Cardioprotection against experimental myocardial ischemic injury using cornin

Phosphorylated-cyclic adenosine monophosphate response element-binding protein (Phospho-CREB) has an important role in the pathogenesis of myocardial ischemia. We isolated the iridoid glycoside cornin from the fruit of Verbena officinalis L, investigated its effects against myocardial ischemia and reperfusion (I/R) injury in vivo, and elucidated its potential mechanism in vitro. Effects of cornin on cell viability, as well as expression of phospho-CREB and phospho-Akt in hypoxic H9c2 cells in vitro, and myocardial I/R injury in vivo, were investigated. Cornin attenuated hypoxia-induced cytotoxicity significantly in H9c2 cells in a concentration-dependent manner. Treatment of H9c2 cells with cornin (10 µM) blocked the reduction of expression of phospho-CREB and phospho-Akt in a hypoxic condition. Treatment of rats with cornin (30 mg/kg, iv) protected them from myocardial I/R injury as indicated by a decrease in infarct volume, improvement in hemodynamics, and reduction of severity of myocardial damage. Cornin treatment also attenuated the reduction of expression of phospho-CREB and phospho-Akt in ischemic myocardial tissue. These data suggest that cornin exerts protective effects due to an increase in expression of phospho-CREB and phospho-Akt.

The determination of sinigrin in Brassica, and investigations into the use of allyl-isothiocyanate as a nematicide

The goal of this thesis was to study factors related to the development of Brassica juncea as a sustainable nematicide. Brassica juncea is characterized by the glycoside (glucosinolate) sinigrin. Various methods were developed for the determination of sinigrin in Brassica juncea tissue extracts. Sinigrin concentrations in plant tissues at various stages of growth were monitored. Sinigrin enzymatically breaks down into allylisothiocyanate (AITC). AITC is unstable in aqueous solution and degradation was studied in water and in soil. Finally, the toxicity of AITC against the root-lesion nematode (Pratylenchus penetrans) was determined. A method was developed to extract sinigrin from whole Brassica j uncea tissues. The optimal time of extraction wi th boiling phosphate buffer (0.7mM, pH=6.38) and methanol/water (70:30 v/v) solutions were both 25 minutes. Methanol/water extracted 13% greater amount of sinigrin than phosphate buffer solution. Degradation of sinigrin in boiling phosphate buffer solution (0.13%/minute) was similar to the loss of sinigrin during the extraction procedure. The loss of sinigrin from boiling methanol/water was estimated to be O.Ol%/minute. Brassica juncea extract clean up was accomplished by an ion-pair solid phase extraction (SPE) method. The recovery of sinigrin was 92.6% and coextractive impurities were not detected in the cleaned up extract. Several high performance liquid chromatography (HPLC) methods were developed for the determination of sinigrin. All the developed methods employed an isocratic mobile phase system wi th a low concentration of phosphate buffer solution, ammonium acetate solution or an ion-pair reagent solution. A step gradient system was also developed. The method involved preconditioning the analytical column with phosphate buffer solution and then switching the mobile phase to 100% water after sample injection.Sinigrin and benzyl-glucosinolate were both studied by HPLC particle beam negative chemical ionization mass spectrometry (HPLCPB- NCI-MS). Comparison of the mass spectra revealed the presence of fragments arising from the ~hioglucose moiety and glucosinolate side-chain. Variation in the slnlgrin concentration within Brassica juncea plants was studied (Domo and Cutlass cuItivars). The sinigrin concentration in the top three leaves was studied during growth of each cultivar. For Cutlass, the minimum (200~100~g/g) and maximum (1300~200~g/g) concentrations were observed at the third and seventh week after planting, respectively. For Domo, the minimum (190~70~g/g) and maximum (1100~400~g/g) concentrations were observed at the fourth and eighth week after planting, respectively. The highest sinigrin concentration was observed in flower tissues 2050±90~g/g and 2300±100~g/g for Cutlass and Domo cultivars, respectively. Physical properties of AITC were studied. The solubility of AITC in water was determined to be approximately 1290~g/ml at 24°C. An HPLC method was developed for the separation of degradation compounds from aqueous AITC sample solutions. Some of the degradation compounds identified have not been reported in the literature: allyl-thiourea, allyl-thiocyanate and diallyl-sulfide. In water, AITC degradation to' diallyl-thiourea was favored at basic pH (9.07) and degradation to diallyl-sulfide was favored at acidic pH (4 . 97). It wap necessary to amend the aqueous AITC sample solution with acetonitrile ?efore injection into the HPLC system. The acetonitrile amendment considerably improved AITC recovery and the reproducibility of the results. The half-life of aqueous AITC degradation at room temperature did not follow first-order kinetics. Beginning with a 1084~g/ml solution, the half-life was 633 hours. Wi th an ini tial AITC concentration of 335~g/ml the half-life was 865 hours. At 35°C the half-life AITC was 76+4 hours essentially independent of the iiisolution pH over the range of pH=4.97 to 9.07 (1000~g/ml). AITC degradation was also studied in soil at 35°C; after 24 hours approximately 75% of the initial AITC addition was unrecoverable by water extraction. The ECso of aqueous AITC against the root-lesion nematode (Pratylenchus penetrans) was determined to be approximately 20~g/ml at one hour exposure of the nematode to the test solution. The toxicological study was also performed with a myrosinase treated Brassica juncea extract. Myrosinase treatment of the Brassica juncea extract gave nearly quantitative conversion of sinigrin into AITC. The myrosinase treated extract was of the same efficacy as an aqueous AITC solution of equivalent concentration. The work of this thesis was focused upon understanding parameters relevant to the development of Brassica juncea as a sustainable nematicide. The broad range of experiments were undertaken in support of a research priority at Agriculture and Agri-Food Canada.

