964 resultados para Mécanisme enzymatique
Resumo:
Linsuffisance rnale chronique (IRC) se dfinit par un dfaut de filtration glomrulaire et est associe plusieurs dsordres. La perturbation de lhomostasie glucidique en fait partie. Lhomostasie glucidique est contrle principalement par linsuline, soit lhormone scrte en rponse au glucose par les cellules bta-pancratiques contenues dans les lots de Langerhans. La prservation de la fonction de la cellule bta est essentielle au maintien de lhomostasie glucidique. Il a t dmontr que la scrtion de l'insuline est altre au cours l'IRC, cependant les mécanismes demeurent peu connus. Au cours de lIRC, laccumulation chronique de toxines urmiques pourrait contribuer la dfaillance de la cellule bta. Lure est une toxine urmique majeure et sa toxicit a t rcemment rapporte dans plusieurs tissus. Le but de ce mmoire tait donc de vrifier le rle de lure dans la dysfonction de la cellule bta-pancratique au cours de lIRC. Nous avons dmontr que lexposition des lots de souris des concentrations pathologiques dure entrane une diminution de la scrtion dinsuline via laugmentation du stress oxydant et des O-glycosylations. Ce dfaut est d une perturbation du mtabolisme intracellulaire du glucose. Entre autres, nous avons observ une baisse de la glycolyse associe la rduction de lactivit enzymatique de la phosphofructokinase-1. Ces rsultats dmontrent un effet toxique direct de lure sur la scrtion dinsuline et permettent de mieux comprendre le mécanisme de dysfonction de la cellule bta-pancratique au cours de lIRC.
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Linsuffisance rnale chronique (IRC) se dfinit par un dfaut de filtration glomrulaire et est associe plusieurs dsordres. La perturbation de lhomostasie glucidique en fait partie. Lhomostasie glucidique est contrle principalement par linsuline, soit lhormone scrte en rponse au glucose par les cellules bta-pancratiques contenues dans les lots de Langerhans. La prservation de la fonction de la cellule bta est essentielle au maintien de lhomostasie glucidique. Il a t dmontr que la scrtion de l'insuline est altre au cours l'IRC, cependant les mécanismes demeurent peu connus. Au cours de lIRC, laccumulation chronique de toxines urmiques pourrait contribuer la dfaillance de la cellule bta. Lure est une toxine urmique majeure et sa toxicit a t rcemment rapporte dans plusieurs tissus. Le but de ce mmoire tait donc de vrifier le rle de lure dans la dysfonction de la cellule bta-pancratique au cours de lIRC. Nous avons dmontr que lexposition des lots de souris des concentrations pathologiques dure entrane une diminution de la scrtion dinsuline via laugmentation du stress oxydant et des O-glycosylations. Ce dfaut est d une perturbation du mtabolisme intracellulaire du glucose. Entre autres, nous avons observ une baisse de la glycolyse associe la rduction de lactivit enzymatique de la phosphofructokinase-1. Ces rsultats dmontrent un effet toxique direct de lure sur la scrtion dinsuline et permettent de mieux comprendre le mécanisme de dysfonction de la cellule bta-pancratique au cours de lIRC.
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Rsum : Les maladies cardiovasculaires reprsentent la principale cause de mortalit mondiale, soit le tiers des dcs annuels selon lOrganisation mondiale de la Sant. Lhypercholestrolmie, caractrise par une lvation des niveaux plasmatiques de lipoprotines de faible densit (LDL), est lun des facteurs de risque majeur pour les maladies cardiovasculaires. La proprotine convertase subtilisine/kexine type 9 (PCSK9) joue un rle essentiel dans lhomostasie du cholestrol sanguin par la rgulation des niveaux protiques du rcepteur LDL (LDLR). PCSK9 est capable de se lier au LDLR et favorise linternalisation et la dgradation du rcepteur dans les lysosomes. Linhibition de PCSK9 savre une cible thrapeutique valide pour le traitement de lhypercholestrolmie et la prvention des maladies cardiovasculaires. Par contre, plusieurs mécanismes responsables de la rgulation et la dgradation du complexe PCSK9-LDLR nont pas encore t compltement caractriss comme la rgulation par la protine annexin A2 (AnxA2), un inhibiteur endogne de PCSK9. De plus, plusieurs vidences suggrent la prsence dune ou plusieurs protines, encore inconnues, impliques dans le mécanisme daction de PCSK9. Celles-ci pourraient rguler linternalisation et le transport du complexe PCSK9-LDLR vers les lysosomes. Les objectifs de cette thse sont de mieux dfinir le rle et limpact de lAnxA2 sur la protine PCSK9 en plus didentifier de nouveaux partenaires dinteractions de PCSK9 pour mieux caractriser son mécanisme daction sur la rgulation des niveaux de LDLR. Nous avons dmontr que linhibition de PCSK9 par lAnxA2 extracellulaire seffectue via sa liaison aux domaines M1+M2 de la rgion C-terminale de PCSK9 et nous avons mis en vidence les premires preuves dun contrle intracellulaire de lAnxA2 sur la traduction de lARNm de PCSK9. Nos rsultats rvlent une liaison de lAnxA2 lARN messager de PCSK9 qui cause une rpression traductionnelle. Nous avons galement identifi la protine glypican-3 (GPC3) comme un nouveau partenaire dinteraction extracellulaire avec le PCSK9 et intracellulaire avec le complexe PCSK9-LDLR dans le rticulum endoplasmique des cellules HepG2 et Huh7. Nos tudes dmontrent que GPC3 rduit lactivit extracellulaire de PCSK9 en agissant comme un comptiteur du LDLR pour la liaison avec PCSK9. Une meilleure comprhension des mécanismes de rgulation et de dgradation du complexe PCKS9-LDLR permettra de mieux valuer limpact et lefficacit des inhibiteurs de la protine PCSK9.
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RESUMO: As concentraes circulantes de clcio so notavelmente constantes a despeito das variaes dirias na absoro intestinal e na eliminao renal deste elemento. A regulao da calcmia um sistema complexo que compreende vrios factores controladores (a calcmia, a fosformia, as concentraes circulantes de paratormona (PTH) e calcitriol alm de muitos outros factores como hormonas esterides em geral, outros ies como o magnsio e outros factores hormonais) e vrios rgos alvo (glndulas paratiroideias, osso, rim e intestino). As respostas dos rgos alvo tambm so muito variadas. No caso mais simples, a cristalizao de sais de clcio corresponde a uma mudana de fase em que participam molculas orgnicas que a iniciam, aceleram ou inibem. Em geral a combinao de um factor controlador com o respectivo receptor de membrana (para polipeptdeos ou ies) ou intracelular (hormonas esterides) apenas o primeiro passo de uma cadeia bioqumica que introduz uma enorme amplificao na resposta. A esta variedade de mecanismos de resposta correspondem grandes diferenas nos tempos de resposta que podem ser de minutos a semanas. hoje possvel observar (medir) com aprecivel rigor nos lquidos biolgicos (sangue, urina, fezes, etc.) os factores mais importantes do sistema de regulao da calcmia (clcio, fsforo, paratormona e calcitriol) assim como administrar estes factores em experincias agudas. Esta possibilidade reflecte se na literatura neste campo que tem vindo a crescer. O advento das tcnicas da biologia molecular tem permitido a caracterizao molecular de algumas das disfunes da homeostase do clcio e de esperar um diagnstico fisiopatolgico cada vez mais rigoroso dessas disfunes. Com o avano dos conhecimentos nesta rea que no cessa de aumentar temos cada vez maiores capacidades para fazer diagnsticos e cada vez mais difcil interpretar com rigor os correspondentes quadros metablicos. A anlise ou sntese de sistemas complexos a actividade mais nobre dos engenheiros que lhes permite desenhar pontes, diques, barcos, avies ou automveis. Com o aparecimento de computadores de mdio ou grande porte foi lhes possvel utilizar descries matemticas no s para desenhar sistemas como ainda para interpretar eventuais falhas na sua operao. Essas descries matemticas consistem numa sequncia de operaes realizadas num computador segundo um programa informtico que receberam a designao genrica de modelos, por analogia com as famosas leis (equaes) da fsica que foram deduzidas a partir de um certo nmero de postulados e que permitem representar matematicamente processos fsicos. As famosas leis de Newton so talvez os exemplos mais famosos de modelos de sistemas fsicos. A introduo de modelos matemticos em biologia e particularmente em medicina s se deu recentemente.MTODOS No trabalho que aqui se apresenta construiu - se um modelo simplificado da homeostase do clcio destinado ao clculo de variveis observveis (concentraes de clcio, fsforo, PTH e calcitriol) de modo a poderem comparar-se valores calculados com valores observados. A escolha dos componentes do modelo foi determinada pela nossa experincia clnica e pela informao fisiopatolgica e clnica publicada. Houve a preocupao de construir o modelo de forma modular de modo a ser possvel a sua expanso sem grandes transformaes na descrio matemtica (e informtica) j existente. Na sua fase actual o modelo no pode ser usado como instrumento de diagnstico. antes uma ferramenta destinada a esclarecer em princpio mecanismos fisiopatolgicos. Usou se o modelo para simular um certo nmero de observaes publicadas e para exemplificar a sua eventual aplicao clnica na simulao de situaes hipotticas e na anlise de possveis mecanismos fisiopatolgicos responsveis por situaes de hipo ou hipercalcmias. Simultaneamente fez se uma anlise dos dados acumulados relativos a doentes vistos no Servio de Endocrinologia do Instituto Portugus de Oncologia de Francisco Gentil Centro Regional Oncolgico de Lisboa, S.A. CONCLUSES Numa populao de 894 doentes com patologias variadas do Instituto Portugus de Oncologia de Lisboa os valores da calcmia tiveram uma distribuio normal unimodal com uma mdia de 9.56 mg/dl, e um erro padro de 0.41 mg/dl. Estas observaes sugerem