Consequences of cerebroventricular insulin injection on renal sodium handling in rats: effect of inhibition of central nitric oxide synthase

In the present study, we investigated the effects of acute intracerebroventricular (icv) insulin administration on central mechanisms regulating urinary sodium excretion in simultaneously centrally NG-nitro-L-arginine methylester (L-NAME)-injected unanesthetized rats. Male Wistar-Hannover rats were randomly assigned to one of five groups: a) icv 0.15 M NaCl-injected rats (control, N = 10), b) icv dose-response (1.26, 12.6 and 126 ng/3 µL) insulin-injected rats (N = 10), c) rats icv injected with 60 µg L-NAME in combination with NaCl (N = 10) or d) with insulin (N = 10), and e) subcutaneously insulin-injected rats (N = 5). Centrally administered insulin produced an increase in urinary output of sodium (NaCl: 855.6 ± 85.1 Δ%/min; 126 ng insulin: 2055 ± 310.6 Δ%/min; P = 0.005) and potassium (NaCl: 460.4 ± 100 Δ%/min; 126 ng insulin: 669.2 ± 60.8 Δ%/min; P = 0.025). The urinary sodium excretion response to icv 126 ng insulin microinjection was significantly attenuated by combined administration of L-NAME (126 ng insulin: 1935 ± 258.3 Δ%/min; L-NAME + 126 ng insulin: 582.3 ± 69.6 Δ%/min; P = 0.01). Insulin-induced natriuresis occurred by increasing post-proximal sodium excretion, despite an unchanged glomerular filtration rate. Although the rationale for decreased urinary sodium excretion induced by combined icv L-NAME and insulin administration is unknown, it is tempting to suggest that perhaps one of the efferent signals triggered by insulin in the CNS may be nitrergic in nature.

Acute lead-induced vasoconstriction in the vascular beds of isolated perfused rat tails is endothelium-dependent

Chronic lead exposure induces hypertension in humans and animals, affecting endothelial function. However, studies concerning acute cardiovascular effects are lacking. We investigated the effects of acute administration of a high concentration of lead acetate (100 µΜ) on the pressor response to phenylephrine (PHE) in the tail vascular bed of male Wistar rats. Animals were anesthetized with sodium pentobarbital and heparinized. The tail artery was dissected and cannulated for drug infusion and mean perfusion pressure measurements. Endothelium and vascular smooth muscle relaxation were tested with acetylcholine (5 µg/100 µL) and sodium nitroprusside (0.1 µg/100 µL), respectively, in arteries precontracted with 0.1 µM PHE. Concentration-response curves to PHE (0.001-300 µg/100 µL) were constructed before and after perfusion for 1 h with 100 µΜ lead acetate. In the presence of endothelium (E+), lead acetate increased maximal response (Emax) (control: 364.4 ± 36, Pb2+: 480.0 ± 27 mmHg; P < 0.05) and the sensitivity (pD2; control: 1.98 ± 0.07, 2.38 ± 0.14 log mM) to PHE. In the absence of endothelium (E-) lead had no effect but increased baseline perfusion pressure (E+: 79.5 ± 2.4, E-: 118 ± 2.2 mmHg; P < 0.05). To investigate the underlying mechanisms, this protocol was repeated after treatment with 100 µM L-NAME, 10 µM indomethacin and 1 µM tempol in the presence of lead. Lead actions on Emax and pD2 were abolished in the presence of indomethacin, and partially abolished with L-NAME and tempol. Results suggest that acute lead administration affects the endothelium, releasing cyclooxygenase-derived vasoconstrictors and involving reactive oxygen species.

The methyl ester of rosuvastatin elicited an endothelium-independent and 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase-independent relaxant effect in rat aorta

The relaxant effect of the methyl ester of rosuvastatin was evaluated on aortic rings from male Wistar rats (250-300 g, 6 rats for each experimental group) with and without endothelium precontracted with 1.0 µM phenylephrine. The methyl ester presented a slightly greater potency than rosuvastatin in relaxing aortic rings, with log IC50 values of -6.88 and -6.07 M, respectively. Unlike rosuvastatin, the effect of its methyl ester was endothelium-independent. Pretreatment with 10 µM indomethacin did not inhibit, and pretreatment with 1 mM mevalonate only modestly inhibited the relaxant effect of the methyl ester. Nω-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME, 10 µM), the selective nitric oxide-2 (NO-2) inhibitor 1400 W (10 µM), tetraethylammonium (TEA, 10 mM), and cycloheximide (10 µM) partially inhibited the relaxant effect of the methyl ester on endothelium-denuded aortic rings. However, the combination of TEA plus either L-NAME or cycloheximide completely inhibited the relaxant effect. Inducible NO synthase (NOS-2) was only present in endothelium-denuded aortic rings, as demonstrated by immunoblot with methyl ester-treated rings. In conclusion, whereas rosuvastatin was associated with a relaxant effect dependent on endothelium and hydroxymethylglutaryl coenzyme A reductase in rat aorta, the methyl ester of rosuvastatin exhibited an endothelium-independent and only slightly hydroxymethylglutaryl coenzyme A reductase-dependent relaxant effect. Both NO produced by NOS-2 and K+ channels are involved in the relaxant effect of the methyl ester of rosuvastatin.