Studies toward the total synthesis of natural and unnatural aeruginosins

Nous avons démontré l’utilité du groupement protecteur tert-butylsulfonyle (N-Bus) pour la chimie des acides aminés et des peptides. Celui-ci est préparé en deux étapes, impliquant la réaction d’une amine avec le chlorure de tert-butylsulfinyle, suivie par l’oxydation par du m-CPBA, pour obtenir les tert-butylsulfonamides correspondants avec d’excellents rendements. Le groupement N-Bus peut être clivé par traitement avec 0.1 N TfOH/DCM/anisole à 0oC en 10h pour régénérer le sel d’ammonium. Une variété d’acides aminés N-Bus protégés ainsi que d’autres aminoacides peuvent alors être utilisés pour préparer divers dipeptides et tripeptides. A l’exception du groupe N-Fmoc, les conditions de déprotection du groupe N-Bus clivent également les groupements N-Boc, N-Cbz et O-Bn. Une déprotection sélective et orthogonale des groupes N-Boc, N-Cbz, N-Fmoc et O-Bn est également possible en présence du groupe protecteur N-Bus. Le nouvel acide aminé non-naturel (3R, 2R) 3–méthyl-D-leucine (β-Me-Leu) et son régioisomère 2-méthyle ont été synthétisés par ouverture d’une N-Ts aziridine en présence d’un excès de LiMe2Cu. Chacun des régioisomères du mélange (1:1,2) a été converti en la méthylleucine correspondante, puis couplé à l’acide D-phényllactique puis au motif 2-carboxyperhydroindole 4-amidinobenzamide en présence de DEPBT. Des élaborations ultérieures ont conduit à des analogues peptidiques non-naturels d’aeruginosines telles que la chlorodysinosine A. Les deux analogues ont ensuite été évalués pour leur activité inhibitrice de la thrombine et la trypsine. La présumée aeruginosine 3-sulfate 205B et son anomère β ont été synthétisés avec succès à partir de 5 sous-unités : la 3-chloroleucine, l’acide D-phényllactique, le D-xylose, le 2-carboxy-6-hydroxyoctahydroindole et l’agmatine. La comparaison des données RMN 1H et 13C reportées avec celles obtenues avec l’aeruginosine synthétique 205B révèle une différence majeure pour la position du groupe présumé 3'-sulfate sur l’unité D-xylopyranosyle. Nous avons alors synthétisés les dérivés méthyl-α-D-xylopyranosides avec un groupement sulfate à chacune des positions hydroxyles, afin de démontrer sans ambiguïté la présence du sulfate en position C-4' par comparaison des données spectroscopiques RMN 1H et 13C. La structure de l’aeruginosine 205B a alors été révisée. Une des étapes-clés de cette synthèse consiste en la formation du glycoside avec le groupe hydroxyle en C-6 orienté en axial sur la sous-unité Choi. Le 2-thiopyridylcarbonate s’est avéré une méthode efficace pour l’activation anomérique. Le traitement par AgOTf et la tétraméthylurée en solution dans un mélange éther-DCM permet d’obtenir l’anomère α désiré, qui peut alors être aisément séparé de l’anomère β par chromatographie

Synthèse de 4-désoxy hexopyrannoses, C-disaccharides et C-glycosides biologiquement actifs

Les glucides constituent la classe de molécules organiques la plus abondante et ceux-ci jouent des rôles cruciaux dans divers processus biologiques. De part leur importance médicinale, la préparation des désoxy-sucres, des C-glycosides et des C-disaccharides est devenue un sujet de pointe en synthèse organique. De façon générale, cette thèse décrit une nouvelle synthèse de novo des 4-désoxy hexopyrannoses en plus de la préparation de C-glycosides biologiquement actifs. De plus, une attention particulière a été portée à la préparation de novo de 4-désoxy-C-disaccharides. Dans un premier temps, le catalyseur de Cr(III) de Jacobsen et un complexe binaphtol/titane ont été utilisés pour réaliser des hétéro-Diels-Alder énantiosélectives. Les dihydropyrannes ainsi générés ont été transformés en 4-désoxy hexopyrannoses présents dans la nature. De cette façon, un dérivé de l’acide ézoaminuroïque, un précurseur de la désosamine et de la néosidomycine, a été préparé suivant cette approche de novo. De plus, à titre comparatif, la néosidomycine a également été fabriquée selon une approche chiron, à partir du méthyl alpha-D-mannopyrannoside. Finalement, une évaluation biologique préliminaire de la néosidomycine a été effectuée sur une la concanavaline-A (Chapitre 2). Dans un deuxième temps, une allylation stéréosélective sur un aldéhyde lié via des liens C-C à une unité mannoside a permis de générer un alcool homoallylique. Cette dernière fonctionnalité a été transformée en 4-désoxy hexopyrannose de configuration D ou L. De cette façon, la préparation de pseudo 4-désoxy-C-disaccharides, de 4-désoxy-C-disaccharides et de pseudo 4-désoxy aza-C-disaccharides a facilement été réalisée. Les rapports diastéréoisomériques de la réaction d’allylation ont été déterminés en plus de la configuration absolue des nouveaux centres stéréogéniques formés. La transformation des alcools homoallyliques en pyrannes poly hydroxylés ou en lactames poly hydroxylés a été réalisée, en plus de la déprotection de certains membres de cette famille pour une évaluation biologique préliminaire sur la concanavaline-A (Chapitre 3). Finalement, la synthèse de C-glycosides biologiquement actifs a été réalisée selon deux volets: i) préparation de 3-C-mannopyrannosyl coumarines et ii) synthèse de C-galactosides, inhibiteurs de la lectine PA-IL. Pour ce faire, le couplage de Heck a été utilisé à partir d’un ester alpha,bêta-insaturé, attaché à une unité glycosidique via des liens C-C, pour générer un dérivé glycosyl cinnamate de méthyle. Cependant, lorsque le 2-iodophénol est utilisé comme partenaire de Heck, la coumarine correspondante a été isolée. Les dérivés C-galactopyrannosyl cinnamates de méthyle représentent de bons inhibiteurs monovalents de la PA-IL avec un Kd aussi bas que 37 micro M (Chapitre 4).

