Étude sur les fonctions in vivo des GEFs DOCK chez les mammifères

Dock1 (aussi nommé Dock180) est le membre prototypique de la famille Dock d’activateurs des petites GTPases de la famille Rho. Dock1 agit au sein d’une voie de signalisation conservée au cours de l’évolution et des études génétiques ont démontré que les orthologues de Dock1, myoblast city (mbc) chez la drosophile et Ced-5 chez le nématode, activent Rac dans divers processus biologiques. Notamment, mbc est un important régulateur de la fusion des myoblastes lors de la formation des fibres musculaires de drosophile. Mbc est aussi essentiel à la migration collective d’un groupe de cellules, appelées cellules de bordures, lors de leur migration dans la chambre de l’oeuf suite à l’activation de récepteurs à activité tyrosine kinase (RTK). La migration collective des cellules de bordures récapitule certains des événements observés lorsque des cellules tumorales envahissent le tissu environnant lors de la formation de métastases. Chez les mammifères, des études réalisées en lignées cellulaires suggèrent que Dock1 est aussi un régulateur du cytosquelette lors de la migration cellulaire. De plus, certaines études ont démontré que la voie Dock1/Rac agit en aval de RTKs lors de l’invasion de cellules de glioblastome. Néanmoins, les fonctions in vivo de Dock1 chez les mammifères demeurent méconnues et le but de cette thèse est d’identifier et de caractériser certaines de ses fonctions. Guidés par la fonction de mbc, nous démontrons dans l’objectif no 1 un rôle essentiel pour ce gène au cours du développement embryonnaire grâce à la caractérisation d’une souris Dock1 knock-out. Des défauts sévères de fusion des myoblastes sont observés en absence de l’expression de Dock1 et ils contribuent à la réduction de la masse musculaire des souris mutantes. De plus, nous avons constaté une contribution du gène Dock5, un membre de la famille Dock proche de Dock1, au développement des fibres musculaires. Dans l’objectif no 2, nous avons observé que des hauts niveaux d’expression de DOCK1 corrèlent avec un mauvais pronostic chez les patientes atteintes de cancer du sein possédant une forte expression du gène codant pour le RTK HER2. Une surexpression ou une amplification du locus codant pour le récepteur HER2 est associée à près de 20% des cas de cancer du sein. Les cancers de ces patientes développent fréquemment des métastases et sont associés à un mauvais pronostic. Des études biochimiques ont révélé que DOCK1 interagit avec le récepteur HER2 dans des cellules de cancer du sein. De plus, DOCK1 est essentiel à l’activation de RAC et à la migration cellulaire induite par HER2 dans ces cellules. L’utilisation d’un modèle de cancer du sein médié par HER2 chez la souris combiné avec l’inactivation du gène Dock1 dans les glandes mammaires, nous a permis d’identifier Dock1 et Rac comme de nouveaux effecteurs de la croissance tumorale et de la formation de métastases régulées par l’oncogène HER2. Nous concluons que l’utilisation de différents modèles de souris knock-out pour le gène Dock1 nous a permis d’identifier des fonctions clés de ce gène. Tout comme son orthologue mbc, Dock1 joue un rôle important lors du développement embryonnaire en régulant notamment la fusion des myoblastes. Nos études ont également contribué à démontrer un important degré de conservation des mécanismes moléculaires de fusion entre les espèces. De plus, DOCK1 agit en aval du RTK HER2 et son expression dans les cellules épithéliales de glandes mammaires contribue au développement tumoral et à la formation de métastases induits par cet oncogène.

