Dose-dependent protection of reseveratrol against spinal cord ischemic-reperfusion injury in rats

Purpose: To examine the protective effects of resveratrol (RESV) against spinal cord ischemic reperfusion (SCIR) injury. Methods: Forty-eight male rats were divided into six groups: sham-operated (control-I), SCIR-treated (SCIR-II), rats receiving 20 mg/kg of RESV with SCIR (RESV 20+SCIR-III), rats receiving 40 mg/kg of RESV with SCIR (RESV 40+SCIR-IV), rats receiving 60 mg/kg of RESV with SCIR (RESV 60+SCIR-V), and rats receiving 50 mg/kg of methylprednisolone (MP) with SCIR (MP + SCIR-VI), for 7 days prior to IR (pre-treatment) and 7 days after IR (post-treatment). Results: The levels of oxidative markers (TBARS, MPO) and inflammatory markers (IL-1β, IL-6, TNF-α, and NF-p65) were concomitantly suppressed in RESV-treated rats, which showed improved locomotor function. A pronounced increase in the activities of antioxidant enzymes (SOD, CAT and GSH) was noted in the RESV group compared with the MP and SCIR groups. RESV and MP supplementation increased neuronal count with decreased nuclear degeneration. RESV (40 mg) exhibited greater protective effect than 20 mg and 60 mg of RESV and 50 mg of MP. Conclusion: The results show the neurotherapeutic potential of RESV (40 mg) to attenuate oxidative stress and the inflammatory response to SCIR injury.

Bcl-X(L) translocation in renal tubular epithelial cells in vitro protects distal cells from oxidative stress

BACKGROUND: The molecular pathogenesis of different sensitivities of the renal proximal and distal tubular cell populations to ischemic injury, including ischemia-reperfusion (IR)-induced oxidative stress, is not well-defined. An in vitro model of oxidative stress was used to compare the survival of distal [Madin-Darby canine kidney (MDCK)] and proximal [human kidney-2 (HK-2)] renal tubular epithelial cells, and to analyze for links between induced cell death and expression and localization of selected members of the Bcl-2 gene family (anti-apoptotic Bcl-2 and Bcl-X(L), pro-apoptotic Bax and Bad). METHODS: Cells were treated with 1 mmol/L hydrogen peroxide (H2O2) or were grown in control medium for 24 hours. Cell death (apoptosis) was quantitated using defined morphological criteria. DNA gel electrophoresis was used for biochemical identification. Protein expression levels and cellular localization of the selected Bcl-2 family proteins were analyzed (Western immunoblots, densitometry, immunoelectron microscopy). RESULTS: Apoptosis was minimal in control cultures and was greatest in treated proximal cell cultures (16.93 +/- 4.18% apoptosis) compared with treated distal cell cultures (2.28 +/- 0.85% apoptosis, P < 0.001). Endogenous expression of Bcl-X(L) and Bax, but not Bcl-2 or Bad, was identified in control distal cells. Bcl-X(L) and Bax had nonsignificant increases (P> 0.05) in these cells. Bcl-2, Bax, and Bcl-X(L), but not Bad, were endogenously expressed in control proximal cells. Bcl-X(L) was significantly decreased in treated proximal cultures (P < 0.05), with Bax and Bcl-2 having nonsignificant increases (P> 0.05). Immunoelectron microscopy localization indicated that control and treated but surviving proximal cells had similar cytosolic and membrane localization of the Bcl-2 proteins. In comparison, surviving cells in the treated distal cultures showed translocation of Bcl-X(L) from cytosol to the mitochondria after treatment with H2O2, a result that was confirmed using cell fractionation and analysis of Bcl-X(L) expression levels of the membrane and cytosol proteins. Bax remained distributed evenly throughout the surviving distal cells, without particular attachment to any cellular organelle. CONCLUSION: The results indicate that in this in vitro model, the increased survival of distal compared with proximal tubular cells after oxidative stress is best explained by the decreased expression of anti-apoptotic Bcl-X(L) in proximal cells, as well as translocation of Bcl-X(L) protein to mitochondria within the surviving distal cells.

