Avaliação de padrões morfológicos e funcionais do epitélio respiratório superior de ratos (Rattus norvegicus) mantidos em diferentes sistemas de ventilação.

Na última década, o uso de sistemas microventilados (sistema VMA) em biotérios possibilitou alojar animais com melhor qualidade sanitária devido ao maior controle ambiental fornecido por esses sistemas. Contudo, ainda é necessário uma melhor avaliação desses sistemas, principalmente no que tange às respostas dos animais. Dessa forma, o objetivo deste trabalho foi avaliar a integridade do epitélio do trato respiratório superior (septo nasal e traquéia) de ratos mantidos em sistema VMA. Cem ratos, da linhagem Wistar-Hannover, heterogênicos, machos, de padrão sanitário convencional, foram mantidos durante 6 meses em dois distintos sistemas de ventilação: ventilação para conforto (grupo VGD, controle) e sistema VMA com intervalos de troca de cama variando de 3, 5, 7 e 9 dias (grupos IT3, IT5, IT7 e IT9, respectivamente). Após a eutanásia dos animais, fragmentos de septo nasal e traquéia foram coletados, processados com rotina de técnica histológica e corados com combinação de ácido periódico de Shiff e azul alciano (PAS-AB) e hematoxilina-eosina (HE). Os parâmetros morfométricos avaliados em septo nasal foram: 1) área de epitélio por unidade de superfície de membrana basal (EP/MB), 2) área de cílios por unidade de superfície de membrana basal (CI/MB), 3) número de núcleos por unidade de superfície de membrana basal (NN/MB), 4) área de muco ácido por unidade de superfície de membrana basal (MAc/MB), 5) área de muco ácido por área de epitélio (MAc/EP) e 6) número de núcleos por área de epitélio (NN/EP). Para NN/MB, o grupo VGD apresentou diferença estatística com os grupos IT3, IT5 e IT9. Para NN/EP, o grupo VGD teve diferença estatística com os todos grupos mantidos em VMA (IT3, IT5, IT7 e IT9). Em AE/MB observou-se diferença significativa do grupo VGD com os grupos IT7 e IT9. Para CI/MB notou-se diferença significativa entre os grupos IT3 e IT7. Embora não foi demonstrada diferença significativa entre os demais grupos, os dados sugerem que o grupo IT3 apresenta proporcionalmente maior área de cílios em relação aos demais grupos. Em MAc/MB e MAc/EP observou-se diferença significativa entre os grupos VGD e IT7. Na avaliação qualitativa da traquéia por escores, predominou a lesão inflamatória crônica, com intenso infiltrado de mononucleares (predominando neutrófilos). A presença e intensidade dessas lesões variaram de acordo com o sistema de ventilação sendo que somente no grupo VGD é que foram encontradas lesões severas (grau III). Com base nos resultados obtidos, os animais mantidos no sistema VMA, independente do intervalo de trocas de cama a que foram submetidos, apresentaram menor intensidade de lesões no septo nasal e na traquéia do que os animais mantidos em VGD. A maior integridade epitelial pode ser relacionado com a qualidade das condições ambientais fornecida aos animais alojados no sistema VMA, confirmando ser este o sistema mais adequado para a manutenção de ratos em experimentação.

Estudo da resposta inflamatória em lactentes com sibilância : análise de IL-10 e celularidade no aspirado nasofaríngeo

Episódios de sibilância secundários a infecções respiratórias virais são comuns nos primeiros anos de vida. Contudo, sua patogênese e relação com o posterior surgimento de asma permanecem ainda pouco esclarecidos. Com o objetivo de analisar a resposta celular e da IL-10 em lactentes com sibilância, foram analisadas amostras de aspirado nasofaríngeo de 71 lactentes. Os pacientes foram classificados em três grupos: primeiro episódio de sibilância (n=36), sibilância recorrente (n=18) e infecção de vias aéreas superiores (n=17). O exame citológico da secreção nasofaríngea demonstrou uma predominância de neutrófilos em todos os grupos. Não foi evidenciada a presença de eosinófilos na secreção nasofaríngea de nenhum paciente, exceto em um caso do grupo de sibilância recorrente, cujo percentual dessas células foi de 1%. Foram encontrados níveis de IL-10 significativamente aumentados no aspirado nasofaríngeo do grupo com primeiro episódio de sibilância, quando comparados ao grupo de infecção de vias aéreas superiores (p=0,017). Não foi encontrada correlação significativa entre os níveis de IL-10 em secreção nasofaríngea e gravidade do episódio de sibilância. Conclui-se que os neutrófilos são as células que predominam na resposta inflamatória em lactentes com sibilância secundária à infecção respiratória viral e que a IL-10 pode ser uma citocina com participação importante na predisposição à doença obstrutiva brônquica do lactente.