Gadolinium increases the vascular reactivity of rat aortic rings

Gadolinium (Gd) blocks intra- and extracellular ATP hydrolysis. We determined whether Gd affects vascular reactivity to contractile responses to phenylephrine (PHE) by blocking aortic ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase (E-NTPDase). Wistar rats of both sexes (260-300 g, 23 females, 7 males) were used. Experiments were performed before and after incubation of aortic rings with 3 µM Gd. Concentration-response curves to PHE (0.1 nM to 0.1 mM) were obtained in the presence and absence of endothelium, after incubation with 100 µM L-NAME, 10 µM losartan, or 10 µM enalaprilat. Gd significantly increased the maximum response (control: 72.3 ± 3.5; Gd: 101.3 ± 6.4%) and sensitivity (control: 6.6 ± 0.1; Gd: 10.5 ± 2.8%) to PHE. To investigate the blockade of E-NTDase activity by Gd, we added 1 mM ATP to the bath. ATP reduced smooth muscle tension and Gd increased its relaxing effect (control: -33.5 ± 4.1; Gd: -47.4 ± 4.1%). Endothelial damage abolished the effect of Gd on the contractile responses to PHE (control: 132.6 ± 8.6; Gd: 122.4 ± 7.1%). L-NAME + Gd in the presence of endothelium reduced PHE contractile responses (control/L-NAME: 151.1 ± 28.8; L-NAME + Gd: 67.9 ± 19% AUC). ATP hydrolysis was reduced after Gd administration, which led to ATP accumulation in the nutrient solution and reduced ADP concentration, while adenosine levels remained the same. Incubation with Gd plus losartan and enalaprilat eliminated the pressor effects of Gd. Gd increased vascular reactivity to PHE regardless of the reduction of E-NTPDase activity and adenosine production. Moreover, the increased reactivity to PHE promoted by Gd was endothelium-dependent, reducing NO bioavailability and involving an increased stimulation of angiotensin-converting enzyme and angiotensin II AT1 receptors.

Participation of the NO/cGMP/K+ATP pathway in the antinociception induced by Walker tumor bearing in rats

Implantation of Walker 256 tumor decreases acute systemic inflammation in rats. Inflammatory hyperalgesia is one of the most important events of acute inflammation. The L-arginine/NO/cGMP/K+ATP pathway has been proposed as the mechanism of peripheral antinociception mediated by several drugs and physical exercise. The objective of this study was to investigate a possible involvement of the NO/cGMP/K+ATP pathway in antinociception induced in Walker 256 tumor-bearing male Wistar rats (180-220 g). The groups consisted of 5-6 animals. Mechanical inflammatory hypernociception was evaluated using an electronic version of the von Frey test. Walker tumor (4th and 7th day post-implantation) reduced prostaglandin E2- (PGE2, 400 ng/paw; 50 µL; intraplantar injection) and carrageenan-induced hypernociception (500 µg/paw; 100 µL; intraplantar injection). Walker tumor-induced analgesia was reversed (99.3% for carrageenan and 77.2% for PGE2) by a selective inhibitor of nitric oxide synthase (L-NAME; 90 mg/kg, ip) and L-arginine (200 mg/kg, ip), which prevented (80% for carrageenan and 65% for PGE2) the effect of L-NAME. Treatment with the soluble guanylyl cyclase inhibitor ODQ (100% for carrageenan and 95% for PGE2; 8 µg/paw) and the ATP-sensitive K+ channel (KATP) blocker glibenclamide (87.5% for carrageenan and 100% for PGE2; 160 µg/paw) reversed the antinociceptive effect of tumor bearing in a statistically significant manner (P < 0.05). The present study confirmed an intrinsic peripheral antinociceptive effect of Walker tumor bearing in rats. This antinociceptive effect seemed to be mediated by activation of the NO/cGMP pathway followed by the opening of KATP channels.

Arginine induces GH gene expression by activating NOS/NO signaling in rat isolated hemi-pituitaries

The amino acid arginine (Arg) is a recognized secretagogue of growth hormone (GH), and has been shown to induce GH gene expression. Arg is the natural precursor of nitric oxide (NO), which is known to mediate many of the effects of Arg, such as GH secretion. Arg was also shown to increase calcium influx in pituitary cells, which might contribute to its effects on GH secretion. Although the mechanisms involved in the effects of Arg on GH secretion are well established, little is known about them regarding the control of GH gene expression. We investigated whether the NO pathway and/or calcium are involved in the effects of Arg on GH gene expression in rat isolated pituitaries. To this end, pituitaries from approximately 170 male Wistar rats (~250 g) were removed, divided into two halves, pooled (three hemi-pituitaries) and incubated or not with Arg, as well as with different pharmacological agents. Arg (71 mM), the NO donor sodium nitroprusside (SNP, 1 and 0.1 mM) and a cyclic guanosine monophosphate (cGMP) analogue (8-Br-cGMP, 1 mM) increased GH mRNA expression 60 min later. The NO acceptor hemoglobin (0.3 µM) blunted the effect of SNP, and the combined treatment with Arg and L-NAME (a NO synthase (NOS) inhibitor, 55 mM) abolished the stimulatory effect of Arg on GH gene expression. The calcium channel inhibitor nifedipine (3 µM) also abolished Arg-induced GH gene expression. The present study shows that Arg directly induces GH gene expression in hemi-pituitaries isolated from rats, excluding interference from somatostatinergic neurons, which are supposed to be inhibited by Arg. Moreover, the data demonstrate that the NOS/NO signaling pathway and calcium mediate the Arg effects on GH gene expression.