Développement et radiosynthèse de ligands du récepteur tyrosine kinase neurotrophique type 2 (TrkB) marqués aux carbone-11 et fluor-18 pour l’imagerie cérébrale par tomographie d’émission de positons

Ce mémoire présente mes travaux ayant menés au développement d’une première génération de radioligands marqués au fluor-18 (t1/2 = 110 min) et au carbone-11 (t1/2 = 20.4 min) destinés à l’imagerie cérébrale in vivo du récepteur tyrosine kinase neurotrophique de type 2 (TrkB) en tomographie par émission de positons (TEP). Ces travaux reposent sur l’identification récente de ligands de TrkB non peptidiques à hautes affinités dérivés du 7,8-dihydroxyflavone. La synthèse d’une série de dérivés du 7,8-dihydroxyflavone non-radioactifs de même que des précuseurs à l’incorporation du fluro-18 et du carbone-11 a d’abord été effectuée. Partant des précurseurs adéquats synthétisés, la radiosynthèse de deux radioligands, l’un marqué au fluor-18 et l’autre au carbone-11, a été développée. Ces radiosynthèses reposent respectivement sur une 18F-radiofluorination nucléophile aromatique nouvelle et hautement efficace et sur une 11C-méthylation N-sélective. Les radiotraceurs de TrkB ainsi obtenus ont ensuite été évalués in vitro en autoradiographie et in vivo en tant que traceurs TEP dans des rats. L’évaluation des propriétés physico-chimique de même que de la stabilité in vitro des radiotraceurs sont présentées. Partant d’une série d’analogues cristallisés de ces flavones synthétiques, une étude de relation structure-activité a été menée. La combinaison de cette étude, de pair avec l’évaluation in vivo de la première génération de radiotraceurs de TrkB a aussi permis d’investiguer les pharmacophores nécessaires à l’affinité de ces ligands de même que d’identifier des fragments structurels associés au métabolisme des radiotraceurs. La radiosynthèse d’un troisième radioligand de TrkB et son évaluation TEP in vivo de même que la mise en lumière des modifications structurelles utiles au développement d’une seconde génération de radioligands de TrkB avec des propriétés optimisées pour fin d’imagerie TEP sont aussi détaillés.

Effet de la mutation du gène lrpprc sur l'activité de l'AMPK dans les fibroblastes des patients atteints du syndrome de Leigh, type canadien français

Le syndrome de Leigh, type canadien français (LSFC) est une maladie infantile orpheline causée par une mutation du gène lrpprc. Elle se caractérise par une déficience tissu spécifique de cytochrome c oxydase (COX), une dysfonction mitochondriale et la survenue de crises d’acidose lactique fatales dans plus de 80% de cas. Selon les familles des patients, ces crises apparaissent lors d’une demande excessive d’énergie. Malheureusement, les mécanismes sous-jacents à l’apparition des crises et notamment la physiopathologie du LSFC demeurent inconnus. Afin de mieux comprendre les mécanismes de régulation du métabolisme énergétique chez les patients LSFC, nous avons examiné la régulation de la protéine kinase activée par l’AMP (AMPK), une enzyme clé de l'homéostasie énergétique, de même que certaines de ses voies cibles (SIRT1/PGC1α et Akt/mTOR) dans les fibroblastes de patients LSFC et de témoins en conditions basales et conditions de stress. En conditions basales, l’activité de l’AMPK était similaire dans les cellules LSFC et les témoins. Par contre, les cellules LSFC montraient une surexpression significative des voies Akt/mTOR et SIRT1/PGC1α comparativement aux cellules témoins. Nous avons aussi examiné ces voies de signalisation suite à une incubation de 4h avec 10 mM de lactate et 1 mM de palmitate (LP), nous permettant de mimer les conditions de « crise ». Nos résultats ont démontré que le LP augmentait les niveaux de phosphorylation de l’AMPK de 90% (p<0,01) dans les cellules témoins mais pas dans les cellules LSFC. Pourtant, l’AMPK est activée dans les cellules LSFC en réponse à une hypoxie chimique induite par le 2,4 dinitrophénol. Dans les cellules témoins, le LP augmentait aussi les niveaux d’expression de SIRT1 (57%, p<0,05), de LRPPRC (23%, p=0,045) et de COXIV (19%, p<0,05). Un prétraitement de 48h au ZMP, un activateur pharmacologique de l’AMPK, a eu un effet additif avec le LP et des augmentations de SIRT1 phosphorylée (120%, p<0,05), de SIRT1 total (75%, p<0,01), de LRPPRC (63%, p<0,001) et de COXIV (38%, p<0,001) ont été observées. Tous ces effets étaient aussi abolis dans les cellules LSFC. En conclusion, nos résultats ont démontré des altérations importantes de la régulation du métabolisme énergétique dans les fibroblastes de patients LSFC.

