Transcriptional functions of DNA Topoisomerases at a genome-wide scale and a single gene levels

The DNA topology is an important modifier of DNA functions. Torsional stress is generated when right handed DNA is either over- or underwound, producing structural deformations which drive or are driven by processes such as replication, transcription, recombination and repair. DNA topoisomerases are molecular machines that regulate the topological state of the DNA in the cell. These enzymes accomplish this task by either passing one strand of the DNA through a break in the opposing strand or by passing a region of the duplex from the same or a different molecule through a double-stranded cut generated in the DNA. Because of their ability to cut one or two strands of DNA they are also target for some of the most successful anticancer drugs used in standard combination therapies of human cancers. An effective anticancer drug is Camptothecin (CPT) that specifically targets DNA topoisomerase 1 (TOP 1). The research project of the present thesis has been focused on the role of human TOP 1 during transcription and on the transcriptional consequences associated with TOP 1 inhibition by CPT in human cell lines. Previous findings demonstrate that TOP 1 inhibition by CPT perturbs RNA polymerase (RNAP II) density at promoters and along transcribed genes suggesting an involvement of TOP 1 in RNAP II promoter proximal pausing site. Within the transcription cycle, promoter pausing is a fundamental step the importance of which has been well established as a means of coupling elongation to RNA maturation. By measuring nascent RNA transcripts bound to chromatin, we demonstrated that TOP 1 inhibition by CPT can enhance RNAP II escape from promoter proximal pausing site of the human Hypoxia Inducible Factor 1 (HIF-1) and c-MYC genes in a dose dependent manner. This effect is dependent from Cdk7/Cdk9 activities since it can be reversed by the kinases inhibitor DRB. Since CPT affects RNAP II by promoting the hyperphosphorylation of its Rpb1 subunit the findings suggest that TOP 1inhibition by CPT may increase the activity of Cdks which in turn phosphorylate the Rpb1 subunit of RNAP II enhancing its escape from pausing. Interestingly, the transcriptional consequences of CPT induced topological stress are wider than expected. CPT increased co-transcriptional splicing of exon1 and 2 and markedly affected alternative splicing at exon 11. Surprisingly despite its well-established transcription inhibitory activity, CPT can trigger the production of a novel long RNA (5’aHIF-1) antisense to the human HIF-1 mRNA and a known antisense RNA at the 3’ end of the gene, while decreasing mRNA levels. The effects require TOP 1 and are independent from CPT induced DNA damage. Thus, when the supercoiling imbalance promoted by CPT occurs at promoter, it may trigger deregulation of the RNAP II pausing, increased chromatin accessibility and activation/derepression of antisense transcripts in a Cdks dependent manner. A changed balance of antisense transcripts and mRNAs may regulate the activity of HIF-1 and contribute to the control of tumor progression After focusing our TOP 1 investigations at a single gene level, we have extended the study to the whole genome by developing the “Topo-Seq” approach which generates a map of genome-wide distribution of sites of TOP 1 activity sites in human cells. The preliminary data revealed that TOP 1 preferentially localizes at intragenic regions and in particular at 5’ and 3’ ends of genes. Surprisingly upon TOP 1 downregulation, which impairs protein expression by 80%, TOP 1 molecules are mostly localized around 3’ ends of genes, thus suggesting that its activity is essential at these regions and can be compensate at 5’ ends. The developed procedure is a pioneer tool for the detection of TOP 1 cleavage sites across the genome and can open the way to further investigations of the enzyme roles in different nuclear processes.

L'impatto delle politiche e dei programmi europei sullo sviluppo della società multiculturale e dello status sociale delle comunità minoritarie in Repubblica di Macedonia