Pharmacological characterization of the relaxant effect induced by adrenomedullin in rat cavernosal smooth muscle

The aim of the present study was to determine the mechanisms underlying the relaxant effect of adrenomedullin (AM) in rat cavernosal smooth muscle (CSM) and the expression of AM system components in this tissue. Functional assays using standard muscle bath procedures were performed in CSM isolated from male Wistar rats. Protein and mRNA levels of pre-pro-AM, calcitonin receptor-like receptor (CRLR), and Subtypes 1, 2 and 3 of the receptor activity-modifying protein (RAMP) family were assessed by Western immunoblotting and quantitative real-time polymerase chain reaction, respectively. Nitrate and 6-keto-prostaglandin F1α (6-keto-PGF1α; a stable product of prostacyclin) levels were determined using commercially available kits. Protein and mRNA of AM, CRLR, and RAMP 1, -2, and -3 were detected in rat CSM. Immunohistochemical assays demonstrated that AM and CRLR were expressed in rat CSM. AM relaxed CSM strips in a concentration-dependent manner. AM22-52, a selective antagonist for AM receptors, reduced the relaxation induced by AM. Conversely, CGRP8-37, a selective antagonist for calcitonin gene-related peptide receptors, did not affect AM-induced relaxation. Preincubation of CSM strips with NG-nitro-L-arginine-methyl-ester (L-NAME, nitric oxide synthase inhibitor), 1H-(1,2,4)oxadiazolo[4,3-a]quinoxalin-1-one (ODQ, quanylyl cyclase inhibitor), Rp-8-Br-PET-cGMPS (cGMP-dependent protein kinase inhibitor), SC560 [5-(4-chlorophenyl)-1-(4-methoxyphenyl)-3-trifluoromethyl pyrazole, selective cyclooxygenase-1 inhibitor], and 4-aminopyridine (voltage-dependent K+ channel blocker) reduced AM-induced relaxation. On the other hand, 7-nitroindazole (selective neuronal nitric oxide synthase inhibitor), wortmannin (phosphatidylinositol 3-kinase inhibitor), H89 (protein kinase A inhibitor), SQ22536 [9-(tetrahydro-2-furanyl)-9H-purin-6-amine, adenylate cyclase inhibitor], glibenclamide (selective blocker of ATP-sensitive K+ channels), and apamin (Ca2+-activated channel blocker) did not affect AM-induced relaxation. AM increased nitrate levels and 6-keto-PGF1α in rat CSM. The major new contribution of this research is that it demonstrated expression of AM and its receptor in rat CSM. Moreover, we provided evidence that AM-induced relaxation in this tissue is mediated by AM receptors by a mechanism that involves the nitric oxide-cGMP pathway, a vasodilator prostanoid, and the opening of voltage-dependent K+ channels.

β-Citronellol, an alcoholic monoterpene with inhibitory properties on the contractility of rat trachea

β-Citronellol is an alcoholic monoterpene found in essential oils such Cymbopogon citratus (a plant with antihypertensive properties). β-Citronellol can act against pathogenic microorganisms that affect airways and, in virtue of the popular use of β-citronellol-enriched essential oils in aromatherapy, we assessed its pharmacologic effects on the contractility of rat trachea. Contractions of isolated tracheal rings were recorded isometrically through a force transducer connected to a data-acquisition device. β-Citronellol relaxed sustained contractions induced by acetylcholine or high extracellular potassium, but half-maximal inhibitory concentrations (IC50) for K+-elicited stimuli were smaller than those for cholinergic contractions. It also inhibited contractions induced by electrical field stimulation or sodium orthovanadate with pharmacologic potency equivalent to that seen against acetylcholine-induced contractions. When contractions were evoked by selective recruitment of Ca2+ from the extracellular medium, β-citronellol preferentially inhibited contractions that involved voltage-operated (but not receptor-operated) pathways. β-Citronellol (but not verapamil) inhibited contractions induced by restoration of external Ca2+ levels after depleting internal Ca2+ stores with the concomitant presence of thapsigargin and recurrent challenge with acetylcholine. Treatment of tracheal rings with L-NAME, indomethacin or tetraethylammonium did not change the relaxing effects of β-citronellol. Inhibition of transient receptor potential vanilloid subtype 1 (TRPV1) or transient receptor potential ankyrin 1 (TRPA1) receptors with selective antagonists caused no change in the effects of β-citronellol. In conclusion, β-citronellol exerted inhibitory effects on rat tracheal rings, with predominant effects on contractions that recruit Ca2+ inflow towards the cytosol by voltage-gated pathways, whereas it appears less active against contractions elicited by receptor-operated Ca2+ channels.

Deficiency of sex hormones does not affect 17-ß-estradiol-induced coronary vasodilation in the isolated rat heart

The relaxation of coronary arteries by estrogens in the coronary vascular beds of naive and hypertensive rats has been well described. However, little is known about this action in gonadectomized rats. We investigated the effect of 17-ß-estradiol (E2) in coronary arteries from gonadectomized rats, as well as the contributions of endothelium-derived factors and potassium channels. Eight-week-old female and male Wistar rats weighing 220-300 g were divided into sham-operated and gonadectomized groups (n=9−12 animals per group). The baseline coronary perfusion pressure (CPP) was determined, and the vasoactive effects of 10 μM E2 were assessed by bolus administration before and after endothelium denudation or by perfusion with NG-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME), indomethacin, clotrimazole, L-NAME plus indomethacin, L-NAME plus clotrimazole or tetraethylammonium (TEA). The CPP differed significantly between the female and sham-operated male animals. Gonadectomy reduced the CPP only in female rats. Differences in E2-induced relaxation were observed between the female and male animals, but male castration did not alter this response. For both sexes, the relaxation response to E2 was, at least partly, endothelium-dependent. The response to E2 was reduced only in the sham-operated female rats treated with L-NAME. However, in the presence of indomethacin, clotrimazole, L-NAME plus indomethacin or L-NAME plus clotrimazole, or TEA, the E2 response was significantly reduced in all groups. These results highlight the importance of prostacyclin, endothelium-derived hyperpolarizing factor, and potassium channels in the relaxation response of coronary arteries to E2 in all groups, whereas nitric oxide may have had an important role only in the sham-operated female group.