Phosphorylation et régulation de l’E3 ubiquitine ligase MDM2 par la protéine kinase RSK dans les mélanomes

La voie de signalisation Ras/MAPK (Ras/mitogen-activated protein kinase) régule une variété de protéines intracellulaires qui jouent un rôle important dans la croissance et la prolifération cellulaire. La régulation inappropriée de cette voie de signalisation conduit au développement de nombreux cancers comme le mélanome, qui est caractérisé par des mutations activatrices au niveau des gènes NRAS et BRAF. La protéine kinase RSK (p90 ribosomal S6 kinase) est un composant central de la voie Ras/MAPK, mais son rôle dans la croissance et la prolifération cellulaire n’est pas bien compris. RSK a été montrée pour participer à la résistance des mélanomes aux chimiothérapies, mais le mécanisme moléculaire reste encore à élucider. Nous montrons à l’aide d’un anticorps phospho-spécifique que MDM2 est phosphorylée en réponse à des agonistes et des mutations oncogéniques activant spécifiquement la voie Ras/MAPK. En utilisant des méthodes in vitro et in vivo, nous avons constaté que RSK phosphoryle directement MDM2 sur les Sérines 166 et 186, ce qui suggère que MDM2 est un substrat de RSK. La mutagénèse dirigée envers ces sites nous indique que ces résidus régulent l’ubiquitination de MDM2, suggérant que RSK régule la stabilité de MDM2 et de p53. De plus, nous avons observé que l’inhibition de RSK conduit à une augmentation du niveau protéique de p53 après un dommage à l’ADN dans les cellules de mélanomes. En conclusion, nos travaux suggèrent un rôle important de la protéine kinase RSK dans la régulation de MDM2 et de sa cible, p53. L’étude de ces mécanismes moléculaires aidera à mieux définir le rôle de RSK dans la croissance tumorale, mais également dans la résistance aux agents chimiothérapeutiques.

Role of the Protein Tyrosine Kinase 7 gene in human neural tube defects

Les anomalies du tube neural (ATN) sont des anomalies développementales où le tube neural reste ouvert (1-2/1000 naissances). Afin de prévenir cette maladie, une connaissance accrue des processus moléculaires est nécessaire. L’étiologie des ATN est complexe et implique des facteurs génétiques et environnementaux. La supplémentation en acide folique est reconnue pour diminuer les risques de développer une ATN de 50-70% et cette diminution varie en fonction du début de la supplémentation et de l’origine démographique. Les gènes impliqués dans les ATN sont largement inconnus. Les études génétiques sur les ATN chez l’humain se sont concentrées sur les gènes de la voie métabolique des folates du à leur rôle protecteur dans les ATN et les gènes candidats inférés des souris modèles. Ces derniers ont montré une forte association entre la voie non-canonique Wnt/polarité cellulaire planaire (PCP) et les ATN. Le gène Protein Tyrosine Kinase 7 est un membre de cette voie qui cause l’ATN sévère de la craniorachischisis chez les souris mutantes. Ptk7 interagit génétiquement avec Vangl2 (un autre gène de la voie PCP), où les doubles hétérozygotes montrent une spina bifida. Ces données font de PTK7 comme un excellent candidat pour les ATN chez l’humain. Nous avons re-séquencé la région codante et les jonctions intron-exon de ce gène dans une cohorte de 473 patients atteints de plusieurs types d’ATN. Nous avons identifié 6 mutations rares (fréquence allélique <1%) faux-sens présentes chez 1.1% de notre cohorte, dont 3 sont absentes dans les bases de données publiques. Une variante, p.Gly348Ser, a agi comme un allèle hypermorphique lorsqu'elle est surexprimée dans le modèle de poisson zèbre. Nos résultats impliquent la mutation de PTK7 comme un facteur de risque pour les ATN et supporte l'idée d'un rôle pathogène de la signalisation PCP dans ces malformations.