L’oggetto della mia ricerca è la società multiculturale e il livello di sviluppo sociale delle comunità minoritarie in Macedonia, rispetto all’attuazione delle politiche e i programmi europei per la stabilizzazione democratica. L’indagine condotta nella mia tesi si è sviluppata esaminando i risultati ottenuti dai programmi CARDS, attuati per soddisfare gli obblighi stabiliti nell’Accordo di Stabilizzazione e Associazione e per l’implementazione dell’Accordo Quadro di Ohrid. Uno dei valori democratici, su cui l’UE è particolarmente attenta, ed al quale ha riservato un posto primario nei programmi CARDS, è la tutela dei diritti delle minoranze ossia il rispetto delle differenze culturali, linguistiche e religiose. L’obiettivo della mia indagine è stato quello di valutare l’impatto delle politiche europee sulla normativa macedone, concernente i diritti delle comunità minoritarie, ovvero il loro effetto sul consolidamento della società multiculturale e sullo status sociale delle comunità minoritarie in Macedonia. A tale scopo, in primo luogo sono stati esaminati gli emendamenti costituzionali e le modifiche legislative introdotti in seguito alla stipulazione dell’Accordo Quadro di Ohrid. L’analisi è stata incentrata nel verificare se la normativa macedone rientra nei parametri della normativa europea. I risultati ottenuti dimostrano quale è il tipo di multiculturalismo che promuove e garantisce la costituzione macedone. Attraverso l’analisi dei rapporti preparati dalla Commissione europea, relativi all’implementazione del Processo di Stabilizzazione e Associazione, è stato dimostrato come le politiche e i programmi europei hanno inciso sul consolidamento della società multiculturale. Analizzando invece i risultati dai rapporti relativi all’implementazione delle disposizioni dell’Accordo Quadro di Ohrid è stato valutato l’impatto che le politiche europee hanno avuto sullo sviluppo sociale delle comunità minoritarie in Macedonia. Per la valutazione di questo ultimo, sono state prese in considerazione il livello di partecipazione politica delle comunità minoritarie, la realizzazione delle richieste e delle questioni legate alla loro particolarità, l’ambito normativo regolato dal diritto di con-decisione, la rappresentanza delle comunità minoritarie nella sfera pubblica, il livello dell’accesso di istruirsi nella propria lingua e quindi il livello di istruzione e l’ambito e la libertà di usare la propria lingua nel settore pubblico. I concetti principali di questa ricerca sono: cooperazione, democrazia, multiculturalismo e sviluppo. Il termine cooperazione usato in questa ricerca si riferisce ai rapporti di cooperazione instaurati tra l’Unione Europea e la Macedonia nell’ambito dell’Accordo di Stabilizzazione e Associazione e dell’Accordo Quadro di Ohrid, ossia il sostegno dell’UE per la stabilizzazione democratica della Macedonia. Riferendosi a questa ultima, si fa riferimento al livello di garanzia di libera partecipazione dei cittadini, in ogni segmento della vita politica, sociale ed economica, senza discriminazioni etniche, linguistiche e religiose. Il termine multiculturalismo si riferisce alla società multiculturale ed è legato alla questione della politica della differenza, ossia del riconoscimento delle differenze culturali, che discendono dall’appartenenza ad una minoranza etnica e linguistica. Il multiculturalismo in questa ricerca viene analizzato, riferendosi alla multiculturalità della società macedone e ai diritti che la Costituzione macedone garantisce alle comunità minoritarie in Macedonia. Infine, per lo sviluppo in questa ricerca si fa riferimento allo sviluppo sociale delle comunità minoritarie, inteso e misurato tramite una seri di indicatori relativi all’occupazione (crescita di capitale sociale), all’educazione (capitale umano e qualifica di alta istruzione), alla partecipazione politica (occupazione dei posti principali nelle istituzione governative e della amministrazione pubblica), alla diffusione della cultura (uso e mantenimento della lingua e delle tradizioni) ecc. Prendendo in considerazione i principali concetti di questa tesi, il quadro teorico della ricerca sviluppa i nodi cruciali del dibattito sullo sviluppo e la democrazia, sul nesso tra democrazia e multiculturalismo e tra multiculturalismo e sviluppo. Attenendosi alle varie tesi, la ricerca avrà lo scopo di rilevare come si conciliano la società multiculturale macedone ed il modello democratico vigente. In questo contesto sarà fatto riferimento alle tesi fanno favoriscono la necessità di iniziare con la democrazia per poter innescare e sostenere il processo di sviluppo, alla tesi che sostiene la necessità di riconoscimento obbligatorio dei diritti collettivi nella società multiculturale, ossia dell’etnosviluppo delle comunità minoritarie. La ricerca è stata condotta tramite i seguenti metodi: - Il metodo descrittivo sarà usato per descrivere cosa è accaduto nel periodo di interesse di ricerca, riguardo i cambiamenti di natura sociale e politica delle minoranze in Macedonia. - Il metodo comparativo sarà applicato nella comparazione dell'efficacia delle leggi relative ai diritti delle minoranze e del loro status di sviluppo sociale e politico, prima e dopo l'attuazione e implementazione delle riforme europee. - Il metodo qualitativo sarà applicato per l’analisi di documenti, della legislatura e dei rapporti europei e nazionali. Le fonti usate in questa ricerca principalmente si basano su: - analisi di documenti e rapporti governativi, rapporti elaborati dalla Commissione Europea, dall’OSCE, dagli organi governativi e dalle organizzazioni non governative. - analisi di letteratura accademica, focalizzata sui problemi che sono oggetto di questa ricerca. - analisi di documenti pubblicati, come la gazzetta ufficiale, leggi costituzionali e atti legislativi, strategie nazionali e statistiche ufficiali. - analisi dei dati ottenuti da interviste e questionari.

Conservare il non finito: il Magazzino Darsena e il comparto del sale di Cervia

L’oggetto del nostro studio è il Magazzino del sale detto “Darsena” di Cervia. Durante l’elaborazione della tesi sono state affrontate diverse tematiche. La nostra attenzione è stata concentrata inizialmente sullo studio della Città Vecchia e sulla fondazione della Nuova, in rapporto alla nascita del comparto dei magazzini del sale, di cui il Darsena fa parte, e sulle trasformazioni che il manufatto ha subito nel tempo per effetto di questi cambiamenti. Siamo giunte fino all’ultimo, e più rilevante, intervento ad opera dell’Architetto Giancarlo De Carlo, che ha cambiato profondamente la spazialità interna dell’edificio. Questa premessa ha indirizzato lo studio della consistenza dell’edificio e del suo stato di conservazione, riflettendo sulla diversità e convivenza di nuovo e antico. Ci siamo proposte in seguito di intervenire sul manufatto con un progetto di restauro conservativo, accompagnato da una nuova destinazione d’uso che permetta all’edificio il suo riuso. Questa proposta si espande all’esterno dell’edificio, verso un progetto per il comparto del sale.