Estresse oxidativo e o desenvolvimento de sepse

O estresse oxidativo tem um papel importante no desenvolvimento da falência orgânica múltipla e choque séptico. O presente estudo foi realizado para determinar diferentes parâmetros de dano oxidativo a biomoléculas, produção de superóxido mitocondrial, atividades da superóxido dismutase e catalase e suas relações com a mortalidade por sepse em um modelo animal. Além disso, nós avaliamos os efeitos da combinação de antioxidantes (N-acetilcisteína e deferoxamina) em um modelo murino de sepse polimicrobiana induzida por ligação cecal e punção (CLP). Ratos Wistar machos (250-300 g) foram randomicamente divididos em quatro grupos: sham-operated, CLP ressuscitado com solução salina (50 ml/Kg imediatamente e 12h após CLP), CLP ressuscitado com solução salina e antibioticoterapia (solução salina 50 ml/ Kg imediatamente e 12h após CLP + ceftriaxone 30 mg/Kg e clindamicina 25 mg/Kg de 6/6h), e CLP com N-acetilcisteína (20 mg/kg subcutâneo, 3h, 6h, 12h, 18h e 24h após CLP) + deferoxamina (20mg/kg, subcutâneo, 3h e 24h após CLP). A peroxidação lipídica, a carbonilação protéica e a atividade da superóxido dismutase se apresentaram significativamente aumentadas nos animais não-sobreviventes podendo predizer a mortalidade. Nós demonstramos que existe uma modulação diferente da superóxido dismutase e da catalase nos animais não-sobreviventes Existe um grande aumento da atividade da superóxido dismutase sem um aumento proporcional da atividade da catalase nos não-sobreviventes. Os ratos tratados com antioxidantes apresentaram uma redução significante da atividade da mieloperoxidase e da peroxidação lipídica em todos os órgãos estudados. A produção de superóxido mitocondrial apresentou uma redução significante nos animais tratados com antioxidantes. Além disto, o tratamento com antioxidantes melhorou o equilíbrio entre a atividade da catalase e superóxido dismutase. A sobrevivências nos ratos sépticos não tratados foi de 10%. A sobrevivência aumentou para 40% com a ressuscitação volêmica e antibióticos. Ratos tratados apenas con N-acetilcisteína e desferoxamina apresentaram uma sobrevivência de 47%, similar aos ratos que receberam suporte básico. Este estudo demonstrou pela primeira vez que a atividade da superóxido dismutase deve ser um marcador precoce de mortalidade em sepse. Nossos resultados auxiliam o entendimento de aspectos importantes da resposta oxidativa na sepse; um aumento na atividade da superóxido dismutase sem um aumento proporcional na atividade da catalase. Além disto, nossos resultados demonstraram que o tratamento combinado com N-acetilcisteína e desferoxamina reduzem as conseqüências da sepse, reduzindo o estresse oxidativo, limitando a ativação de neutrófilos e a disfunçào mitocondrial, levando a uma melhor sobrevida.

Variação dos perfis metabólico, hematológico e lácteo em ovinos leiteiros na serra gaúcha