Endothelin-1 and H2O2-induced signaling in vascular smooth muscle cells : modulation by CaMKII and Nitric oxide

L’endothéline-1 (ET-1) est un peptide vasoactif extrêmement puissant qui possède une forte activité mitogénique dans les cellules du muscle lisse vasculaire (VSMCs). Il a été démontré que l’ET-1 est impliquée dans plusieurs maladies cardio-vasculaires, comme l’athérosclérose, l'hypertension, la resténose après l'angioplastie, l’insuffisance cardiaque et l'arythmie. L’ET-1 exerce ses effets via plusieurs voies de signalisation qui incluent le Ca2+, les protéines kinases activées par les mitogènes (MAPKs) y compris les kinases régulées par les signaux extracellulaires (ERK1/2) et la voie de la phosphatidylinositol 3-kinase (PI-3K)/protein kinase B (PKB). Plusieurs études ont démontré que les dérivés réactifs de l'oxygène (ROS) peuvent jouer un rôle important dans la signalisation d’ERK1/2 et de PKB induite par plusieurs facteurs de croissance et hormones. Nous avons précédemment montré que l'ET-1 produit des ROS qui agissent comme médiateur de la signalisation cellulaire induite par l’ET-1. Le peroxyde d’hydrogène (H2O2), une molécule qui appartient à la famille des ROS, peut activer les voies de la MAPK et de la PKB dans les VSMCs. Par ailleurs, nos résultats suggèrent également que le Ca2+ et la calmoduline (CaM) sont essentiels pour la phosphorylation d’ERK1/2, de p38 et de PKB induite par le H2O2 dans les VSMCs. La Ca2+/CaM-dependent protein kinases II (CaMKII) est une sérine/thréonine protéine kinase multifonctionnelle activée par le Ca2+/CaM. Il a été montré que la CaMKII est impliquée dans les voies de signalisation induite par le H2O2 dans les cellules endothéliales. Cependant, le rôle de la CaMKII dans la phosphorylation d’ERK1/2, de PKB et de la proline-rich tyrosine kinase 2 (Pyk2) induite par l’ET-1 et le H2O2, de même que son rôle dans l’effet hypertrophique et prolifératif de l’ET-1 dans les VSMCs demeure inexploré. Le monoxyde d’azote (NO) est une molécule vasoactive impliquée dans la régulation de plusieurs réponses hormonales. Le NO peut moduler la signalisation contrôlant la croissance cellulaire induite par plusieurs agonistes d’où son rôle protecteur dans le système vasculaire. Des études ont montré que le NO peut inhiber la voie de Ras/Raf/ERK1/2 et la voie de PKB induite par le facteur de croissance endothélial (EGF) et l’angiotensine II (Ang II). Beaucoup d’autres travaux ont mis en évidence un cross-talk entre les voies de signalisation activées par l’ET-1 et le NO. La capacité du NO à inhiber la signalisation intracellulaire induite par l’ET-1 dans les VSMCs demeure inconnue. Le travail présenté dans cette thèse vise à déterminer le rôle du système Ca2+-CaM-CaMKII dans la phosphorylation d’ERK1/2, de PKB et de Pyk2 induite par l’ET-1 et le H2O2 ainsi que son rôle dans la croissance et la prolifération cellulaire induites par l’ET-1 dans les VSMCs. Nous avons également testé le rôle du NO dans la phosphorylation d’ERK1/2, de PKB et de Pyk2 ainsi que la synthèse protéique induite par l’ET-1. Dans la première partie de notre étude, nous avons examiné le rôle de la CaMKII dans la phosphorylation d’ERK1/2 et de PKB induite par l’ET-1 dans les VSMCs en utilisant trois approches différentes i.e. l'usage d'inhibiteurs pharmacologiques, un peptide auto-inhibiteur de la CaMKII (CaMKII AIP) et la technique de siRNA. Nous avons démontré que la CaMKII est impliquée dans la phosphorylation d’ERK1/2 et de PKB induite par l’ET-1 dans les VSMCs. Des études précédentes ont montré à l’aide d’inhibiteurs pharmacologiques comme le KN-93 que l'Ang II et les agents induisant une augmentation de la concentration en Ca2+ intracellulaire comme l’ionomycine, provoquent la phosphorylation d’ERK1/2 via la CaM dans les VSMCs. Cependant, en utilisant différentes approches, nos études ont montré pour la première fois une implication de la CaMKII dans la phosphorylation d’ERK1/2 et de PKB induite par l’ET-1 dans les VSMCs. Nous avons également rapporté pour la première fois, un rôle crucial de la CaMKII dans la pathophysiologie vasculaire associée à l’ET-1 puisque l’activation de la CaMKII joue un rôle important dans l’hypertrophie et la croissance cellulaire. Dans la deuxième partie, à la lumière des études précédentes qui montraient que les ROS agissent comme médiateurs de la signalisation induite par l’ET-1 dans les VSMCs, nous avons examiné si la CaMKII est également impliquée dans l’activation des voies d’ERK1/2 et de PKB induite par le H2O2. En utilisant des approches pharmacologiques et moléculaires, nous avons montré, comme pour l’ET-1, que la CaMKII joue un rôle critique en amont de la phosphorylation d’ERK1/2, de PKB et de Pyk2 induite par le H2O2. Nous avons précédemment montré que la transactivation du récepteur de type I de l’insulin-like growth factor (IGF-1R) est nécessaire à l’activation de PKB induite par le H2O2. Pour cette raison, nous avons examiné l'effet de l'inhibition de la CaMKII par l’inhibiteur pharmacologique ou par le knock-down de la CaMKII sur la phosphorylation d’IGF-1R induite par le H2O2. Les résultats démontrent que la CaMKII joue un rôle critique en amont de la phosphorylation d’ERK1/2, de PKB et d’IGF-1R induite par le H2O2. Dans la troisième partie de notre étude, nous avons également examiné le mécanisme moléculaire par lequel le NO exerce ses effets anti-mitogéniques et anti-hypertrophiques dans la signalisation induite par l’ET-1. En testant l'effet de deux différents donneurs de NO (S-nitroso-N-acetylpenicillamine (SNAP), sodium nitroprusside (SNP)) et un inhibiteur de NO synthase, le N (G)-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME) dans la phosphorylation d’ERK1/2, de PKB et de Pyk2 induite par l’ET-1, nous avons observé que le NO a un effet inhibiteur sur la signalisation induite par l’ET-1 dans les VSMCs. Par ailleurs, le 8-Br-GMPc, un analogue du GMPc, a un effet similaire à celui des deux donneurs du NO, tandis que l’oxadiazole quinoxaline (ODQ), un inhibiteur de la guanylate cyclase soluble, inverse l'effet inhibiteur du NO. Nous concluons que le NO diminue la phosphorylation d’ERK1/2, de PKB et de Pyk2 induite par l’ET-1 d’une manière dépendante du GMPc. Le NO inhibe aussi les effets hypertrophiques de l’ET-1 puisque le traitement avec le SNAP diminue la synthèse des protéines induite par l’ET-1. En résumé, les études présentées dans cette thèse démontrent que l’ET-1 et le H2O2 sont des activateurs de la phosphorylation d’ERK1/2, de PKB et de Pyk2 dans les VSMCs et que la CaMKII s’avère nécessaire pour ce processus, en agissant en amont de l’activation de IGF-1R induite par le H2O2 dans les VSMCs. Elles montrent également que le NO inhibe la phosphorylation d’ERK1/2, de PKB et de Pyk2 induite par l’ET-1. Enfin, nos travaux suggèrent aussi que l’activation de la CaMKII stimule la synthèse des protéines et de l’ADN induites par l’ET-1 alors que le NO inhibe la synthèse des protéines induite par ET-1. Mots clés: Endothéline ; Peroxyde d'hydrogène ; CaMKII ; Monoxyde d’azote ; Système vasculaire ; PKB; ERK1/2; IGF-1R; Hypertrophie.