A hybrid technology for parallel recording of single ion channels

Hybrid technologies, thanks to the convergence of integrated microelectronic devices and new class of microfluidic structures could open new perspectives to the way how nanoscale events are discovered, monitored and controlled. The key point of this thesis is to evaluate the impact of such an approach into applications of ion-channel High Throughput Screening (HTS)platforms. This approach offers promising opportunities for the development of new classes of sensitive, reliable and cheap sensors. There are numerous advantages of embedding microelectronic readout structures strictly coupled to sensing elements. On the one hand the signal-to-noise-ratio is increased as a result of scaling. On the other, the readout miniaturization allows organization of sensors into arrays, increasing the capability of the platform in terms of number of acquired data, as required in the HTS approach, to improve sensing accuracy and reliabiity. However, accurate interface design is required to establish efficient communication between ionic-based and electronic-based signals. The work made in this thesis will show a first example of a complete parallel readout system with single ion channel resolution, using a compact and scalable hybrid architecture suitable to be interfaced to large array of sensors, ensuring simultaneous signal recording and smart control of the signal-to-noise ratio and bandwidth trade off. More specifically, an array of microfluidic polymer structures, hosting artificial lipid bilayers blocks where single ion channel pores are embededed, is coupled with an array of ultra-low noise current amplifiers for signal amplification and data processing. As demonstrating working example, the platform was used to acquire ultra small currents derived by single non-covalent molecular binding between alpha-hemolysin pores and beta-cyclodextrin molecules in artificial lipid membranes.

Analisi della stabilità dei risultati dei test di risposta termica: prove in campo, confronto e analisi critica per diversi metodi di esecuzione e modellizzazione

Il Test di Risposta Termica (Thermal Response Test-TRT) (Mogenson,1983) è il test esistente con il più alto grado di accuratezza per la caratterizzazione del reservoir geotermico superficiale. Il test consiste in una simulazione in situ del funzionamento di un sistema a circuito chiuso di sfruttamento dell’energia geotermica, per un periodo limitato di tempo, attraverso l’iniezione o estrazione di calore a potenza costante all’interno del geo-scambiatore (Borehole Heat Exchanger-BHE). Dall’analisi della variazione delle temperature del fluido circolante, è possibile avere una stima delle proprietà termiche medie del volume del reservoir geotermico interessato dal test. Le grandezze principali per la caratterizzazione di un serbatoio geotermico sono la conduttività termica (λ), la capacità termica volumetrica (c), la temperatura indisturbata del suolo (Tg) e la resistenza termica del pozzo (Rb); la loro determinazione è necessaria per il corretto progettazione degli geo-scambiatori. I risultati del TRT sono tuttavia sensibili alle condizioni al contorno spazio-temporali quali ad es.: variazione della temperatura del terreno, movimento d’acqua di falda, condizioni metereologiche, eventi stagionali, ecc. Questo lavoro vuole: i) introdurre uno studio sui problemi di caratterizzazione del reservoir geotermico superficiale, in particolare analizzando l’effetto che il movimento d’acqua di falda ha sui parametri termici; ii) analizzare la sensitività dei risultati del test alle variabilità dei parametri caratteristici del funzionamento delle attrezzature. Parte del lavoro della mia tesi è stata svolta in azienda per un periodo di 4 mesi presso la “Groenholland Geo Energy systems” che ha sede ad Amsterdam in Olanda. Tre diversi esperimenti sono stati realizzati sullo stesso sito (stratigrafia nota del terreno: argilla, sabbia fine e sabbia grossa) usando una sonda profonda 30 metri e diversi pozzi per l’estrazione d’acqua e per monitorare gli effetti in prossimità del geo scambiatore. I risultati degli esperimenti sono stati molto diversi tra di loro, non solo in termini di dati registrati (temperature del fluido termovettore), ma in termini dei valori dei parametri ottenuti elaborando i dati. In particolare non è sufficiente adottare il modello classico della sorgente lineare infinita (Infinite Line Source Solution- ILS) (Ingersoll and Plass, 1948), il quale descrive il trasferimento di calore per conduzione in un mezzo omogeneo indefinito a temperatura costante. Infatti, lo scambio di calore avviene anche tramite convezione causata dal movimento d’acqua di falda, non identificabile mediante gli approcci classici tipo CUSUM test (Cumulative Sum test) (Brown e altri,1975) Lo studio della tesi vuole dare un quadro di riferimento per correlare la variabilità dei risultati con la variabilità delle condizioni al contorno. L’analisi integra le metodologie classiche (ILS) con un approccio geostatistico utile a comprendere i fenomeni e fluttuazioni che caratterizzano il test. Lo studio delle principali variabili e parametri del test, quali temperatura in ingresso e uscita del fluido termovettore, portata del fluido e potenza iniettata o estratta, è stato sviluppato mediante: il variogramma temporale, ovvero la semivarianza dell’accrescimento, che esprime il tipo di autocorrelazione temporale della variabile in esame; la covarianza incrociata temporale, ovvero la covarianza fra due variabili del sistema, che ne definisce quantitativamente il grado di correlazione in funzionamento del loro sfasamento temporale. L’approccio geostatistico proposto considera la temperatura del fluido Tf come una funzione aleatoria (FA) non stazionaria nel tempo (Chiles, 1999), il cui trend è formalmente definito, ma deve essere identificato numericamente. Si considera quindi un classico modello a residuo; in cui la FA è modellizzata come la somma di un termine deterministico, la media (il valore atteso) m(t),coincidente col modello descritto dalla teoria della sorgente lineare infinità, e di un termine aleatorio, la fluttuazione, Y(t). Le variabili portata e potenza sono invece considerate delle funzioni aleatorie stazionarie nel tempo, ovvero a media costante. Da questo studio di Tesi si sono raggiunte delle conclusioni molto importanti per lo studio del TRT: Confronto tra gli esperimenti in estrazione di calore, con e senza movimento d’acqua di falda: si studia l’effetto indotto dalla falda sul TRT. E’ possibile caratterizzare quantitativamente l’incremento della conducibilità termica equivalente legata a fenomeni convettivi dovuti al movimento d’acqua di falda. Inoltre, i variogrammi sperimentali evidenziano periodicità simili nei due casi e legate al funzionamento della pompa di calore e della componentistica associata ed alla circolazione del fluido termovettore all’interno della sonda. Tuttavia, la componente advettiva ha un effetto di smorzamento sulle piccole periodicità dei variogrammi, ma di aumento dell’ampiezza delle periodicità maggiori a causa del funzionamento della pompa di calore che deve fornire maggiore energia al sistema per bilanciare le dispersioni dovute al movimento d’acqua di falda. Confronto fra estrazione ed iniezione di calore, con movimento d’acqua di falda: si studia la significatività dei risultati nei due casi. L’analisi delle variografie evidenzia significative differenze nella struttura dei variogrammi sperimentali. In particolare, nel test con iniezione di calore i variogrammi sperimentali delle temperature hanno valori sistematicamente inferiori, circostanza che assicura una migliore precisione nella stima dei parametri termici. Quindi eseguire il TRT in iniezione di calore risulta più preciso. Dall’analisi dei variogrammi sperimentali delle singole variabili quali temperatura del fluido in ingresso e uscita all’interno del geoscambiatore è stato confermato il fenomeno di smorzamento delle oscillazioni da parte del terreno. Dall’analisi delle singole variabili del test (temperature, potenza, portata) è stata confermata l’indipendenza temporale fra portate e temperature. Ciò è evidenziato dalle diverse strutture dei variogrammi diretti e dalle covarianze incrociate prossime a zero. Mediante correlogrami è stato dimostrato la possibilità di calcolare il tempo impiegato dal fluido termovettore per circolare all’interno della sonda. L’analisi geostatistica ha permesso quindi di studiare in dettaglio la sensitività dei risultati del TRT alle diverse condizioni al contorno, quelle legate al reservoir e quelle legate al funzionamento delle attrezzature