Expression et localisation du système endocannabinoïde dans la rétine du singe

Les effets de la marijuana, un médicament utilisé par l’homme depuis des millénaires, sur le système visuel sont peu connus. Une meilleure connaissance de la distribution du système endocannabinoïde (eCB) de la rétine pourrait expliquer comment cette drogue affecte la vision. Cette étude vise à caractériser la distribution du récepteur cannabinoïde CB1 (CB1R) et de l’enzyme de dégradation FAAH (“fatty acid amide hydrolase”) des ligands du CB1R dans la rétine du singe Vert (Chlorocebus sabaeus). De plus, elle vise à déterminer quelles sous-populations cellulaires de la rétine expriment ces composantes. La plupart des études à ce jour ont été conduites surtout sur les rongeurs et peu de travaux ont été réalisés chez le singe. Notre étude vient donc combler cette carence. Par le biais de méthodes immunohistochimiques, nous avons investigué la localisation du CB1R et de l’enzyme FAAH à différentes excentricités rétiniennes, de la fovéa centralis vers la périphérie. Nos résultats, en accord avec notre hypothèse de travail, démontrent que CB1R et FAAH sont exprimés à travers toute la rétine mais avec, cependant, des différences notoires. Au niveau de la couche des photorécepteurs, CB1R est exprimé préférentiellement dans les cônes et ce patron d’expression suit la distribution des photorécepteurs centre-périphérie. De plus, CB1R se retrouve surtout dans les pédicules des cônes de la couche plexiforme externe. CB1R et FAAH sont abondants dans les cellules bipolaires tant au centre qu’en périphérie. Le soma et l’axone des cellules ganglionnaires expriment aussi CB1R et FAAH. Ces données suggèrent que le système eCB est présent à travers toute la rétine du primate et pourrait expliquer les perturbations visuelles entrainées par la marijuana, telles la photosensibilité et la vision des couleurs.

Influence du système endocrinien de la vitamine D dans la régulation de la vitamine D3 25-hydroxylase CYP27A hépatique et intestinale chez l'humain et le rat

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Monoacylglycerol as a metabolic coupling factor in glucose-stimulated insulin secretion

Les cellules beta pancréatiques sécrètent l’insuline lors d’une augmentation post-prandiale du glucose dans le sang. Ce processus essentiel est contrôlé par des facteurs physiologiques, nutritionnels et pathologiques. D’autres sources d’énergie, comme les acides aminés (leucine et glutamine) ou les acides gras potentialisent la sécrétion d’insuline. Une sécrétion d’insuline insuffisante au besoin du corps déclanche le diabète. Le rôle que joue l’augmentation du calcium intracellulaire et les canaux K+/ATP dans la sécrétion d’insuline est bien connu. Bien que le mécanisme exact de la potentialisation de la sécrétion d’insuline par les lipides est inconnu, le cycle Glycérolipides/Acides gras (GL/FFA) et son segment lipolytique ont été reconnu comme un composant essentiel de la potentialisation lipidique de la sécrétion d’insuline. Le diacylglycérol, provenant de la lipolyse, a été proposé comme un signal lipidique important d’amplification. Cependant, l’hydrolyse des triglycérides et des diacylglycérides a été démontrée essentielle pour la sécrétion d’insuline stimulée par le glucose, en suggérant un rôle du monoacylglycérol (MAG) dans ce processus. Dans cette étude, on démontre que la réduction de la sécrétion d’insuline stimulée par le glucose, lors d’une inhibition de la lipolyse, est restaurée par l’addition de MAG. Dans les cellules beta pancréatiques, le niveau de MAG augmente en présence des concentrations élevées du glucose, et également lorsqu’on inhibe l’enzyme MAG hydrolase abhydrolase-6 (ABHD6) avec l’inhibiteur spécifique WWL70. L’analyse lipidomique a démontré qu’après la stimulation des cellules beta pancréatiques avec le glucose et aussi avec le WWL70, l’espèce la plus accumulée de MAG était le 1-stearoylglycérol (1-SG). L’addition de 1-SG, de 1-palmitoylglycérol (1-PG) ou de WWL70 augmente la sécrétion d’insuline stimulée par le glucose, et cette augmentation est indépendante de la génération de acides gras à partir de MAG. Cela suggère que le MAG est un signal lipidique pour la potentialisation de la sécrétion d’insuline stimulée par le glucose. De plus, la surexpression du gène d’ABHD6 dans les cellules INS832/13 cause une réduction de la sécrétion d’insuline, due probablement à la diminution des niveaux intracellulaire de MAG. Avec le but de comprendre le mécanisme moléculaire impliqué dans la potentialisation de la sécrétion d’insuline par le MAG, on a bloqué l’action du récepteur vanilloid-1 (TRPV1) liant le MAG par l’agent pharmacologiste, AMG9810. Le traitement des cellules beta pancréatique par AMG9810 entraîne une diminution de la potentialisation de la sécrétion de l’insuline induite par le MAG. Il est a noter que le MAG pourrait activer TRPV1 par une liaison physique dans la membrane cellulaire interne; ce qui entraînerai l’entrée du calcium dans la cellule, et ensuite la stimulation de l’exocytose des granules à insuline. En soutien de cette hypothèse, on a trouvé une diminution du calcium intracellulaire lorsqu’on traite au AMG9810 des cellules beta pancréatique de rat (provenant des îlots dispersés) stimulées au glucose et au WWL70. L’ensemble des résultats suggère que le MAG est un médiateur de la potentialisation lipidique de la sécrétion d’insuline stimulée par le glucose. Vu que l’inhibition pharmacologique d’ABHD6 augmente la sécrétion d’insuline, on pourra conclure que cette enzyme représente une cible thérapeutique potentielle dans le développement des médicaments anti-diabétiques, visant une augmentation de la sécrétion d’insuline.

