Inibizione selettiva delle istone-deacetilasi nelle cellule neoplastiche come approccio innovativo alla terapia antitumorale

Lo scopo di questo lavoro di tesi consiste nel valutare l’efficacia di inibizione delle HDAC e la selettività per le cellule tumorali di nuove molecole basate su coniugati poliamminici (PC1, PC2, PC3, PC4, PC5). I modelli sperimentali utilizzati saranno una linea cellulare tumorale di glioblastoma umano (U87), paragonata a una linea cellulare sana di fibroblasti fetali umani (IMR90). Il progetto nasce dalla collaborazione con la Prof.ssa Anna Minarini del Dipartimento di Farmacia e BioTecnologie di Bologna e con il Dott. Andrea Milelli del Dipartimento di Scienze per la Qualità della Vita di Rimini che hanno progettato e sintetizzato i composti poliamminici utilizzati negli esperimenti condotti nel laboratorio di Ingegneria Cellulare e Molecolare “S. Cavalcanti” a Cesena. Gli obiettivi del progetto consistono nel valutare i potenziali vantaggi che sembrano offrire le poliammine se coniugate a molecole con specifiche funzioni antitumorali, quali l’acido idrossamico e il gruppo intercalante il DNA, naftalene-diimide. L’aggiunta della coda poliamminica al composto, infatti, permetterebbe alla molecola risultante di sfruttare il sistema di trasporto delle poliammine, tipicamente sovraespresso o iperattivo nelle cellule neoplastiche, favorendo così l’ingresso in cellula del farmaco e conferendogli selettività per le cellule tumorali. Inoltre, l’affinità elettrostatica che intercorre tra la coda policationica poliamminica e il DNA, carico negativamente, direzionerebbe con maggior efficacia l’intera molecola, compresa la parte intercalante e l’acido idrossamico (HDACi), verso il loro bersaglio, la doppia elica dell’acido nucleico e le HDAC. Gli effetti dei PC valutati in questo lavoro di tesi comprendono l’influenza dei farmaci sulla vitalità cellulare e l’efficacia di inibizione delle HDAC. Si effettueranno test di crescita cellulare in seguito ai trattamenti farmacologici per confrontare i diversi composti poliamminici, individuare quelli con maggior effetto citotossico e stabilire se il tipo di trattamento risulti idoneo per il proseguimento dell’indagine. Il grado di inibizione delle HDAC, relativo ai diversi farmaci, verrà valutato indirettamente mediante la tecnica del Western Blotting quantificando il livello di iperacetilazione istonica globale indotta. I vantaggi che queste nuove molecole potenzialmente possiedono e che andranno verificati con ulteriori studi, inducono ad attribuire loro un grande potenziale per la terapia antitumorale, come induttori dell’apoptosi e/o riprogrammazione dell’assetto epigenetico, risultante nella riattivazione di geni oncosoppressori silenziati nelle cellule neoplastiche. L’azione antitumorale di queste molecole potrà essere più efficace se combinata con altri farmaci, quali chemioterapici standard o demetilanti del DNA. Inoltre la variazione della coda poliamminica potrà essere utile per lo sviluppo di inibitori specifici per le diverse isoforme delle HDAC. La selettività per le cellule tumorali e l’affinità per il DNA di questi nuovi composti potrebbe infine limitare gli eventuali effetti collaterali in clinica.

Ricerca di nuove strategie differenziative: Analisi degli effetti di stimoli fisici e molecolari su cellule mesenchimali umane isolate da tessuto adiposo