Effetto dei campi elettromagnetici ad alta frequenza sull’espressione genica e proteica dell’enzima acetilcolinesterasi in cellule PC12

Con lo sviluppo di nuovi sistemi di telecomunicazione e con i progressi nelle applicazioni mediche ed industriali, l’uomo è sempre più esposto a campi elettromagnetici. Sorge quindi la volontà di indagare sui loro potenziali effetti nocivi, manifestatasi nel corso di diversi decenni di ricerca. Risultano di particolare interesse sanitario i campi elettromagnetici ad alta frequenza (HF-EMF) prodotti dai telefoni cellulari, in quanto il loro utilizzo implica il posizionamento dell’apparecchio in prossimità dell’orecchio, e quindi del cervello. Nel 2011 l’Agenzia Internazionale dell'OMS per la Ricerca sul Cancro (IARC), ha classificato gli HF-EMF come “possibilmente cancerogeni”, in quanto l’evidenza epidemiologica è stata giudicata “limitata”. Successivamente l’OMS si è espressa in favore di ulteriori ricerche giustificate dal crescente uso di telefoni cellulari, mentre non è stata richiesta l’adozione di misure precauzionali di limitazione al loro utilizzo. Emerge dunque la necessità di proseguire gli studi, che con questa tesi abbiamo indirizzato all’enzima acetilcolinesterasi (AChE). L’AChE svolge un ruolo importante nella trasmissione sinaptica in quanto catalizza l’idrolisi dell’acetilcolina (ACh), importante neurotrasmettitore nel sistema nervoso umano e animale. Lo studio dell’attività dell’AChE presenta una rilevante importanza dal punto di vista sanitario considerando che il deterioramento progressivo delle cellule neuronali, riscontrato nel Morbo di Alzheimer, è attribuito ad una diminuzione del livello del neurotrasmettitore ACh (Lane et al. 2005). A partire dagli anni 80, sono stati svolti studi sull’attività dell’enzima a seguito di esposizioni a EMF, i quali hanno evidenziato nella maggior parte dei casi un cambiamento dell’attività stessa. Il presente lavoro si avvale di un valido sistema di irraggiamento ad alta frequenza che simula l’esposizione ai segnali GSM; lo studio è stato svolto sulla linea cellulare PC12, cellule tumorali derivanti da feocromocitoma di ratto capaci di secernere e immagazzinare ACh e AChE. Sono state valutate in particolare l’attività enzimatica e l’espressione genica dell’AChE nelle cellule PC12 esposte ad una frequenza portante di 1,8 GHz con frequenza di modulazione di 217 Hz, condizioni alle quali lavorano comunemente gli apparati di telefonia mobile in modalità GSM, per un periodo di 24 h. I risultati ottenuti mostrano un aumento dell’attività dell’enzima AChE dei campioni irraggiati rispetto ai controlli, con variazione della Vmax ma non della Km, mentre non è stata rilevata alcuna variazione significativa dell’espressione genica, analizzata mediante PCR real-time. Nelle cellule PC12, si aveva una maggiore attività ed espressione genica dell’enzima in cellule trattate con forskolin e dbcAMP, impiegati come stimoli positivi. Questi risultati suggeriscono il coinvolgimento del sistema AMPc–dipendente nel controllo dell’espressione genica dell’enzima. L’AMPc, pur agendo tipicamente come secondo messaggero nella trasduzione del segnale chimico, in molte cellule di diversi organismi sembra essere aumentato anche in condizioni di stress. In particolare l’effetto si esplicava infatti sulla isoforma AChER, indotta in condizioni di stress. Il fatto che l’aumento dell’attività enzimatica di AChE indotto da HF-EMF non sia associato né all’aumento dell’affinità per il substrato, né all’aumento del numero di molecole, suggerisce l’ipotesi che i campi elettromagnetici ad alta frequenza agiscano sul microambiente di membrana che circonda l’enzima, per esempio determinando cambiamenti delle condizioni all’interno della matrice lipidica, influenzando fortemente la sua attività. Sarà interessante valutare in futuro come l’aumento della Vmax di reazione venga indotto in assenza di aumento dei trascritti genici. In conclusione il presente lavoro non fornisce risposte circa gli effetti del segnale GSM sulla salute umana, ma consente di affermare l’esistenza di un’interazione dei campi elettromagnetici con il modello biologico da noi utilizzato, richiamando l’attenzione sull’attività di questo enzima come possibile “indicatore” dell’interazione cellulare con tali segnali. Tale “indicatore”, ricercato da molti anni, non è mai stato individuato.