Les effets de l’Angiopoietin-like 2 sur la voie cytoprotectrice antioxydante Nrf2

L’angiopoietin-like 2 (angptl2) est une glycoprotéine de 64 kDa pro-inflammatoire et pro-athérogénique associée à divers maladies inflammatoires chroniques. Il est probable que l’angptl2 possède également un effet pro-oxydant, puisqu’elle stimule la production aigüe de dérivés réactifs oxygénés (DRO). Le facteur de transcription « nuclear factor (erythroidderived 2)-like 2 » (Nrf2) fait partie d’un mécanisme antioxydant majeur permettant de maintenir l’équilibre redox via l’induction de plusieurs gènes de l’élément de réponse antioxydante (ERA). En présence de DRO, la protéine Keap-1 se dissocie de Nrf2 et cesse de promouvoir sa dégradation protéasomale. Cette dissociation est stimulée par la protéine DJ-1 qui favorise la translocation nucléaire de Nrf2. La p38MAPK peut phosphoryler Nrf2 et promouvoir son interaction avec Keap-1. Nous avons posé l’hypothèse selon laquelle l’angptl2 causait un stress oxydant chronique, d’abord en stimulant en aigu la production de DRO, puis en inhibant la voie antioxydante Nrf2. Nous avons étudié, par immunobuvardage de type Western sur des cellules endothéliales en culture (HUVEC), les effets de l’angptl2 recombinante (100 nM) sur les niveaux protéiques nucléaires de Nrf2, les niveaux de Keap-1 dans le cytosol et de DJ-1 dans le noyau, en absence et en présence de l’antioxydant NAC (10 μM). Nous avons également étudié l’activation de la p38MAPK. Les niveaux nucléaires de Nrf2 n’ont pas été affectés par la stimulation aigüe (10 min) à l’angptl2 recombinante, mais ont été diminués par la stimulation chronique (24 h). L’ajout d’un agent antioxydant n’a pas altéré l’effet chronique, indiquant que les DRO ne sont pas directement impliqués. Les niveaux protéiques cytosoliques de Keap-1, protéine inhibitrice de Nrf2, et les niveaux nucléaires de DJ-1, protéine stabilisatrice de Nrf2, n’ont pas été affectés par l’angptl2 de manière significative. La phosphorylation de la p38MAPK n’a pas été non plus affectée par la stimulation aigüe ou chronique à l’angptl2. Ces données suggèrent que l’angptl2 n’a pas d’effet aigu, mais a un effet chronique inhibiteur sur la voie Nrf2, qui n’est pas associé à un effet sur Keap-1, DJ-1 ou p38MAPK.

Impact des cavines sur le phénotype invasif et inflammatoire des cellules souches mésenchymateuses

L’évolution d’une cellule tumorale initiée à une tumeur solide nécessite, à chaque étape, un microenvironnement favorable à sa survie et à sa croissance. Le microenvironnement tumoral est comparé à un foyer d’inflammation chronique dont la composition cellulaire et moléculaire est complexe. Les cellules souches mésenchymateuses (CSM) représentent l’un des principaux acteurs cellulaires présents. Elles migrent vers les sites tumoraux où elles soutiennent l’inflammation, l’angiogenèse et le développement tumoral en activant plusieurs voies de signalisation. Une des voies majeures qui contribuent à l’inflammation est la voie de signalisation NF-B. L’initiation de cette voie provient de la membrane cellulaire entre autres des cavéoles. Nous soumettons l’hypothèse que l’une des cavines, protéines associées aux cavéoles, modulerait le phénotype inflammatoire etou migratoire dans les CSM traitées à la cytokine TNF- (facteur de nécrose tumorale ) en modulant la voie de signalisation NF-B. En effet, nous avons observé une régulation à la hausse de l’expression de la COX-2 (cyclooxygénase-2) et une diminution de l’expression d’IκB qui sont synonymes de l’activation de la voie NF-B dans les CSM que nous avons traitées au TNF-. Nous avons trouvé que le TNF- induit la migration des CSM, et que la répression génique de la Cavine-2 augmente significativement la migration des CSM traitées par le TNF-. La répression génique de la Cavine-2 vient aussi amplifier la tubulogenèse dans les CSM en réponse au TNF-. D’un point de vue moléculaire, la répression génique de la Cavine-2 a montré une très forte amplification de l'expression protéique de la COX-2 dans les CSM en réponse au TNF-. Dans ces mêmes cellules où la Cavine-2 a été réprimée, et suite à un traitement au TNF-, le pic de phosphorylation est plus intense et la courbe de phosphorylation est plus prolongée dans le temps. Ces observations nous permettent d’affirmer que la Cavine-2 a un rôle répresseur sur l’expression de COX-2. Collectivement, nos résultats montrent que la Cavine-2 peut être proposée comme un gène suppresseur de tumeur et est de ce fait, une bonne cible thérapeutique dans les CSM qui permettraient d’agir à des stades précoces du développement tumoral.