que a calcmia est sujeita a regulao. A partir dos resultados publicados em que o metabolismo do clcio foi perturbado por infuses de clcio, calcitriol ou PTH, de estudos bioqumicos e fisiolgicos sobre os mecanismos de aco de factores controladores da calcmia e do estudo do comportamento de rgos alvo (paratiroideias, intestino, osso e rim) foi possvel construir um modelo matemtico de parmetros concentrados do sistema de regulao da calcmia. As expresses analticas usadas foram baseadas na cintica enzimtica de modo a que os seus parmetros tivessem um significado fsico ou fisiolgico simples. O modelo revelou aprecivel robustez e flexibilidade. estvel quando no perturbado e transita entre estados estacionrios quando perturbado. Na sua forma actual gera simulaes que reproduzem satisfatoriamente um nmero aprecivel de dados experimentais colhidos em doentes. Isto no significa que possa ser usado como instrumento de diagnstico aplicvel a doentes individuais. O desenho do modelo comporta a adio posterior de novas relaes quando surgirem situaes para as quais se revele insuficiente. A utilizao exaustiva do modelo permitiu explicitar aspectos do metabolismo do clcio que ou no esto contidas na sua formulao actual o aparecimento de hipertrofia ou de adenomas das paratiroideias e as alteraes na estrutura ssea , a participao de outros factores controladores magnsio, ou esto insuficientemente descritas alteraes do metabolismo do fsforo nos hipoparatiroidismos. A anlise dos dados relativos aos doentes do Servio de Endocrinologia do IPO permitiu o incio da caracterizao dos tipos de patologia que representam e de possveis mecanismos fisiopatolgicos subjacentes. Estas observaes so o ponto de partida para anlises futuras. So exemplos das relaes encontradas: a distribuio dos doentes por dois grandes grupos conforme a calcmia determinada pelas concentraes circulantes de PTH ou estas so determinadas pela calcmia; a distribuio sazonal das concentraes de Vit. D25. no sangue; a correlao negativa entre estas e as concentraes de PTH no sangue. Tambm foi possvel extrair a cintica do controlo da PTH sobre a sntese de calcitriol. O estudo dos nveis circulantes de PTH no ps-operatrio imediato de doentes paratiroidectomizados permitiu determinar as suas taxas de degradao metablica. O modelo permitiu simular as relaes Ca/PTH no sangue, Ca/Fraco excretada da carga tubular, Ca/P no sangue para valores normais ou altos de Ca. Foram feitas simulaes de situaes fisiopatolgicas (em doentes virtuais): infuses crnicas de clcio, PTH e calcitriol; alteraes no comportamento de receptores. Estas simulaes correspondem a experincias que no podem ser realizadas em humanos. So exemplos da utilizao do modelo na explorao de possveis mecanismos fisiopatolgicos atravs da observao de resultados quantitativos inacessveis intuio. O modelo foi til em duas fases do trabalho: Primeiro, durante a sua sntese implicou uma escolha criticamente selectiva de informao, sua anlise quantitativa e processamento, uma explicitao rigorosa (analtica) das relaes funcionais entre os controladores e as variveis e da sua integrao numa estrutura global; Segundo, a simulao de situaes experimentais ou clnicas (dados do Servio de Endocrinologia do IPO) em doentes obrigou a explicitar raciocnios fisiopatolgicos habitualmente formulados em bases puramente intuitivas. Esta prtica revelou comportamentos bvios aps as simulaes aco reduzida das infuses PTH (simulao de hiperparatiroidismos primrios) enquanto no h inibio total da respectiva secreo, necessidade de aumento da massa secretora da paratiroideia nas insuficincias renais avanadas, etc. A sntese e utilizao do modelo no implicaram uma preparao matemtica avanada e foram possveis merc da disponibilidade de software interactivo especificamente desenhado para a simulao de sistemas dinmicos em que os programas se escrevem em ingls usando a simbologia simples da lgebra elementar. A funo nobre de modelos desta natureza semelhante dos modelos usados pelos fsicos desde o sculo XVII: permitir explicaes de carcter geral funcionando como uma ferramenta intelectual para manipulao de conceitos e para a realizao de experincias pensadas (thought experiments) respeitando certos princpios fsicos (princpios de conservao) que estabelecem as fronteiras da realidade. -------ABSTRACT: Calcium blood levels are remarkably constant despite great variations in calcium daily intake, intestinal absorption and renal excretion. The regulation of the calcium concentration in the blood is achieved by a complex system that includes several controller factors (mainly the serum levels of calcium, phosphorus, parathyroid hormone (PTH) and calcitriol but also of steroid hormones, ions such as magnesium and other hormonal factors) and several target organs (parathyroid glands, bone, kidney and intestine). The functional response to the controlling factors obeys a variety of kinetics. The precipitation of calcium salts is a simple phase transition in which organic molecules may provide nucleation centres or inhibit the process. The combination of a controller factor with its receptor located in the cell membrane (for peptides or ions) or in the nucleus (for steroid hormones) is only the first step of a biochemical chain that introduces a huge amplification in the response. To this great variability of response we have to add the times of response that vary from minutes to weeks. It is possible to observe (measure) with great accuracy in biological fluids (blood, urine, faeces, etc.) the most important factors intervening in the calcium regulation (calcium, phosphorus, PTH and calcitriol). The response of the system to acute infusions of the controlling factors has also been studied. Using molecular biology techniques it has been possible to characterize some calcium homeostasis dysfunctions and better physiopathological diagnosis are expected. With the increasingly new knowledge in this area we have better capacity to diagnose but it is harder to explain correctly the underlying metabolic mechanisms. The analysis or synthesis of complex systems is the noble activity of engineers that enables them to draw bridges, dams, boats, airplanes or cars. With the availability of medium-large frame computers it was possible to use mathematical descriptions not only to draw systems but also to explain flaws in its operations. These mathematical descriptions are generally known as models by analogy with the laws (equations) of physics that allow the mathematical description of physical processes. In practice it is not possible to find general solutions for the mathematical descriptions of complex systems but (numeric) computations for specific situations can be obtained with digital computers. The introduction of mathematical models in biology and particularly in medicine is a recent event. METHODS In this thesis a simplified model of calcium homeostasis was built that enables the computation of observable variables (concentrations of calcium, phosphorus, PTH and calcitriol) and allows the comparison between the simulation values and observed values. The choice of the models components was made according to our clinical experience and to the published clinical and physiopathological data. The model has a modular design that allows future expansions with minor alterations in its structure. In its present form the model cannot be used for diagnosis. It is a tool designed to enlighten physiopathological processes. To exemplify its possible clinical application in the simulation of hypothetical situations and in the analysis of possible mechanisms responsible for hypo or hypercalcemias the model was used to simulate a certain number of published observations. An analysis of clinical and laboratory data from the Endocrinology Department of the Portuguese Cancer Institute (I.P.O.F.G.-C.R.O.L.,S.A.) is also presented. CONCLUSIONS In a population of 188 patients without an identifiable disease of the calcium metabolism at the Portuguese Cancer Institute the calcemia levels had a unimodal distribution with an average of 9.56 mg/dL and a S.E.M of 0.41 mg/dL. This observation confirms that serum calcium is regulated. Using published data; in which calcium metabolism was disrupted by calcium, PTH or calcitriol infusions; from biochemical and physiological studies of the action of controller factors on the calcemia; in which the response of target organs (parathyroid glands, intestine, bone, kidney) was studied it was possible to build a mathematical model of concentrated parameters of the calcium homeostasis. Analytical expressions used were based on enzymatic kinetics. The model is flexible and robust. It is stable when not disturbed and changes between steady states when disturbed. In its present form it provides simulations that reproduce closely a number of experimental clinical data. This does not mean that it can be used as a diagnostic tool for individual patients. The exhaustive utilisation of the model revealed the need of future expansions to include aspects of the calcium metabolism not included in its present form hypertrophy or adenomas of the parathyroid glands, bone structure changes, participation of other controller factors such as magnesium or insufficiently described phosphate metabolism in hypoparathyroidism. The analysis of the data collected from the I.P.O.s Endocrinology Department allowed the initial characterization of the different pathologies represented and of their possible physiopathological mechanisms. These observations are a starting point for future analysis. As examples of the relations found were: the distribution of patients in two groups according to the dependency of calcium by PTH levels or PTH levels by calcium concentration; the seasonal distribution of the serum concentrations of D25; its negative correlation