Rôle de la protéine DUSP5 dans l’autophagie des cardiomyocytes

Résumé: L’autophagie est un processus essentiel au maintien de l’homéostasie cellulaire. Elle permet de dégrader et recycler aussi bien des organelles entières que des composants cytoplasmiques non fonctionnels. De plus, l’augmentation d’autophagie en condition de stress constitue une réponse adaptative favorisant la survie cellulaire. Chez les cardiomyocytes, l’autophagie en condition basale est indispensable au renouvellement, entre autres, des mitochondries et des protéines formant les sarcomères. De plus, les stress tels l’ischémie cardiaque ou la carence en nutriments induisent une augmentation de l’autophagie protectrice. Dans certaines conditions extrêmes, il a été suggéré qu’un surcroît d’autophagie puisse toutefois exacerber la pathologie cardiaque en provoquant la mort des cardiomyocytes. Considérant l’importance de ce processus dans la physiopathologie cardiaque, l’identification des mécanismes signalétiques régulant l’autophagie chez les cardiomyocytes a été le sujet de recherches intenses. À cet effet, l’activation des Mitogen-Activated Protein Kinase (MAPK) a été démontrée pour réguler, avec d’autres voies signalétiques, l’autophagie et l’apoptose des cardiomyocytes. Il est donc probable que les Dual-Specificity Phosphatase (DUSP), enzymes clés contrôlant l’activité des MAPK, participent aussi à la régulation de l’autophagie. Afin de vérifier cette hypothèse, nous avons induit l’autophagie chez des cardiomyocytes isolés de rats nouveau-nés en culture. L’analyse de marqueurs d’autophagie par immunobuvardage démontre que l’activation des MAPK ERK1/2 et p38 corrèle avec l’activité autophagique chez les cardiomyocytes. Dans ces conditions, la diminution d’expression de la majorité des ARNm encodant les différentes DUSP retrouvées chez les cardiomyocytes contraste de façon marquée avec l’augmentation d’expression de l’ARNm Dusp5. De plus, nous avons démontré par une étude de gain de fonction que l’activation soutenue de p38 par surexpression d’un mutant MKK6 constitutivement actif stimule l’autophagie chez les cardiomyocytes. De façon surprenante, la perte de fonction de p38 obtenue par surexpression d’un mutant p38 dominant négatif n’altère en rien la réponse autophagique initiatrice dans notre modèle in vitro. Nos résultats suggèrent que les DUSP puissent réguler, via leurs actions sur les MAPK, d’importantes étapes du processus autophagique chez les cardiomyocytes.

Effets du stress oxydatif induit par les rayons UVA et endogène sur la cornée humaine : étude des délétions de l’ADN mitochondrial, des modifications dans la matrice extracellulaire cornéenne et de la dystrophie cornéenne endothéliale de Fuchs