Dynamic, invivo, real-time detection of retinal oxidative status in a model of elevated intraocular pressure using a novel, reversibly responsive, profluorescent nitroxide probe

Changes to the redox status of biological systems have been implicated in the pathogenesis of a wide variety of disorders including cancer, Ischemia-reperfusion (I/R) injury and neurodegeneration. In times of metabolic stress e.g. ischaemia/reperfusion, reactive oxygen species (ROS) production overwhelms the intrinsic antioxidant capacity of the cell, damaging vital cellular components. The ability to quantify ROS changes in vivo, is therefore essential to understanding their biological role. Here we evaluate the suitability of a novel reversible profluorescent probe containing a redox-sensitive nitroxide moiety (methyl ester tetraethylrhodamine nitroxide, ME-TRN), as an in vivo, real-time reporter of retinal oxidative status. The reversible nature of the probe's response offers the unique advantage of being able to monitor redox changes in both oxidizing and reducing directions in real time. After intravitreal administration of the ME-TRN probe, we induced ROS production in rat retina using an established model of complete, acute retinal ischaemia followed by reperfusion. After restoration of blood flow, retinas were imaged using a Micron III rodent fundus fluorescence imaging system, to quantify the redox-response of the probe. Fluorescent intensity declined during the first 60 min of reperfusion. The ROS-induced change in probe fluorescence was ameliorated with the retinal antioxidant, lutein. Fluorescence intensity in non-Ischemia eyes did not change significantly. This new probe and imaging technology provide a reversible and real-time response to oxidative changes and may allow the in vivo testing of antioxidant therapies of potential benefit to a range of diseases linked to oxidative stress

Role of thrombin in coronary artery bypass grafting

Thrombin is a multifunctional protease, which has a central role in the development and progression of coronary atherosclerotic lesions and it is a possible mediator of myocardial ischemia-reperfusion injury. Its generation and procoagulant activity are greatly upregulated during cardiopulmonary bypass (CPB). On the other hand, activated protein C, a physiologic anticoagulant that is activated by thrombomodulin-bound thrombin, has been beneficial in various models of ischemia-reperfusion. Therefore, our aim in this study was to test whether thrombin generation or protein C activation during coronary artery bypass grafting (CABG) associate with postoperative myocardial damage or hemodynamic changes. To further investigate the regulation of thrombin during CABG, we tested whether preoperative thrombophilic factors associate with increased CPB-related generation of thrombin or its procoagulant activity. We also measured the anticoagulant effects of heparin during CPB with a novel coagulation test, prothrombinase-induced clotting time (PiCT), and compared the performance of this test with the present standard of laboratory-based anticoagulation monitoring. One hundred patients undergoing elective on-pump CABG were studied prospectively. A progressive increase in markers of thrombin generation (F1+2), fibrinolysis (D-dimer), and fibrin formation (soluble fibrin monomer complexes) was observed during CPB, which was further distinctly propagated by reperfusion after myocardial ischemia, and continued to peak after the neutralization of heparin with protamine. Thrombin generation during reperfusion after CABG associated with postoperative myocardial damage and increased pulmonary vascular resistance. Activated protein C levels increased only slightly during CPB before the release of the aortic clamp, but reperfusion and more significantly heparin neutralization caused a massive increase in activated protein C levels. Protein C activation was clearly delayed in relation to both thrombin generation and fibrin formation. Even though activated protein C associated dynamically with postoperative hemodynamic performance, it did not associate with postoperative myocardial damage. Preoperative thrombophilic variables did not associate with perioperative thrombin generation or its procoagulant activity. Therefore, our results do not favor routine thrombophilia screening before CABG. There was poor agreement between PiCT and other measurements of heparin effects in the setting of CPB. However, lower heparin levels during CPB associated with inferior thrombin control and high heparin levels during CPB associated with fewer perioperative transfusions of blood products. Overall, our results suggest that hypercoagulation after CABG, especially during reperfusion, might be clinically important.