Valutazione del rischio ecologico dei residui di farmaci nel suolo: analisi sperimentale della tossicità della carbamazepina sul lombrico Eisenia andrei

La carbamazepina fu commercializzata a partire dagli anni Sessanta; è un analgesico anticonvulsivante e specifico per la nevralgia del trigemino ed è uno dei principali farmaci usati nel trattamento dell’epilessia. La sua azione più nota a livello del sistema nervoso è quella di rallentare il recupero dei canali al sodio, sebbene abbia anche effetti metabolici importanti interferendo con il ciclo degli inositoli e con la GSK-3 (glicogeno sintasi-chinasi 3). Tale sostanza è sotto la lente d’ingrandimento sia per le sue caratteristiche chimico-fisiche (vedi la sua alta persistenza in ambiente) sia per la sua alta tossicità per la salute umana. Le sue proprietà terapeutiche spesso sono accompagnate da effetti collaterali sia nei pazienti che assumono direttamente il medicinale, sia negli organismi non-bersaglio che vengono a contatto con i residui ed i metaboliti del farmaco in ambiente. Le principali fonti di contaminazione dell’ambiente sono rappresentate dagli scarichi domestici, urbani, ospedalieri ed industriali e dagli effluenti di impianti di depurazione. Inoltre, l’uso irriguo di acque contenenti residui del farmaco oppure fenomeni di esondazione di corpi idrici contaminati contribuiscono ampiamente alla distribuzione di questo composto nei suoli. La matrice suolo ha avuto relativamente poca attenzione per quanto riguarda gli effetti dell’inquinamento sugli organismi in generale, ed in particolare non vi sono studi sui farmaci. Il presupposto di questo studio dunque è stato quello di mettere a punto una metodologia volta a valutare gli effetti all’esposizione del farmaco carbamazepina su organismi bioindicatori, i lombrichi della specie Eisenia andrei. Il seguente progetto è durato da Maggio 2012 a Febbraio 2013, periodo in cui sono stati effettuati saggi sub cronici per valutare l’effetto di suoli sperimentalmente contaminati con il farmaco sui parametri del ciclo vitale del lombrico (accrescimento, mortalità e riproduzione) e su una serie di biomarker cellulari (neutral red retention assay, accumulo lisosomiale di lipofuscine, accumulo lisosomiale di lipidi neutri insaturi, attività dell’enzima acetilcolinsterasi, attività dell’enzima catalasi, attività dell’ enzima glutatione-S-transferasi e concentrazione di malondialdeide). I risultati ottenuti mostrano che la carbamazepina non ha effetti sui parametri del ciclo vitale. Per quanto riguarda i parametri fisiologici si notano tuttavia dei risultati diversi. L’accumulo lisosomiale di lipofuscine e lipidi neutri indica che il metabolismo dei vermi risulta in qualche modo alterato dall’esposizione alla carbamazepina alle concentrazioni saggiate. Queste alterazioni potrebbero essere spiegate da un effetto di tipo ossidante; infatti i due biomarker oltre a rappresentare un segnale di alterazione metabolica rappresentano anche un indicazione di perossidazione lipidica. Queste osservazioni meritano di essere approfondite studiando il bioaccumulo e la degradazione della carbamazepina nei suoli, che potrebbero essere alla base della diversità di risultati rispetto alla tossicità evidenziata negli organismi acquatici. A fronte della consapevolezza dei rischi potenziali dovuti alla presenza di farmaci nelle acque e nel suolo, molto resta da fare per ampliare le conoscenze su questa tipologia di contaminazione, in particolare nei campi del monitoraggio e del comportamento ambientale, degli studi ecotossicologici e delle procedure e tecnologie idonee a limitare la loro immissione nell’ambiente.