Le stress oxydatif peut provenir de sources exogènes comme les UVA ou de sources endogènes comme la chaîne respiratoire (OXPHOS). L’oxydation des composants cellulaires a été associée avec la dégénération, des phénotypes de vieillissement et des pertes de fonctionnalités des tissus. Les UVA sont les plus efficaces des rayons UV à induire de l’oxydation, tel que démontré par la formation de dommages oxydatifs à l’ADN et par l’apparition de délétions mitochondriales qui en résultent. La délétion mitochondriale de 4977 pb (ADNmtCD4977), la plus commune, et celle de 3895 pb (ADNmt3895) sont deux délétions reliées au photovieillissement cutané et à l’exposition au stress oxydant. Le phénomène de vieillissement dans la peau est bien documenté et se traduit par une dégradation de la matrice extracellulaire, une perte d’élasticité et la formation de rides. Toutefois, peu d’études portent sur la cornée humaine alors qu’elle est un tissu exposé directement aux rayonnements UV au même titre que la peau. Nous avons donc tenté mieux comprendre l’effet de l’oxydation exogène et endogène sur cette structure. L’analyse de la localisation des délétions ADNmtCD4977 et ADNmtCD4977 dans l’oeil humain a permis de révéler qu’elles se concentrent principalement dans le stroma cornéen et s’accumule avec l’âge. Le stroma cornéen est la couche cellulaire qui confère la transparence et la rigidité à la cornée humaine. Ces résultats nous ont suggéré une implication des UVA dans le photovieillissement de la cornée. Nous avons donc entrepris de vérifier les changements liés à l’exposition aux UVA dans le stroma cornéen puisque les UVA sont connus pour causer des altérations à la matrice extracellulaire (ECM) au niveau cutané. Nous avons donc créé un modèle de photovieillisement par une exposition chronique aux UVA sur des kératocytes avec lesquels nous avons fait sécréter une ECM. Nos résultats nous ont démontré qu’une exposition chronique aux UVA cause des altérations à l’ECM cornéen semblable à des phénotypes de photvieillissement. En effet, nous avons dénoté des changements transcriptomiques et protéomiques pour certains collagènes et protéoglycans. Une atteinte aux collagènes par le vieillissement cornéen se traduit entre autres par une rigidification, une opacification et un changement dans son pouvoir réfractif qui mène à une perte de la vision. Par ailleurs, notre avons également investigué l’implication du stress oxydatif dans la dystrophie cornéenne endothéliale de Fuchs (FECD), une maladie dégénérative de l’endothélium cornéen, qui mène à une perte de vision et est une cause principale de greffe cornéenne. L’étiologie de la maladie est encore inconnue, mais le stress oxydatif est soupçonné de jouer un rôle important dans la pathogenèse. Nos résultats ont amené de nouvelles évidences de l’implication de l’oxydation dans la maladie par l’augmentation de la quantité d’ADN mitochondrial et un raccourcissement des télomères dans des explants de cornées pathologiques. Nos résultats nous ont également démontré que la mise en culture de cellules FECD permettait la sélection de cellules fonctionnelles et comparables à des cellules saines en termes de quantité d’ADN mitochondrial et de son intégrité, de sensibilité à l’oxydation et de longueur télomérique. Les résultats obtenus soutiennent ainsi la possibilité d’employer les cellules FECD fonctionnelles sélectionnées pour utilisation en génie tissulaire afin de créer des cornées autologues pour pallier aux manques de greffes cornéennes. Enfin, nos résultats apportent de nouvelles évidences quant à l’implication du stress oxydatif dans le photovieillissement cornéen et dans l’étiologie de la FECD.

Étude de la toxicité causée par le gène C9orf72 dans la Sclérose Latérale Amyotrophique

La Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA) est une maladie neurodégénérative qui affecte les neurones moteurs. 10% des cas sont des cas familiaux et l’étude de ces familles a mené à la découverte de plusieurs gènes pouvant causer la SLA, incluant SOD1, TARDBP et FUS. L’expansion de la répétition GGGGCC dans le gène C9orf72 est, à ce jour, la cause la plus connue de SLA. L’impact de cette expansion est encore méconnu et il reste à déterminer si la toxicité est causée par un gain de fonction, une perte de fonction ou les deux. Plusieurs gènes impliqués dans la SLA sont conservés entre le nématode Caenorhabditis elegans et l’humain. C. elegans est un vers transparent fréquemment utilisé pour des études anatomiques, comportementales et génétiques. Il possède une lignée cellulaire invariable qui inclue 302 neurones. Aussi, les mécanismes de réponse au stress ainsi que les mécanismes de vieillissement sont très bien conservés entre ce nématode et l’humain. Donc, notre groupe, et plusieurs autres, ont utilisé C. elegans pour étudier plusieurs aspects de la SLA. Pour mieux comprendre la toxicité causée par l’expansion GGGGCC de C9orf72, nous avons développé deux modèles de vers pour étudier l’impact d’une perte de fonction ainsi que d’un gain de toxicité de l’ARN. Pour voir les conséquences d’une perte de fonction, nous avons étudié l’orthologue de C9orf72 dans C. elegans, alfa-1 (ALS/FTD associated gene homolog). Les vers mutants alfa-1(ok3062) développent des problèmes moteurs causant une paralysie et une dégénérescence spécifique des neurones moteurs GABAergiques. De plus, les mutants sont sensibles au stress osmotique qui provoque une dégénérescence. D’autre part, l’expression de la séquence d’ARN contenant une répétition pathogénique GGGGCC cause aussi des problèmes moteurs et de la dégénérescence affectant les neurones moteurs. Nos résultats suggèrent donc qu’un gain de toxicité de l’ARN ainsi qu’une perte de fonction de C9orf72 sont donc toxiques pour les neurones. Puisque le mouvement du vers peut être rapidement évalué en cultivant les vers dans un milieu liquide, nous avons développé un criblage de molécules pouvant affecter le mouvement des vers mutants alfa-1 en culture liquide. Plus de 4 000 composés ont été évalués et 80 ameliore la mobilité des vers alfa-1. Onze molécules ont aussi été testées dans les vers exprimant l’expansion GGGGCC et huit diminuent aussi le phénotype moteur de ces vers. Finalement, des huit molécules qui diminent la toxicité causée par la perte de fonction de C9orf72 et la toxicité de l’ARN, deux restaurent aussi l’expression anormale de plusieurs transcrits d’ARN observée dans des cellules dérivées de patient C9orf72. Avec ce projet, nous voulons identifier des molécules pouvant affecter tous les modes de toxicité de C9orf72 et possiblement ouvrir de nouvelles avenues thérapeutiques