Inhibition of Thrombin in Cardiac Surgery : experiments in a porcine model

Cardiac surgery involving cardiopulmonary bypass (CPB) induces activation of inflammation and coagulation systems and is associated with ischemia-reperfusion injury (I/R injury)in various organs including the myocardium, lungs, and intestine. I/R injury is manifested as organ dysfunction. Thrombin, the key enzyme of coagulation , plays a cenral role also in inflammation and contributes to regulation of apoptosis as well. The general aim of this thesis was to evaluate the potential of thrombin inhibition in reducing the adverse effects of I/R injury in myocardium, lungs, and intestine associated with the use of CPB and cardiac surgery. Forty five pigs were used for the studies. Two randomized blinded studies were performed. Animals underwent 75 min of normothermic CPB, 60 min of aortic clamping, and 120 min of reperfusion period. Twenty animals received iv. recombinant hirudin, a selective and effective inbitor of thrombin, or placebo. In a similar setting, twenty animals received an iv-bolus (250 IU/kg) of antithrombin (AT) or placebo. An additional group of 5 animals received 500 IU/kg in an open label setting to test dose response. Generation of thrombin (TAT), coagulation status (ACT), and hemodynamics were measured. Intramucosal pH and pCO2 were measured from the luminal surface of ileum using tonometry simultaneusly with arterial gas analysis. In addition, myocardial, lung, and intestinal biopsies were taken to quantitate leukocyte infiltration (MPO), for histological evaluation, and detection of apoptosis (TUNEL, caspase 3). In conclusion, our data suggest that r-hirudin may be an effective inhibitor of reperfusion induced thrombin generation in addition to being a direct inhibitor of preformed thrombin. Overall, the results suggest that inhibition of thrombin, beyond what is needed for efficient anticoagulation by heparin, has beneficial effects on myocardial I/R injury and hemodynamics during cardiac surgery and CPB. We showed that infusion of the thrombin inhibitor r-hirudin during reperfusion was associated with attenuated post ischemia left ventricular dysfunction and decreased systemic vascular resistance. Consequently microvascular flow was improved during ischemia-reperfusion injury. Improved recovery of myocardium during the post-ischemic reperfusion period was associated with significantly less cardiomyocyte apoptosis and with a trend in anti-inflammatory effects. Thus, inhibition of reperfusion induced thrombin may offer beneficial effects by mechanisms other than direct anticoagulant effects. AT, in doses with a significant anticoagulant effect, did not alleviate myocardial I/R injury in terms of myocardial recovery, histological inflammatory changes or post-ischemic troponin T release. Instead, AT attenuated reperfusion induced increase in pulmonary pressure after CPB. Taken the clinical significance of postoperative pulmonary hemodynamics in patients undergoing cardiopulmonary bypass, the potential positive regulatory role of AT and clinical implications needs to be studied further. Inflammatory response in the gut wall proved to be poorly associated with perturbed mucosal perfusion and the animals with the least neutrophil tissue sequestration and I/R related histological alterations tended to have the most progressive mucosal hypoperfusion. Thus, mechanisms of low-flow reperfusion injury during CPB can differ from the mechanisms seen in total ischemia reperfusion injury.

Papel dos receptores β-adrenérgicos no reparo cutâneo de lesões crônicas em camundongos: modelo não invasivo de lesão por isquemia e reperfusão

Os receptores β1- e β2-adrenérgicos estão presentes em inúmeras células que participam do processo de reparo como fibroblastos, queratinócitos, células inflamatórias e células endoteliais. Diversos trabalhos demonstram que estes receptores modulam o processo de reparo tecidual. Entretanto, nenhum trabalho demonstrou se o bloqueio destes receptores compromete o reparo de úlceras de pressão. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito do bloqueio dos receptores β1- e β2-adrenérgicos no reparo de úlceras de pressão em camundongos, para isto utilizamos um modelo não invasivo de lesão por isquemia e reperfusão. No presente estudo, utilizamos animais que foram tratados por gavagem com propranolol (um antagonista não seletivo dos receptores β1- e β2-adrenérgicos). A administração do antagonista teve início um dia antes do início dos ciclos de isquemia e reperfusão e se manteve diariamente até a eutanásia. Para desenvolver a úlcera de pressão, um par de magnetos foi aplicado no dorso dos animais previamente depilado. O período de permanência do magneto é caracterizado como período de isquemia, enquanto sua retirada é caracterizada como período de reperfusão. Os ciclos de isquemia e reperfusão foram repetidos duas vezes, e ao final do último ciclo, duas úlceras circulares foram criadas no dorso dos animais. Os animais foram mortos 3, 7, 14 e 21 dias após a lesão. Após o último ciclo de isquemia, o fluxo sanguíneo da área comprimida foi nulo, 7 horas após a compressão o fluxo sanguíneo estava elevado, com níveis superiores ao da pele normal. Após 24 e 48 horas, o fluxo sanguíneo estava reduzido e abaixo dos níveis da pele normal. O bloqueio dos receptores β1- e β2-adrenérgicos aumentou os níveis de peróxidos lipídicos 3 dias após a lesão, comprometeu a migração dos queratinócitos, levando a um aumento da proliferação epitelial, resultando em uma re-epitelização atrasada. O retardo na formação da neo-epiderme induzido pelo bloqueio destes receptores prejudicou a remoção do tecido necrótico. O bloqueio dos receptores β1- e β2-adrenérgicos aumentou o número de células inflamatórias (neutrófilos e macrófagos), os níveis proteicos de elastase neutrofílica 3 dias após a lesão e reduziu os níveis proteicos de MCP-1 3 dias após a lesão e os níveis proteicos de MMP-12 7 dias após a lesão. O bloqueio dos receptores β1- e β2-adrenérgicos aumentou a proliferação celular e apoptose no tecido conjuntivo 7 dias após a lesão e aumentou a densidade de vasos sanguíneos 14 e 21 dias após a lesão. O bloqueio dos receptores β1- e β2-adrenérgicos retardou a diferenciação miofibroblástica e reduziu os níveis proteicos de TGF-β 1/2/3 3 dias após a lesão e a contração da lesão. Vinte e um dias após a lesão, o bloqueio dos receptores β1- e β2-adrenérgicos aumentou a espessura da neo-epiderme e a expressão de tenascina-C em fibroblastos e reduziu a deposição de colágeno. Em conclusão, o bloqueio dos receptores β1- e β2-adrenérgicos atrasa o reparo tecidual em úlceras de pressão.