with PTH concentration. It was also possible to extract the kinetics of the control of the synthesis of calcitriol by PTH. The analysis of immediate post-surgical levels of PTH in parathyroidectomized patients allowed the determination of its metabolic clearance. The model also allowed the simulation of the relations between Ca/PTH in blood, serum Ca/Fraction of tubular load excreted and Ca/P in blood for normal and high values of calcium. Simulations were made of pathological situations (in virtual patients): chronic infusions of calcium, PTH and calcitriol; changes in the characteristics of receptors. These simulations are not possible in real persons. They are an example of the use of this model in exploring possible mechanisms of disease through the observation of quantitative results not accessible to simple intuition. This model was useful in two phases: Firstly, its construction required a careful choice of data, its quantitative analysis and processing, an analytical description of the relations between controller factors and variables and their integration in a global structure. Secondly, the simulation of experimental or clinical (I.P.O.s Endocrinology Department) data implied testing physiopathological explanations that previously were based on intuition. The construction and utilisation of the model didnt demand an advanced mathematical preparation since user-friendly interactive software was used. This software was specifically designed for the simulation of dynamic systems. The programs are written in English using elementary algebra symbols. The essential function of this type of models is identical to that of those used by physicists since the XVII century which describe quantitatively natural processes and are an intellectual tool for the manipulation of concepts and the performance of thought experiments based in certain physical principles (conservation principles) that are the frontiers of reality.------------------RESUME: Les concentrations circulantes de calcium sont constantes mme pendant des variations de labsorption intestinale et de llimination rnale de cet lment. La rgulation de la calcmie est un systme complexe qui comprend plusieurs lments contrleurs (la calcmie, la phosphormie, les concentrations circulantes de lhormone parathyrodienne (PTH) e du calcitriol et dautres comme les hormones strodes ou des ions comme le magnsium) et plusieurs organes (glandes parathyrodiennes, los, le rein et lintestin). Les rponses de ces organes sont varies. Dans le cas plus simple, la cristallisation des sels de calcium correspond un changement de phase dans lequel y participent des molcules organiques que la dbutent, lacclrent ou linhibent. Gnralement la combinaison dun lment contrleur avec leur rcepteur de membrane (pour les peptides ou les ions) ou intracellulaire (pour les hormones strodes) nest que le premier pas dune chane biochimique quintroduit une grande amplification de la rponse. A cette varit de rponses correspondent des grandes diffrences des temps de rponses quy vont des minuits a semaines. Il est possible observer (mesurer) dans les fluides biologiques (sang, urine, fces, etc.) les lments plus importants du systme de rgulation de la calcmie (calcium, phosphate, PTH et le calcitriol) et les administrer en exprimentes aigus. Cette possibilit est visible dans la littrature publie dans ce domaine qui est en croissance permanente. Lavenir des techniques de biologie molculaire a permis caractriser des nombreuses dysfonctions de la rgulation de la calcmie et on attend un diagnostique physiopathologique de ces dysfonctions chaque fois plus rigoureuses. Les connaissances dans ce domaine sagrandissent et on a de plus de capacits pour faire des diagnostiques et il est chaque fois plus difficile les interprter. Lanalyse ou synthse de systmes complexes est lactivit plus noble des ingnieurs qui les permit dessiner des ponts, bateaux, avions ou automobiles. Avec des ordinateurs de mdium ou grand port il les est possible utiliser descriptions mathmatiques pour dessiner les systmes et interprter des ventuelles fautes dopration. Ces descriptions mathmatiques sont une squence doprations ralises dans un ordinateur selon un programme informatique qui ont reu la dsignation gnrique de modles, pour analogie avec les quations de la physique qui ont t dduits dun nombre de postules et quont permit reprsenter des processus physiques en quations mathmatiques. Les fameuses quations de Newton sont peut-tre les exemples plus connus des systmes physiques. Lintroduction des modles mathmatiques en biologie et en particulier en mdecine est un vnement rcent. Dans ce travaille, on a construit un modle simplifi de lhomostasie du calcium pour calculer les variables observables (concentrations de calcium, phosphate, PTH et calcitriol) pour les comparer. Les choix des components a t dtermins par notre exprience clinique et par linformation physiopathologique et clinique publie. Le modle a t construit de faon modulaire ce que permit leur postrieur expansion sans des grandes altrations dans la description mathmatique et informatique dj existante. Dans cette forme le modle ne peut tre utilis comme un instrument de diagnostique. Il est un outil pour clairer la physiopathologie. Le modle a t utilis pour simuler un certain nombre dobservations publies et pour exemplifier leur possible utilisation clinique dans la simulation des hypothses et de la physiopathologie des situations dhypo ou hypercalcmie. On a fait une analyse des lments des procs cliniques des malades observes dans le Service dEndocrinologie de lIPOFG-CROL, SA. Dans une population de 894 malades avec des diffrentes pathologies les valeurs de calcmie on une distribution uni modale avec une Mdie de 9.56 mg/dL et une erreur standard de 0.41 mg/dL. Ces observations suggrent que la calcmie soit sujette de rgulation. En utilisant des rsultats de travaux publis dans lesquels le mtabolisme du calcium a t chang par des infusions de calcium, calcitriol ou PTH, des tudes biochimiques et physiologiques sur des mécanismes daction des lments contrleurs de la calcmie et de ltude du comportement des organes cible (parathyrodes, intestin, rein, os), il a t possible de construire un modle mathmatique de paramtres concentrs du systme de rgulation de la calcmie. Les expressions analytiques utilises ont t bases sur la cintique enzymatique de faon que les paramtres aient eu une signification physique ou biologique. Le modle est stable quand il nest pas perturb et transit entre tats stationnaires quand il est sujet a des perturbations. A ce moment il fait des simulations qui reproduisent de faon satisfaisant un nombre dobservations exprimentales. La construction du modle permit laddiction de nouvelles relations dans les cas ou il est insuffisant. Lutilisation exhaustive du modle a permit expliciter des aspects du mtabolisme du calcium qui y ne sont pas compris lhyperplasie ou la formation des adnomes des parathyrodes, les altrations de la structure des os, la participation doutres lments rgulateurs (magnsium), ou sont insuffisamment dcrites les altrations du mtabolisme des phosphates dans lhypoparathyroidism. Lanalyse de linformation des malades du Service dEndocrinologie a permit caractriser les pathologies reprsentes et leurs possibles mécanismes physiopathologiques. Ces observations sont le point de dpart pour les analyses futures. Sont des exemples des relations trouves: la distribution des malades par deux groupes: ceux dans lequel la calcmie est dtermine par la PTH ou ceux dans lesquels la PTH est dtermine par la calcmie; la distribution sazonale de la concentration de la vitamine D; la corrlation ngative entre la vitamine D et la PTH. On a eu la possibilit de dduire la cintique de control de la PTH sur la synthse du calcitriol. Ltude des niveaux circulants de PTH sur des sujets parathyroidectomises a permit dduire leur taux de dgradation mtabolique. Le modle a permit simuler les relations Ca/PTH dans le sang, Ca/fraction limine par le rein, Ca/P dans le sang pour des valeurs normales ou hautes de calcium. On a fait des simulations de situations physiopathologiques (dans malades virtuelles): Infusions chroniques de calcium, PTH ou calcitriol; altrations des rcepteurs. Ces simulations ne peuvent pas tre ralises dans les humains. Sont des exemples dutilisation du modle dans lexploration des possibles mécanismes de la physiopathologie en observant des rsultats quantitatifs inaccessibles lintuition. Le modle a t utile pendant deux tapes des travaux: La premire, dans sa construction on a choisi linformation disponible, son analyse quantitative, lexplicitation rigoureuse (analytique) des relations fonctionnelles entre les contrleurs et les variables et sa intgration dans une structure globale. La deuxime, la simulation de situations exprimentales ou cliniques (du Service dEndocrinologie) a oblig dexpliciter des raisonnements physiopathologiques gnralement formuls utilisant lintuition. Cette pratique a montr des comportements action rduite des infusions de PTH (jusqu linhibition totale de leur respective scrtion), ncessit daugmenter la masse scrteuse de la parathyrode dans les insuffisants rnales, etc. La synthse et utilisation du modle nont pas besoin dune formation avance en mathmatique et sont possibles grce un programme interactif qui a t conu pour la simulation des systmes dynamiques dans lesquels le programme se construit en anglais en utilisant la symbolique lmentaire de lalgbre. La fonction noble de ces modles est semblable celles des physiques du XVII sicle: Permettre tablir explications gnrales en fonctionnant comme un outil intellectuel pour manipuler des concepts et pour la ralisation dexprimentes penses en respectant certains principes de la physique (principe de la conservation) qutablissent les frontires de la ralit.