Introduzione. Le cellule mesenchimali derivate dal tessuto adiposo (hASC) rappresentano un importante strumento per la terapia cellulare, in quanto derivano da un tessuto adulto abbondante e facilmente reperibile. Con il dispositivo medico Lipogems l’isolamento di tali cellule è eseguito esclusivamente mediante sollecitazioni meccaniche. Il prodotto ottenuto è quindi minimamente manipolato e subito utilizzabile. Ad oggi, il condizionamento pro-differenziativo delle staminali è per lo più attuato mediante molecole di sintesi. Tuttavia, altri fattori possono modulare la fisiologia cellulare, come gli stimoli fisici e molecole naturali. Onde elettromagnetiche hanno indotto in modelli cellulari staminali l’espressione di alcuni marcatori di differenziamento e, in cellule adulte, una riprogrammazione, mentre estratti embrionali di Zebrafish sono risultati antiproliferativi sia in vitro che in vivo. Metodi. La ricerca di nuove strategie differenziative sia di natura fisica che molecolare, nel particolare onde acustiche ed estratti embrionali di Zebrafish, è stata condotta utilizzando come modello cellulare le hASC isolate con Lipogems. Onde acustiche sono state somministrate mediante l’utilizzo di due apparati di trasduzione, un generatore di onde meccaniche e il Cell Exciter . I trattamenti con gli estratti embrionali sono stati effettuati utilizzando diverse concentrazioni e diversi tempi sperimentali. Gli effetti sull’espressione dei marcatori di staminalità e differenziamento relativi ai trattamenti sono stati saggiati in RT-PCR quantitativa relativa e/o in qPCR. Per i trattamenti di tipo molecolare è stata valutata anche la proliferazione. Risultati e conclusioni. La meta-analisi dei dati delle colture di controllo mostra la stabilità d’espressione genica del modello. I trattamenti con i suoni inducono variazioni dell’espressione genica, suggerendo un ruolo regolatorio di tali stimoli, in particolare del processo di commitment cardiovascolare. Due degli estratti embrionali di Zebrafish testati inibiscono la proliferazione alle 72 ore dalla somministrazione. L’analisi d’espressione associata ai trattamenti antiproliferativi suggerisce che tale effetto abbia basi molecolari simili ai processi di differenziamento.

Diabete ed ischemia critica degli arti inferiori. Valutazione degli indicatori sierologici di danno di parete: determinazione quantitativa delle cellule endoteliali circolanti mature

OBIETTIVO : Quantificare le CECs/ml nei pazienti affetti da ischemia critica (IC) degli arti inferiori, eventuali correlazioni tra i fattori di rischio, lo stadio clinico con l’ aumento delle CECs. Valutare i cambiamenti strutturali (calcificazione ed infiltratto infiammatorio) e l’ angiogenesi (numero di capillari /sezione) della parete arteriosa. MATERIALI E METODI: Da Maggio 2006 ad Aprile 2008 in modo prospettico abbiamo arruolato paziente affetti da IC da sottoporre ad intervento chirurgico. In un data base abbiamo raccolto : caratteristiche demografiche, fattori di rischio, stadiazione dell'IC secondo Leriche-Fontaine (L-F), il tipo di intervento chirurgico. Per ogni paziente abbiamo effettuato un prelievo ematico di 2 ml per la quantificazione immunomagnetica delle CECs e prelievo di parete arteriosa. RISULTATI: In modo consecutivo abbiamo arruolato 33 pazienti (75.8% maschi) con età media di 71 aa (range 34-91aa), affetti da arteriopatia ostruttiva cronica periferica al IV stadio di L-F nel 84.8%, da cardiopatia ischemica cronica nel 60.6%, da ipertensione arteriosa nel 72.7% e da diabete mellito di II tipo nel 66.6%. Il valore medio di CECs/ml è risultato significativamente più elevato (p= 0.001) nei soggetti affetti da IC (CECs/ml =531.24 range 107- 3330) rispetto ai casi controllo (CECs/ml = 125.8 range 19-346 ). Le CECs/ml nei pazienti diabetici sono maggiori rispetto alle CECs/ml nei pazienti non diabetici ( 726.7 /ml vs 325.5/ml ), p< 0.05 I pazienti diabetici hanno presentato maggior incidenza di lesioni arteriose complesse rispetto ai non diabetici (66% vs 47%) e minor densità capillare (65% vs 87%). Conclusioni : Le CECs sono un marker sierologico attendibile di danno vascolare parietale, la loro quantità è maggiore nei pazienti diabetici e ipertesi. La minor capacità angiogenetica della parete arteriosa in presenza di maggior calcificazioni ed infiltrato infiammatorio nei diabetici, dimostra un danno istopatologico di parete maggiore .