Phosphodiesterase 6 generates intracellular cGMP microdomains in the native endothelium

Endothelial cells (EC) are essential regulator of vascular homeostasis through the generation and release of various bioactive agents, including nitric oxide (NO). NO modulates several vascular functions such as vascular tone and permeability, through the stimulation of soluble guanylate cyclase (sGC) leading to the production of cGMP. Conversely, phosphodiesterases (PDEs) are enzymes metabolizing cyclic nucleotides (cGMP and cAMP) and are therefore major regulatory players for cGMP and cAMP signalling pathways. Although ECs are the main source of NO, little is known on the endothelial NO-cGMP signalling pathway and cellular outcomes. It was then hypothesized that a specific population of cGMP-phosphodiesterases allows ECs to stabilize cGMP levels despite the elevated production of NO. Expression of cGMP-phosphodiesterases was initially studied in resistance mesenteric arteries from mice. PDE5 and PDE6 were both found at mRNA and protein levels in native arteries but PDE6 is not found in cultured ECs. Interestingly, subcellular distributions of both enzymes were distinct. PDE5 appeared to be homogeneously distributed whilst PDE6 catalytic subunits (PDE6 and PDE6) showed a preferential staining in the perinuclear region. These results suggest that PDE6 might be involved in the regulation of cGMP microdomains. Based on these findings, a mathematical model was developed. Simulations of dynamic cGMP levels in ECs support the notion of cGMP microdomains dependent on PDE6 expression and localization. In the absence of PDE6, application of NO either as a single bolus or repetitive pulses led to a homogeneous increase in cGMP levels in ECs despite PDE5 homogeneous distribution. However, PDE6 subcellular targeting to the perinuclear membrane generated a cGMP-depleted perinuclear space. The findings from this study provide the first evidence of the expression and specific intracellular distribution of PDE6 in native endothelial cells that strongly support their involvement in the generation of cGMP microdomains

Phosphodiesterase 6 generates intracellular cGMP microdomains in the native endothelium

Endothelial cells (EC) are essential regulator of vascular homeostasis through the generation and release of various bioactive agents, including nitric oxide (NO). NO modulates several vascular functions such as vascular tone and permeability, through the stimulation of soluble guanylate cyclase (sGC) leading to the production of cGMP. Conversely, phosphodiesterases (PDEs) are enzymes metabolizing cyclic nucleotides (cGMP and cAMP) and are therefore major regulatory players for cGMP and cAMP signalling pathways. Although ECs are the main source of NO, little is known on the endothelial NO-cGMP signalling pathway and cellular outcomes. It was then hypothesized that a specific population of cGMP-phosphodiesterases allows ECs to stabilize cGMP levels despite the elevated production of NO. Expression of cGMP-phosphodiesterases was initially studied in resistance mesenteric arteries from mice. PDE5 and PDE6 were both found at mRNA and protein levels in native arteries but PDE6 is not found in cultured ECs. Interestingly, subcellular distributions of both enzymes were distinct. PDE5 appeared to be homogeneously distributed whilst PDE6 catalytic subunits (PDE6 and PDE6) showed a preferential staining in the perinuclear region. These results suggest that PDE6 might be involved in the regulation of cGMP microdomains. Based on these findings, a mathematical model was developed. Simulations of dynamic cGMP levels in ECs support the notion of cGMP microdomains dependent on PDE6 expression and localization. In the absence of PDE6, application of NO either as a single bolus or repetitive pulses led to a homogeneous increase in cGMP levels in ECs despite PDE5 homogeneous distribution. However, PDE6 subcellular targeting to the perinuclear membrane generated a cGMP-depleted perinuclear space. The findings from this study provide the first evidence of the expression and specific intracellular distribution of PDE6 in native endothelial cells that strongly support their involvement in the generation of cGMP microdomains

Role of 17β-Hydroxysteroid Dehydrogenase Type 5 in Breast Cancer Studied by Intracrinology