Rôle et implication du système cannabinoïde dans la modulation périphérique de la douleur inflammatoire et neuropathique

Les dérivés de l’opium (opioïdes) et du cannabis (cannabinoïdes) présentent de nombreuses propriétés intéressantes. Suite à l’identification de leurs récepteurs respectifs, diverses stratégies pharmacologiques ont tenté d’exploiter leurs propriétés analgésiques. Le clonage des récepteurs cannabinoïdes CB1 et CB2 a favorisé la découverte de composés endogènes pour ces récepteurs, les endocannabinoïdes, dont les deux plus étudiés sont l’anandamide et le 2-arachidonyl glycérol (2-AG). Cette découverte a également mené à l’identification d’enzymes qui catalysent l’inactivation de ces cannabinoïdes endogènes : une amidohydrolase des acides gras ou FAAH ainsi qu’une monoacylglycérol lipase ou MAGL. Le système cannabinoïde endogène est régulé à la hausse dans une variété de processus pathologiques, tels que les douleurs inflammatoire et neuropathique. Cette augmentation est habituellement interprétée comme une réaction physiologique visant à rétablir l’homéostasie et elle a notamment été observée en périphérie. Les endocannabinoïdes semblent donc agir de façon spécifique à des moments clés dans certains tissus ciblés afin de minimiser les conséquences reliées au déclenchement de ces douleurs. Cette observation est très intéressante d’un point de vue thérapeutique puisqu’elle suggère la possibilité de cibler les enzymes de dégradation des endocannabinoïdes dans le but d’augmenter leurs concentrations locales et d’ainsi prolonger leur action neuromodulatrice. En périphérie, l’activation des récepteurs cannabinoïdes induit des effets antinociceptifs bénéfiques tout en minimisant les effets indésirables souvent associés à leur activation centrale. Nous avons orienté nos travaux vers la modulation périphérique de ce système endogène à l’aide d’inhibiteurs des enzymes de dégradation des endocannabinoïdes afin d’évaluer leur potentiel thérapeutique et d’élucider les mécanismes d’action qui sous-tendent leurs effets dans des modèles animaux de douleurs inflammatoire et neuropathique. Nous avons démontré que cette approche permet de soulager les symptômes associés à ces deux types de douleurs, et ce via les récepteurs CB1 et CB2. Les systèmes cannabinoïde et opioïde présentent des similitudes, dont des localisations similaires le long des voies de la douleur, des mécanismes d’action relayés par des récepteurs couplés aux protéines G et des propriétés pharmacologiques communes telles que l’analgésie. Le système opioïde est impliqué dans les effets antinociceptifs induits par les cannabinoïdes. À l’inverse, le rôle joué par le système cannabinoïde dans ceux induits par la morphine demeure incertain. Nous avons démontré que les effets antinociceptifs périphériques et spinaux produits par la morphine sont diminués chez les souris génétiquement modifiées chez lesquelles l’expression des récepteurs CB1 ou CB2 a été éliminée, laissant supposer un rôle pour ces récepteurs dans les effets de la morphine. Nous avons de plus démontré que la diminution de l'analgésie produite par la morphine dans ces souris n'est pas causée par un dysfonctionnement des récepteurs opioïdes mu (MOP) ni par une régulation à la baisse de ces récepteurs. Nos résultats confirment l'existence d'interactions fonctionnelles entre les systèmes cannabinoïde et opioïde au niveau périphérique et spinal. Ces observations sont prometteuses d’un point de vue thérapeutique puisqu’une modulation périphérique ciblée des niveaux d’endocannabinoïdes et d’opioïdes endogènes permettrait de produire des effets analgésiques bénéfiques potentiellement synergiques tout en minimisant les effets indésirables associés à l’activation centrale de ces systèmes.