Carcinoma a cellule basali: l'esperienza della dermatologia dell'Universita' di Bologna dal 1990 al 2014

Il carcinoma a cellule basali (BCC) costituisce l'80 peercento dei tumori cutanei non-melanoma, rappresentando dunque il tumore maligno della cute più frequente nella popolazione generale. Tuttavia, non esistono ad oggi studi epidemiologici ampi ed approfonditi condotti su scala nazionale su questo tipo di neoplasia, poichè i tumori cutanei non-melanoma sono esclusi dal registro statistico dei tumori. A tale scopo presso la Dermatologia dell'Università di Bologna sono stati raccolti di tutti i casi di carcinoma basocellulare osservati dal 1 gennaio 1990 sino al 31 dicembre 2014, e sono stati rielaborati statisticamente. Il criterio di inclusione adottato è stato la positività per BCC all’esame istologico, sia in caso di biopsia semplice, sia in caso di asportazione radicale. Il progetto è stato svolto presso l’ambulatorio di chirurgia oncologica della nostra UO, così come il follow-up dei pazienti nei casi di recidività multiple o di comparsa di nuovi tumori cutanei. Ad oggi, tale neoplasia è risultata essere quella di più frequente osservazione nella Unità Operativa di Dermatologia dell’Università di Bologna. Non solo, la nostra casistica rimane quella più numerosa fino ad ora riportata in tutta Italia negli ultimi 24 anni.

Proprietà elettriche di cellule interagenti con matrici polimeriche biocompatibili

L'utilizzo di polimeri organici coniugati in dispositivi elettronici per applicazioni biologiche, grazie alle loro proprietà meccaniche ed elettriche, insieme alla loro biocompatibilità, è un campo di ricerca relativamente nuovo e in rapida espansione. In questo lavoro di tesi si utilizza la tecnica del Voltage Clamp in configurazione whole cell per caratterizzare le proprietà elettrofisiologiche della linea cellulare di glioblastoma multiforme (T98G) e per registrare le correnti ioniche di cellule adese su una matrice polimerica biocompatibile di poli(etilenediossitiofene)-poli(stirenesulfonato) (PEDOT:PSS). La tecnica consiste nel bloccare il potenziale di membrana al valore desiderato, secondo un preciso protocollo di stimolazione, misurando la corrente necessaria per mantenere costante il potenziale presente tra le due superfici della membrana cellulare. Nella prima parte del lavoro le cellule sono state perfuse con farmaci inibitori dei canali potassio, prima con il bloccante non specifico tetraetilammonio (TEA), e poi selettivamente tramite bloccanti specifici come iberiotossina e dendrotossina. Il 44% circa delle cellule ha evidenziato una significativa corrente residua riconducibile all'attività dei canali ionici voltaggio-dipendenti Kv1.2. Al contrario nelle cellule restanti questi canali non sono espressi. Successivamente, sempre utilizzando le T98G, si è analizzato come lo stato di ossido-riduzione del polimero coniugato PEDOT:PSS possa influenzare le correnti dei canali ionici di membrana; è emerso che il substrato di PEDOT:PSS ridotto provoca una diminuzione significativa della corrente registrata rispetto al substrato di controllo (petri in polistirene). Questi risultati sono stati confrontati con le curve di proliferazione delle cellule T98G coltivate per 24h, 48h e 72h sui diversi substrati considerati, evidenziando interessanti correlazioni nel caso del substrato PEDOT:PSS ridotto.

Meccanismi neurali per la rappresentazione semantica e lessicale: modello di una rete neurale per apprendere il significato di oggetti e parole