Mécanismes moléculaires de l’hypertrophie vasculaire dans le modèle animal d’hypertension essentielle (SHR)

La voie de signalisation des phosphoinositides joue un rôle clé dans la régulation du tonus vasculaire. Plusieurs études rapportent une production endogène de l’angiotensin II (Ang II) et de l’endothéline-1 (ET-1) par les cellules musculaires lisses vasculaires (CMLVs) de rats spontanément hypertendus (spontaneously hypertensive rats : SHR). De plus, l’Ang II exogène induit son effet prohypertrophique sur les CMLVs selon un mécanisme dépendant de la protéine Gqα et de la PKCẟ. Cependant, le rôle de l’axe Gqα/PLCβ/PKCẟ dans l’hypertrophie des CMLVs provenant d’un modèle animal de l’hypertension artérielle n’est pas encore étudié. L’objectif principal de cette thèse est d’examiner le rôle de l’axe Gqα/PLCβ1 dans les mécanismes moléculaires de l’hypertrophie des CMLVs provenant d’un modèle animal d’hypertension artérielle essentielle (spontaneously hypertensive rats : SHR). Nos premiers résultats indiquent que contrairement aux CMLVs de SHR âgés de 12 semaines (absence d’hypertrophie cardiaque), les CMLVs de SHR âgés de 16 semaines (présence d’hypertrophie cardiaque) présentent une surexpression protéique endogène de Gqα et de PLCβ1 par rapport aux CMLVs de rats WKY appariés pour l’âge. L’inhibition du taux d’expression protéique de Gqα et de PLCβ1 par des siRNAs spécifiques diminue significativement le taux de synthèse protéique élevé dans les CMLVs de SHR. De plus, la surexpression endogène des Gqα et PLCβ1, l’hyperphosphorylation de la molécule ERK1/2 et le taux de synthèse protéique élevé dans les CMLVs de SHR de 16 semaines ont été atténués significativement par des antagonistes des récepteurs AT1 (losartan) et ETA (BQ123), mais pas par l’antagoniste du récepteur ETB (BQ788). L’inhibition pharmacologique des MAPKs par PD98059 diminue significativement la surexpression endogène de Gqα/PLCβ1 et le taux de synthèse protéique élevé dans les CMLVs de SHR. D’un côté, l’inhibition du stress oxydatif (par DPI, inhibiteur de la NAD(P)H oxidase, et NAC , molécule anti-oxydante), de la molécule c-Src (PP2) et des récepteurs de facteurs de croissance (AG1024 (inhibiteur de l’IGF1-R), AG1478 (inhibiteur de l’EGFR) et AG1295 (inhibiteur du PDGFR)) a permis d’atténuer significativement la surexpression endogène élevée de Gqα/PLCβ1 et l’hypertrophie des CMLVs de SHR. D’un autre côté, DPI, NAC et PP2 atténuent significativement l’hyperphosphorylation de la molécule c-Src, des RTKs (récepteurs à activité tyrosine kinase) et de la molécule ERK1/2. Dans une autre étude, nous avons aussi démontré que la PKCẟ montre une hyperphosphorylation en Tyr311 dans les CMLVs de SHR comparées aux CMLVs de WKY. La rottlerin, utilisée comme inhibiteur spécifique de la PKCẟ, inhibe significativement cette hyperphosphorylation en Tyr311 dépendamment de la concentration. L’inhibition de l’activité de la PKCẟ par la rottlerin a été aussi associée à une atténuation significative de la surexpression protéique endogène de Gqα/PLCβ1 et l’hypertrophie des CMLVs de SHR. De plus, l’inhibition pharmacologique de l’activité de la PKCẟ, en amont du stress oxydatif, a permis d’inhiber significativement l’activité de la NADPH, le taux de production élevée de l’ion superoxyde ainsi que l’hyperphosphorylation de la molécule ERK1/2, de la molécule c-Src et des RTKs. À notre surprise, nous avons aussi remarqué une surexpression protéique de l’EGFR et de l’IGF-1R dans les CMLVs de SHR à l’âge de 16 semaines. L’inhibition pharmacologique de l’activité de la PKCẟ, de la molécule c-Src et du stress oxydatif a permis d’inhiber significativement la surexpression protéique endogène de ces RTKs. De plus, l’inhibition de l’expression protéique de l’EGFR et de la molécule c-Src par des siRNA spécifiques atténue significativement le taux d’expression protéique élevé de Gqα et de PLCβ1 ainsi que le taux de synthèse protéique élevé dans les CMLVs de SHR. Des siRNAs spécifiques à la PKCẟ ont permis d’atténuer significativement le taux de synthèse protéique élevé dans les CMLVs de SHR et confirment le rôle important de la PKCẟ dans les mécanismes moléculaires de l’hypertrophie des CMLVs selon une voie dépendante du stress oxydatif. En conclusion, ces résultats suggèrent un rôle important de l’activation endogène de l’axe Gqα-PLCβ-PKCẟ dans le processus d’hypertrophie vasculaire selon un mécanisme impliquant une activation endogène des récepteurs AT1/ETa, de la molécule c-Src, du stress oxidatif, des RTKs et des MAPKs.