A ovinocultura no Rio Grande do Sul (RS), tem mostrado mudanças no tipo de exploração nos últimos 20 anos. A produção de lã, que por muito tempo movimentou a economia do setor primário, cedeu lugar para a produção de cordeiros. Recentemente, a ovinocultura leiteira começa a dar seus primeiros passos dentro do sistema de produção ovina. Esta dissertação tem por objetivo apresentar a variação dos perfis metabólico, hematológico e lácteo em ovinos leiteiros na Serra Gaúcha e discutir seus resultados. O trabalho foi realizado em ovelhas da raça Lacaune, criadas em regime de confinamento no município de Bento Gonçalves (RS). As observações se estenderam pelo período de dois anos consecutivos. Para determinação do perfil bioquímico foram coletadas amostras de sangue por venipunção jugular sem anticoagulante. O mesmo procedimento foi empregado na coleta de amostras para o hemograma, utilizando-se, nesse caso, tubos contendo EDTA, como anticoagulante. As amostras foram coletadas de sete animais ao acaso nos seguintes períodos fisiológico: (a) ovelhas vazias; (b) início, (c) meio e (d) final da gestação e (e) aos 7, (f) 30, (g) 60 e (h) 140 dias de lactação. Durante os mesmos períodos da lactação foram coletadas amostras para a determinação dos componentes físico-químicos do leite. Os valores dos parâmetros físico-químicos do leite estudados discordam com os resultados citados pela literatura em outros países. A acidez em °Dornic (°D) foi maior que a relatada em outros estudos. Os valores de proteína e gordura foram inferiores aos citados na literatura. Os parâmetros com variação estatística (P<0,05) no período da lactação foram: pH, acidez em °D, densidade, proteína, lactose, gordura, ESTe ESD. O perfil metabólico apresentou as maiores variações com relação à média no final da gestação e início da lactação. Não foi observada diferença significativa nos parâmetros analisados entre o grupo de ovelhas vazias e prenhes, com exceção do cálcio que foi maior nas ovelhas vazias (P<0,05). Dentre os parâmetros do metabolismo nitrogenado, apenas a uréia mostrou variação durante a gestação e a lactação (P<0,05). Os valores de glicose e fructosamina diminuíram e os de BHB aumentaram significativamente (P<0,05) no final da gestação. Durante a lactação a glicose diminuiu e o colesterol aumentou significativamente (P<0,05) com o avanço do período. O nível de magnésio aumentou no final da lactação e o fósforo apresentou um diminuição nos valores aos 30 dias após o parto (P<0,05). Os parâmetros hematológicos mostraram não haver diferença significativa nos diferentes períodos fisiológicos estudados, com exceção dos neutrófilos segmentados que aumentaram com o avanço da gestação. Os dados encontrados servem como referência para estudos sobre nutrição, metabolismo e qualidade do leite em ovelhas leiteiras.

Transporte espermático e resposta inflamatória na égua após a inseminação com diferentes concentrações de espermatozóides.

Normalmente, após a cobertura ou a inseminação artificial de éguas, ocorre uma endometrite aguda transitória em resposta ao sêmen e bactérias no útero. O objetivo deste estudo foi verificar se o transporte espermático e a intensidade da reação inflamatória uterina, 2h, 4h ou 24h após a inseminação com sêmen resfriado, são influenciados pela concentração espermática na dose inseminante. Para tal, foram utilizadas 192 éguas em cio, com folículo dominante ≥35 mm, sem crescimento bacteriano e livres de PMNs aos exames uterinos complementares. As éguas foram distribuídas aleatoriamente em grupos e inseminadas com 20 ml contendo 100x106 (n=30), 500x106 (n=27) ou 1000x106 (n=31) espermatozóides diluídos em solução de 3 ml de plasma seminal e 17 ml de leite desnatado, refrigerado e armazenado por 18 a 22 horas, ou infundidas com 20 ml de plasma seminal (n=33), ou com 20 ml de leite desnatado (n=38). As éguas foram abatidas duas, quatro ou 24h após as inseminações ou infusões. O grupo controle (n=33) não recebeu nenhum tratamento. Os ovidutos foram separados do útero, sendo útero e ovidutos lavados separadamente com PBS. Uma amostra do lavado de cada oviduto foi examinada para contagem de espermatozóides e uma amostra de cada lavado uterino foi utilizada para contagem de leucócitos. Após as lavagens, foi retirada uma amostra de endométrio para exame histopatológico. As éguas inseminadas e infundidas apresentaram reação inflamatória significativamente maior que as éguas do grupo controle, no decorrer das 24 horas. A reação inflamatória foi significativamente maior nas éguas inseminadas que nas infundidas. A reação inflamatória apresentou correlação com a concentração espermática (r=0,389). O número de éguas apresentando espermatozóides nos ovidutos não foi diferente nos grupos inseminados. Concluiu-se que componentes da dose inseminante provocam uma resposta inflamatória, sendo esta tanto mais severa e de resolução mais rápida, quanto maior for a concentração espermática. Por outro lado, até as quatro horas pós-inseminação, o transporte espermático independe da concentração espermática utilizada.