Caractérisation fonctionnelle du suppresseur de tumeurs BAP1

La déubiquitinase BAP1 (« BRCA1-Associated Protein1 ») a initialement été isolée pour sa capacité de promouvoir la fonction suppressive de tumeurs de BRCA1. BAP1 est muté de manière homozygote dans plusieurs cancers (tel que le cancer du rein, de la peau, de l’oeil et du sein) suggérant fortement que cette déubiquitinase est un suppresseur de tumeurs. Effectivement, la surexpression de BAP1 réduit la prolifération cellulaire et la croissance tumorale dans des modèles de xénogreffe de souris. Toutefois, la fonction biologique et le mécanisme d’action de cette déubiquitinase restent encore marginalement connus. Ainsi, les objectifs de cette thèse sont de caractériser la fonction biologique de BAP1 et de révéler les bases moléculaires de sa fonction suppressive de tumeurs. Pour déterminer la fonction biologique de BAP1, nous avons immuno-purifié et identifié les protéines associées à BAP1, qui s’avèrent être principalement des facteurs et co-facteurs de transcription. Ensuite, nous avons démontré que BAP1 est un régulateur de la transcription. Parallèlement, un autre groupe a montré que BAP1 chez la drosophile, Calypso, régule l’ubiquitination de H2A et la transcription génique. D’autre part, nos résultats d’analyse d’expression génique globale suggèrent que BAP1 jouerait un rôle important dans la réponse aux dommages à l’ADN. Effectivement, des expériences de gain et de perte de fonction (méthode de l’ARNi, modèle de cellules KO en BAP1 et de cellules déficientes en BAP1 re-exprimant BAP1) ont révélé que cette déubiquitinase régule la réponse aux bris double brin d’ADN par la recombinaison homologue. Nos résultats suggèrent que BAP1 exerce sa fonction suppressive de tumeurs en contrôlant la réparation sans erreur de l’ADN via la recombinaison homologue. En cas d’inactivation de BAP1, les cellules deviendront plus dépendantes du mécanisme de réparation par jonction d'extrémités non-homologues, qui est potentiellement mutagénique causant ainsi l’instabilité génomique. D’autres études seront nécessaires afin de déterminer le rôle exact de BAP1 dans la transcription et de comprendre comment la dérégulation de l’ubiquitination de H2A contribue au développement du cancer. Définir les mécanismes de suppression tumorale est de grand intérêt, non seulement pour comprendre la carcinogénèse mais également pour le développement de nouvelles thérapies contre cette maladie.

Localization and function of the endocannabinoid system throughout the retinogeniculate pathway of vervet monkeys

Le système endocannabinoïde (eCB) est présent dans le système nerveux central (SNC) de mammifères, incluant la rétine, et est responsable de la régulation de nombreux processus physiologiques. Bien que la présence du récepteur cannabinoïde de type 1 (CB1R) a bien été documenté dans la rétine de rongeurs et primates, il y a encore une controverse quant à la présence du récepteur cannabinoïde de type 2 (CB2R) au niveau du SNC. En utilisant la microscopie confocale, nous sommes les premiers à signaler les patrons d’expression du CB2R dans la rétine de singe. Nos résultats démontrent que le CB2R est exprimé exclusivement dans les cellules de Müller de la rétine du singe. En outre, nous avons comparé les différents patrons d’expression du système eCB dans la rétine de la souris, du toupaye, ainsi que du singe vervet et macaque. Nous rapportons que les distributions de CB1R, FAAH (fatty acid amid hydrolase), MAGL (monoacylglycerol lipase) et DAGLα (diacylglycerol lipase alpha) sont hautement conservées parmi ces espèces alors que CB2R et NAPE-PLD (N-acyl phosphatidylethanolamine phospholipase D) présentent différents profils d'expression. CB2R n'a pas été détecté dans les cellules neuronales de la rétine des primates. L’immunoréactivité de NAPE-PLD est présente dans les couches de la rétine de souris et toupayes, mais a été limitée à la couche des photorécepteurs des singes vervet et macaque. Pour étudier les corrélats neuronaux et le rôle de la signalisation du système eCB dans la rétine, nous avons établi un protocole standard pour l'électrorétinographie (ERG), puis enregistré la réponse ERG de la rétine après le blocage des récepteurs avec des antagonistes spécifiques pour CB1R (AM251) et CB2R (AM630). Comparé au témoin, dans des conditions photopiques, et à certaines intensités faibles du stimulus, le blocage de CB1R diminue l'amplitude de l'onde-b, alors qu’à des intensités plus élevées, le blocage de CB2R augmente l'amplitude des deux-ondes a et b. De plus, le blocage des récepteurs cannabinoïdes provoque une augmentation de la latence des deux ondes a et b. Dans des conditions d’adaptation à l'obscurité, le blocage de CB1R et CB2R réduit l’amplitudes de l'onde a seulement à des intensités plus élevées et réduit l’onde b à intensités plus faibles. Des augmentations significatives de latence ont été observées dans les deux cas. Ces résultats indiquent que les récepteurs CB1 et CB2 chez les primates non humains sont impliqués dans la fonction rétinienne conditions photopiques. En outre, nous avons évalué le profil d'expression du CB1R, de FAAH et de NAPE-PLD au-delà de la rétine dans le corps géniculé latéral des singes et nous rapportons pour la première fois que CB1R et FAAH sont exprimés davantage dans les couches magnocellulaires. La NAPE-PLD a été localisée à travers les couches magno- et parvocellulaires. Aucune de ces composantes n’est exprimée dans les couches koniocellulaires. Ces résultats nous aident à mieux comprendre les effets des cannabinoïdes sur le système visuel qui pourraient nous mener à trouver éventuellement de nouvelles cibles thérapeutiques.