Hemodinâmica cardíaca e o metabolismo energético mitocondrial de camundongos adultos hiperalimentados na lactação

O desequilíbrio nutricional no início da vida leva ao desenvolvimento da obesidade, diabetes e doenças cardiovasculares na idade adulta. Este estudo teve como objetivo analisar os efeitos a longo prazo da hiperalimentação na lactação por meio do modelo de redução da ninhada na hemodinâmica e bioenergética cardíaca. Vinte e quatro camundongos machos Swiss adultos foram divididos em dois grupos (controle e hiperalimentado) submetidos a duas condições (linha de base e isquemia/reperfusão) formando quatro grupos no total: grupo controle linha de base (GCLB), grupo controle isquemia/reperfusão (GCIR), grupo hiperalimentado linha de base (GHLB) e o grupo hiperalimentado isquemia/reperfusão (GHIR), todos com seis camundongos/grupo. As alterações cardíacas foram analisadas por meio da hemodinâmica cardíaca, da respiração mitocondrial e da biologia molecular. Os parâmetros hemodinâmicos analisados foram a velocidade de contração (Max dP/dt), a velocidade de relaxamento (Min dP/dt), o tempo de relaxamento cardíaco isovolumétrico (Tau) e os batimentos por minuto (BPM). A respiração mitocondrial foi avaliada por meio da razão do controle respiratório (RCR) na oxidação de carboidratos e ácidos gordos, e finalmente, a biologia molecular, através de proteínas-chave como a proteína quinase B (AKT), a proteína quinase ativada por adenosina monofosfato (AMPK), a carnitina palmitoil transferase 1 (CPT-1), a proteína desacopladora 2 (UCP2), o 4-hidroxinonenal (4-HNE) e a gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH). Os camundongos do GH desenvolveram maior peso corporal (30,95%, P<0,001), gordura epididimal (68,64%, P<0,001), gordura retroperitoneal (109,38%, P<0,01) e glicemia de jejum (19,52%, P<0,05) comparados aos do GC. Os parâmetros Max dP/dt e BPM apresentaram diminuição no GHIR quando comparado ao GHLB (P<0,001 e P<0,05). O parâmetro Min dP/dt apresentou-se reduzido no GCIR e GHIR quando comparado aos grupos GCLB e GCLB (P<0,05; P<0,0001 respectivamente). Camundongos do GHIR apresentaram redução do Tau quando comparado aos grupos GCIR e GHLB (P<0,0001). Estes desequilíbrios na hemodinâmica cardíaca foram associados a função mitocondrial, uma vez que, o GHLB apresenta a RCR reduzida para oxidação de ácidos graxos e carboidratos (P<0,05 e P<0,01, respectivamente) e o GHIR apenas na oxidação dos ácidos graxos (P<0,01). Além disso, o GHIR apresentou diversas alterações nas proteínas-chave do metabolismo energético cardíaco, como diminuição do conteúdo de AKT (P<0,05) e aumento do conteúdo de CPT-1 (P<0,05), 4-HNE (P<0,05) e GAPDH (P<0,05) quando comparado ao CGIR. Finalmente, a expressão do mRNA para CPT1, GAPDH e UCP2 foi aumentada no GHIR quando comparado aos GCIR (P<0,05) e GHLB (P<0,05). A expressão de mRNA para UCP2 e CPT-1 foi reduzida no GCIR quando comparado ao GCLB (P<0,01 e P<0,05, respectivamente). O estudo apresenta resultados consistentes, demonstrando efeitos deletérios sobre o metabolismo cardíaco adulto resultante de alterações nutricionais durante a lactação.