Estudos sobre a ação de leucócitos no endométrio de éguas.

As endometrites bacterianas são uma das principais causas de infertilidade na égua. Entre os tratamentos utilizados nesta patologia, estão as infusões uterinas de plasma homólogo acrescido de leucócitos e a infusão de leucócitos heterólogos criopreservados. O presente trabalho teve por objetivo realizar testes in vivo e in vitro, que foram descritos em dois artigos. No primeiro artigo, objetivou-se avaliar in vitro a quimiotaxia dos leucócitos eqüinos em relação a diferentes quimioatraentes, bem como sua vitalidade e produção de radicais livres de oxigênio (ROS) pós-descongelamento. No experimento 1, testou-se dextrose em concentrações de 0, 1, 2 e 6%, acrescida ou não de interleucina-8 (IL-8), como quimioatraente para leucócitos eqüinos suspensos em salina fosfatada tamponada (PBS) ou em R3F; no experimento 2, testou-se plasma homólogo ou heterólogo, a 3% (com ou sem IL-8), 10, 30, 60 e 90%, como quimioatraente; no experimento 3, foi testada a quimiotaxia de leucócitos íntegros em relação a diferentes quantidades de leucócitos lisados. O experimento 4 avaliou a vitalidade e a geração de ROS pelos leucócitos após o descongelamento, comparando quatro graus de diluição em NaCl e PBS. Concluiu-se que a dextrose não apresenta bom efeito quimioatraente para leucócitos eqüinos. Dentre as concentrações de plasma utilizadas, concentrações de plasma homólogo entre 10% e 60% apresentam bom efeito quimiotático. Já o plasma heterólogo apresentou boa atração de leucócitos quando em concentrações de 10% e de 30% Na concentração de 10x106/mL, os leucócitos lisados foram capazes de atrair leucócitos em proporção semelhante à da IL-8. Com relação aos testes-pós-descongelamento, células ressuspendidas em PBS ou NaCl apresentam vitalidade e geração de radicais livres de oxigênio semelhantes, quando incubados por até 15 minutos. No segundo artigo, realizaram-se testes in vivo compararando cinco tratamentos em éguas, em estro, experimentalmente infectadas com Streptococcus equi subsp.zooepidemicus. Foram utilizadas 25 éguas, 20 consideradas resistentes, e 5 éguas susceptíveis à endometrite. Após 24 horas, os animais foram submetidos a exame clínico, bacteriológico e citológico. Com a presença de quadro clínico de endometrite, as éguas eram submetidas a um dos seguintes tratamentos: 1-Infusão de 120mL de plasma homológo com de leucócitos frescos; 2-– Infusão de 4 mL contendo 800 x 106 leucócitos íntegros, congelados; 3-Leucócitos lisados - Infusão de 4 mL contendo 800 x 106 leucócitos lisados; 4- IL-8- Infusão de 4 mL contendo 25 ng/mL de IL-8 congelada; 5-Controle – Infusão de 4 mL de meio R3F congelado. Os exames clínico, bacteriológico e citológico foram realizados diariamente até o sétimo dia pós-infecção, ou até a eliminação da bactéria, ou até a ausência de neutrófilos no esfregaço citológico. Após os exames, as éguas receberam o tratamento designado, sendo estes realizados diariamente até a ausência de crescimento bacteriano no exame microbiológico ou por, no máximo, quatro dias. No sétimo dia, todas as éguas foram tratadas com infusão intra-uterina de 5.000.000 UI de penicilina G potássica cristalina. Após o término de um tratamento, aguardava-se cerca de sete dias para a reinfecção, num outro ciclo, quando um outro tratamento era aplicados. Todas as éguas foram submetidas a todos os tratamentos, perfazendo um total de 125 infecções experimentais num delineamento experimental do tipo Quadrado Latino. Não se observaram diferenças significativas no tempo de eliminação bacteriana nas éguas resistentes. Entretanto, nas éguas susceptíveis, observou-se uma cura bacteriana mais rápida quando as éguas foram tratadas com leucócitos frescos, leucócitos congelados e leucócitos lisados, em relação às tratadas com IL-8 e as do grupo controle. Concluiu-se que o efeito bactericida dos leucócitos viáveis ou lisados, associados ou não à presença de fatores de opsonização do plasma, foi o responsável pela cura bacteriológica e que o efeito quimioatraente de neutrófilos, plasma, restos celulares e IL-8 não influiu no tempo de eliminação bacteriana.