Rôle du monoxyde d'azote dans la calcification vasculaire et la rigidité artérielle dans un modèle d'hypertension systolique isolée

L’hypertension systolique isolée (HSI) est le résultat de changements au niveau de la paroi vasculaire qui ont pour conséquence d’augmenter la rigidité artérielle. Ces modifications surviennent surtout au niveau des grosses artères comme l’aorte et sont associées au vieillissement. La fragmentation des fibres élastiques, leur calcification (élastocalcinose) et la fibrose font partie des changements majeurs observés avec l’âge. En plus de ces changements, le vieillissement vasculaire provoque des modifications au niveau des cellules qui composent la paroi. Les cellules endothéliales sécrètent moins de monoxyde d’azote (NO) provoquant une dysfonction endothéliale et les cellules musculaires lisses vasculaires (CMLVs) synthétisent maintenant des protéines matricielles et osseuses. Situé entre le sang et les CMLVs, l’endothélium contrôle le tonus vasculaire par la sécrétion de plusieurs substances vasoactives qui interagissent entre elles afin de maintenir l’homéostasie du système vasculaire. Parmi celles-ci, on note l’endothéline (ET), un puissant vasoconstricteur et le NO, un gaz vasorelaxants. Ce dernier est aussi reconnu pour bloquer la production d’ET par un mécanisme dépendant du guanosine monophosphate cyclique (GMPc). Comme il y a une interaction entre le NO et l’ET, et que cette dernière est impliquée dans la calcification artérielle, le NO pourrait être impliqué dans la modulation de l’élastocalcinose et de la rigidité artérielle par l’inhibition de l’ET et la modification de la composition de la paroi. Cet effet, qui se produirait au delà des effets vasorelaxants du NO, offre un potentiel thérapeutique intéressant pour l’HSI. Afin d’évaluer l’implication du NO dans la calcification vasculaire et la rigidité artérielle, un modèle animal d’HSI a été utilisé (modèle warfarine vitamine K, WVK). Ce modèle d’élastocalcinose est basé sur l’inhibition de la maturation d’une protéine anti-calcifiante, la matrix Gla protein (MGP), par la warfarine. Afin de déterminer l’implication physiologique du NO dans l’initiation et la progression de l’élastocalcinose, sa production a été inhibée par un analogue de la L-arginine, le L-NG-nitroarginine methyl ester (L-NAME). Lors des processus d’initiation de la calcification, le L-NAME a prévenu l’élastocalcinose sans toutefois modifier la vitesse de l’onde de pouls (PWV). Suite au traitement L-NAME, l’expression de la NO synthase inductible (iNOS) a été diminuée alors qu’elle a été augmentée lors du traitement WVK. Elle pourrait donc être impliquée dans les processus de calcification vasculaire. De plus, la NO synthase endothéliale (eNOS) semble également impliquée puisqu’elle a été augmentée dans le modèle WVK. Cette hausse pourrait être bénéfique pour limiter l’élastocalcinose alors que l’expression de la iNOS serait délétère. Lors de la progression de la calcification, le L-NAME a augmenté l’élastocalcinose et le PWV. Dans ce contexte, l’ET serait impliquée dans l’amplification de la calcification vasculaire entrainant une hausse de la rigidité artérielle. Comme le NO endogène limite la progression de la calcification et conséquemment la rigidité artérielle, il semble être protecteur. L’efficacité d’une modulation de la voie du NO dans le modèle WVK a été étudiée par l’administration d’un donneur de NO, le sinitrodil, ou d’un inhibiteur de la phosphosdiestérase 5 (PDE5), le tadalafil. La modulation de la voie du NO semble être bénéfique sur la rigidité artérielle, mais seulement de façon aiguë. En effet, le sinitrodil a modifié de transitoirement la rigidité au niveau de l’aorte possiblement par la modulation du tonus vasculaire sans toutefois avoir des effets sur la composition de la paroi. Comme le modèle WVK n’affecte pas la fonction endothéliale, les concentrations endogènes de NO semblent être optimales puisque le sinitrodil provoque une augmentation de l’élastocalcinose possiblement par le développement d’une tolérance. Tout comme le sinitrodil, le tadalafil a modulé de manière aiguë la rigidité artérielle sans modifier la composition de la paroi. Globalement, ces travaux ont permis de mettre en évidence les effets bénéfiques du NO endogène pour limiter le développement de l’HSI, suggérant qu’une dysfonction endothéliale, tel qu’observé lors du vieillissement, a un impact négatif sur la maladie.

Les prostanoïdes contrôlent la circulation placentaire : implication dans la prééclampsie

