lipophile tel que la vitamine E offre une protection similaire, particulièrement au niveau des paramètres du stress oxydatif. Par ailleurs, l’étude illustre aussi que la silibinine, composé polyphénolique actif du chardon marie (Silybum marianum) et utilisé en traitement pendant 5 semaines, possède un pouvoir hépatoprotecteur, des propriétés antioxydantes et un effet hypoinsulinémique dans ce modèle de stéatohépatite d’origine nutritionnelle. Le potentiel thérapeutique de ces composés en fait des candidats de choix pour le traitement du NASH qui méritent de faire l’objet d’études cliniques poussées.

Mutagénèse semi-aléatoire au site actif de la DHFR humaine : création et caractérisation de variantes hautement résistantes au MTX.

La dihydrofolate réductase humaine (DHFRh) est une enzyme essentielle à la prolifération cellulaire. Elle réduit le dihydrofolate en tétrahydrofolate, un co-facteur impliqué dans la biosynthèse des purines et du thymidylate. La DHFRh est une cible de choix pour des agents de chimiothérapie comme le méthotrexate (MTX), inhibant spécifiquement l’enzyme ce qui mène à un arrêt de la prolifération et ultimement à la mort cellulaire. Le MTX est utilisé pour le traitement de plusieurs maladies prolifératives, incluant le cancer. La grande utilisation du MTX dans le milieu clinique a mené au développement de mécanismes de résistance, qui réduisent l’efficacité de traitement. La présente étude se penche sur l’un des mécanismes de résistance, soit des mutations dans la DHFRh qui réduisent son affinité pour le MTX, dans le but de mieux comprendre les éléments moléculaires requis pour la reconnaissance de l’inhibiteur au site actif de l’enzyme. En parallèle, nous visons à identifier des variantes plus résistantes au MTX pour leur utilisation en tant que marqueurs de sélection en culture cellulaire pour des systèmes particuliers, tel que la culture de cellules hématopoïétiques souches (CHS), qui offrent des possibilités intéressantes dans le domaine de la thérapie cellulaire. Pour étudier le rôle des différentes régions du site actif, et pour vérifier la présence d’une corrélation entre des mutations à ces régions et une augmentation de la résistance au MTX, une stratégie combinatoire a été dévelopée pour la création de plusieurs banques de variantes à des résidus du site actif à proximité du MTX lié. Les banques ont été sélectionnées in vivo dans un système bactérien en utilisant des milieux de croissance contenant des hautes concentrations de MTX. La banque DHFRh 31/34/35 généra un nombre considérable de variantes combinatoires de la DHFRh hautement résistantes au MTX. Les variantes les plus intéressantes ont été testées pour leur potentiel en tant que marqueur de sélection dans plusieurs lignées cellulaires, dont les cellules hématopoïétiques transduites. Une protection complète contre les effets cytotoxiques du MTX a été observée chez ces cellules suite à leur infection avec les variantes combinatoires. Pour mieux comprendre les causes moléculaires reliées à la résistance au MTX, des études de structure tridimensionnelle de variantes liées au MTX ont été entreprises. La résolution de la structure de la double variante F31R/Q35E lié au MTX a révélé que le phénotype de résistance était attribuable à d’importantes différences entre le site actif de la double variante et de l’enzyme native, possiblement dû à un phénomème dynamique. Une compréhension plus générale de la reconnaissance et la résistance aux antifolates a été réalisée en comparant des séquences et des structures de variantes de la DHFR résistants aux antifolates et provenant de différentes espèces. En somme, ces travaux apportent de nouveaux éléments pour la comprehension des intéractions importantes entre une enzyme et un ligand, pouvant aider au développement de nouveaux antifolates plus efficaces pour le traitement de diverses maladies. De plus, ces travaux ont généré de nouveaux gènes de résistance pouvant être utilisés en tant que marqueurs de sélection en biologie cellulaire.