Avaliação da função nasal em indivíduos expostos ao TXIB

A importância de se estudar os efeitos de substâncias potencialmente deletérias para o nosso organismo, em locais fechados, tem recebido maior atenção nos últimos anos. O ser humano contemporâneo passa grande parte do dia em ambientes fechados e a qualidade do ar repercute no seu bem-estar e também poderá influenciar sua saúde. A Síndrome do Prédio Doente (SPD) é definida como uma condição médica em que indivíduos apresentam uma série de sintomas físicos relacionados ao ambiente de trabalho. A SPD resulta em perda substancial do desempenho no trabalho e relações pessoais, além de considerável perda de produtividade. Como o nariz representa a primeira área exposta aos contaminantes ambientais e a histologia da mucosa nasal é similar à da mucosa das vias aéreas inferiores, processos inflamatórios nas cavidades nasais podem refletir ou afetar àqueles nas vias aéreas inferiores. Estudou-se a exposição nasal aguda ao TXIB (2,2,4- trimetil-1,3-pentanediol diisobutirato), comumente utilizado como um plastificante, em 19 voluntários normais e avaliou-se as alterações na função nasal (resitência nasal, transporte mucociliar e celularidade nasal), tendo como controles a exposição ao placebo e etanol. A exposição nasal ao TXIB e etanol resultou em aumento significativo da resistência nasal total (p< 0,05). Entretanto, também verificou-se aumento na resistência no grupo placebo (p<0,05). O tempo de transporte mucociliar aumentou nos grupos placebo e TXIB, não significativamente (p>0,05). No grupo etanol houve diminuição (p>0,05). O número de células totais e neutrófilos aumentou nos três grupos estudados, porém sem diferença estatisticamente significativa (p>0,05). O número de células epiteliais aumentou nos indivíduos expostos ao TXIB e etanol, e diminuiu no grupo placebo, não significativamente. Porém, no grupo TXIB demonstrou-se aumento do número de células epiteliais com forte tendência estatística (p=0,065). A análise dos resultados deste estudo nos permite concluir que a celularidade nasal apresenta-se como uma medida da função nasal com maior sensibilidade para demonstrar alterações em indivíduos expostos agudamente ao TXIB, sendo que o número de células epiteliais altera-se imediatamente após a exposição.

Efeito da sinvastatina na sepse abdominal de ratos diabéticos

Analisar se o pré-tratamento com sinvastatina em modelo experimental de sepse abdominal é benéfico em ratos diabéticos. Métodos: Cinquenta e seis ratos Wistar foram aleatoriamente distribuídos em: grupo não diabético (n-28) e grupo diabetes induzido por estreptozotocina (n=28). Sepse abdominal por ligadura e punção do ceco foi induzida em 14 ratos diabéticos e em 14 não diabéticos. Os demais 28 animais foram alocados em grupo sham. Os grupos de ratos com sepse e os sham (cada com sete animais) foram tratados com microemulsão oral de simvastatina (20 mg kg-1 day-1) e solução salina 0,9%, respectivamente. Sangue periférico foi usado para dosagem de TNFa, IL-1b, IL-6, proteína C reativa, procalcitonina, contagem de leucócitos e neutrófilos em todos os animais. A análise estatística foi realizada pela ANOVA e teste de Tukey, com p<0,05. Resultados: A sinvastatina reduziu a mortalidade nos ratos diabéticos. Os valores séricos de TNF-a, IL-1b, IL-6, proteína C reativa, procalcitonina, leucócitos e neutrófilos mostraram-se mais baixos nos ratos diabéticos e não diabéticos com sepse, tratados com sinvastatina, do que nos tratados com solução salina. Conclusão: A sinvastatina teve efeito antiinflamatório, que pode ter resultado em proteção contra a sepse em ratos diabéticos