Impatti paesaggistici ed economici delle misure agroambientali nell'ambito dei programmi di sviluppo rurale

La ricerca è mirata a valutare come l’attuazione delle politiche ambientali di Sviluppo Rurale possa contribuire al miglioramento del paesaggio, analizzando i suoi effetti territoriali. Nell’ambito del caso di studio della Regione Emilia-Romagna vengono analizzate le misure agro-ambientali e di forestazione agricola dal 1994 al 2011, comprendendo gli interventi realizzati con i Regolamenti (CEE) 2078/1992, 2080/1992 e dai Programmi di Sviluppo Rurale (PSR) 2000-2006 e 2007-2013. In particolare, sono approfonditi i fattori che determinano la partecipazione territoriale delle misure agro-ambientali, individuate a livello aziendale le motivazioni alla partecipazione per le azioni con effetto diretto sul paesaggio, valutati i conseguenti effetti tecnico-economici e analizzati gli impatti degli interventi sul paesaggio a livello territoriale, in funzione del contesto ambientale. I risultati hanno consentito di approfondire quanto già riportato nelle valutazioni istituzionali dei PSR e in letteratura scientifica, individuando i fattori determinanti della partecipazione a livello regionale. A questo scopo sono state utilizzate analisi di econometria spaziale che hanno permesso di evidenziare effetti di concentrazione territoriale delle superfici sotto impegno, in funzione delle priorità della misura e degli ordinamenti produttivi dei beneficiari. Sono stati inoltre analizzati gli impatti paesaggistici in un’area di studio ristretta a livello territoriale e aziendale: gli interventi specifici, in alcuni contesti territoriali dove è stata raggiunta una certa concentrazione delle superfici sotto impegno, hanno modificato il paesaggio rurale, differenziandolo rispetto alla matrice agricola intensiva in cui sono stati inseriti. A livello aziendale sono stati rilevati effetti significativi sull’economia dei beneficiari che scelgono di aderire a tali misure, con un diffuso effetto di riduzione della redditività. I contributi compensano in maniera differenziata i costi legati all’implementazione degli interventi in funzione della tipologia di intervento e delle scelte tecniche aziendali adottate per la loro gestione.

The effect of osmolytes on protein fold stability at the single-molecule level

By pulling and releasing the tension on protein homomers with the Atomic Force Miscroscope (AFM) at different pulling speeds, dwell times and dwell distances, the observed force-response of the protein can be fitted with suitable theoretical models. In this respect we developed mathematical procedures and open-source computer codes for driving such experiments and fitting Bell’s model to experimental protein unfolding forces and protein folding frequencies. We applied the above techniques to the study of proteins GB1 (the B1 IgG-binding domain of protein G from Streptococcus) and I27 (a module of human cardiac titin) in aqueous solutions of protecting osmolytes such as dimethyl sulfoxide (DMSO), glycerol and trimethylamine N-oxide (TMAO). In order to get a molecular understanding of the experimental results we developed an Ising-like model for proteins that incorporates the osmophobic nature of their backbone. The model benefits from analytical thermodynamics and kinetics amenable to Monte-Carlo simulation. The prevailing view used to be that small protecting osmolytes bridge the separating beta-strands of proteins with mechanical resistance, presumably shifting the transition state to significantly higher distances that correlate with the molecular size of the osmolyte molecules. Our experiments showed instead that protecting osmolytes slow down protein unfolding and speed-up protein folding at physiological pH without shifting the protein transition state on the mechanical reaction coordinate. Together with the theoretical results of the Ising-model, our results lend support to the osmophobic theory according to which osmolyte stabilisation is a result of the preferential exclusion of the osmolyte molecules from the protein backbone. The results obtained during this thesis work have markedly improved our understanding of the strategy selected by Nature to strengthen protein stability in hostile environments, shifting the focus from hypothetical protein-osmolyte interactions to the more general mechanism based on the osmophobicity of the protein backbone.

Studio e caratterizzazione di biosensori sviluppati su dispositivi inorganici ed organici

L’attività di dottorato qui descritta ha riguardato inizialmente lo sviluppo di biosensori elettrochimici semplificati per la rilevazione di DNA e successivamente lo studio di dispositivi organici ad effetto di campo per la stimolazione e il rilevamento dell’attività bioelettrica di cellule neuronali. Il lavoro di ricerca riguardante il prima parte è stato focalizzato sulla fabbricazione e sulla caratterizzazione di un biosensore a due elettrodi per la rilevazione di DNA solubile , facilmente producibile a livello industriale. Tale sensore infatti, è in grado di leggere livelli diversi di correnti faradiche sulle superfici in oro degli elettrodi, a discrezione di un eventuale ibridizzazione del DNA da analizzare su di esse. I risultati ottenuti riguardo a questo biosensore sono :la paragonabilità dello stesso con i sensori standard a tre elettrodi basati sulla medesima metodica, la possibilità di effettuare due misure in parallelo di uno stesso campione o di 2 diversi campioni su di uno stesso di dispositivo e la buona applicabilità della chimica superficiale a base di tale biosensore a superfici create con tecnologie industriali. Successivamente a tali studi, mi sono focalizzato sull’utilizzo di dispositivi organici ad effetto campo (in particolare OTFT) per lo sviluppo di un biosensore capace di stimolare e registrare l’attività bioelettrica di cellule neuronali. Inizialmente sono state identificate le caratteristiche del materiale organico utilizzato e successivamente del dispositivo fabbricato pre e post esposizione all’ambiente fisiologico. Poi, sono stati effettuati esperimenti per osservare la capacità di stimolare e di leggere i segnali elettrogenici da parte dell’OTFT. I risultati ottenuti da tali studi sono che: il materiale organico ed il dispositivo mantengo le loro caratteristiche morfologiche e funzionali dopo l’esposizione per giorni all’ambiente fisiologico. Inoltre l’OFET in grado di stimolare il cambiamento delle tensioni di membrana cellulari e contemporaneamente di registrare tali variazioni e le eventuali risposte cellulari provocate da esse.