Resumo:
RESUMO - A exposio contnua a substncias qumicas tem consequncias para a sade humana, algumas das quais no esto ainda totalmente estabelecidas. A toxicologia ocupacional uma rea interdisciplinar que envolve conhecimentos de higiene e de medicina ocupacional, de epidemiologia e de toxicologia e que tem por principal objectivo prevenir a ocorrncia de efeitos adversos decorrentes do ambiente ocupacional sendo um dos seus principais papis fornecer o mximo de dados que possam contribuir para o conhecimento dos potenciais efeitos na sade. O chumbo um txico de caractersticas cumulativas que provoca na sade efeitos principalmente sistmicos, ou seja, o efeito txico manifesta-se em locais afastados do contacto inicial que resultam essencialmente de exposies crnicas, resultantes de perodos de exposio mais ou menos longos ao metal (entre meses e anos). Pode interagir com diferentes rgos e tecidos, ligando-se a molculas e constituintes celulares. Uma vez que no possui qualquer funo fisiolgica, a presena do chumbo no organismo humano resulta numa srie de efeitos prejudiciais que afectam diversos rgos e sistemas. A toxicidade do chumbo manifesta-se em diversos rgos e tecidos, nomeadamente no sistema hematopoitico, no sistema nervoso, no rim, no aparelho reprodutor, no sistema cardiovascular, no sistema endcrino e no sistema imunitrio. Da interferncia do chumbo com o funcionamento de alguns sistemas biolgicos resultam um conjunto de alteraes fundamentais ao nvel dos processos de transporte atravs das membranas, da integridade estrutural e funcional das enzimas e de vrias vias metablicas, em especial da fosforilao oxidativa e da sntese do heme sendo os primeiros efeitos bioqumicos do chumbo detectados a partir de valores de plumbmia inferiores a 10 g/dL. As medidas de higiene e segurana actualmente em vigor nos pases desenvolvidos asseguram que os casos de intoxicao grave so cada vez menos frequentes. No entanto, o risco de exposio a nvel ocupacional existe em todas as actividades que envolvem materiais que o contenham como as exploraes mineiras, as fundies primria e secundria, a produo de baterias de chumbo cido, a produo de vidro com pigmentos de chumbo, as soldaduras de reparao automvel e a instruo de tiro. Desde 2006 o chumbo considerado pela International Agency for Research on Cancer (IARC) uma substncia carcinognica do grupo 2A (provvel carcinognio para o ser humano). Considera-se, assim, que o chumbo tem, inequivocamente, capacidade de induzir cancro em animais experimentais mas que, embora haja fortes indcios de que os mecanismos que medeiam a carcinognese desses compostos ocorrem no ser humano, os dados disponveis ainda no podem assegurar essa relao. Com este estudo pretendeu-se contribuir para o conhecimento da toxicidade do chumbo atravs do estudo da exposio ao chumbo e da influncia da susceptibilidade individual (em industrias sem co-exposio significativa a outros agentes conhecidos ou suspeitos de serem carcinognicos). Pretendeu-se estudar o caso atravs de uma abordagem mltipla que permitisse relacionar diferentes tipos de marcadores biolgicos uma vez que a monitorizao biolgica integra todas as possveis vias de entrada no organismo (para alm da via respiratria), eventuais exposies fora do contexto estritamente profissional assim como uma srie de factores intrnsecos individuais (relacionados com modos de via, de natureza fisiolgica e comportamentais). Sendo a co-exposio a outros compostos com propriedades genotxicas e carcinognicas uma questo difcil de tornear quando se quer avaliar o potencial genotxico do chumbo em populaes expostas, ocupacional ou ambientalmente este estudo tem a vantagem de ter sido efectuado em populaes sem co-exposio conhecida a outras substncias deste tipo, permitindo concluir sobre os efeitos resultantes apenas da exposio a chumbo na populao humana, contribuindo para explicar algumas das aparentes inconsistncias e contradies entre diferentes estudos sobre este tema. Os indicadores de exposio usados foram: indicadores de dose interna (doseamento de chumbo e de PPZ no sangue), indicadores de efeitos adversos no heme e genotxicos (actividade da ALAD, teste do cometa e mutao em TCR) e indicadores de susceptibilidade (polimorfismos genticos de ALAD e VDR) atravs de uma abordagem estatstica de comparao directa de sub-grupos previamente definidos na populao e da aplicao de um modelo de regresso mltipla. Este estudo revelou que os nveis de plumbmia na populao portuguesa baixaram significativamente nos ltimos 10 anos, tanto na populao ocupacionalmente exposta como na populao em geral e que a presena do gentipo B-B (do gene VDR) preditiva das variaes de plumbmia, quando comparada com o gentipo mais frequente na populao, B-b; ao contrrio, o gentipo b-b no aparenta ter influncia em nenhum dos marcadores estudados. No que diz respeito a efeitos genotxicos concluiu-se que estes no se manifestaram na populao estudada, levando a concluir que nos nveis de exposio estudados, o chumbo no tem capacidade de induzir este tipo de efeitos per si levando ao reforo da hiptese, j levantada por outros autores, de que o mecanismo de genotoxicidade do chumbo seja essencialmente de promoo de processos de genotoxicidade desencadeados por outros agentes. A realizao de estudos de efeitos genotxicos e de stress oxidativo desenhados de forma a comparar grupos de trabalhadores expostos apenas a chumbo com grupos de trabalhadores com o mesmo nvel de exposio a chumbo, mas com co-exposio a outros agentes reconhecidamente carcinognicos poder ajudar a aumentar o conhecimento deste efeito do chumbo na sade humana.
Resumo:
Tese de Doutoramento em Cincias - Especialidade em Fsica
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Dans l'intoxication exprimentale du pigeon avec les venins de Crotalus terrificus, de Lachesis jararaca et de Naya tripudians, nous avons tudi l'action de 12 mdicaments, possdant des affinits neurotropes plus ou moins accuses, arrivant aux conclusions suivantes: 1 - Quelques-uns des ces mdicaments exercent une action protectrice spciale contre ces venins, permettant, injects une heure avant le vnin, d'eviter tout symptme d'intoxication chez le pigeon. Certains n'agissent qu'injects em mme temps que le vnin. D'autres sont compltement inactifs. Aucun d'ntre eux ne possde de proprits curatives. 2 - En plus de ce pouvoir protecteur, ou phylactique, un certain nombre d'entre eux possde sur les venins, une action neutralisante "in vitro", s'accentuant aprs une heure de contact. 3 - Les conditions dans lesquelles s'exercent ces deux actions, protectrice et neutralisante, sont trs variables suivant les venins et les mdicaments. Sur leur mécanisme trs complexe, on ne peut actuellement formuler que des hypothses. 4 - Au point de vue pratique, certains de ces mdicaments, surtout la spartine et l'adrnaline, peuvent tre utiliss avec avantage comme complment du traitement srotrapique spcifique dans les accidents dtermins par les animaux venimeux.
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Rsum : Les progrs techniques de la spectromtrie de masse (MS) ont contribu au rcent dveloppement de la protomique. Cette technique peut actuellement dtecter, identifier et quantifier des milliers de protines. Toutefois, elle n'est pas encore assez puissante pour fournir une analyse complte des modifications du protome corrles des phnomnes biologiques. Notre objectif tait le dveloppement d'une nouvelle stratgie pour la dtection spcifique et la quantification des variations du protome, base sur la mesure de la synthse des protines plutt que sur celle de la quantit de protines totale. Pour cela, nous volions associer le marquage puls des protines par des isotopes stables avec une mthode d'acquisition MS base sur le balayage des ions prcurseurs (precursor ion scan, ou PIS), afin de dtecter spcifiquement les protines ayant intgr les isotopes et d'estimer leur abondance par rapport aux protines non marques. Une telle approche peut identifier les protines avec les plus hauts taux de synthse dans une priode de temps donne, y compris les protines dont l'expression augmente spcifiquement suite un vnement prcis. Nous avons tout d'abord test diffrents acides amins marqus en combinaison avec des mthodes PIS spcifiques. Ces essais ont permis la dtection spcifique des protines marques. Cependant, en raison des limitations instrumentales du spectromtre de masse utilis pour les mthodes PIS, la sensibilit de cette approche s'est rvle tre infrieure une analyse non cible ralise sur un instrument plus rcent (Chapitre 2.1). Toutefois, pour l'analyse diffrentielle de deux milieux de culture conditionns par des cellules cancreuses humaines, nous avons utilis le marquage mtabolique pour distinguer les protines d'origine cellulaire des protines non marques du srum prsentes dans les milieux de culture (Chapitre 2.2). Paralllement, nous avons dvelopp une nouvelle mthode de quantification nomme IBIS, qui utilise des paires d'isotopes stables d'acides amins capables de produire des ions spcifiques qui peuvent tre utiliss pour la quantification relative. La mthode IBIS a t applique l'analyse de deux lignes cellulaires cancreuses compltement marques, mais de manire diffrencie, par des paires d'acides amins (Chapitre 2.3). Ensuite, conformment l'objectif initial de cette thse, nous avons utilis une variante pulse de l'IBIS pour dtecter des modifications du protome dans des cellules HeLa infecte par le virus humain Herpes Simplex-1 (Chapitre 2.4). Ce virus rprime la synthse des protines des cellules htes afin d'exploiter leur mécanisme de traduction pour la production massive de virions. Comme prvu, de hauts taux de synthse ont t mesurs pour les protines virales dtectes, attestant de leur haut niveau d'expression. Nous avons de plus identifi un certain nombre de protines humaines dont le rapport de synthse et de dgradation (S/D) a t modifi par l'infection virale, ce qui peut donner des indications sur les stratgies utilises par les virus pour dtourner la machinerie cellulaire. En conclusion, nous avons montr dans ce travail que le marquage mtabolique peut tre employ de faon non conventionnelle pour tudier des dimensions peu explores en protomique. Summary : In recent years major technical advancements greatly supported the development of mass spectrometry (MS)-based proteomics. Currently, this technique can efficiently detect, identify and quantify thousands of proteins. However, it is not yet sufficiently powerful to provide a comprehensive analysis of the proteome changes correlated with biological phenomena. The aim of our project was the development of ~a new strategy for the specific detection and quantification of proteom variations based on measurements of protein synthesis rather than total protein amounts. The rationale for this approach was that changes in protein synthesis more closely reflect dynamic cellular responses than changes in total protein concentrations. Our starting idea was to couple "pulsed" stable-isotope labeling of proteins with a specific MS acquisition method based on precursor ion scan (PIS), to specifically detect proteins that incorporated the label and to simultaneously estimate their abundance, relative to the unlabeled protein isoform. Such approach could highlight proteins with the highest synthesis rate in a given time frame, including proteins specifically up-regulated by a given biological stimulus. As a first step, we tested different isotope-labeled amino acids in combination with dedicated PIS methods and showed that this leads to specific detection of labeled proteins. Sensitivity, however, turned out to be lower than an untargeted analysis run on a more recent instrument, due to MS hardware limitations (Chapter 2.1). We next used metabolic labeling to distinguish the proteins of cellular origin from a high background of unlabeled (serum) proteins, for the differential analysis of two serum-containing culture media conditioned by labeled human cancer cells (Chapter 2.2). As a parallel project we developed a new quantification method (named ISIS), which uses pairs of stable-isotope labeled amino acids able to produce specific reporter ions, which can be used for relative quantification. The ISIS method was applied to the analysis of two fully, yet differentially labeled cancer cell lines, as described in Chapter 2.3. Next, in line with the original purpose of this thesis, we used a "pulsed" variant of ISIS to detect proteome changes in HeLa cells after the infection with human Herpes Simplex Virus-1 (Chapter 2.4). This virus is known to repress the synthesis of host cell proteins to exploit the translation machinery for the massive production of virions. As expected, high synthesis rates were measured for the detected viral proteins, confirming their up-regulation. Moreover, we identified a number of human proteins whose synthesis/degradation ratio (S/D) was affected by the viral infection and which could provide clues on the strategies used by the virus to hijack the cellular machinery. Overall, in this work, we showed that metabolic labeling can be employed in alternative ways to investigate poorly explored dimensions in proteomics.