Effects of simvastatin in abdominal sepsis in rats

Statins are widely recognized as hypolipemic drugs, but some studies have observed anti-inflammatory and immunomodulatory effects, known as pleiotropic. The aims of this work was to study possible anti-inflammatory effects of simvastatin in abdominal sepsis. Serum pro-inflammatory cytokines and leukocytes count were determined in an experimental model of abdominal sepsis, using cecal ligation and puncture (CLP) in rats. Methods: Twenty eigth Wistar rats weighing 285±12g were randomly divided in: CLP/Sinvastatin rats (n=7), treated with 10 mg/Kg of oral simvastatin 18 and 2 hs berofe CLP; CLP/Saline group rats (n=7), treated with oral saline; group Sham/Simvastatin (n=7), treated with simvastatin, and group Sham/Saline (n=7), treated with saline. Serum TNF-α, IL-1β and IL-6 by ELISA and total leukocytes, neutrophils, lymphocytes, and eosinophils were determined 24 hs after CLP. ANOVA and Tukey test were used considering significant p<0.05. Results: It was demonstrated that serum TNF-α, IL-1β and IL-6 were respectively 364,8±42pg/mL; 46,3±18pg/mL and 28,4±13pg/mL in CLP/Sinvastatin rats, significantly lower (p<0.05) than in group CLP/Saline (778,5±86pg/ml; 176,9±46pg/ ml; 133,6±21 pg/ml, respectively). The same results were observed in total leukocytes and neutrophils counts. Conclusion: These results clearly demonstrate that simvastatin is an effective agent that reduces cytokines levels and leukocyte count in sepsis, independently of its well-known lipid-lowering effects. Thus, HMG-CoA reductase inhibitors like simvastatin have important anti-inflammatory effects in abdominal sepsis in rats

Purificação, caracterização e análise da atividade bioinseticida, de um inibidor de tripsina em sementes de catanduva (Piptadenia moniliformis)

One Kunitz-type trypsin inhibitors (PmTI) was purified from Piptadenia moniliformis seeds, a tree of the sub-family Mimosoideae, by TCA precipitation, affinity chromatography on immobilized trypsin-Sepharose, DEAE cellulose (ion exchange) and Superose 12 (molecular exclusion) column FPLC/AKTA. The inhibitor has Mr of 25 kDa by SDS-PAGE and chromatography molecular exclusion. The N-terminal sequence of this inhibitor showed high homology with other family Kunitz inhibitors. This also stable variations in temperature and pH and showed a small decrease in its activity when incubated with DDT in the concentration of 100mM for 120 minutes. The inhibition of trypsin by PmTI was competitive, with Ki of 1.57 x10-11 M. The activity of trypsin was effectively inhibited by percentage of inhibition of 100%, among enzymes tested, was not detected inhibition for the bromelain, was weak inhibitor of pancreatic elastase (3.17% of inhibition) and inhibited by 76.42% elastase of neutrophils, and inhibited in a moderate, chymotrypsin and papain with percentage of inhibition of 42.96% and 23.10% respectively. In vitro assays against digestive proteinases from Lepidoptera, Diptera and Coleoptera pests were carried out. Several degrees of inhibition were found. For Anthonomus grandis and Ceratitis capitata the inhibition was 89.93% and 70.52%, respectively, and the enzymes of Zabrotes subfasciatus and Callosobruchus maculatus were inhibited by 5.96% and 9.41%, respectively, and the enzymes of Plodia. interpunctella and Castnia licus were inhibited by 59.94% and 23.67, respectively. In vivo assays, was observed reduction in the development of larvae in 4rd instar of C. capitata, when PmTI was added to the artificial diet, getting WD50 and LD50 of 0.30% and 0.33%, respectively. These results suggest that this inhibitor could be a strong candidate to plant management programs cross transgenic

Novas propriedades do SKTI (Inibidor de tripsina de soja): inibição para elastase neutrofílica humana e efeitos no processo de injúria pulmonar aguda