Sintesi e proprietà di biochar da biomasse residuali

Il termine biochar definisce il prodotto solido derivante dalla pirolisi di un qualsiasi materiale organico, con lo specifico scopo di essere applicato nei suoli sia per fini agronomici che di gestione ambientale. Un suo utilizzo in maniera "responsabile" richiede però una piena comprensione delle sue proprietà e dei meccanismi che controllano la sua attività nel terreno, che dipendono dalla biomassa di partenza e dalle condizioni di sintesi tramite pirolisi. Infatti le condizioni di pirolisi, in particolare la temperatura di processo e il tempo di residenza, determinano biochar con caratteristiche differenti. In questo lavoro di tesi sono stati prodotti biochar da due diverse tipologie di biomassa residuale ampiamente disponibili (stocchi di mais e pollina). Per ciascuna biomassa sono state scelte tre condizioni di pirolisi (400°C x 20 minuti, 500°C x 10 minuti e 600°C x 5 minuti). Sui biochar ottenuti sono state effettuate le seguenti determinazioni: analisi elementare, Pirolisi‐GC‐MS, idrocarburi policiclici aromatici (IPA), acidi grassi volatili (VFA), azoto ammoniacale (N‐NH4 +), pH, conduttività elettrica e ritenzione idrica. Infine i biochar sintetizzati sono stati utilizzati per fare due test di germinazione per valutare l'effetto sulla formazione delle prime strutture di crescita delle plantule, tramite test di tossicità brevi con piastre Petri. Il primo test è stato condotto a concentrazione crescente di miscele acqua/biochar (2, 5, 40 e 100 g/L sulla base delle quantità di biochar utilizzate come ammendante nel suolo), sulla germinazione seguendo la metodologia normata dalla ISO 11269:2012. I semi utilizzati nel primo test sono stati quelli del crescione (Lepidium sativum L.) come specie dicotiledone, e del sorgo (Sorghum saccharatum M.) come monocotiledone. Il secondo saggio di tossicità eseguito è stato quello descritto dalla normativa in materia UNI 11357, valutando l'eventuale effetto di tossicità alla massima concentrazione delle varie tipologie di biochar, utilizzando come specie dicotiledoni il cetriolo (Cucumis sativus L.) ed il crescione (Lepidium sativum L.), come monocotiledone il sorgo (Sorghum saccharatum M.). Per i biochar da stocchi di mais, rappresentativi di biomasse erbacee e con diverso grado di carbonizzazione, non si osservano effetti apprezzabili alle condizioni di uso agricolo. Nel caso dei biochar da pollina si osservano invece inibizioni alla germinazione sin dalle concentrazioni più basse. In particolare, quello pirolizzato a 400°C mostra un potenziale effetto tossico più marcato, probabilmente associato ad un contenuto di IPA e VFA superiore a quello degli altri biochar.

Sviluppo e caratterizzazione di bulk superconduttori in MgB2 per sistemi di levitazione

Superconduttori bulk in MgB2, ottenuti con tecnologia Mg-RLI brevettata da Edison Spa, sono stati oggetto di un'approfondita analisi in termini di forze di levitazione. Questo studio è stato preliminare per la progettazione di un innovativo sistema di levitazione lineare. I risultati ottenuti sperimentalmente sono stati validati attraverso modelli numerici sviluppati ad hoc. I campioni oggetto dello studio sono tre bulk in MgB2 rappresentativi delle tipiche forme usate nelle applicazioni reali: un disco, un cilindro, una piastra. I bulk sono stati misurati con un sistema di misura per le forze di levitazione realizzato a tale scopo. Un protocollo sperimentale è stato seguito per la caratterizzazione di base, sia in condizioni Field Cooling sia Zero Field Cooling, al quale sono state affiancate prove specifiche come la possibilità di mantenere inalterate le proprietà superconduttive attraverso la giunzione di più campioni con la tecnologia Mg-RLI. Un modello numerico è stato sviluppato per convalidare i risultati sperimentali e per studiare l'elettrodinamica della levitazione. Diverse configurazioni di rotori magnetici sono state accoppiate con un cilindro in MgB2 con lo scopo di valutare la soluzione ottimale; questo tema è stato apporofondito attraverso lo sviluppo di un software di simulazione che può tenere conto sia del numero di magneti sia della presenza di anelli in materiale magneti intercalati fra di essi. Studi analoghi sono stati portati avanti su una piastra di MgB2 per simulare il comportamento di una geometria piana. Un sistema di raffreddamento innovativo basato sull'azoto solido è stato studiato per poterlo accoppiare con un sistema di levitazione. Il criostato progettato è costituito da due dewar, uno dentro l'altro; quello interno ha lo scopo di raffreddare l'MgB2 mentre quello esterno di limitare delle perdite verso l'esterno. Il criopattino così ottenuto è accoppiato in condizioni FC ad una rotaia formata da magneti permanenti in NdFeB.