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RESUME : L'athrosclrose, pathologie inflammatoire artrielle chronique, est l'origine de la plupart des maladies cardiovasculaires qui constituent l'une des premires causes de morbidit et mortalit en France. Les tudes observationnelles et exprimentales montrent que l'exercice physique prvient la mortalit cardiovasculaire. Cependant, les mécanismes prcisant les bnfices cliniques de l'exercice sur l'athrosclrose sont encore largement inconnus. Le but gnral de ce travail a donc t d'explorer, en utilisant un modle exprimental d'athrosclrose, la souris hypercholestrolmique gntiquement dpourvue en apolipoprotine E (apoE-/-), les mécanismes athroprotecteurs de l'exercice. La dysfonction endothliale, gnralement associe aux facteurs de risque cardiovasculaire, serait l'une des tapes prcoces majeures de l'athrogense. Elle est caractrise par une diminution de la biodisponibilit en monoxyde d'azote (NO) avec la perte de ses proprits vasculo-protectrices, ce qui favorise un climat pro-athrogne (stress oxydatif, adhsion et infiltration des cellules inflammatoires dans la paroi artrielle...) conduisant la formation de la plaque athromateuse. L'objectif de notre premier travail a donc t d'explorer les effets de l'exercice d'une part, sur le dveloppement des plaques athromateuses et d'autre part, sur la fonction endothliale de la souris apoE-/-. Nos rsultats montrent que l'exercice rduit significativement l'extension de l'athrosclrose et prvient la dysfonction endothliale. L'explication pharmacologique montre que l'exercice stimule la fonction endothliale via, notamment, une plus grande sensibilit des rcepteurs endothliaux muscariniques, ce qui active les vnements signaltiques cellulaires rcepteurs-dpendants l'origine d'une bioactivit accrue de NO. Les complications cliniques graves de l'athrosclrose sont induites par la rupture de la plaque instable provoquant la formation d'un thrombus occlusif et l'ischmie du territoire tissulaire en aval. L'objectif de notre deuxime travail a t d'examiner l'effet de l'exercice sur la qualit/stabilit de la plaque. Nos rsultats indiquent que l'exercice de longue dure stabilise la plaque en augmentant le nombre de cellules musculaires lisses et en diminuant le nombre de macrophages intra-plaques. Nos rsultats montrent aussi que la phosphorylation de la eNOS (NO Synthase endothliale) Akt-dpendante n'est pas le mécanisme molculaire majeur l'origine de ce bnfice. Enfin, dans notre troisime travail, nous avons investigu l'effet de l'exercice sur le dveloppement de la plaque vulnrable. Nos rsultats montrent, chez un modle murin de plaque instable (modle d'hypertension rnovasculaire rnine et angiotensine II levs) que l'exercice prvient l'apparition de la plaque vulnrable indpendamment d'un effet hmodynamique. Ce bnfice serait associ une diminution de l'expression vasculaire des rcepteurs AT1 de l'Angiotensine II. Nos rsultats justifient l'importance de l'exercice comme outil prventif des maladies cardiovasculaires. ABSTRACT : Atherosclerosis, a chronic inflammatory disease, is one of the main causes of morbidity and mortality in France. Observational and experimental data indicate that regular physical exercise has a positive impact on cardiovascular mortality. However, the mechanisms by which exercise exerts clinical benefits on atherosclerosis are still unknown. The general aim of this work was to elucidate the anti-atherosclerotic effects of exercise, using a mouse model of atherosclerosis: the apolipoprotein E-deficient mice (apoE-/- mice). Endothelial dysfunction, generally associated with cardiovascular risk factors, has been recognized to be a major and early step in atherogenesis. Endothelial dysfunction is characterized by Nitric Oxide (NO) biodisponibility reduction with loss of NO-mediated vasculoprotective actions. This leads to vascular effects such as increased oxidative stress and increased adhesion of inflammatory cells into arterial wall thus playing a role in atherosclerotic plaque development. Therefore, one of the objective of our study was to explore the effects of exercise on atherosclerotic plaque extension and on endothelial function in apoE-/- mice. Results show that exercise significantly reduces plaque progression and prevents endothelial dysfunction. Pharmacological explanation indicates that exercise stimulates endothelial function by increasing muscarinic receptors sensitivity which in turn activates intracellular signalling receptor-dependent events leading to increased NO bioactivity. The clinical manifestations of atherosclerosis are the consequences of unstable plaque rupture with thrombus formation leading to tissue ischemia. The second aim of our work was to determine the effect of exercise on plaque stability. We demonstrate that long-term exercise stabilizes atherosclerotic plaques as shown by decreased macrophage and increased Smooth Muscle Cells plaque content. Our results also suggest that the Akt-dependent eNOS phosphorylation pathway is not the primary molecular mechanism mediating these beneficial effects. Finally, we assessed a putative beneficial effect of exercise on vulnerable plaque development. In a mouse model of Angiotensine II (Ang II)-mediated vulnerable atherosclerotic plaques, we provide fist evidence that exercise prevents atherosclerosis progression and plaque vulnerability. The beneficial effect of swimming was associated with decreased aortic Ang II AT1 receptor expression independently from any hemodynamic change. These findings suggest clinical benefit of exercise in terms of cardiovascular event protection.
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Summary : The hypothalamus represents less than 1 % of the total volume of the brain tissue, yet it plays a crucial role in endocrine regulations. Puberty is defined as a process leading to physical, sexual and psychosocial maturation. The hypothalamus is central to this process, via the activation of GnRH neurons. Pulsatile GnRH secretion, minimal during childhood, increases with the onset of puberty. The primary function of GnRH is to regulate the growth, development and function of testes in boys and ovaries in girls, by stimulating the pituitary gland secretion of luteinizing hormone (LH) and follicle-stimulating hormone (FSH). Several factors contribute to the timing of puberty, including sex and ethnicity, genetics, dietary intake and energy expenditure. Kisspeptins constitute a family of small peptides arising from the proteolytic cleavage of metastin, a peptide with 54 amino acids initially purified from human placenta. These kisspeptins were the subject of much attention following their discovery because of their antimetastatic properties, but it was more recently that their determining role in the reproductive function was demonstrated. It was shown that kisspeptins are ligands of a receptor, GPR54, whose natural inactivating mutation in humans, or knockout in the mouse, lead to infertility. GnRH neurons play a pivotal role in the central regulation of fertility. Kisspeptin greatly increases GnRH release and GnRH neuron firing activity, but the neurobiological mechanisms for these actions are unknown. Gprotein-coupled receptor 54, the receptor for kisspeptin, is expressed by GnRH neurons as well as other hypothalamic neurons, suggesting that both direct and indirect effects are possible. In the first part of my thesis, we investigated a possible connection between the acceleration of sexual development induced by leptin and hypothalamic metastin neurons. However, the data generated by our preliminary experiments confirmed that the commercially available antibodies are non-specific. This finding constituted a major drawback for our studies, which relied heavily upon the neuroanatomical study of the hypothalamic metastinergic pathways to elucidate their sensitivity to exogenous leptin. Therefore, we decided to postpone any further in vivo experiment until a better antibody becomes available, and focused on in vitro studies to better understand the mechanisms of action of kisspeptins in the modulation of the activity of GnRH neurons. We used two GnRH-expressing neuronal cell lines to investigate the cellular and molecular mechanisms of action of metastin in GnRH neurons. We demonstrated that kisspeptin induces an early activation of the MAP kinase intracellular signaling pathway in both cell lines, whereas the SAP/JNK or the Akt pathways were unaffected. Moreover, we found an increase in GnRH mRNA levels after 6h of metastin stimulation. Thus, we can conclude that kisspeptin regulates GnRH neurons both at the secretion and the gene expression levels. The MAPK pathway is the major pathway activated by metastin in GnRH expressing neurons. Taken together, these data provide the first mechanism of action of kisspeptin on GnRH neurons. Rsum : L'hypothalamus est une zone situe au centre du cerveau, dont il reprsente moins de 1 du volume total. La pubert est la priode de transition entre l'enfance et l'age adulte, qui s'accompagne de transformations somatiques, psychologiques, mtaboliques et hormonales conduisant la possibilit de procrer. La fonction principale de la GnRH est la rgulation de la croissance, du dveloppement et de la fonction des testicules chez les hommes, et des ovaires chez les femmes en stimulant la scrtion de l'hormone lutinisante (LH) et de l'hormone folliculostimulante (FSH) par la glande hypophysaire. Plusieurs facteurs contribuent au dclanchement de la pubert, y compris le sexe et l'appartenance ethnique, la gntique, l'apport alimentaire et la dpense nergtique. Les Kisspeptines constituent une famille de peptides rsultant de la dissociation proteolytique de la mtastine, un peptide de 54 acides amins initialement purifi partir de placenta humain. Ces kisspeptines ont fait l'objet de beaucoup d'attention la suite de leur dcouverte en raison de leurs proprits anti-metastatiques, et c'est plus rcemment que leur rle dterminant dans la fonction reproductive a t dmontr. Les kisspeptines sont des ligands du rcepteur GPR54, dont la mutation inactivatrice chez l'homme, ou le knockout chez la souris, conduisent l'infertilit par hypogonadisme hypogonadotrope. Les neurones GnRH jouent un rle central dans le rglement des fonctions reproductrices et la kisspeptine stimule l'activit des neurones GnRH et la libration de GnRH par ces neurones. Toutefois, les mécanismes neurobiologiques de ces actions ne sont pas connus. Dans la premire partie de ma thse, nous avons tudi le lien potentiel entre l'acclration du dveloppement sexuel induite par la leptine et les neurones hypothalamiques metastine. Les donnes gnres dans cette premire srie d'expriences ont malheureusement confirm que les anticorps anti-metastine disponibles dans le commerce sont aspcifiques. Ceci a constitu un inconvnient majeur pour nos tudes, qui devaient fortement s'appuyer sur l' tude neuroanatomique des neurones hypothalamiques metastine pour valuer leur sensibilit la leptine exogne. Nous avons donc dcid de focaliser nos travaux sur une tude in vitro des mécanismes d'action de la kisspeptine pour moduler l'activit des neurones GnRH. Nous avons utilis deux lignes de cellules neuronales exprimant la GnRH pour tudier les mécanismes d'action cellulaires et molculaires de la metastine dans des neurones. Nous avons ainsi pu dmontrer que la kisspeptine induit une activation prcoce de la voie f de signalisation de la MAP kinase dans les deux lignes cellulaires, alors que nous n'avons observ aucune activation de la voie de signalisation de la P13 Kinase et de la SAP/JNK. Nous avons en outre dmontr une augmentation de l'expression de la GnRH par la stimulation avec la Kisspeptine. L'ensemble de ces donnes contribue lucider le mécanisme d'action avec lequel la kisspeptine agit dans les neurones GnRH, en dmontrant un effet sur l'expression gnique de la GnRH. Nous pouvons galement conclure que la voie de la MAPK est la voie principale active par la metastine dans les neurones exprimant la GnRH.