Seeds from legumes including the Glycine max are known to be a rich source of protease inhibitors. The soybean Kunitz trypsin inhibitor (SKTI) has been well characterised and has been found to exhibit many biological activities. However its effects on inflammatory diseases have not been studied to date. In this study, SKTI was purified from a commercial soy fraction, enriched with this inhibitor, using anion exchange chromatography Resource Q column. The purified protein was able to inhibit human neutrophil elastase (HNE) and bovine trypsin. . Purified SKTI inhibited HNE with an IC50 value of 8 µg (0.3 nM). At this concentration SKTI showed neither cytotoxic nor haemolytic effects on human blood cell populations. SKTI showed no deleterious effects on organs, blood cells or the hepatic enzymes alanine amine transferase (ALT) and aspartate amino transferase (AST) in mice model of acute systemic toxicity. Human neutrophils incubated with SKTI released less HNE than control neutrophils when stimulated with PAF or fMLP (83.1% and 70% respectively). These results showed that SKTI affected both pathways of elastase release by PAF and fMLP stimuli, suggesting that SKTI is an antagonist of PAF/fMLP receptors. In an in vivo mouse model of acute lung injury, induced by LPS from E. coli, SKTI significantly suppressed the inflammatory effects caused by elastase in a dose dependent manner. Histological sections stained by hematoxylin/eosin confirmed this reduction in inflammation process. These results showed that SKTI could be used as a potential pharmacological agent for the therapy of many inflammatory diseases

Purificação, caracterização e avaliação da atividade antiproliferativa de um inibidor de quimotripsina tipo kunitz de semente de Eryhrina velutina

A chymotrypsin inhibitor was purified from Erythrina velutina seeds by ammonium sulphate fractionation, affinities chromatographies on Trypsin-Sepharose, Quimotrypsin-Sepharose and reversed phase C-18 FPLC/AKTA system. The inhibitor, named EvCI, shown molecular mass of 17 kDa, as determined by SDSPAGE. 2D-PAGE showed four isoinhibitors with pI values of 4,42, 4,63, 4,83 and 5,06, with molecular mass of 17 kDa each. The aminoacid sequence of EvCI was determined by MALDI-TOF-MS and showed a high similarity with other Kunitz-type inhibitor of Erythrina variegata. EvCI competitively inhibited chymotrypsin, with Ki of 4 x10-8 M, but did not inhibited trypsin, pancreatic elastase, bromelain and papain. The inhibitory activity of EvCI was stable over wide pH and temperature ranges. In the presence of DTT 100 mM for 120 min, EvCI lost 50 % of activity. Cytotoxicity was studied in HeLa, MDA, HepG2, K562 and PC3 cells after 72-h incubation period. EvCl inhibited HeLa cells growth with an IC50 value of 50 μg/ml. Subsequent studies in HeLa cells analysis of cell death by annexin V/PI double-staining and cell cycle, using flow cytometry. The results provide evidence for a cytostatic activity of EvCl and support further studies on potential application of this inhibitors as an antiproliferative agent in combined therapy against cervical cancer

Avaliação das atividades anti-inflamatória, anticoagulante e antiproliferativa do inibidor de quimotripsina das sementes de erythrina velutina (EvCI)

Studies indicate that several components were isolated from medicinal plants, which have antibacterial, antifungal, antitumor and anti-inflammatory properties. Sepsis is characterized by a systemic inflammation which leads to the production of inflammatory mediators exacerbated by excessive activation of inflammatory cells and disseminated intravascular coagulation (DIC), in which the human neutrophil elastase plays an important role in its pathogenesis. Several epidemiological studies suggest that components of plants, especially legumes, can play a beneficial role in reducing the incidence of different cancers. A chymotrypsin inhibitor of Kunitz (Varela, 2010) was purified from seeds of Erythrina velutina (Mulungu) by fractionation with ammonium sulfate, affinity chromatography on Trypsin-Sepharose, Chymotrypsin-Sepharose and ion exchange chromatography on Resource Q 1 ml (GE Healthcare) in system FPLC / AKTA. The inhibitor, called EvCI, had a molecular mass of 17 kDa determined by SDS-PAGE. The purified protein was able to inhibit human neutrophil elastase (HNE), with an IC50 of 3.12 nM. The EvCI was able to inhibit both pathways of HNE release stimulated by PAF and fMLP (75.6% and 65% respectively). The inhibitor also inhibited leukocyte migration in septic mice about 87% and prolonged the time of coagulation and inhibition factor Xa. EvCI showed neither hemolytic activity nor cytotoxicity. EvCI showed a selective antiproliferative effect to HepG2 cell lines with IC50 of 0.5 micrograms per milliliter. These results suggest EvCI as a molecule antagonist of PAF / fMLP and a potential use in fighting inflammation related disorders, disseminated intravascular coagulation (DIC) and cancer