Lipoprotein-associated phospholipase A2 (Lp-PLA2) in acute coronary syndrome

La phospholipase A2 liée aux lipoprotéines (Lp-PLA2) est une biomarqueur de plusieurs maladies inflammatoires et une niveau sérique élevé est associé à l’instabilité de la plaque artérioscléreuse. Comme son nom l’indique, la Lp-PLA2 est liée aux lipoprotéines plasmatiques (LDL et HDL) et son rôle est de prévenir l’accumulation de phospholipides oxidés a la surface des lipoprotéines. Toutefois, les produits de dégradation des phospholipides oxidés par la Lp-PLA2 - le lysophosphatidyl choline par les acides gras oxidés peuvent aussi promouvoir l’inflammation. Mieux comprendre le métabolisme de la Lp-PLA2 pourrait nous permettre de mieux apprécier son rôle dans la formation d’une plaque artérioscléreuse instable, car des études antérieures ont démontré une forte expression de la Lp-PLA2 dans la plaque. De plus, il existe une forte corrélation entre les niveaux et l’activité plasmatiques de la Lp-PLA2 et la maladie coronarienne, les accidents cérébraux-vasculaires et la mortalité cardiaque. L’inhibition de la Lp-PLA2 avec une petite molécule, le darapladib, n’a pas démontré de bénéfice sur les évènements cardiovasculaires dans deux études cliniques. Cette thèse présentera d’abord une revue de la littérature sur la Lp-PLA2 et les maladies cardiovasculaires et les deuxième et troisième chapitres, une étude clinique réalisée sur des patients avec un syndrome coronarien aigu.

Glycosidation avec protection minimale en solution et sur support solide

Les glycosides sont reconnus pour leur potentiel pharmaceutique tels que les antibiotiques, les agents anticancéreux et antiviraux. Ils sont impliqués dans plusieurs processus biologiques entre autres la reconnaissance cellulaire, l’inflammation, la réponse immunitaire, la croissance, le transport cellulaire, l’adhésion cellulaire et les groupes sanguin. Notre groupe excelle dans la glycosidation stéréocontrôlée avec un minimum de protection suivant le concept d’activation à distance d’aglycones hétérocycliques anomériques. La présence d’une quantité sous stoechiométrique d’acide de Lewis, les (2-pyridyl)-β-D-glycosides déprotégés sont d’excellents donneurs permettant de haute sélectivité pour l’anomère- α-D de glycosides simples et complexes. Inversement, (2-pyridyl)-α-D-glycosides donnent les β-D-glycosides avec de bonne sélectivité. Des exemples de formation stéréocontrôlée de glycosides sont présentés dans cette thèse avec des accepteurs tels que les phénols, les stéroïdes, les terpènes et les acides hydroxyaminés. Cette méthodologie de glycosidation a été appliquée sur support solide.

Le système endocannabinoïde dans la rétine du singe : expression, localisation et fonctions

Le cannabis produit de nombreux effets psychologiques et physiologiques sur le corps humain. Les molécules contenues dans cette plante, désignées comme « phytocannabinoïdes », activent un système endogène qu’on appelle le système endocannabinoïde (eCB). Les effets de la consommation de cannabis sur la vision ont déjà été décrits sans cependant de formulation sur les mécanismes sous-jacents. Ces résultats comportementaux suggèrent, malgré tout, la présence de ce système eCB dans le système visuel, et particulièrement dans la rétine. Cette thèse vise donc à caractériser l’expression, la localisation et le rôle du système eCB dans la rétine du singe vervet, une espèce animale ayant un système visuel semblable à celui de l’humain. Nous avons mis au point un protocole expérimental d’immunohistochimie décrit dans l’article apparaissant dans l’Annexe I que nous avons utilisé pour répondre à notre objectif principal. Dans une première série de quatre articles, nous avons ainsi caractérisé l’expression et la localisation de deux récepteurs eCBs reconnus, les récepteurs cannabinoïdes de type 1 (CB1R) et de type 2 (CB2R), et d’un 3e présumé récepteur aux cannabinoïdes, le récepteur GPR55. Dans l’article 1, nous avons démontré que CB1R et une enzyme clé de ce système, la fatty acid amide hydrolase (FAAH), sont exprimés dans les parties centrale et périphérique de la rétine, et abondamment présents dans la fovéa, une région où l’acuité visuelle est maximale. Dans l’article 2, nous avons localisé le CB2R dans des cellules gliales de la rétine : les cellules de Müller et nous avons proposé un modèle sur l’action de cette protéine dans la fonction rétinienne faisant appel à une cascade chimique impliquant les canaux potassiques. Dans l’article 3, nous avons observé le GPR55 exclusivement dans les bâtonnets qui sont responsables de la vision scotopique et nous avons soumis un deuxième modèle de fonctionnement de ce récepteur par le biais d'une modulation des canaux calciques et sodiques des bâtonnets. Vu que ces 3 récepteurs se retrouvent dans des cellules distinctes, nous avons suggéré leur rôle primordial dans l’analyse de l’information visuelle au niveau rétinien. Dans l’article 4, nous avons effectué une analyse comparative de l’expression du système eCB dans la rétine de souris, de toupayes (petits mammifères insectivores qui sont sont considérés comme l’étape intermédiaire entre les rongeurs et les primates) et de deux espèces de singe (le vervet et le rhésus). Ces résultats nous ont menés à présenter une hypothèse évolutionniste quant à l’apparition et à la fonction précise de ces récepteurs. Dans les articles subséquents, nous avons confirmé notre hypothèse sur le rôle spécifique de ces trois récepteurs par l’utilisation de l’électrorétinographie (ERG) après injection intravitréenne d’agonistes et d’antagonistes de ces récepteurs. Nous avons conclu sur leur influence indéniable dans le processus visuel rétinien chez le primate. Dans l’article 5, nous avons établi le protocole d’enregistrement ERG normalisé sur le singe vervet, et nous avons produit un atlas d’ondes ERG spécifique à cette espèce, selon les règles de l’International Society for Clinical Electrophysiology of Vision (ISCEV). Les patrons électrorétinographiques se sont avérés semblables à ceux de l’humain et ont confirmé la similarité entre ces deux espèces. Dans l’article 6, nous avons démontré que le blocage de CB1R ou CB2R entraine une modification de l’électrorétinogramme, tant au niveau photopique que scotopique, ce qui supporte l’implication de ces récepteurs dans la modulation des ondes de l’ERG. Finalement, dans l’article 7, nous avons confirmé le modèle neurochimique proposé dans l’article 3 pour expliquer le rôle fonctionnel de GPR55, en montrant que l’activation ou le blocage de ce récepteur, respectivement par un agoniste (lysophosphatidylglucoside, LPG) ou un antagoniste (CID16020046), entraine soit une augmentation ou une baisse significative de l’ERG scotopique seulement. Ces données, prises ensemble, démontrent que les récepteurs CB1R, CB2R et GPR55 sont exprimés dans des types cellulaires bien distincts de la rétine du singe et ont chacun un rôle spécifique. L’importance de notre travail se manifeste aussi par des applications cliniques en permettant le développement de cibles pharmacologiques potentielles dans le traitement des maladies de la rétine.