Au cours de la grossesse, une perfusion placentaire adéquate est indispensable au bon développement du fœtus. Dans certaines maladies comme la prééclampsie, celle-ci est altérée, compromettant ainsi la vie du fœtus, mais aussi celle de sa mère. Le retrait du placenta mène à la disparition des symptômes de la prééclampsie, suggérant un rôle central de ce dernier dans la maladie. Le placenta étant dépourvu d’innervation autonome, le tonus vasculaire placentaire doit être sous le contrôle de facteurs humoraux et tissulaires. Les vaisseaux placentaires sont très réactifs aux prostanoïdes. Le rapport thromboxane A2 (TXA2)/prostacycline (PGI2) est fortement augmenté dans les placentas de grossesses avec prééclampsie. De plus, le taux d’isoprostane, marqueur du stress oxydatif, est accru dans les placentas de femmes avec prééclampsie. Finalement, la prééclampsie s’accompagne d’un stress oxydatif placentaire marqué. Les espèces réactives de l’oxygène sont connues d’une part, pour oxyder l’acide arachidonique (AA), formant ainsi des isoprostanes et d’autre part, pour augmenter la production de TXA2 dans différents tissus, suite à l’activation des cyclooxygénases (COXs). Nous proposons que : 1. les prostanoïdes sont parmi les molécules endogènes qui contrôlent le tonus vasculaire placentaire. 2. la maladie modifie la réponse aux isoprostanes dans les vaisseaux placentaires. 3. l’induction d’un stress oxydatif placentaire entraîne une réponse vasoactive par activation de la voie du métabolisme de l’AA. Nous avons tout d’abord montré, dans des placentas obtenus de grossesses normotensives, que l’U-46619, un mimétique de la TXA2, de même que l’isoprostane, 8-iso-prostaglandine E2 (8-isoPGE2), ont augmenté fortement la pression de perfusion dans les cotylédons perfusés in vitro et la tension dans les anneaux d’artères chorioniques suspendus dans des bains à organe isolé. En revanche, dans les artères chorioniques de placentas obtenus de grossesses avec prééclampsie, ces réponses étaient modifiées puisque la réponse maximale à l’U-46619 était augmentée et celle à la 8-isoPGE2 diminuée. D’autre part, nous avons montré que les réponses maximales aux deux prostanoïdes étaient augmentées dans les vaisseaux placentaires de grossesse normale ou avec prééclampsie issus d’une délivrance prématurée par rapport à ceux d’une délivrance à terme. Ceci suggère une évolution de la réactivité des artères placentaires au cours du 3e trimestre de grossesse. En outre, les vaisseaux placentaires ont répondu aux prostanoïdes de façon semblable qu’ils aient été issus d’un accouchement vaginal ou d’une césarienne élective. Ceci indique que les prostanoïdes placentaires n’interviennent pas dans le processus de délivrance. D’un autre côté, l’utilisation de bloqueurs spécifiques des récepteurs TP à la TXA2, le SQ29,548 et l’ICI192,605, et des récepteurs EP à la prostaglandine E2, l’AH6809, nous ont permis de mettre en évidence le fait que l’U-46619 et la 8-isoPGE2 pouvaient agir de façon non-sélective sur l’un ou l’autre des récepteurs. Ces résultats supportent donc nos 2 premières hypothèses : les prostanoïdes font partie des molécules endogènes qui peuvent contrôler le tonus vasculaire placentaire et la prééclampsie modifie la réponse aux isoprostanes dans les artères chorioniques d’une manière compatible avec l’augmentation de la production de ces substances qui elle, est probablement le résultat du stress oxydatif. En revanche, en ce qui concerne les substances capables de jouer la contrepartie vasodilatatrice, l’utilisation d’un inhibiteur des synthases de monoxyde d’azote, le L-NAME, et celle d’inhibiteurs des COXs, l’ibuprofène, l’indométacine et le N-2PIA, ne nous a pas permis de mettre en évidence un quelconque rôle du monoxyde d’azote ou des prostanoïdes vasodilatatrices à ce niveau. Finalement, nous avons montré que l’induction d’un stress oxydatif dans les cotylédons perfusés in vitro et les artères chorioniques entraînait une vasoconstriction marquée. Celle-ci semble résulter de l’action des prostanoïdes puisqu’un blocage des récepteurs TP ou des COXs diminuait significativement la réponse maximale au peroxyde d’hydrogène. Les prostanoïdes impliquées dans la réponse au stress oxydatif proviendraient essentiellement d’une activation des COXs puisque l’étude ne nous permet pas de conclure à une quelconque implication des isoprostanes dans cette réponse. Ces observations confirment donc notre hypothèse que, dans le placenta, le stress oxydatif possède des propriétés vasoactives par activation du métabolisme de l’AA. En résumé, les résultats obtenus dans les placentas de grossesses normotensives et avec prééclampsie suggèrent que les prostanoïdes sont des molécules d’importance dans la régulation du tonus vasculaire placentaire. Le fait que la prééclampsie modifie la réponse aux prostanoïdes pourrait expliquer pourquoi la perfusion placentaire est altérée chez ces patientes. En outre, il apparaît évident qu’il existe un lien étroit entre le stress oxydatif et la voie de synthèse des prostanoïdes placentaires. Cependant d’autres études sont nécessaires pour mieux comprendre la nature de ce lien, qui pourrait, d’une certaine façon, jouer un rôle important dans le développement de la prééclampsie.