Dans cette thèse, je présente une étude (1) du rôle de la 17β-HSD5 dans la modulation des taux d’hormones et dans la prolifération, et l’impact de l’expression de la 17β-HSD5 sur d’autres protéines de BC cellules; (2) une étude comparative sur trois enzymes (17β-HSD1, 17β-HSD7 et 3α-HSD3) avec la provision de DHEA et ses substrats directes soit l’E1 ou la DHT. Les principaux résultats obtenus dans cette étude sont les suivants: (1) en utilisant l’ARN d’interférence de la 17β-HSD5, des immunodosages enzymatiques et des tests de prolifération de cellules démontrent que l’expression de la 17β-HSD5 est positivement corrélée à un niveau de T et de DHT dans les BCC, mais négativement corrélée pour l’E2 et la prolifération des cellules de BC (2) les analyses quantitatives de PCR en temps réel et de Western blot ont démontré que l’inhibition de l’expression de la 17β-HSD5 régule à la hausse l’expression de l’aromatase dans les cellules MCF-7. (3) L’analyse d’ELISA de la prostaglandine E2 a vérifié que l’expression accrue de l’aromatase a été modulée par des niveaux élevés de PGE2 après l’inactivation de l’expression du gène de la 17β-HSD5. (4) Le test de cicatrisation a montré que l’inactivation de l’expression du gène de la 17β-HSD5 favorise l’augmentation de la migration cellulaire. (5) L’expression du gène 17β-HSD5 dans des échantillons cliniques, à partir de l’analyse de base de données ONCOMINE, a montré que sa plus faible expression a été corrélée avec le statut de l’HER-2 et de la métastase de la tumeur. (6) Les données protéomiques révèlent également que des protéines impliquées dans les voies métaboliques sont fortement exprimées dans les cellules MCF-7 après l’inactivation de l’expression du gène de la 17β-HSD5. (7) L’étude n’a démontré aucune différence dans la fonction biologique de la 17β-HSD1 et de la 17β-HSD7 lorsqu’elles sont cultivées avec différentes stéroïdes: tel que les niveaux de stéroides, la prolifération cellulaire et les protéines régulées. (8) Toutefois, la supplémentation du milieu de culture se révèle avoir un impact marqué sur l’étude de la 3α-HSD3. (9). Nous avons proposé que l’utilisation de la DHEA comme source d’hormone puisse entraîner une meilleure imitation des conditions physiologiques post-ménopausales en culture cellulaire selon l’intracrinologie.

Caractérisation de l’effet antibiofilm et antibactérien du chitosane sur les souches de Staphylococcus aureus responsables des mammites bovines

La mammite bovine est l’inflammation des tissus internes de la glande mammaire des vaches laitières. Elle est la plupart du temps causée par l’intrusion d’agents pathogènes dans le canal du trayon de la glande mammaire causant ainsi une infection intramammaire (IIM). La mammite engendre des pertes économiques importantes pour l’industrie laitière en raison de la faible production du lait, des coûts de traitements élevés, la présence de résidus d’antibiotiques dans le lait suite à leur utilisation, le rejet de lait non destiné à la consommation et les faibles taux de rendement pendant la transformation du lait en divers produits laitiers. Le développement de l’inflammation est souvent associé au degré d’exposition des glandes mammaires aux pathogènes. Staphylococcus aureus est le pathogène le plus souvent responsable de la mammite bovine au Canada. Il est capable de causer des infections intramammaires persistantes sous-cliniques souvent réfractaires à l’antibiothérapie. En outre, le biofilm représente un facteur de virulence clé dans la persistance de S. aureus pendant la mammite, car il augmente la résistance des bactéries contre les antibiotiques grâce à la matrice extracellulaire qui recouvre et protège la communauté. Le biofilm représente donc, une problématique majeure de l’industrie laitière et le besoin de nouveaux outils thérapeutiques alternatifs adressant ce facteur de virulence est très urgent. Le chitosane est une molécule naturelle extraite de la carapace des crustacés. Elle est exploitée pour de multiples applications biologiques, y compris certaines activités antibiofilm. Dans cette étude, nous avons démontré que les formes de 2,6 kDa et 4 kDa empêchaient la production de biofilm des souches : S. aureus 2117 (forte productrice du biofilm) et le SARM bovin (S. aureus résistant à la méthicilline). Chez la souris, l’administration d’un chitosane de 2,6 kDa n’a démontré aucun effet inflammatoire comparativement au 4 kDa. Les tests de bactéricidie ont démontré que le 2,6 kDa était capable de tuer les bactéries incorporées dans les biofilms préformés d'une manière dose-réponse avec une réduction de > 3 log[indice inférieur 10] CFU / biofilm à la concentration de 4 mg / ml. En culture cellulaire, nous avons observé que le chitosane de 2,6 kDa pouvait empêcher la persistance du SARM bovin dans les cellules épithéliales bovines MAC-T. Les tests de combinaison sur plaque ont révélé que le 2,6 kDa produit une synergie avec les antibiotiques de la classe des macrolides (par exemple, la tilmicosine) contre S. aureus, en réduisant la CMI des deux molécules par 2-8 fois. Finalement, l'administration intramammaire de 2,6 kDa, seul (p <0,01) ou en combinaison avec la tilmicosine (p <0,0001), a réduit la colonisation de S. aureus dans les glandes mammaires de notre modèle de mammite aigu murin.