Efeito do pré-condicionamento isquêmico remoto em modelo de lesão hepática por isquemia-reperfusão em ratos

A lesão por isquemia-reperfusão (I/R) é o mecanismo fisiopatológico central no desenvolvimento da insuficiência hepática pós-operatória. Diversas estratégias para minimizar suas consequências estão sendo desenvolvidas, mas ainda sem resultados satisfatórios. Recentemente o pré-condicionamento isquêmico remoto (PCIR), método em que ciclos breves de I/R aplicados em um órgão ou membro é capaz de atenuar os resultados da I/R em um órgão distante, vem sendo utilizado, em modelos experimentais, com resultados promissores. No entanto seu mecanismo de ação ainda não foi esclarecido. Um dos mecanismos propostos é a modulação na expressão das citocinas sintetizadas durante a resposta inflamatória que acompanha o processo de I/R. Foram utilizados 36 ratos (Rattus norvegicus), machos, com peso entre 250 e 280 g, divididos em três grupos: Grupo Sham, cirurgia simulada; Grupo IR, isquemia de 70% do fígado por 45 minutos e reperfusão; e Grupo PCIR, pré-condicionamento isquêmico remoto do fígado através de seis ciclos de isquemia-reperfusão da pata do animal, com quatro minutos de isquemia e quatro minutos de reperfusão em cada ciclo, seguido de isquemia hepática semelhante ao do Grupo IR. Terminado os procedimentos cirúrgicos, metade dos animais foi morta decorridos 60 minutos de reperfusão, e a outra metade após 180 minutos. Foi coletado tecido hepático do lobo submetido à isquemia, para estudo histopatológico, utilizando o índice de injúria hepática modificado; e sangue, para dosagem plasmática de TNF-α, IL-6, IL-10 e ALT. A análise histopatológica mostrou que a necrose celular foi significativamente reduzida no Grupo PCIR quando comparado com Grupo IR (p <0,0001). As transaminases mostraram o mesmo padrão com redução significativa dos seus valores no Grupo PCIR quando comparados com o Grupo I-R (p <0,0001). A dosagem das interleucinas mostrou redução significativa na expressão da IL-6 no Grupo PCIR quando comparado com o Grupo IR (p<0,001). Houve aumento da expressão de IL-10 nos grupo PCIR, porém não atingiu significância estatística. Não foi identificada diferença na dosagem de TNF-α nos grupos estudados. O PCI-R foi eficaz na redução na necrose celular resultante da lesão por I-R nos grupos estudados. A redução na síntese de IL-6 segue o padrão observado em outros estudos.

Efeitos de modificação dietética associada ou não a uma rotina de exercícios aeróbicos na microcirculação em modelo animal de obesidade exógena