Lo studio della memoria semantica attraverso modelli teorici (qualitativi o matematici) gioca un ruolo importante nelle neuroscienze cognitive. In questa tesi viene presentato un modello della memoria semantica e lessicale. Il principio alla base del modello è che la semantica di un oggetto è descritta attraverso una collezione di proprietà, che sintetizzano la percezione dell’oggetto nelle diverse regioni corticali. Gli aspetti semantici e lessicali sono memorizzati in regioni separate del cervello, ma reciprocamente connesse sulla base dell’esperienza passata, secondo un meccanismo di apprendimento Hebbiano. L’obiettivo del lavoro è indagare i meccanismi che portano alla formazione di categorie, analizzare il ruolo delle diverse proprietà nella costruzione di un concetto e le connessioni tra queste proprietà e la parola corrispondente al nome dell’oggetto. Durante l’addestramento per ogni oggetto sono presentate alcune proprietà in input, con una data frequenza: alcune sono condivise, cioè appartengono a più di un concetto e permettono la formazione di categorie, altre sono distintive, cioè sono tipiche di un concetto e consentono la rappresentazione dei membri di una categoria. Un ulteriore aspetto riguardante le proprietà è la distinzione fra proprietà salienti, che sono spontaneamente evocate, e proprietà marginali. E’ stata utilizzata una tassonomia composta da 11 parole che identificano 11 animali. La salienza è stabilita dalla frequenza con cui si verifica ciascuna proprietà. La distinzione tra proprietà condivise e distintive, e tra proprietà salienti e non salienti, è stata ottenuta mediante l’uso della regola di Hebb con una diversa soglia presinaptica e postsinaptica, producendo patterns di sinapsi asimmetriche all’interno della rete semantica (auto-associazione) e tra la rete semantica e lessicale (etero-associazione). La rete addestrata è in grado di risolvere compiti di riconoscimento e denominazione di oggetti, mantenendo una distinzione tra le categorie e i suoi membri, e fornendo un diverso ruolo per le proprietà salienti rispetto alle proprietà marginali.

Fenomeni di interazione audio-visiva in soggetti sani e in soggetti autistici: analisi mediante rete neurale

Negli ultimi anni, studi scientifici hanno evidenziato come il nostro sistema nervoso abbia la capacità di combinare e integrare informazioni di diversa natura sensoriale. Una interazione ampiamente studiata è quella audiovisiva. Oggetto principale di questa tesi è un esempio di interazione audiovisiva, ovvero un fenomeno illusorio visivo indotto dal suono che prende il nome “sound-induced flash illusion”: quando una coppia flash+beep è preceduta o seguita - ad una distanza temporale detta Stimulus Onset Asynchorny (SOA) - da un secondo beep, i soggetti spesso riportano la percezione di aver visto due flash. Il fenomeno illusorio tende a svanire al crescere dell’SOA, e si definisce “finestra temporale d’integrazione” l’intervallo di valori di SOA all’interno del quale si verifica l’illusione. Il fenomeno illusorio è presente anche nei soggetti autistici; questi, rispetto ai soggetti sani, presentano una maggiore propensione nel riportare l’illusione e una finestra temporale d’integrazione di durata maggiore. Obiettivo di questo lavoro è stato approfondire questi fenomeni di interazione mediante l’utilizzo di un modello di rete neurale precedentemente sviluppato dal gruppo di Bioingegneria dell’Università di Bologna. Tale modello era in grado di simulare il fenomeno illusorio, ma presentava il limite di non considerare l’intera finestra temporale in cui tale fenomeno si verifica. Un’analisi di sensitività del modello ha individuato quali variazioni dei parametri potessero spiegare l’illusione in un ampio intervallo temporale e interpretare le differenze tra soggetti sani e soggetti autistici. I risultati delle simulazioni hanno evidenziato un soddisfacente accordo con i dati di letteratura. Le analisi svolte possono contribuire a chiarire i meccanismi alla base del fenomeno illusorio e della finestra temporale in cui esso ha luogo e a fare luce sulle possibili alterazioni nelle singole aree cerebrali e nella interazione tra esse che possono interpretare le differenze osservate nei soggetti autistici rispetto ai sani.

Bioelettronica organica: Nuovi approcci tecnologici per la stimolazione e la rilevazione della comunicazione di cellule neuronali.