Dopamine Receptor Subtypes,IP3, cAMP and cGMP Functional Regulation in Parkinsonism Induced by Unilateral Infusion of Rotenone in Rats: Recovery with Bone Marrow Cells,Serotonin and GABA Supplementation

In the present study, the effects of 5-HT, GABA and Bone Marrow Cells infused intranigrally to substantia nigra individually and in combinations on unilateral rotenone infused Parkinsonism induced rats. Scatchard analysis of DA, DA D1 and D2 receptors in the corpus striatum, cerebral cortex, cerebellum, brain stem and hippocampus showed a significant increase in the Brain regions of rotenone infused rat compared to control. Real Time PCR amplification of DA D1, D2, Bax and ubiquitin carboxy-terminal hydrolase were up regulated in the brain regions of rotenone infused rats compared to control. Gene expression studies of -Synuclien, cGMP and Cyclic AMP response element-binding protein showed a significant down regulation in Rotenone infused rats compared to control. Behavioural studies were carried out to confirm the biochemical and molecular studies.Our study demonstrated that BMC administration alone cannot reverse the above said molecular changes occurring in PD rat. 5-HT and GABA acting through their specific receptors in combination with bone marrow cells play a crucial role in the functional recovery of PD rats. 5-HT, GABA and Bone marrow cells treated PD rats showed significant reversal to control in DA receptor binding and gene expression. 5-HT and GABA have co-mitogenic property. Proliferation and differentiation of cells re-establishing the connections in Parkinson's disease facilitates the functional recovery. Thus, it is evident that 5-HT and GABA along with BMC to rotenone infused rats renders protection against oxidative, related motor and cognitive deficits which makes them clinically significant for cellbased therapy. The BMC transformed to neurons when co-transplanted with 5-HT and GABA which was confirmed with PKH2GL and nestin. These newly formed neurons have functional significance in the therapeutic recovery of Parkinson’s disease.

β-glucosidases from Aspergillus unguis NII 08123: Molecular characterization, properties and applications