Valutazione quantitativa del rischio dovuto ad incidenti causati da eventi naturali in impianti di processo

La minaccia derivante da fattori di rischio esterni, come gli eventi catastrofici naturali, è stata recentemente riconosciuta come una questione importante riguardo la sicurezza degli impianti chimici e di processo. Gli incidenti causati dal rilascio di sotanze pericolose in seguito al danneggiamento di apparecchiature per effetto di eventi naturali sono stati definiti eventi NaTech, data la doppia componente naturale e tecnologica. È proprio la simultaneità del disastro naturale e dell’incidente tecnologico il problema principale di questo tipo di eventi, che, oltre a generare elevate difficoltà nella gestione delle emergenze, sono caratterizzati da un’elevata criticità in quanto la catastrofe naturale può essere la causa del cedimento contemporaneo di più apparecchiature in zone diverse dell’impianto. I cambiamenti climatici in corso porteranno inoltre ad un incremento della frequenza degli eventi idrometerologici estremi, con un conseguente aumento del rischio Natech. Si tratta quindi di un rischio emergente la cui valutazione deve essere effettuata attraverso metodologie e strumenti specifici. Solo recentemente è stato proposto un framework per la valutazione quantitativa di questo tipo di rischio. L’applicazione di tale procedura passa attraverso l’utilizzo di modelli di vulnerabilità che relazionano la probabilità di danneggiamento di una specifica apparecchiatura all’intensità dell’evento naturale di riferimento. Questo elaborato, facendo riferimento ai modelli di vulnerabilità e alle cartteristiche delle apparecchiature prese in esame, avrà inizialmente lo scopo di sviluppare una procedura a ritroso, calcolando l’intensità degli eventi di riferimento (terremoti e alluvioni) capace di causare un incremento di rischio non accettabile, al fine di poter determinare a priori se una data apparecchiatura con determinate condizioni operative e caratteristiche strutturali possa o meno essere installata in una zona specifica.

Stato ecologico di Punte Alberete e Valle Mandriole: popolamenti macrozoobentonici e chimica delle acque

Il presente studio si è proposto di fornire un contributo per la definizione dello stato ecologico delle zone umide d’acqua dolce ravennati (Punte Alberete, Valle Mandriole e uno stagno temporaneo creatosi nella limitrofa Pineta di San Vitale), attraverso lo studio della fauna macrobentonica presente nei sedimenti e nella vegetazione emergente. Sono stati prelevati campioni d’acqua con lo scopo di analizzare alcuni parametri chimico fisici, per relazionarli con i dati ecologici sulle comunità oggetto di studio. Inoltre è stato valutato il potenziale effetto sulle comunità macrozoobentoniche della attuale gestione di Valle Mandriole, che prevede il prosciugamento estivo della zona meridionale al fine di consentire operazioni di sflacio della vegetazione. Per valutare questo tipo di impatto è stato applicato un disegno di campionamento di tipo Beyond-BACI. Sono stati definiti quattro siti di controllo ed un sito potenzialmente impattato. Sono stati definiti due punti di campionamento su ciascun sito e sono stati campionati in totale quattro volte ciascuno, due volte prima del periodo estivo, corrispondente alla messa in secca del sito impattato, e due volte in autunno. I dati raccolti sul benthos e sulle acque sono poi stati analizzati attraverso l’analisi statistica multivariata PERMANOVA. I risultati dei test statistici non hanno rilevato nessun tipo di impatto associabile alla pratica di gestione attuata a Valle Mandriole, mentre l’analisi delle comunità macrozoobentoniche ha evidenziato, attraverso confronti temporali con dati storici e con altri studi, una situazione di degrado dal punto di vista delle stato ecologico di Punte Alberete e Valle Mandriole, molto probabilmente associabile all’abbondante presenza del gambero della Louisiana. La condizione di stato ecologico non soddisfacente può oltretutto essere imputabile anche alla qualità ecologica scarsa dei corsi d’acqua deputati al ricarico delle zone umide considerate. Lo studio ha inoltre sottolineato l’importanza dal punto di vista conservazionistico dello stagno in Pineta San Vitale.

Sintesi e caratterizzazione di oligo e politiofeni per applicazioni in elettronica e biodiagnostica

Negli ultimi anni sono stati sintetizzati numerosi oligomeri e polimeri del tiofene che, grazie alle loro proprietà di semiconduttori, hanno trovano largo impiego in molti campi di interesse tecnologico come, ad esempio, transistor ad effetto di campo, diodi elettroluminescenti, dispositivi ottici non lineari e celle fotovoltaiche. Più recentemente, oligomeri tiofenici ossidati allo zolfo hanno trovato applicazione sia in campo elettronico, come materiali accettori in blenda con il poli(3-esiltiofene) (P3HT) usato come materiale donatore, in celle solari di tipo Bulk Hetero Junction (BHJ), ma anche in campo biologico come marcatori fluorescenti di proteine e oligonucleotidi. Tuttavia la sintesi di queste specie richiede condizioni di reazione spinte e al contempo rischiose dovute all’utilizzo in largo eccesso di agenti ossidanti molto forti. Uno degli obiettivi di questa tesi è stato lo sviluppo di metodi più versatili per la mono e di-ossidazione selettiva allo zolfo del tiofene di building-blocks dibromurati di diversa natura. Successivamente i building-blocks S-monossido e S,S-diossido derivati sono stati impiegati per la sintesi di oligomeri e polimeri tramite reazioni di cross-coupling Palladio catalizzate. I composti finali sono stati caratterizzati sia dal punto di vista spettroscopico UV-Vis che elettrochimico, mettendo in evidenza le relazioni che esistono fra gli andamenti dei dati sperimentali ottenuti con il diverso stato di ossidazione dei composti tiofenici diversamente sostituiti. Infine i composti finali sono stati testati sia in campo fotovoltaico che biologico.