Platelet nitric oxide synthase is activated by tyrosine dephosphorylation: possible role for SHP-1 phosphatase

Background: Endothelial nitric oxide synthase (eNOS) activity in endothelial cells is regulated by post-translational phosphorylation of critical serine, threonine and tyrosine residues in response to a variety of stimuli. However, the post-translational regulation of eNOS in platelets is poorly defined. Objectives: We investigated the role of tyrosine phosphorylation in the regulation of platelet eNOS activity. Methods: Tyrosine phosphorylation of eNOS and interaction with the tyrosine phosphatase SHP-1 were investigated by coimmunoprecipitation and immunoblotting. An in vitro immunoassay was used to determine eNOS activity together with the contribution of protein tyrosine phosphorylation. Results: We found platelet eNOS was tyrosine phosphorylated under basal conditions. Thrombin induced a dose- and time-dependent increase in eNOS activity without altering overall level of tyrosine phosphorylation, although we did observe evidence of minor tyrosine dephosphorylation. In vitro tyrosine dephosphorylation of platelet eNOS using a recombinant protein tyrosine phosphatase enhanced thrombin-induced activity compared to thrombin alone, but had no effect on endothelial eNOS activity either at basal or after stimulation with bradykinin. Having shown that dephosphorylation could modulate platelet eNOS activity we examined the role of potential protein phosphatases important for platelet eNOS activity. We found SHP-1 protein tyrosine phosphatase, co-associated with platelet eNOS in resting platelets, but does not associate with eNOS in endothelial cells. Stimulation of platelets with thrombin increased SHP-1 association with eNOS, while inhibition of SHP-1 abolished the ability of thrombin to induce elevated eNOS activity. Conclusions: Our data suggest a novel role for tyrosine dephosphorylation in platelet eNOS activation, which may be mediated by SHP-1.