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Summary The best described physiological function of low-density lipoproteins (LDL) is to transport cholesterol to target tissues. LDL deliver their cholesterol cargo to cells following their interaction with the LDL receptor. LDL, when their vascular concentrations increase, have also been implicated in pathologies such as atherosclerosis. Among the cell types that are found in blood vessels, endothelial and smooth muscle cells have dominated cellular research on atherosclerotic mechanisms and LDL activation of signaling pathways, while very little is known about adventitial fibroblast activation caused by elevated lipoprotein levels. Since fibroblasts participate in wound repair and since it has recently been recognized that fibroblasts may play pivotal roles in vascular remodeling and repair of injury, we assessed whether lipoproteins affect fibroblast function. We have found that LDL specifically mediate the activation of a class of mitogen-activated protein kinases (MAPKs): the p38 MAPKs. The activation of this pathway in turn modulates cell shape by promoting lamellipodia formation and extensive cell spreading. This is of particular interest because it provides a mechanism by which LDL can promote wound healing or vessel wall remodeling as observed during the development of atherosclerosis. In order to understand the molecular mechanisms by which LDL induce p38 activation we searched for the component in the LDL particle responsible for the induction of this pathway. We found that cholesterol is the major component of lipoprotein particles that mediates their ability to stimulate the p38 MAPK pathway. Furthermore, we investigated the cellular mechanisms underlying the ability of LDL to induce cell shape changes and whether this could participate in wound repair. Our recent data demonstrates that the capacity of LDL to induce fibroblast spreading relies on their ability to stimulate IL-8 secretion, which in turn leads to accelerated wound healing. LDL-induced IL-8 production and subsequent wound closure are impaired upon inhibition of the p38 MAPK pathway indicating that the LDL-induced spreading and accelerated wound sealing rely on the ability of LDL to stimulate IL-8 secretion in a p38 MAPK-dependent manner. Therefore, regulation of fibroblast shape and migration by lipoproteins may be relevant to atherosclerosis that is characterized by increased LDL-cholesterol levels, IL-8 production and extensive remodeling of the vessel wall. Rsum: La fonction physiologique des lipoprotines faible densit (LDL) la mieux dcrite est celle du transport du cholestrol aux tissus cibles. Les LDL livrent leur cargaison de cholestrol aux cellules aprs leur interaction avec le rcepteur au LDL. Une concentration vasculaire des LDL augment est galement implique dans le dveloppement de l'athrosclrose. Parmi les types de cellule prsents dans les vaisseaux sanguins, les cellules endothliales et les cellules du muscle lisse ont domin la recherche cellulaire sur les mécanismes athrosclrotiques et sur l'activation par les LDL des voies de signalisation intracellulaire. A l'inverse peu de choses sont connues sur l'activation des fibroblastes de l'adventice par les lipoprotines. Puisqu'il a t rcemment reconnu que les fibroblastes peuvent jouer un rle central dans la remodlisation vasculaire et la rparation tissulaire, nous avons tudi si les lipoprotines affectent la fonction des fibroblastes. Nous avons constat que les LDL activent spcifiquement une classe de protines kinases: les p38 MAPK (mitogen-activated protein kinases). L'activation de cette voie module son tour la forme de la cellule en favorisant la formation de lamellipodes et l'agrandissement des cellules. Cela a un intrt particulier car il fournit un mécanisme par lequel les LDL peuvent promouvoir la cicatrisation ou la remodlisation des parois vasculaires comme observs lors du dveloppement de l'athrosclrose. Pour comprendre les mécanismes molculaires par lesquels les LDL provoquent l'activation des p38 MAPK, nous avons cherch identifier les composants dans la particule de LDL responsables de l'induction de cette voie. Nous avons constat que le cholestrol est l'lment principal des particules de lipoprotine qui contrle leur capacit stimuler la voie des p38 MAPK. En outre, nous avons examin les mécanismes cellulaires responsables de la capacit des LDL induire des changements dans la forme des cellules. Nos donnes rcentes dmontrent que la capacit des LDL induire l'agrandissement des cellules, ainsi que leur aptitude favoriser la cicatrisation, reposant sur leur capacit stimuler la scrtiond'IL-8. La production d'IL-8 induite par les LDL est bloque par l'inhibition de la voie p38 MAPK, ce qui indique que l'talement des cellules induit par les LDL ainsi que l'acclration de la cicatrisation sont lis la capacit des LDL stimuler la scrtion d'IL8 via l'activation des p38 MAPK. La rgulation de la forme et de la migration des fibroblastes par les lipoprotines peuvent donc participer au dveloppement de l'athrosclrose qui est caractrise par l'augmentation des niveaux de production de LDL-cholestrol et d'IL-8 ainsi que par une remodlisation augmente de la paroi du vaisseau.
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L'ubiquitination est une modification des protines conserve, consistant en l'addition de rsidus ubiquitine et rgulant le destin cellulaire des protines. La protine TRAF-interacting protein TRAIP (ou TRIP) est une ligase E3 qui catalyse l'tape finale de l'ubiquitination. TRAIP est conserv dans l'volution et est ncessaire au dveloppement des organismes puisque l'ablation de TRAIP conduit la mort embryonnaire aussi bien de la drosophile que de la souris. De plus, la rduction de l'expression de TRAIP dans des kratinocytes pidermiques humains rprime la prolifration cellulaire et induit un arrt du cycle cellulaire en phase Gl, soulignant le lien troit entre TRAIP et la prolifration cellulaire. Comme les mécanismes de rgulation de la prolifration jouent un rle majeur dans l'homostasie de la peau, il est important de caractriser la fonction de TRAIP dans ces mécanismes. En utilisant des approches in vitro, nous avons dtermin que la protine TRAIP est instable, modifie par l'addition d'ubiquitine et ayant une demi-vie d'environ 4 heures. Nos analyses ont galement rvl que l'expression de TRAIP est dpendante du cycle cellulaire, atteignant un pic d'expression en phase G2/M et que l'induction de son expression s'effectue principalement au cours de la transition Gl/S. Nous avons identifi le facteur de transcription E2F1 comme en tant le responsable, en rgulant directement le promoteur de TRAIP. Aussi, TRAIP endogne ou surexprime est surtout localise au niveau du nuclole, une organelle nuclaire qui est dsassemble pendant la division cellulaire. Pour examiner la localisation subcellulaire de TRAIP pendant la mitose, nous avons imag la protine TRAIP fusionne une protine fluorescente, l'intrieur de cellules vivantes nommes HeLa, l'aide d'un microscope confocal. Dans ces conditions, TRAIP est majoritairement localise autour des chromosomes en dbut de mitose, puis est arrange au niveau de l'ADN chromosomique en fin de mitose. La dtection de TRAIP endogne l'aide d'un anticorps spcifique a confirm cette localisation. Enfin, l'inactivation de TRAIP dans les cellules HeLa par interfrence ARN a inhib leur capacit s'arrter en milieu de mitose. Nos rsultats suggrent que le mécanisme sous-jacent peut tre li au point de contrle de l'assemblage du fuseau mitotique. - Ubiquitination of proteins is a post-translational modification which decides the cellular fate of the protein. The TRAF-interacting protein (TRAIP, TRIP) functions as an E3 ubiquitin ligase mediating addition of ubiquitin moieties to proteins. TRAIP interacts with the deubiquitinase CYLD, a tumor suppressor whose functional inactivation leads to skin appendage tumors. TRAIP is required for early embryonic development since removal of TRAIP either in Drosophila or mice by mutations or knockout is lethal due to aberrant regulation of cell proliferation and apoptosis. Furthermore, shRNA- mediated knock-down of TRAIP in human epidermal keratinocytes (HEK) repressed cell proliferation and induced a Gl/S phase block in the cell cycle. Additionally, TRAIP expression is strongly down- regulated during keratinocyte differentiation supporting the notion of a tight link between TRAIP and cell proliferation. We thus examined the biological functions of TRAIP in epithelial cell proliferation. Using an in vitro approach, we could determine that the TRAIP protein is unstable, modified by addition of ubiquitin moieties after translation and exhibits a half-life of 3.7+/-1-6 hours. Our analysis revealed that the TRAIP expression is modulated in a cell-cycle dependent manner, reaching a maximum expression level in G2/M phases. In addition, the expression of TRAIP was particularly activated during Gl/S phase transition and we could identify the transcription factor E2F1 as an activator of the TRAIP gene promoter. Both endogenous and over-expressed TRAIP mainly localized to the nucleolus, a nuclear organelle which is disassembled during cell division. To examine the subcellular localization of TRAIP during M phase, we performed confocal live-cell imaging of a functional fluorescent protein TRAIP-GFP in HeLa cells. TRAIP was distributed in the cytoplasm and accumulated around mitotic chromosomes in pro- and meta-phasic cells. TRAIP was then confined to chromosomal DNA location in anaphase and later phases of mitosis. Immune-detection of endogenous TRAIP protein confirmed its particular localization in mitosis. Finally, inactivating TRAIP expression in HeLa cells using RNA interference abrogated the cells ability to stop or delay mitosis progression. Our results suggested that TRAIP may involve the spindle assembly checkpoint.