Influência do tempo e dose de heparina em modelo de peritonite aguda

In the last years, heparin has become target of many studies related to inflammation due its ability of biding to proteins involved on immune response. Recently, it was demonstrated, at our laboratory, using a thIoglycollate-induced peritonitis model, heparin s capacity of reduce cellular influx into the peritoneal cavity, 3 hours after the inflammatory stimulus. Once neutrophilic infiltration is highest around 8 hours after the inflammatory stimulus, at the present work, using the same peritonitis model, it was assessed heparin s ability of keeping the interference on leukocyte infiltration, 8 hours after inflammation induction. Moreover, using cellular differential count, it was evaluated how the cellular populations involved in the inflammatory process would be affected by the treatment. Eight hours after the inflammatory stimulus, only heparin dosage of 1 μg/Kg was able to reduce the cellular influx to peritoneum, 62.8% of reduction when compared to positive control (p < 0.001). Furthermore, heparin dosage of 15 μg/Kg presented a pro-inflammatory effect in whole blood verified by the increase of 60.9% (p < 0.001) and 117.8% (p < 0.001) on neutrophils and monocytes proportion, respectively, when compared to positive control. In addition, this dosage also presented a neutrophilic proportion on peritoneal fluid 27.3% higher than positive control (p < 0.05). This duality between anti- and pro-inflammatory effects at different times corroborates studies that attribute a pleiotropic immunomodulator role to heparin.

Estudo comparativo de carragenanas comerciais Kappa, Iota e Lambda no processo inflamatório em ratos :edema intraplantar e pleurisia

The Iota, Kappa and Lambda commercial carrageenans are rarely pure and normally contain varying amounts of the other types of carrageenans. The exact amount of impurity depends on the seaweed source and extraction procedure. Then, different analysis methods have been applied for determination of the main constituents of carrageenans because these three carrageenans are extensively used in food, cosmetic and pharmaceutical industry. The electrophoresis of these compounds proved that the carrageenans are constituted by sulfated polysaccharides. These compounds were characterized by colorimetric methods and was observed that the Lambda carrageenan shown the greater value (33.38%) of sulfate. These polymers were examined by means of 13C NMR spectroscopy and infrared spectra. The polysaccharides consisted mainly of units alternating of sulfated galactoses and anhydrogalactoses. The aim of the study was also to test the inflammatory action of these different polysaccharides. A suitable model of inflammation is acute sterile inflammation of the rat hind limb induced by carrageenan. Paw edema was induced by injecting carrageenans (κ, ι and λ) in saline into the hind paw of a male Wistar rats (175–200 g). The pathway to acute inflammation by carrageenan (kappa, iota and lambda) were expressed as time-edema dependence and measured by paw edema volume. For this purpose, was used an apparatus (pakymeter), which makes it possible to measure the inflammation (swelling of the rat foot) with sufficient accuracy. The results showed that κ-carrageenan (1%) have an edema of 3.7 mm and the paw edema increase was time and dose dependent; the ι-carrageenan (0.2%) caused an edema of 4 mm and the λ-carrageenan (1%) caused an edema of 3.6 mm. Other model was used in this study based in the inflammation of pleura for comparatives studies. Injection of carrageenans into the pleural cavity of rat induced an acute inflammatory response characterized by fluid accumulation in the pleural cavity, a large number of neutrophils and raised NO production. The levels of NO were measured by Griess reactive. The ι-carrageenan caused the greater inflammation, because it has high concentration of nitrite/nitrate (63.478 nmoles/rat), exudato volume (1.52 ml) and PMNs (4902 x 103 cells). Quantitative evaluation of inflammations of rats is a useful and important parameter for the evaluation of the efficacy of anti-inflammatory drugs