Functional Analysis of Nuclear beta-Adrenergic Receptors in the Myocardium

Récemment plusieurs récepteurs couplés aux protéines G (RCPGs) ont été caractérisés au niveau des membranes intracellulaires, dont la membrane nucléaire. Notre objectif était de déterminer si les sous-types de récepteurs β-adrénergiques (βAR) et leurs machineries de signalisation étaient fonctionnels et localisés à la membrane nucléaire des cardiomyocytes. Nous avons démontré la présence des β1AR et β3AR, mais pas du β2AR à la membrane nucléaire de myocytes ventriculaires adultes par immunobuvardage, par microscopie confocale, et par des essais fonctionnels. De plus, certains partenaires de signalisation comme les protéines GαS, Gαi, l’adénylate cyclase II, et V/VI y étaient également localisés. Les sous-types de βAR nucléaires étaient fonctionnels puisqu'ils pouvaient lier leurs ligands et activer leurs effecteurs. En utilisant des noyaux isolés, nous avons observé que l'agoniste non-sélectif isoprotérénol (ISO), et que le BRL37344, un ligand sélectif du β3AR, stimulaient l'initiation de la synthèse de l’ARN, contrairement à l'agoniste sélectif du β1AR, le xamotérol. Cette synthèse était abolie par la toxine pertussique (PTX). Cependant, la stimulation des récepteurs nucléaires de type B de l’endothéline (ETB) causaient une réduction de l'initiation de la synthèse d’ARN. Les voies de signalisations impliquées dans la régulation de la synthèse d’ARN par les RCPGs ont ensuite été étudiées en utilisant des noyaux isolés stimulés par des agonistes en présence ou absence de différents inhibiteurs des voies MAP Kinases (proteines kinases activées par mitogènes) et de la voie PI3K/PKB. Les protéines impliquées dans les voies de signalisation de p38, JNK, ERK MAP Kinase et PKB étaient présents dans les noyaux isolés. L'inhibition de PKB par la triciribine, inhibait la synthèse d’ARN. Nous avons ensuite pu mettre en évidence par qPCR que la stimulation par l’ISO entrainait une augmentation du niveau d'ARNr 18S ainsi qu’une diminution de l'expression d’ARNm de NFκB. En contraste, l’ET-1 n’avait aucun effet sur le niveau d’expression de l’ARNr 18S. Nous avons ensuite montré que la stimulation par l’ISO réduisait l’expression de plusieurs gènes impliqués dans l'activation de NFκB, tandis que l’inhibition de ERK1/2 et PKB renversait cet effet. Un microarray global nous a ensuite permis de démontrer que les βARs et les ETRs nucléaires régulaient un grand nombre de gènes distincts. Finalement, les βARs et ETRs nucléaires augmentaient aussi une production de NO de noyaux isolés, ce qui pouvait être inhibée par le LNAME. Ces résultats ont été confirmés dans des cardiomyocytes intacts en utilisant des analogues cagés et perméables d’ISO et de l'ET-1: l'augmentation de NO nucléaire détectée par DAF2-DA, causée par l'ET-1 et l'ISO, pouvait être prévenue par le LNAME. Finalement, l’augmentation de l’initiation de la transcription induite par l'ISO était aussi bloquée par le L-NAME ou par un inbitheur de PKG, le KT5823, suggérant que la voie NO-GC-PKG est impliquée dans la régulation de la transcription par les βAR. En conclusion, les βARs et les ETRs nucléaires utilisent des voies de signalisation différentes et exercent ainsi des effets distincts sur l’expression des gènes cardiaques. Ils représentent donc une avenue intéressante pour le développement de drogues pharmacologiques.