A obesidade atinge proporções epidêmicas em países industrializados e está relacionada a uma série de doenças metabólicas e circulatórias. Nesse contexto, a atividade física, tratamento não farmacológico da obesidade, acessível a diversas populações e está relacionada com a redução do risco cardiovasvascular mesmo. O objetivo deste trabalho foi avaliar, após mudança ou não da dieta, associação ou não a um programa de treinamento aeróbico (PTA) durante 8 semanas, a possível reversibilidade dos danos causados por uma dieta hiperlipídica por 12 semanas. Para tal, 120 hamsters machos da espécie Mesocricetus auratus, com massa corporal de 60 g, foram distribuídos em quatro grupos, cada um subdividido em três subgrupos, com dez animais para diferentes análises. Os grupos Obeso Controle (OBC) e Obeso Exercitado (OBEX) receberam a ração hiperlipídica por 20 semanas, com adição do PTA ao grupo OBEX nas últimas 8 semanas. Os Obeso Ração Padrão (OBRP) e Obeso Ração Padrão/Exercício (OBRP/EX) tiveram a ração modificada para comercial padrão e adição do PTA ao grupo OBRP/EX após as 12 semanas iniciais. Para as análises microcirculatórias, a bolsa da bochecha foi usada para determinação do número máximo de extravasamentos induzidos por 30 min de isquemia seguida de reperfusão e da reatividade microvascular após a aplicação tópica de acetilcolina e nitroprussiato de sódio. No sangue coletado foi avaliado o perfil lipídico, glicemias quinzenais e leptina. As expressões de eNOS e iNOS foram determinadas na aorta por imunoblotting e a composição corporal avaliada nos tecidos adiposos visceral, urogenital e retroperitoneal, retirados no dia do experimento. Os resultados foram analisados com os métodos o teste estatístico de análise de variância (One Way ANOVA - Teste de Kruskal-Wallis), seguido pelo pós-teste de Dunn. Resultados mostram que a modificação dietética, associada ou não ao PTA, reduziu significativamente a massa corporal (p<0,0001), comprimento naso-anal (p=0,0011) e tecido adiposo (visceral [p<0,0001], urogenital [p=0.0004] e retroperitoneal [p= 0,0083]). Nas análises sanguíneas não foram encontradas diferenças com relação ao perfil lipídico e glicemia, já na leptina houve uma redução significativa (p=0,0039). A análise da reatividade microvascular mostrou melhora significativa na vasodilatação endotélio-dependente nos grupos submetidos à modificação dietética associada ou não ao PTA. Nas medidas de permeabilidade a macromoléculas houve redução significativa no número de extravasamentos nos grupos submetidos à modificação dietética associada ou não ao PTA, (5 min [p= 0,0207] e 10 min [p= 0,0057]). Houve um aumento na expressão de eNOS nos grupos submetidos à modificação dietética associada ou não ao PTA, em comparação ao grupo OBC (p=0,0352). Os resultados mostraram que a modificação dietética, associada ao protocolo de treinamento aeróbico melhora a vasodilatação endotélio-dependente, aumenta a expressão da óxido nítrico sintase endotelial e reduz o número de extravasamentos induzidos por isquemia e reperfusão, mesmo sem melhoras nos marcadores bioquímicos tradicionais como glicemia e perfil lipídico.

Avaliação dos testículos de ratos submetidos à torção testicular antes, durante e após a puberdade, e o efeito do tratamento com L-arginina

Torção testicular (TT) é uma síndrome urológica comumente encontrada em recém nascidos, crianças e adolescentes. Neste trabalho foi estudada as lesões morfológicas e a função reprodutiva em ratos adultos que sofreram TT, em diferentes idades de maturidade sexual e o efeito protetor da L-arginina, contra os danos causados pela isquemia/reperfusão na torção testicular. Dezoito ratos pré-púberes (4 semanas de vida) dezessete púberes (6 semanas de vida) e dezessete adultos (9 semanas de vida) foram submetidos à TT. Sob anestesia o testículo direito foi rotacionado em 720 e fixado, sendo então destorcido após 4 horas. Vinte e quatro ratos (ARG4, n=8, ARG6, n=8 e ARG9 n=8) foram submetidos ao tratamento com 650mg/kg de L-arginina, por via oral, durante 7 dias. Outros trinta ratos de mesma idade sofreram cirurgia simulada (SH4, n=10, SH6, n=10 e SH9, n=10). Com 12 semanas de idade, foram submetidos ao acasalamento controlado com 3 fêmeas e ao vigésimo dia de gestação o número de fetos, corpos lúteos, absorções e implatações foram contados. Na 14 semana, os ratos foram mortos e os espermatozóides coletados da cauda dos epidídimos, foi anotado o peso corporal, o peso e volume testicular. O soro foi usado para dosagem de testosterona. Foram avaliadas a concentração, motilidade e a viabilidade espermática. Os testículos coletados foram fixados em Bouin, pós-fixados em formalina e processados em parafina. Utilizando o programa de imagem Image J, lâminas coradas com HE, mensuramos a altura do epitélio, densidade volumétrica e diâmetro do túbulo seminífero. Para avaliar a integridade do epitélio seminífero foi utilizado a frequência dos estágios do ciclo do epitélio e o escorre de Johnsen. Também foi avaliado a proliferação do compartimento tubular e intertubular, através da imunomarcação com PCNA. Os dados foram tabulados e as médias dos grupos comparadas pelo teste de ANOVA com pós-teste de Bonferroni ou teste de Kruskal-Wallis com pós teste de Dunns (programa Graphpad Prism, com p < 0,05). Os resultados revelaram grandes danos produzidos pela injuria testicular, no testículo ipsilateral, com diminuição da capacidade reprodutiva, da concentração, viabilidade e mobilidade, do peso e volume testicular. Animais TT9 não apresentaram espermatozoides nas amostras coletas. Houve diminuição do diâmetro dos túbulos seminíferos e da altura do epitélio, aumento do compartimento intertubular, com ênfase dos vasos sanguíneos, aumento da proliferação celular estromal e diminuição da proliferação epitelial. Houve diminuição da concentração sérica de testosterona no grupo TT4, quando comparado como grupo TT9. Em geral, os animais submetidos à torção na fase adulta foram os mais acometidos. Não foram encontradas alterações dignas de nota, nos testículo contralaterais. Animais tratados com L-arginina obtiveram melhora dos índices reprodutivos, com aumento da potência em todas as idades. Houve aumento da concentração espermática no testículo contralateral de ARG4 e ARG6, mostrando que a L-arginina atuou como antioxidante. Não houve proteção para as lesões causadas pela torção na maioria dos grupos, mas os animais tratados ARG9 apresentaram concentração espermática mensuravel, quando comparados aos ratos TT9, que tinham azospermia.

