A cell therapy approach for erythropoietin delivery using encapsulated human primary fibroblasts

Summary Cell therapy has emerged as a strategy for the treatment of various human diseases. Cells can be transplanted considering their morphological and functional properties to restore a tissue damage, as represented by blood transfusion, bone marrow or pancreatic islet cells transplantation. With the advent of the gene therapy, cells also were used as biological supports for the production of therapeutic molecules that can act either locally or at distance. This strategy represents the basis of ex vivo gene therapy characterized by the removal of cells from an organism, their genetic modification and their implantation into the same or another individual in a physiologically suitable location. The tissue or biological function damage dictates the type of cells chosen for implantation and the required function of the implanted cells. The general aim of this work was to develop an ex vivo gene therapy approach for the secretion of erythropoietin (Epo) in patients suffering from Epo-responsive anemia, thus extending to humans, studies previously performed with mouse cells transplanted in mice and rats. Considering the potential clinical application, allogeneic primary human cells were chosen for practical and safety reasons. In contrast to autologous cells, the use of allogeneic cells allows to characterize a cell lineage that can be further transplanted in many individuals. Furthermore allogeneic cells avoid the potential risk of zoonosis encountered with xenogeneic cells. Accordingly, the immune reaction against this allogeneic source was prevented by cell macro- encapsulation that prevents cell-to-cell contact with the host immune system and allows to easy retrieve the implanted device. The first step consisted in testing the survival of various human primary cells that were encapsulated and implanted for one month in the subcutaneous tissue of immunocompetent and naturally or therapeutically immunodepressed mice, assuming that xenogeneic applications constitute a stringent and representative screening before human transplantation. A fibroblast lineage from the foreskin of a young donor, DARC 3.1 cells, showed the highest mean survival score. We have then performed studies to optimize the manufacturing procedures of the encapsulation device for successful engraftment. The development of calcifications on the polyvinyl alcohol (PVA) matrix serving as a scaffold for enclosed cells into the hollow fiber devices was reported after one month in vivo. Various parameters, including matrix rinsing solutions, batches of PVA and cell lineages were assessed for their respective role in the development of the phenomenon. We observed that the calcifications could be totally prevented by using ultra-pure sterile water instead of phosphate buffer saline solution in the rinsing procedure of the PVA matrix. Moreover, a higher lactate dehydrogenase activity of the cells was found to decrease calcium depositions due to more acidic microenvironment, inhibiting the calcium precipitation. After the selection of the appropriate cell lineage and the optimization of encapsulation conditions, a retroviral-based approach was applied to DARC 3.1 fibroblasts for the transduction of the human Epo cDNA. Various modifications of the retroviral vector and the infection conditions were performed to obtain clinically relevant levels of human Epo. The insertion of a post-transcriptional regulatory element from the woodchuck hepatitis virus as well as of a Kozak consensus sequence led to a 7.5-fold increase in transgene expression. Human Epo production was further optimized by increasing the multiplicity of infection and by selecting high producer cells allowing to reach 200 IU hEpo/10E6 cells /day. These modified cells were encapsulated and implanted in vivo in the same conditions as previously described. All the mouse strains showed a sustained increase in their hematocrit and a high proportion of viable cells were observed after retrieval of the capsules. Finally, in the perspective of human application, a syngeneic model using encapsulated murine myoblasts transplanted in mice was realized to investigate the roles of both the host immune response and the cells metabolic requirements. Various loading densities and anti-inflammatory as well as immunosuppressive drugs were studied. The results showed that an immune process is responsible of cell death in capsules loaded at high cell density. A supporting matrix of PVA was shown to limit the cell density and to avoid early metabolic cell death, preventing therefore the immune reaction. This study has led to the development of encapsulated cells of human origin producing clinically relevant amounts of human EPO. This work resulted also to the optimization of cell encapsulation technical parameters allowing to begin a clinical application in end-stage renal failure patients. Résumé La thérapie cellulaire s'est imposée comme une stratégie de traitement potentiel pour diverses maladies. Si l'on considère leur morphologie et leur fonction, les cellules peuvent être transplantées dans le but de remplacer une perte tissulaire comme c'est le cas pour les transfusions sanguines ou les greffes de moelle osseuse ou de cellules pancréatiques. Avec le développement de la thérapie génique, les cellules