Impact d’une mutation ponctuelle stratégique de la protéine HOXB4 sur son pouvoir de régulation, de prolifération et de différenciation des CSH et des progéniteurs murins

L’expansion des cellules souches hématopoïétiques ex vivo représente une option des plus intéressante afin d’améliorer les greffes de moelle osseuse. Le facteur de transcription HOXB4 semble être le candidat ayant le plus de potentiel jusqu’à présent. Cependant, la très courte demi-vie de la protéine représente un obstacle majeur dans l’élaboration de protocoles cliniques. Par contre, la substitution d’un acide aminé (3 mutations individuelles) dans la partie N-terminale de la protéine augmente de près de 3 fois la stabilité intracellulaire de HOXB4. Nous avons comparé l’activité biologique de ces mutants à celle de HOXB4 natif (« wt ») dans des essais in vitro et in vivo. Nous avons démontré que la surexpression de HOXB4 muté par infection des cellules souches hématopoïétiques n’affectait pas leur pouvoir de reconstitution hématopoïétique à long terme dans des souris transplantées. Par ailleurs, nous avons noté que dans les essais de reconstitution hématopoïétique en compétition et en non compétition, les cellules surexprimant les protéines mutées ont une expansion supérieure in vitro et reconstituent le sang et la rate avec une répartition de cellules lymphoïdes et myéloïdes plus près de souris non-transplantées comparativement aux cellules exprimant HOXB4 « wt ». De plus, les cellules surexprimant la protéine HOXB4 mutée apparaissent beaucoup plus rapidement et en plus grande proportion dans le sang comparativement aux cellules surexprimant la forme native. Une des protéines HOXB4 mutées (1426) ne permet pas l’expansion des progéniteurs myéloïdes immatures (CMP) contrairement à la protéine « wt ». Et finalement, par les études de modulation intracellulaire protéique, nous avons démontré que les comportements des protéines HOXB4 « wt » et mutées envers les cellules souches hématopoïétiques et progéniteurs n’étaient pas complètement dus à un effet de concentration protéique.

Action anti-leucémique des inhibiteurs de la méthylation de l’ADN et de la déacétylation des histones

Les gènes suppresseurs de tumeurs (TSGs) contrôlent la prolifération cellulaire et leur inactivation joue un rôle important dans la leucémogénèse. Deux mécanismes épigénétiques majeurs sont impliqués dans la répression des TSGs: 1- la méthylation de l’ADN et 2- la déacétylation des histones des chromosomes. On les dit épigénétiques car ils n’affectent pas la séquence de l’ADN. Ces phénomènes sont réversibles, faisant donc d’eux des cibles thérapeutiques de choix. Dans le cadre de cette thèse, nous avons évalué le potentiel chimiothérapeutique de différents agents qui visent ces mécanismes épigénétiques et nous les avons administrés seuls et en combinaison dans le but d’améliorer leur efficacité. La 5-aza-2’-désoxycytidine (5-Aza-CdR) est un inhibiteur de la méthylation de l’ADN qui permet la ré-expression des TSGs. Cet agent s’est avéré efficace contre certaines maladies hématologiques et est d’ailleurs approuvé aux États-Unis dans le traitement du syndrome myélodysplasique depuis 2006. Cependant, le protocole d’administration optimal de cet agent, en termes de doses et de durée, n’est toujours pas établi. Nos recherches suggèrent que le celui-ci devrait être plus intensif que ce que rapporte la littérature. Les inhibiteurs des déacétylases des histones (HDACi) ont également montré une activité antinéoplasique intéressante. De récentes recherches ont montré que la combinaison d’agents ciblant à la fois la méthylation de l’ADN et la déacétylation des histones produit une réactivation synergique des TSGs, ce à quoi nous nous sommes intéressé. Nous avons observé que la co-administration d’un HDACi avec la 5-Aza-CdR potentialise son action anti-leucémique. Il est aussi possible d’augmenter l’activité de la 5-Aza-CdR en inhibant sa dégradation par l’enzyme cytidine (CR) désaminase. Nous avons observé que la co-administration du zebularine, un inhibiteur de la CR désaminase, avec la 5-Aza-CdR accroît son efficacité. Le zebularine est aussi un inhibiteur de la méthylation de l’ADN, ce qui pourrait contribuer à la potentialisation de la réponse anti-leucémique observée lors de la co-administration de ces deux agents. En résumé, il est possible d’augmenter l’efficacité anti-leucémique de la 5-Aza-CdR en : 1- intensifiant son protocole d’administration, en termes de doses et de durée, 2- la combinant avec un HDACi, et 3- diminuant sa dégradation par la CR désaminase. L’utilisation de ces résultats précliniques dans l’élaboration de protocoles cliniques pourrait être bénéfique à beaucoup de patients.