Il campo della Bioelettronica si è sviluppato a partire dal 18 secolo con l’ esperimento di Luigi Galvani che, applicando uno stimolo elettrico ai muscoli di una rana dissezionata, ne osservò il movimento. Da questo esperimento si è aperta la strada che ha portato ad oggi ad un grande sviluppo tecnologico nella realizzazione di dispositivi elettronici che permettono di offrire un miglioramento generale delle condizioni di vita. Come spesso accade con le tecnologie emergenti, i materiali sono la maggiore limitazione nello sviluppo di nuove applicazioni. Questo è certamente il caso della Bioelettronica. I materiali elettronici organici, nella forma di polimeri conduttivi, hanno mostrato di poter dotare gli strumenti elettronici di grandi vantaggi rispetto a quelli tradizionali a base di silicio, in virtù delle loro proprietà meccaniche ed elettroniche, della loro biocompatibilità e dei bassi costi di produzione. E’ da questi studi che nasce più propriamente il campo della Bioelettronica Organica, che si basa sulla applicazione di semiconduttori a base di carbonio in forma di piccole molecole coniugate e di polimeri, e del loro utilizzo nei dispositivi elettronici. Con il termine di ‘Bioelettronica organica’, quindi, si descrive l’accoppiamento tra dispositivi elettronici organici e il mondo biologico, accoppiamento che si sviluppa in due direzioni: da un lato una reazione o un processo biologico può trasferire un segnale ad un dispositivo elettronico organico, dall’altro un dispositivo elettronico organico può avviare un processo biologico.

Recupero e purificazione di poliidrossialcanoati da cellule batteriche

Le materie plastiche sono materiali polimerici che possono contenere altre sostanze finalizzate a migliorarne le proprietà o ridurre i costi (IUPAC). Accanto agli innumerevoli vantaggi apportati dall’utilizzo della plastica, negli anni sono emersi aspetti negativi relativi all’inquinamento ambientale causato dalla dispersione del materiale plastico nei rifiuti urbani e conseguentemente nelle discariche. La diffusione e l’utilizzo della bioplastica si pone come obiettivo minimizzare la dipendenza dal petrolio in previsione della diminuzione del numero di giacimenti e quindi della sua disponibilità. Lo scopo del presente lavoro di sperimentazione è lo studio del processo di dowstream di PHA prodotti in laboratorio partendo dalla verifica dei risultati riportati in letteratura e puntando poi ad un miglioramento di un processo convenzionale attraverso la ricerca di nuove alternative.

Utilizzo di cellule MCF-7 in coltura per valutare la presenza di xenoestrogeni e composti genotossici in acque ad uso potabile pre- e post- trattamento

Nelle matrici ambientali sono spesso presenti xenoestrogeni, molecole sintetiche o di origine naturale ad attività estrogenica in grado di alterare il normale equilibrio ormonale di organismi esposti, incidendo negativamente su alcune funzioni vitali come la riproduzione ed il metabolismo. Diverse sostanze chimiche presenti in ambiente, tra cui alcune molecole ad attività estrogenica, sono anche potenziali composti genotossici, in grado, cioè, di interagire con il DNA ed esercitare effetti anche a lungo termine come l’insorgenza di tumori nei vertebrati, uomo compreso. L’obiettivo del presente lavoro di tesi è stato quello di mettere a punto ed utilizzare due saggi biologici, il saggio E-screen ed il test dei micronuclei, per valutare la presenza di xenoestrogeni e composti genotossici in campioni di acque prelevate prima e dopo i trattamenti di potabilizzazione, utilizzando cellule MCF-7 di adenocarcinoma mammario come modello sperimentale in vitro. Le indagini biologiche sono state condotte sulla base di una convenzione di ricerca con la Società acquedottistica Romagna Acque- Società delle fonti e hanno previsto tre campagne di monitoraggio. I campioni di acqua sperimentale, raccolti prima e dopo i trattamenti presso diversi impianti di potabilizzazione, sono stati preventivamente filtrati, estratti in fase solida, fatti evaporare sotto leggero flusso di azoto, ed infine, saggiati sulle cellule. Il test E-screen, di cui abbiamo dimostrato un elevato livello di sensibilità, ha permesso di escludere la presenza di composti ad attività estrogenica nei campioni esaminati. Allo stesso modo, i risultati del test dei micronuclei hanno dimostrato l’assenza di effetti genotossici, confermando la buona qualità delle acque analizzate. Nell’ambito delle attività di monitoraggio, le indagini biologiche risultano essenziali per la valutazione di una potenziale contaminazione ambientale, in quanto forniscono informazioni anche quando non sono state condotte analisi chimiche. Inoltre, anche quando le analisi chimiche siano state condotte, i test biologici informano della potenzialità tossica di una matrice causata eventualmente da sostanze non oggetto del saggio chimico. Infine, i test biologici permettono di identificare eventuali sinergie tra più contaminanti presenti nelle acque, affermandosi come test da condurre in maniera complementare ai saggi chimici. I test biologici come quelli impiegati nel lavoro di tesi sono molto sensibili ed informativi, ma necessitano della definizione di protocolli standardizzati per garantirne un’uniforme applicazione alle acque ad uso potabile, almeno a livello nazionale.