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L'insuline est une hormone qui diminue la concentration de sucre dans le sang et qui est produite par la cellule β du pancras. Un dfaut de production de cette hormone est une des causes principales du diabte. Cette perte de production d'insuline est la consquence la fois, de la rduction du nombre de cellules β et du mauvais fonctionnement des cellules β restantes. L'inflammation, en activant la voie de signalisation c-Jun N-terminal Kinase (JNK) contribue au dclin de ces cellules. Cette voie de signalisation est active par des protines telles que des kinases qui reoivent le signal de stress. Dans ce travail de thse nous nous sommes intresss tudier le rle de Dual leucine zipper bearing kinase (DLK) comme protine capable de relayer le stress inflammatoire vers l'activation de la voie JNK dans les cellules β-pancratiques. Nous montrons que DLK est prsente dans les cellules β-pancratiques et qu'elle agit effectivement comme un activateur de la voie de signalisation de JNK. En outre, DLK joue un rle cl dans le contrle de l'expression de l'insuline, de la scrtion de l'insuline en rponse au glucose et au maintien de la survie des cellules β. Si l'expression de cette protine diminue, la cellule produit moins d'insuline et sera plus sensible la mort en rponse au stress inflammatoire. A l'inverse si l'expression de DLK est augmente, la cellule β produit et secrte plus d'insuline. Des variations de l'expression de DLK sont par ailleurs, associes l'tat de sant de la cellule β. Chez la ratte en gestation ou la souris obse, dans lesquelles la cellule β produit plus d'insuline, l'expression de DLK est augmente. En revanche dans les cellules β des patients diabtiques, l'expression de DLK est diminue par rapport aux cellules non malades. En rsum, DLK est ncessaire pour le bon fonctionnement de la cellule β-pancratique et son expression corrle avec le degr de sant des cellules, faisant que cette protine pourrait tre une cible thrapeutique potentiel. Les cellules β-pancratiques ont la capacit de rguler la scrtion d'insuline en s'adaptant prcisment au stimulus et la glycmie. La fonction de la cellule β est cruciale dans l'homostasie du glucose puisque sa dysfonction et sa mort mnent au dveloppement des diabtes de type 1 et 2. De nombreuses tudes suggrent que l'inflammation pourrait avoir un rle dans la dysfonction et la destruction de ces cellules dans le diabte de type 2. L'excs chronique de cytokines proinflammatoires acclre le dysfonctionnement de la cellule β pancratique par un mécanisme qui implique la voie de signalisation c-Jun N-terminal Kinase (JNK). L'activation de cette voie est organise par des protines d'chafaudages. Elle se fait par trois tapes successives de phosphorylation impliquant une Mitogen Activated Protein Kinase Kinase Kinase (MAP3K), une MAP2K et JNK. Dans ce travail de thse nous montrons l'expression abondante et spcifique de la MAP3K Dual Leucine Zipper Bearing Kinase (DLK) dans les cellules β pancratiques. Cela est la consquence de l'absence du rpresseur transcriptionnel Repressor Element 1 Silencing Transcription. Nous montrons galement que DLK rgule l'activation de JNK et qu'il s'avre ncessaire pour la fonction et la survie de la cellule β pancratique par un mécanisme impliquant le facteur de transcription PDX-1. L'invalidation de l'expression de DLK diminue l'expression de l'insuline et potentialise l'apoptose induite par des cytokines proinflammatoires. A l'inverse, la surexpression de DLK augmente l'expression et la scrtion d'insuline induites par le glucose. Par consquent des niveaux d'expression appropris de DLK sont dterminants pour la fonction et la survie de la cellule β pancratique. L'obsit et la grossesse sont caractrises par une hyperinsulinmie qui rsulte d'une augmentation de la production et de la scrtion de l'insuline. L'expression de DLK est augmente dans des lots de rattes gestantes et des souris obses compars leurs contrles respectifs. A l'inverse, dans des sujets diabtiques, l'expression de DLK est diminue. Ensemble ces rsultats montrent l'importance de DLK dans l'adaptation des lots par un mécanisme qui pourrait impliquer la voie de signalisation de JNK. Des dfauts dans cette voie rgule par DLK pourraient contribuer au dysfonctionnement et la mort de la cellule β pancratique et par consquent au dveloppement du diabte. L'tude dtaille du mécanisme par lequel DLK active la voie de signalisation JNK et rgule la fonction de la cellule β pancratique pourrait ouvrir la voie des nouvelles thrapies ciblant l'amlioration de la fonction de la cellule β dans le diabte. - Pancreatic β-cells are evidently plastic in their ability to regulate insulin secretion. The quantity of insulin released by these cells varies according to the stimulus, and the prevailing glucose concentration, β-cell function is pivotal in glucose homeostasis, as their dysfunction, and death can lead to development of type 1 and type 2 diabetes. There are numerous reports so far underlying the role of inflammation in dysfunction, and destruction of β-cells, in both type 1 and type 2 diabetes. Chronic excess of proinflammatory cytokines promotes a β-cell decline, via induction of the c-Jun N-terminal Kinase (JNK) pathway. The activation of the JNK pathway is organized by a scaffold protein-mediated module in which, a three-step phosphorylation cascade occurs. The latter includes, Mitogen activated protein kinase kinase kinase (MAP3K), MAP2K and JNK. In this thesis, we unveil that the MAP3K Dual Leucine Zipper Bearing Kinase (DLK) is selectively, and highly expressed in pancreatic β-cells, as the result from the absence of the transcriptional repressor named, Repressor Element 1 Silencing Transcription (REST). We show that DLK regulates activation of JNK, and is required for β-cell function and survival by modulating the PDX-1 transcription factor. Silencing of DLK expression diminishes insulin expression, and potentiated cytokine-mediated apoptosis. Conversely, overexpression of DLK increased insulin expression, and glucose-induced insulin secretion. Therefore, an appropriate level of DLK is critical for β-cell function and survival. Obesity and pregnancy are characterized by hyperinsulinemia resulting from an increased production and secretion of insulin. In isolated islets of pregnant rats, and obese mice, the expression of DLK was elevated when compared to their respective controls. However, decreased expression of DLK was observed in islets of individuals with diabetes. Taken together, we highlight the importance of DLK in islet adaptation, and describe a mechanism that may involve the JNK signaling. Deficiency in the JNK pathway regulated by DLK may contribute to β-cell failure and death, and thereby development of diabetes. Unraveling the mechanism whereby DLK activates the JNK pathway, and β-cell function, may pave the way for the design of novel therapies, aiming to improve β-cell function and survival in diabetes in general.
Resumo:
Les progrs de la thrapie antirtrovirale ont transform l'infection par le VIH d'une condition invitablement fatale une maladie chronique. En dpit de ce succs, l'chec thrapeutique et la toxicit mdicamenteuse restent frquents. Une rponse inadquate au traitement est clairement multifactorielle et une individualisation de la posologie des mdicaments qui se baserait sur les facteurs dmographiques et gntiques des patients et sur les taux sanguins totaux, libres et/ou cellulaires des mdicaments pourrait amliorer la fois l'efficacit et la tolrance de la thrapie, cette dernire tant certainement un enjeu majeur pour un traitement qui se prend vie.L'objectif global de cette thse tait de mieux comprendre les facteurs pharmacocintiques (PK) et pharmacogntiques (PG) influenant l'exposition aux mdicaments antirtroviraux (ARVs) nous offrant ainsi une base rationnelle pour l'optimisation du traitement antiviral et pour l'ajustement posologique des mdicaments chez les patients VIH-positifs. Une thrapie antirtrovirale adapte au patient est susceptible d'augmenter la probabilit d'efficacit et de tolrance ce traitement, permettant ainsi une meilleure compliance long terme, et rduisant le risque d'mergence de rsistance et d'chec thrapeutique.A cet effet, des mthodes de quantification des concentrations plasmatiques totales, libres et cellulaires des ARVs ainsi que de certains de leurs mtabolites ont t dveloppes et valides en utilisant la chromatographie liquide coupe la spectromtrie de masse en tandem. Ces mthodes ont t appliques pour la surveillance des taux d'ARVs dans diverses populations de patients HIV-positifs. Une tude clinique a t initie dans le cadre de l'tude VIH Suisse de cohorte mre-enfant afin de dterminer si la grossesse influence la cintique des ARVs. Les concentrations totales et libres du lopnavir, de l'atazanavir et de la nvirapine ont t dtermines chez les femmes enceintes suivies pendant leur grossesse, et celles-ci ont t trouves non influences de manire cliniquement significative par la grossesse. Un ajustement posologique de ces ARVs n'est donc pas ncessaire chez les femmes enceintes. Lors d'une petite tude chez des patients HIV- positifs expriments, la corrlation entre l'exposition cellulaire et plasmatique des nouveaux ARVs, notamment le raltgravir, a t dtermine. Une bonne corrlation a t obtenue entre taux plasmatiques et cellulaires de raltgravir, suggrant que la surveillance des taux totaux est un substitut satisfaisant. Cependant, une importante variabilit interpatient a t observe dans les ratios d'accumulation cellulaire du raltgravir, ce qui devrait encourager des investigations supplmentaires chez les patients en chec sous ce traitement. L'efficacit du suivi thrapeutique des mdicaments (TDM) pour l'adaptation des taux d'efavirenz chez des patients avec des concentrations au-dessus de la cible thrapeutique recommande a t value lors d'une tude prospective. L'adaptation des doses d'efavirenz base sur le TDM s'est montre efficace et sre, soutenant l'utilisation du TDM chez les patients avec concentrations hors cible thrapeutique. L'impact des polymorphismes gntiques des cytochromes P450 (CYP) 2B6, 2A6 et 3A4/5 sur la pharmacocintique de l'efavirenz et de ces mtabolites a t tudi : un modle de PK de population intgrant les covariats gntiques et dmographiques a t construit. Les variations gntiques fonctionnelles dans les voies de mtabolisation principales (CYP2B6) et accessoires {CYP2A6et 3A4/S) de l'efavirenz ont un impact sur sa disposition, et peuvent mener des expositions extrmes au mdicament. Un? ajustement