Avaliação estereológica glomerular em rins de ratos após isquemia-reperfusão por clampeamento arteriovenoso e arterial

A técnica de isquemia-reperfusão tem sido utilizada em cirurgias conservadoras do rim como a nefrectomia parcial e em transplantes renais. Para se realizar a isquemia pode-se fazer o bloqueio do fluxo sanguíneo da artéria renal ou o bloqueio simultâneo da artéria e da veia renal. O evento isquêmico acarreta em dano celular ao rim principalmente pelo estresse oxidativo local e a liberação de radicais livres assim como o aumento da resposta inflamatória. Diversos autores verificaram lesão renal após a isquemia-reperfusão, porém, apenas testes funcionais foram realizados até o momento. Os autores que tentaram avaliar a lesão morfológica do rim apenas fizeram a quantificação de escores subjetivos. O nosso objetivo é avaliar por quantificação estereológica o dano causado pela isquemia-reperfusão comparando o clampeamento somente arterial com o clampeamento arteriovenoso. Utilizamos 24 ratos wistar, machos, de quatro meses de idade. Os animais foram divididos em três grupos: o grupo Sham (n=8), o grupo de clampeamento somente da artéria renal (n=8) e o grupo de clampeamento simultâneo da artéria e da veia renal (n=8). Os animais foram submetidos a laparotomia mediana. Os animais do grupo Sham permaneceram os 60 minutos anestesiados mas sem obstrução do fluxo sanguíneo de seus vasos renais. Os animais do grupo de clampeamento arterial foram submetidos à clampeamento de sua arterial renal esquerda por 60 minutos e os animais do grupo de clampeamento arterial e venoso tiveram seus vasos renais esquerdos clampeados simultaneamente e em bloco pelo mesmo tempo. Após os 60 minutos os animais foram suturados e mantidos por 30 dias em caixas próprias sendo mortos por sobredose anestésica após decorrido esse tempo. Os rins foram coletados e mantidos em solução de formalina tamponada e posteriormente processados para análise histológica e estereológica. Foram analisados a densidade volumétrica (Vv) dos glomérulos, o número de glomérulos/mm3(Nv) e o volume glomerular médio (VGM). A Vv e Nv se encontrou reduzida nos rins esquerdos submetidos à isquemia mas foi somente significativa nos animais do grupo de clampeamento arterial e venoso. Mesmo usando o rato como modelo animal experimental, a partir de nossos resultados recomendamos o uso do clampeamento somente arterial nos casos em que mínina lesão ao rim é imperiosa.

Effects of aniracetam on extracellular levels of transmitter amino acids in the hippocampus of the conscious gerbils: an intracranial microdialysis study

The effects of aniracetam on extracellular amino acid levels in the hippocampus of conscious gerbils, with or without transient cerebral ischemia/reperfusion, were measured by microdialysis and reverse phase-high performance liquid chromatography. Increased extracellular levels of aspartate and glutamate that were observed in the hippocampus of conscious gerbils during transient global forebrain ischemia were reversed by aniracetam. In contrast, the level of extracellular gamma-aminobutyric acid was increased, while taurine was maintained at a higher level than other amino acids by administration of aniracetam (100 mg/kg, p.o.) 60 min before ischemia. Further, in contrast to ischemic animals, administration of aniracetam (100 mg/kg, p.o.) enhanced the release of glutamate and aspartate in the normal gerbil hippocampus. The results suggest that these effects might be due to a partial calcium agonist activity of aniracetam, and that the effects of aniracetam on amino acid levels might be a mechanism of protection against delayed neuronal death in the ischemic hippocampus, thereby improving memory dysfunction induced by ischemia/reperfusion. (C) 2003 Elsevier Science Ireland Ltd. All rights reserved.