Platelet adhesion to collagen and collagen-related peptide under flow. Roles of the alpha(2)beta(1) integrin, GPVI, and Src tyrosine kinases

Objective - Platelet stimulation by collagen and collagen-related peptides (CRPs) is associated with activation of protein tyrosine kinases. In the present study, we investigated the role of Src family tyrosine kinases in the initial adhesion events of human platelets to collagen and cross-linked CRP. Methods and Results - Under arterial flow conditions, a glycoprotein VI - specific substrate, cross-linked CRP, caused rapid (<2 second) platelet retention and protein tyrosine phosphorylation that were markedly decreased by the Src family kinase inhibitor pyrozolopyrimidine (PP2) or by aggregation inhibitor GRGDSP. CRP-induced platelet retention was transient, and 90% of single platelets or aggregates detached within seconds. PP2, although having no effect on RGD peptide-binding to CRP, completely blocked aggregation and tyrosine phosphorylation of Syk and phospholipase Cγ2 (PLCγ2). In contrast, PP2 weakly (<30%) suppressed firm adhesion to collagen mediated primarily by the alpha(2)beta(1) integrin. Although PP2 prevented activation of Syk and PLCgamma2 in collagen-adherent platelets, tyrosine phosphorylation of several unidentified protein bands persisted, as did autophosphorylation of pp125(FAK). Conclusions - These findings indicate that activation of Src-tyrosine kinases Syk and PLCgamma2 is not required for the initial stable attachment of human platelets to collagen and for FAK autophosphorylation. However, Src-tyrosine kinases are critical for glycoprotein VI - mediated signaling leading to platelet aggregation.

The Fc receptor gamma-chain and the tyrosine kinase Syk are essential for activation of mouse platelets by collagen.

Activation of mouse platelets by collagen is associated with tyrosine phosphorylation of multiple proteins including the Fc receptor gamma-chain, the tyrosine kinase Syk and phospholipase Cgamma2, suggesting that collagen signals in a manner similar to that of immune receptors. This hypothesis has been tested using platelets from mice lacking the Fc receptor gamma-chain or Syk. Tyrosine phosphorylation of Syk and phospholipase Cgamma2 by collagen stimulation is absent in mice lacking the Fc receptor gamma-chain. Tyrosine phosphorylation of phospholipase Cgamma2 by collagen stimulation is also absent in mice platelets which lack Syk, although phosphorylation of the Fc receptor gamma-chain is maintained. In contrast, tyrosine phosphorylation of platelet proteins by the G protein-coupled receptor agonist thrombin is maintained in mouse platelets deficient in Fc receptor gamma-chain or Syk. The absence of Fc receptor gamma-chain or Syk is accompanied by a loss of secretion and aggregation responses in collagen- but not thrombin-stimulated platelets. These observations provide the first direct evidence of an essential role for the immunoreceptor tyrosine-based activation motif (ITAM) in signalling by a non-immune receptor stimulus.

Oxidised low-density lipoproteins induce rapid platelet activation and shape change through tyrosine kinase and Rho kinase-signaling pathways

Oxidized low-density lipoproteins (oxLDL) generated in the hyperlipidemic state may contribute to unregulated platelet activation during thrombosis. Although the ability of oxLDL to activate platelets is established, the underlying signaling mechanisms remain obscure. Weshow that oxLDL stimulate platelet activation through phosphorylation of the regulatory light chains of the contractile protein myosin IIa (MLC). oxLDL, but not native LDL, induced shape change, spreading, and phosphorylation of MLC (serine 19) through a pathway that was ablated under conditions that blocked CD36 ligation or inhibited Src kinases, suggesting a tyrosine kinase–dependent mechanism. Consistent with this, oxLDL induced tyrosine phosphorylation of a number of proteins including Syk and phospholipase C g2. Inhibition of Syk, Ca21 mobilization, and MLC kinase (MLCK) only partially inhibited MLC phosphorylation, suggesting the presence of a second pathway. oxLDL activated RhoA and RhoA kinase (ROCK) to induce inhibitory phosphorylation of MLC phosphatase (MLCP). Moreover, inhibition of Src kinases prevented the activation of RhoA and ROCK, indicating that oxLDL regulates contractile signaling through a tyrosine kinase–dependent pathway that induces MLC phosphorylation through the dual activation of MLCK and inhibition of MLCP. These data reveal new signaling events downstream of CD36 that are critical in promoting platelet aggregation by oxLDL.