des doses guid par le TDM est donc recommand chez ces patients, en accord avec les polymorphismes gntiques.Ainsi, nous avons dmont qu'en utilisant une approche globale tenant compte la fois des facteurs PK et PG influenant l'exposition aux ARVs chez les patients infects, il est possible, si ncessaire, d'individualiser la thrapie antirtrovirale dans des situations diverses. L'optimisation du traitement antirtroviral contribue vraisemblablement une meilleure efficacit thrapeutique iong terme tout en rduisant la survenue d'effets indsirables.Rsum grand publicOptimisation de la thrapie antirtrovirale: approches pharmacocintiques et pharmacogntiquesLes progrs effectus dans le traitement de l'infection par le virus de llmmunodficienoe humaine acquise (VIH) ont permis de transformer une affection mortelle en une maladie chronique traitable avec des mdicaments de plus en plus efficaces. Malgr ce succs, un certain nombre de patients ne rpondent pas de faon optimale leur traitement etyou souffrent d'effets indsirables mdicamenteux entranant de frquentes modifications dans leur thrapie. Il a t possible de mettre en vidence que l'efficacit d'un traitement antirtroviral est dans la plupart des cas corrle aux concentrations de mdicaments mesures dans le sang des patients. Cependant, le virus se rplique dans la cellule, et seule la fraction des mdicaments non lie aux protines du plasma sanguin peut entrer dans la cellule et exercer l'activit antirtrovirale au niveau cellulaire. Il existe par ailleurs une importante variabilit des concentrations sanguines de mdicament chez des patients prenant pourtant la mme dose de mdicament. Cette variabilit peut tre due des facteurs dmographiques et/ou gntiques susceptibles d'influencer la rponse au traitement antirtroviral.Cette thse a eu pour objectif de mieux comprendre les facteurs pharmacologiques et gntiques influenant l'efficacit et ta toxicit des mdicaments antirtroviraux, dans le but d'individualiser la thrapie antivirale et d'amliorer le suivi des patients HIV-positifs.A cet effet, des mthodes de dosage trs sensibles ont t dveloppes pour permettre la quantification des mdicaments antirtroviraux dans le sang et les cellules. Ces mthodes analytiques ont t appliques dans le cadre de diverses tudes cliniques ralises avec des patients. Une des tudes cliniques a recherch s'il y avait un impact des changements physiologiques lis la grossesse sur les concentrations des mdicaments antirtroviraux. Nous avons ainsi pu dmontrer que la grossesse n'influenait pas de faon cliniquement significative le devenir des mdicaments antirtroviraux chez les femmes enceintes HIV- positives. La posologie de mdicaments ne devrait donc pas tre modifie dans cette population de patientes. Par ailleurs, d'autres tudes ont ports sur les variations gntiques des patients influenant l'activit enzymatique des protines impliques dans le mtabolisme des mdicaments antirtroviraux. Nous avons galement tudi l'utilit d'une surveillance des concentrations de mdicament (suivi thrapeutique) dans le sang des patients pour l'individualisation des traitements antiviraux. Il a t possible de mettre en vidence des relations significatives entre l'exposition aux mdicaments antirtroviraux et l'existence chez les patients de certaines variations gntiques. Nos analyses ont galement permis d'tudier les relations entre les concentrations dans le sang des patients et les taux mesurs dans les cellules o le virus HIV se rplique. De plus, la mesure des taux sanguins de mdicaments antirtroviraux et leur interprtation a permis d'ajuster la posologie de mdicaments chez les patients de faon efficace et sre.Ainsi, la complmentarit des connaissances pharmacologiques, gntiques et virales s'inscrit dans l'optique d'une stratgie globale de prise en charge du patient et vise l'individualisation de la thrapie antirtrovirale en fonction des caractristiques propres de chaque individu. Cette approche contribue ainsi l'optimisation du traitement antirtroviral dans la perspective d'un succs du traitement long terme tout en rduisant la probabilit des effets indsirables rencontrs. - The improvement in antirtroviral therapy has transformed HIV infection from an inevitably fatal condition to a chronic, manageable disease. However, treatment failure and drug toxicity are frequent. Inadequate response to treatment is clearly multifactorial and, therefore, dosage individualisation based on demographic factors, genetic markers and measurement of total, free and/or cellular drug level may increase both drug efficacy and tolerability. Drug tolerability is certainly a major issue for a treatment that must be taken indefinitely.The global objective of this thesis aimed at increasing our current understanding of pharmacokinetic (PK) and pharmacogenetic (PG) factors influencing the exposition to antirtroviral drugs (ARVs) in HIV-positive patients. In turn, this should provide us with a rational basis for antiviral treatment optimisation and drug dosage adjustment in HIV- positive patients. Patient's tailored antirtroviral regimen is likely to enhance treatment effectiveness and tolerability, enabling a better compliance over time, and hence reducing the probability of emergence of viral resistance and treatment failure.To that endeavour, analytical methods for the measurement of total plasma, free and cellular concentrations of ARVs and some of their metabolites have been developed and validated using liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry. These assays have been applied for the monitoring of ARVs levels in various populations of HIV- positive patients. A clinical study has been initiated within the frame of the Mother and Child Swiss HIV Cohort Study to determine whether pregnancy influences the exposition to ARVs. Free and total plasma concentrations of lopinavir, atazanavir and nevirapine have been determined in pregnant women followed during the course of pregnancy, and were found not influenced to a clinically significant extent by pregnancy. Dosage adjustment for these drugs is therefore not required in pregnant women. In a study in treatment- experienced HIV-positive patients, the correlation between cellular and total plasma exposure to new antirtroviral drugs, notably the HIV integrase inhibitor raltegravir, has been determined. A good correlation was obtained between total and cellular levels of raltegravir, suggesting that monitoring of total levels are a satisfactory. However, significant inter-patient variability was observed in raltegravir cell accumulation which should prompt further investigations in patients failing under an integrase inhibitor-based regimen. The effectiveness of therapeutic drug monitoring (TDM) to guide efavirenz dose reduction in patients having concentrations above the recommended therapeutic range was evaluated in a prospective study. TDM-guided dosage adjustment of efavirenz was found feasible and safe, supporting the use of TDM in patients with efavirenz concentrations above therapeutic target. The impact of genetic polymorphisms of cytochromes P450 (CYP) 2B6, 2A6 and 3A4/5 on the PK of efavirenz and its metabolites was studied: a population PK model was built integrating both genetic and demographic covariates. Functional genetic variations in main (CYP2B6) and accessory (2A6, 3A4/5) metabolic pathways of efavirenz have an impact on efavirenz disposition, and may lead to extreme drug exposures. Dosage adjustment guided by TDM is thus required in those patients, according to the pharmacogenetic polymorphism.Thus, we have demonstrated, using a comprehensive approach taking into account both PK and PG factors influencing ARVs exposure in HIV-infected patients, the feasibility of individualising antirtroviral therapy in various situations. Antiviral treatment optimisation is likely to increase long-term treatment success while reducing the occurrence of adverse drug reactions.
Resumo:
Rapport de synthse : Le rcepteur activ par protase de type 2 (PAR2) intervient dans l'inflammation dans divers modles exprimentaux de maladies inflammatoires et auto-immunes, mais le mécanisme par lequel il exerce cette fonction reste mal compris. PAR2 est exprim sur des cellules endothliales et immunitaires et a t impliqu dans la diffrentiation des cellules dendritiques (DC). Avec leur rle central dans la rponse immune, les DC pourraient jouer un rle clef, l'activation de PAR2 leur surface modulant la rponse immune. Des recherches prcdentes ont montr que PAR2 a un effet dans le dveloppement et la maturation des DC de moelle osseuse in vitro, ainsi que dans la promotion de la rponse immune en allergie. Dans cette tude, nous avons valu l'impact in vivo de l'activation de PAR2 sur les DC et les cellules T dans des souris dficientes en PAR2 (KO) en utilisant un peptide agoniste spcifique du PAR2 (AP2). L'activation de PAR2 a augment la frquence de DC matures dans les ganglions lymphatiques 24 heures aprs l'administration d'AP2 d'une manire significative. En outre, ces DC avaient une expression augmente des molcules de co-stimulation CD86 et du complexe majeur d'histocompatibilit type 2 (MHC-II). 48 heures aprs l'injection d'AP2, nous avons galement observ une lvation significative des lymphocytes T CD4+ et CD8+ activs, (CD44+CD62-) dans ces ganglions. Des changements dans le profil d'activation des DC et des cellules T n'ont pas t observs au niveau de a rate. L'influence de la signalisation de PAR2 sur le transport d'antigne aux ganglions lymphatiques inguinaux a t value dans le contexte d'hypersensibilit retarde de type IV. Les souris KO sensibilises par peinture de la peau avec fluorescine isothyocyanate (FITC) afin d'induire une hypersensibilit retarde avaient un pourcentage diminu de DC FITC+ dans les ganglions lymphatiques 24 heures aprs l'application du FITC en comparaison avec les souris sauvages avec le mme fond gntique (0.47% vs 0.95% des cellules ganglionnaires totales). En conclusion, ces rsultats dmontrent que la signalisation de PAR2 favorise et renforce la maturation et le transport d'antigne par des DC .vers les ganglions lymphatiques ainsi que l'activation ultrieure des lymphocytes T, et de ce fait fournissent une explication pour l'effet pro inflammatoire de PAR2 dans les modles animaux d'inflammation. Une meilleure comprhension de ce mécanisme de modulation du systme immun via PAR2 peut s'avrer particulirement utile pour le dveloppement des vaccins, ainsi que pour la dcouverte de nouvelles cibles thrapeutiques dans le contexte de l'allergie, l'auto-immunit, et les maladies inflammatoires.