C-Kit(+) Cells Isolated from Developing Kidneys Are a Novel Population of Stem Cells with Regenerative Potential

The presence of tissue specific precursor cells is an emerging concept in organ formation and tissue homeostasis. Several progenitors are described in the kidneys. However, their identity as a true stem cell remains elusive. Here, we identify a neonatal kidney-derived c-kit(+) cell population that fulfills all of the criteria as a stem cell. These cells were found in the thick ascending limb of Henle's loop and exhibited clonogenicity, self-renewal, and multipotentiality with differentiation capacity into mesoderm and ectoderm progeny. Additionally, c-kit(+) cells formed spheres in nonadherent conditions when plated at clonal density and expressed markers of stem cells, progenitors, and differentiated cells. Ex vivo expanded c-kit(+) cells integrated into several compartments of the kidney, including tubules, vessels, and glomeruli, and contributed to functional and morphological improvement of the kidney following acute ischemia-reperfusion injury in rats. Together, these findings document a novel neonatal rat kidney c-kit(+) stem cell population that can be isolated, expanded, cloned, differentiated, and used for kidney repair following acute kidney injury. These cells have important biological and therapeutic implications. STEM Cells 2013;31:1644-1656

Superoxide dismutase mimics: chemistry, pharmacology, and therapeutic potential.

Oxidative stress has become widely viewed as an underlying condition in a number of diseases, such as ischemia-reperfusion disorders, central nervous system disorders, cardiovascular conditions, cancer, and diabetes. Thus, natural and synthetic antioxidants have been actively sought. Superoxide dismutase is a first line of defense against oxidative stress under physiological and pathological conditions. Therefore, the development of therapeutics aimed at mimicking superoxide dismutase was a natural maneuver. Metalloporphyrins, as well as Mn cyclic polyamines, Mn salen derivatives and nitroxides were all originally developed as SOD mimics. The same thermodynamic and electrostatic properties that make them potent SOD mimics may allow them to reduce other reactive species such as peroxynitrite, peroxynitrite-derived CO(3)(*-), peroxyl radical, and less efficiently H(2)O(2). By doing so SOD mimics can decrease both primary and secondary oxidative events, the latter arising from the inhibition of cellular transcriptional activity. To better judge the therapeutic potential and the advantage of one over the other type of compound, comparative studies of different classes of drugs in the same cellular and/or animal models are needed. We here provide a comprehensive overview of the chemical properties and some in vivo effects observed with various classes of compounds with a special emphasis on porphyrin-based compounds.

CARBON MONOXIDE AND PREGNANCY: A SEARCH FOR A POSSIBLE THERAPEUTIC IN THE TREATMENT OF PRE-ECLAMPSIA

Pre-eclampsia (PE) is a pregnancy disorder that affects roughly 5-7% of all pregnancies and is a leading cause of both maternal and fetal/neonatal morbidity and mortality. With no present cure for the disease, researchers are interested in the lower incidence of PE observed among the cigarette smoking pregnant population. However, women who use smokeless tobacco do not experience the same decreased incidence of PE, leading to hypothesis of protection against PE from the largest combustible product of cigarette smoke, carbon monoxide (CO). Studies evaluated levels of CO in PE women and found that they were statistically lower than those of healthy pregnancy. Researchers have found CO to possess many cytoprotective and regulatory properties and specifically within the placenta, it has been found to increase perfusion pressure, decrease oxidative stress, decreases ischemia/reperfusion induced apoptosis and maintain endothelial functioning. The idea for use of CO as a possible therapeutic for PE has thus become a real possibility. This study determined CO levels in pregnant women ± smoking as well as in PE women±smoking, as to discover a possible therapeutic range for future treatments. The best correlated automated CO measurement device with blood CO levels was determined, for use in future clinical studies. This thesis also sought a possible CO delivery concentration, in order to achieve the CO levels observed in the human correlation study. A threshold level of maternal CO exposure in a murine animal model was found, for which fetal and maternal negative toxicities were not observed. The results of this thesis lend a few more pieces to the complicated puzzle involving CO and PE and offer another step toward the possibility of a therapeutic treatment/prevention using this gaseous molecule.