Lignocellulosic biomass is probably the best alternative resource for biofuel production and it is composed mainly of cellulose, hemicelluloses and lignin. Cellulose is the most abundant among the three and conversion of cellulose to glucose is catalyzed by the enzyme cellulase. Cellulases are groups of enzymes act synergistically upon cellulose to produce glucose and comprise of endoglucanase, cellobiohydrolase and β-glucosidase. β -glucosidase assumes great importance due to the fact that it is the rate limiting enzyme. Endoglucanases (EG) produces nicks in the cellulose polymer exposing reducing and non reducing ends, cellobiohydrolases (CBH) acts upon the reducing or non reducing ends to liberate cellobiose units, and β - glucosidases (BGL) cleaves the cellobiose to liberate glucose completing the hydrolysis. . β -glucosidases undergo feedback inhibition by their own product- β glucose, and cellobiose which is their substrate. Few filamentous fungi produce glucose tolerant β - glucosidases which can overcome this inhibition by tolerating the product concentration to a particular threshold. The present study had targeted a filamentous fungus producing glucose tolerant β - glucosidase which was identified by morphological as well as molecular method. The fungus showed 99% similarity to Aspergillus unguis strain which comes under the Aspergillus nidulans group where most of the glucose tolerant β -glucosidase belongs. The culture was designated the strain number NII 08123 and was deposited in the NII culture collection at CSIR-NIIST. β -glucosidase multiplicity is a common occurrence in fungal world and in A.unguis this was demonstrated using zymogram analysis. A total 5 extracellular isoforms were detected in fungus and the expression levels of these five isoforms varied based on the carbon source available in the medium. Three of these 5 isoforms were expressed in higher levels as identified by the increased fluorescence (due to larger amounts of MUG breakdown by enzyme action) and was speculated to contribute significantly to the total _- β glucosidase activity. These isoforms were named as BGL 1, BGL3 and BGL 5. Among the three, BGL5 was demonstrated to be the glucose tolerant β -glucosidase and this was a low molecular weight protein. Major fraction was a high molecular weight protein but with lesser tolerance to glucose. BGL 3 was between the two in both activity and glucose tolerance.121 Glucose tolerant .β -glucosidase was purified and characterized and kinetic analysis showed that the glucose inhibition constant (Ki) of the protein is 800mM and Km and Vmax of the enzyme was found to be 4.854 mM and 2.946 mol min-1mg protein-1respectively. The optimumtemperature was 60°C and pH 6.0. The molecular weight of the purified protein was ~10kDa in both SDS as well as Native PAGE indicating that the glucose tolerant BGL is a monomeric protein.The major β -glucosidase, BGL1 had a pH and temperature optima of 5.0 and 60 °C respectively. The apparent molecular weight of the Native protein is 240kDa. The Vmax and Km was 78.8 mol min-1mg protein-1 and 0.326mM respectively. Degenerate primers were designed for glycosyl hydrolase families 1, 3 and 5 and the BGL genes were amplified from genomic DNA of Aspergillus unguis. The sequence analyses performed on the amplicons results confirmed the presence of all the three genes. Amplicon with a size of ~500bp was sequenced and which matched to a GH1 –BGL from Aspergillus oryzae. GH3 degenerate primers producing amplicons were sequenced and the sequences matched to β - glucosidase of GH3 family from Aspergillus nidulans and Aspergillus acculateus. GH5 degenerate primers also gave amplification and sequencing results indicated the presence of GH5 family BGL gene in the Aspergillus unguis genomic DNA.From the partial gene sequencing results, specific as well as degenerate primers were designed for TAIL PCR. Sequencing results of the 1.0 Kb amplicon matched Aspergillus nidulans β -glucosidase gene which belongs to the GH1 family. The sequence mainly covered the N-Terminal region of the matching peptide. All the three BGL proteins ie. BGL1, BGL3 and BGL5 were purified by chromatography an electro elution from Native PAGE gels and were subjected to MALDI-TOF mass spectrometric analysis. The results showed that BGL1 peptide mass matched to . β -glucosidase-I of Aspergillus flavus which is a 92kDa protein with 69% protein coverage. The glucose tolerant β -glucosidase BGL5 mass matched to the catalytic C-terminal domain of β -glucosidase-F from Emericella nidulans, but the protein coverage was very low compared to the size of the Emericella nidulans protein. While comparing the size of BGL5 from Aspergillus unguis, the protein sequence coverage is more than 80%. BGL F is a glycosyl hydrolase family 3 protein.The properties of BGL5 seem to be very unique, in that it is a GH3 β -glucosidase with a very low molecular weight of ~10kDa and at the same time having catalytic activity and glucose 122 tolerance which is as yet un-described in GH β -glucosidases. The occurrence of a fully functional 10kDA protein with glucose tolerant BGL activity has tremendous implications both from the points of understanding the structure function relationships as well as for applications of BGL enzymes. BGL-3 showed similarity to BGL1 of Aspergillus aculateus which was another GH3 β -glucosidase. It may be noted that though PCR could detect GH1, GH3 and GH5 β-glucosidases in the fungus, the major isoforms BGL1 BGL3 and BGL5 were all GH3 family enzymes. This would imply that β-glucosidases belonging to other families may also co-exist in the fungus and the other minor isoforms detected in zymograms may account for them. In biomass hydrolysis, GT-BGL containing BGL enzyme was supplemented to cellulase and the performances of blends were compared with a cocktail where commercial β- glucosidase was supplemented to the biomass hydrolyzing enzyme preparation. The cocktail supplemented with A unguis BGL preparation yielded 555mg/g sugar in 12h compared to the commercial enzyme preparation which gave only 333mg/g in the same period and the maximum sugar yield of 858 mg/g was attained in 36h by the cocktail containing A. unguis BGL. While the commercial enzyme achieved almost similar sugar yield in 24h, there was rapid drop in sugar concentration after that, indicating probably the conversion of glucose back to di-or oligosaccharides by the transglycosylation activity of the BGl in that preparation. Compared this, the A.unguis enzyme containing preparation supported peak yields for longer duration (upto 48h) which is important for biomass conversion to other products since the hydrolysate has to undergo certain unit operations before it goes into the next stage ie – fermentation in any bioprocesses for production of either fuels or chemicals.. Most importantly the Aspergillus unguis BGL preparation yields approximately 1.6 fold increase in the sugar release compared to the commercial BGL within 12h of time interval and 2.25 fold increase in the sugar release compared to the control ie. Cellulase without BGL supplementation. The current study therefore leads to the identification of a potent new isolate producing glucose tolerant β - glucosidase. The organism identified as Aspergillus unguis comes under the Aspergillus nidulans group where most of the GT-BGL producers belong and the detailed studies showed that the glucose tolerant β -glucosidase was a very low molecular weight protein which probably belongs to the glycosyl hydrolase family 3. Inhibition kinetic studies helped to understand the Ki and it is the second highest among the nidulans group of Aspergilli. This has promoted us for a detailed study regarding the mechanism of glucose tolerance. The proteomic 123 analyses clearly indicate the presence of GH3 catalytic domain in the protein. Since the size of the protein is very low and still its active and showed glucose tolerance it is speculated that this could be an entirely new protein or the modification of the existing β -glucosidase with only the catalytic domain present in it. Hydrolysis experiments also qualify this BGL, a suitable candidate for the enzyme cocktail development for biomass hydrolysis