Conséquences d’une restriction de croissance intra-utérine sur la réactivité aortique chez le rat en fonction de l’âge et du sexe biologique

Antécédents. Le tonus vasculaire est régulé par plusieurs mécanismes et réagit à plusieurs composés endogènes et exogènes, dont les hormones circulantes et les substances vasoactives libérées par l’endothélium. Plusieurs études ont démontré que les femmes pré-ménopausées seraient moins à risque d’avoir des maladies cardiovasculaires que les hommes et que cette protection serait due aux hormones stéroïdiennes oestrogéniques. De plus, des études démontrent que les artères gagnent en rigidité avec l’âge différemment selon le sexe et que la restriction de croissance intra-utérine (RCIU) prédispose au développement de maladies cardiovasculaires à l’âge adulte différemment chez les hommes et chez les femmes. On a cherché à savoir si la réactivité vasculaire aortique dépend du sexe biologique, de l’âge et de l’environnement intra-utérin et si la rigidité aortique est différente entre les mâles et les femelles. Méthode. Des anneaux d’aorte thoracique de rats mâles ou femelles, témoins ou RCIU, de 5, 12 et 20 semaines avec endothélium ont été montés dans des bains à organe isolé. La contraction à des doses croissantes de phényléphrine (Phe) avec ou sans L-Name ainsi que la relaxation à des doses croissantes de carbachol (Cbc) ou de nitroprussiate de sodium (SNP) ont été enregistrées afin d’évaluer la réactivité vasculaire de l’aorte et de comparer les différents groupes. Des anneaux d’aorte thoracique de rats mâles et femelles âgés entre 13 et 17 semaines ont été utilisées pour évaluer la rigidité artérielle. Résultats. Chez les rats mâles seulement, la contraction maximale à la Phe en absence et en présence du L-Name est augmentée à 20 semaines chez les témoins et à 12 et 20 semaines chez les RCIU. Chez les femelles, la contraction maximale n’est pas affectée par l’âge et la RCIU. Par contre, un effet du L-Name est observé à l’âge adulte, autant chez les femelles témoins que RCIU. L’effet du L-Name est plus prononcé chez les femelles que chez les mâles. Dans tous les groupes RCIU, la relaxation maximale au Cbc est réduite. Par contre, aucune différence entre les différents groupes n’est observée avec le SNP et aucune différence de rigidité n’est observée entre les mâles et les femelles. Conclusion. Les résultats au L-Name suggèrent un rôle plus important du NO chez les femelles et les résultats à la Phe suggèrent que les mâles sont plus réactifs aux stimulis vasoconstricteurs avec l’âge et que ceci est encore plus prononcé lorsque l’environnement intra-utérin a été défavorable. La différence de contraction maximale entre les mâles et les femelles n’est pas due à la rigidité artérielle.

Réduction d'expansion volumique au cours de la gestation : conséquence sur la circulation utéro-placentaire.

La grossesse est caractérisée par une augmentation du volume circulant maternel et du débit sanguin afin de subvenir aux besoins croissants du foetus. En diminuant l'expansion volumique maternelle, nous avons développé un modèle de restriction de croissance intra-utérine (RCIU) chez la rate dans lequel on observe une diminution du diamètre des artères utérines arquées ainsi qu'une diminution de la réponse à l'angiotensine II. Nous avons émis l'hypothèse que comparativement aux rates normales, les vaisseaux utérins des rates RCIU présentent une dysfonction des mécanismes de relaxation dépendant de l'endothélium lors de la réponse à des agents vasoactifs. Notre objectif était de caractériser l'influence de l'endothélium sur la régulation de la réactivité des artères utérines radiales dans notre modèle RCIU. À l'aide d'un myographe pressurisé, des courbes de concentration-réponse à des agents vasoactifs (Phényléphrine (Pe), Carbachol (Cbc) et Nitroprussiate de sodium (SNP)) ont été effectuées, en présence ou en absence d'inhibiteurs des voies principales de la relaxation dépendante de l'endothélium (monoxyde d'azote (NO), prostacycline (PGI2) et facteurs hyperpolarisants dépendant de l'endothélium (EDHF)). Nous avons ainsi démontré que les artères utérines radiales des rates RCIU ont un diamètre plus petit que celles des rates contrôles. Une utilisation plus grande du NO dans la réponse dilatatrice au Cbc a été observée chez les rates RCIU. De plus, l'inhibition de la voie de l'EDHF par l'ajout de KCl aux inhibiteurs de la voie du NO (L-NAME) et des PGI2 (Ibuprofène) bloque presque complètement la relaxation au Cbc chez les deux groupes. En conclusion, dans les artères utérines radiales des deux groupes, il y a une participation importante de l'EDHF lors de la dilatation au Cbc. De plus, dans notre modèle RCIU, la voie du NO est activée, probablement afin de compenser la diminution du diamètre des artères et la réduction de la perfusion utérine.