Procesos de cambio en la cultura jurídica: análisis desde la experiencia del juicio por jurados. Processes of change in the Legal Culture: Analysis from the Experience of Jury Trials.

El presente proyecto de investigación se orienta a analizar la institución del juicio por jurados, considerada como un punto estratégico para la observación de los procesos de cambio que recorren la cultura jurídica en Argentina. Frente a las múltiples transformaciones y a los intensos procesos de reestructuración de las relaciones sociales observados en el contexto latinoamericano y especialmente en Argentina, la necesidad de reconstruir la legitimidad de los jueces ante la opinión pública se ha vuelto impostergable, y el recurso a la participación popular en el campo judicial aparece como un instrumento útil para ello. Analizar la efectividad de esta estrategia para la legitimación del poder judicial es uno de los objetivos del presente proyecto de investigación. Abordar dicho objetivo implica, indagar en la relación entre la administración de justicia y diferentes actores sociales, especialmente los miembros de la profesión jurídica y la opinión pública.Se explora igualmente la contradicción entre el hecho de que esta institución, nacida para atenuar la dureza de los castigos, se ha implementado recientemente en la provincia de Córdoba en la situación inversa. El modo en que la tensión entre el espíritu garantista de los jueces y la demanda de castigos de los ciudadanos comunes se manejará en la práctica de los juicios por jurado, y su incidencia en el éxito de las estrategias legitimadoras del poder judicial, aparece como una cuestión relevante para el análisis que se propone. Con la utilización de diferentes fuentes de información cuantitativas y cualitativas, se espera que el análisis de la implementación del juicio penal con jurados populares en la provincia de Córdoba propuesto en el presente proyecto, contribuya a documentar los niveles de articulación entre la cultura jurídica interna y externa.

Le football comme religion populaire et comme culture mondialisée : brèves notations en vue d'une interprétation critique d'une quasi-religion contemporaine

(Résumé de l'ouvrage) Le présent recueil d'hommages veut témoigner de l'importance de l'oeuvre théologique de Jean Richard, professeur à la Faculté de théologie et de sciences religieuses de l'Université Laval. Désireux de signifier leur reconnaissance au père Richard, les auteurs de ce livre ont proposé des textes s'inscrivant dans l'un ou l'autre de ses champs de recherche privilégiés. Le tableau des contributeurs à ces mélanges regroupe des théologiens de tous les âges, hommes et femmes, provenant du Canada, mais aussi des États-Unis et de l'Europe, de langue française, anglaise ou allemande, de confession catholique ou protestante, oeuvrant dans des champs disciplinaires aussi divers que la théologie systématique, la théologie fondamentale, l'éthique théologique, l'exégèse ou encore la philosophie. Cette diversité est révélatrice de la personnalité théologique du père Richard, du caractère international de son réseau d'amitiés et de recherche et de l'ampleur de son influence. Elle témoigne aussi de l'audace d'une oeuvre qui, entreprise dans les années 1960, a dès le départ relevé le défi de l'aggiornamento que venait de poser en toute urgence son Église et qui a très vite conduit son auteur « aux confins », pour reprendre - et pour cause - une expression de son mentor Paul Tillich qui lui sied à merveille. Les contributions réunies dans ce volume ne résultent pas d'un plan concerté. D'autant plus significatifs sont les recoupements thématiques qu'on y observe, qui, par un hasard seulement apparent, restituent les principaux axes de la production théologique du père Jean Richard. L'ouverture au présent et a ses problématiques propres, ainsi que les défis conceptuels par là posés à l'effort théologique constituent les deux constantes de ces contributions, comme de l'oeuvre qui les a inspirées.