Studio dell'integrazione multisensoriale nella corteccia attraverso rete neurale

L'argomento di questa tesi è la multisensorialità sensoriale. L'obbiettivo che abbiamo perseguito è stato quello di utilizzare un modello sviluppato in precedenza per effettuare un'analisi di sensitività e capire il ruolo che hanno i vari fattori per lo sviluppo della rete neurale. Inoltre abbiamo cercato di mostrare come effettivamente tale modello, come da letteratura, effettui una stima bayesiana. Al termine di questo lavoro si è evidenziata la forte influenza degli stimoli cross-modali nell'adattamento automatico della rete verso stimoli più precisi e del ventriloquismo necessario a ponderare gli stimoli a seconda del loro grado di affidabilità. Inoltre è stato dimostrato che attraverso l'utilizzo di una regola di apprendimento realistica, la rete neurale può imparare la funzione di verosimiglianza. Uno stimatore bayesiano di questo tipo riesce a rappresentare realisticamente l'integrazione multisensoriale che il nostro cervello deve intraprendere quando si trova davanti a più stimoli di natura sensoriale diversa. Molto interessanti anche gli sviluppi possibili di questo progetto che verranno accennati nelle ultime parti di questa tesi.

Modelli matematici di cardiomiociti derivanti da cellule staminali: una nuova formulazione per riprodurre gli effetti proaritmici del blocco della corrente di potassio

I cardiomiociti derivanti da cellule staminali pluripotenti indotte (hiPSC-CMs) costituiscono un nuovo approccio per lo studio delle proprietà delle cellule cardiache sia degli individui sani che di quelli affetti da malattie ereditarie e possono rappresentare inoltre una piattaforma in vitro per la scoperta di nuovi farmaci e terapie rigenerative. Il grande impatto delle hiPSC-CMs nell’ambito della ricerca si deve soprattutto alle loro proprietà elettrofisiologiche: queste cellule non solo esprimono fenotipi genici e proprietà delle correnti ioniche tipiche delle cellule cardiache, ma sono anche in grado di riprodurre fenomeni aritmici, come le EAD, a seguito della somministrazione di farmaci. Grazie anche alla grande potenza di calcolo oggi disponibile è possibile supportare la pratica in vitro con modelli in silico, abbattendo sia i costi che i tempi richiesti dagli esperimenti in laboratorio. Lo scopo di questo lavoro è quello di simulare il comportamento delle hiPSC-CMs di tipo ventricolare in risposta alla somministrazione di farmaci che interagiscono con la corrente di potassio IKr, principale responsabile della ripolarizzazione cardiaca. L’assunzione di certi farmaci può comportare infatti una riduzione della IKr, con conseguente prolungamento della fase di ripolarizzazione del potenziale d’azione cardiaco. Questo meccanismo è causa dell’insorgenza della sindrome del QT lungo di tipo 2, che in casi estremi può degenerare in aritmie gravi. Ciò suggerisce che queste cellule rappresentano un importante strumento per la valutazione del rischio pro-aritmico che può essere facilitata da simulazioni in silico effettuate utilizzando modelli computazionali basati su dati fisiologici.

La Cellule.

Bibliography of agriculture

La cellule, son origine - sa vie - sa mort ...

"Bibliographie": v. 1, p. [461]-468; v. 2, p. [702]-717.