Critical role for an acidic amino acid region in platelet signaling by the HemITAM (hemi-immunoreceptor tyrosine-based activation motif) containing receptor CLEC-2 (C-type lectin receptor-2)

CLEC-2 is a member of new family of C-type lectin receptors characterized by a cytosolic YXXL downstream of three acidic amino acids in a sequence known as a hemITAM (hemi-immunoreceptor tyrosine-based activation motif). Dimerization of two phosphorylated CLEC-2 molecules leads to recruitment of the tyrosine kinase Syk via its tandem SH2 domains and initiation of a downstream signaling cascade. Using Syk-deficient and Zap-70-deficient cell lines we show that hemITAM signaling is restricted to Syk and that the upstream triacidic amino acid sequence is required for signaling. Using surface plasmon resonance and phosphorylation studies, we demonstrate that the triacidic amino acids are required for phosphorylation of the YXXL. These results further emphasize the distinct nature of the proximal events in signaling by hemITAM relative to ITAM receptors.

Phosphorylation of CLEC-2 is dependent on lipid rafts, actin polymerization, secondary mediators, and Rac

The C-type lectin-like receptor 2 (CLEC-2) activates platelets through Src and Syk tyrosine kinases via a single cytoplasmic YxxL motif known as a hem immunoreceptor tyrosine-based activation motif (hemITAM). Here, we demonstrate using sucrose gradient ultracentrifugation and methyl-beta-cyclodextrin treatment that CLEC-2 translocates to lipid rafts upon ligand engagement and that translocation is essential for hemITAM phosphorylation and signal initiation. HemITAM phosphorylation, but not translocation, is also critically dependent on actin polymerization, Rac1 activation, and release of ADP and thromboxane A(2) (TxA(2)). The role of ADP and TxA(2) in mediating phosphorylation is dependent on ligand engagement and rac activation but is independent of platelet aggregation. In contrast, tyrosine phosphorylation of the GPVI-FcRgamma-chain ITAM, which has 2 YxxL motifs, is independent of actin polymerization and secondary mediators. These results reveal a unique series of proximal events in CLEC-2 phosphorylation involving actin polymerization, secondary mediators, and Rac activation.

A Substrate Trapping Mutant Form of Striatal-Enriched Protein Tyrosine Phosphatase Prevents Amphetamine-Induced Stereotypies and Long-Term Potentiation in the Striatum

Background: Chronic, intermittent exposure to psychostimulant drugs results in striatal neuroadaptations leading to an increase in an array of behavioral responses on subsequent challenge days. A brain-specific striatal-enriched tyrosine phosphatase (STEP) regulates synaptic strengthening by dephosphorylating and inactivating several key synaptic proteins. This study tests the hypothesis that a substrate-trapping form of STEP will prevent the development of amphetamine-induced stereotypies. Methods: A substrate-trapping STEP protein, TAT-STEP (C-S), was infused into the ventrolateral striatum on each of 5 consecutive exposure days and I hour before amphetamine injection. Animals were challenged to see whether sensitization to the stereotypy-producing effects of amphetamine developed. The same TAT-STEP (C-S) protein was used on acute striatal slices to determine the impact on long-term potentiation and depression. Results: Infusion of TAT-STEP (C-S) blocks the increase of amphetamine-induced stereotypies when given during the 5-day period of sensitization. The TAT-STEP (C-S) has no effect if only infused on the challenge day. Treatment of acute striatal slices with TAT-STEP (C-S) blocks the induction of long-term potentiation and potentates long-term depression. Conclusions: A substrate trapping form of STEP blocks the induction of amphetamine-induced neuroplasticity within the ventrolateral striatum and supports the hypothesis that STEP functions as a tonic break on synaptic strengthening.