sont également devenues des supports biologiques pour la production de molécules thérapeutiques. Cette stratégie représente le fondement de la thérapie génique ex vivo, caractérisée par le prélèvement de cellules d'un organisme, leur modification génétique et leur implantation dans le même individu ou dans un autre organisme. Le choix du type de cellule et la fonction qu'elle doit remplir pour un traitement spécifique dépend du tissu ou de la fonction biologique atteintes. Le but général de ce travail est de développer .une approche par thérapie génique ex vivo de sécrétion d'érythropoïétine (Epo) chez des patients souffrant d'anémie, prolongeant ainsi des travaux réalisés avec des cellules murines implantées chez des souris et des rats. Dans cette perpective, notre choix s'est porté sur des cellules humaines primaires allogéniques. En effet, contrairement aux cellules autologues, une caractérisation unique de cellules allogéniques peut déboucher sur de nombreuses applications. Par ailleurs, l'emploi de cellules allogéniques permet d'éviter les riques de zoonose que l'on peut rencontrer avec des cellules xénogéniques. Afin de protéger les cellules allogéniques soumises à une réaction immunitaire, leur confinement dans des macro-capsules cylindriques avant leur implantation permet d'éviter leur contact avec les cellules immunitaires de l'hôte, et de les retrouver sans difficulté en cas d'intolérance ou d'effet secondaire. Dans un premier temps, nous avons évalué la survie de différentes lignées cellulaires humaines primaires, une fois encapsulées et implantées dans le tissu sous-cutané de souris, soit immunocompétentes, soit immunodéprimées naturellement ou par l'intermédiaire d'un immunosuppresseur. Ce modèle in vivo correspond à des conditions xénogéniques et représente par conséquent un environnement de loin plus hostile pour les cellules qu'une transplantation allogénique. Une lignée fibroblastique issue du prépuce d'un jeune enfant, nommée DARC 3 .1, a montré une remarquable résistance avec un score de survie moyen le plus élevé parmi les lignées testées. Par la suite, nous nous sommes intéressés aux paramètres intervenant dans la réalisation du système d'implantation afin d'optimaliser les conditions pour une meilleure adaptation des cellules à ce nouvel environnement. En effet, en raison de l'apparition, après un mois in vivo, de calcifications au niveau de la matrice de polyvinyl alcohol (PVA) servant de support aux cellules encapsulées, différents paramètres ont été étudiés, tels que les procédures de fabrication, les lots de PVA ou encore les lignées cellulaires encapsulées, afin de mettre en évidence leur rôle respectif dans la survenue de ce processus. Nous avons montré que l'apparition des calcifications peut être totalement prévenue par l'utilisation d'eau pure au lieu de tampon phosphaté lors du rinçage des matrices de PVA. De plus, nous avons observe qu'un taux de lactate déshydrogénase cellulaire élevé était corrélé avec une diminution des dépôts de calcium au sein de la matrice en raison d'un micro-environnement plus acide inhibant la précipitation du calcium. Après sélection de la lignée cellulaire appropriée et de l'optimisation des conditions d'encapsulation, une modification génétique des fibroblastes DARC 3.1 a été réalisée par une approche rétrovirale, permettant l'insertion de l'ADN du gène de l'Epo dans le génome cellulaire. Diverses modifications, tant au niveau génétique qu'au niveau des conditions d'infection, ont été entreprises afin d'obtenir des taux de sécrétion d'Epo cliniquement appropriés. L'insertion dans la séquence d'ADN d'un élément de régulation post¬transcriptionnelle dérivé du virus de l'hépatite du rongeur (« woodchuck ») ainsi que d'une séquence consensus appelée « Kozak » ont abouti à une augmentation de sécrétion d'Epo 7.5 fois plus importante. De même, l'optimisation de la multiplicité d'infection et la sélection plus drastique des cellules hautement productrices ont permis finalement d'obtenir une sécrétion correspondant à 200 IU d'Epo/10E6 cells/jour. Ces cellules génétiquement modifiées ont été encapsulées et implantées in vivo dans les mêmes conditions que celles décrites plus haut. Toutes les souris transplantées ont montré une augmentation significative de leur hématocrite et une proportion importante de cellules présentait une survie conservée au moment de l'explantation des capsules. Finalement, dans la perspective d'une application humaine, un modèle syngénique a été proposé, basé sur l'implantation de myoblastes murins encapsulés dans des souris, afin d'investiguer les rôles respectifs de la réponse immunitaire du receveur et des besoins métaboliques cellulaires sur leur survie à long terme. Les cellules ont été encapsulées à différentes densités et les animaux transplantés se sont vus administrer des injections de molécules anti-inflammatoires ou immunosuppressives. Les résultats ont démontré qu'une réaction immunologique péri-capsulaire était à la base du rejet cellulaire dans le cas de capsules à haute densité cellulaire. Une matrice de PVA peut limiter cette densité et éviter une mort cellulaire précoce due à une insuffisance métabolique et par conséquent prévenir la réaction immunitaire. Ce travail a permis le développement de cellules encapsulées d'origine humaine sécrétant des taux d'Epo humaine adaptés à des traitements cliniques. De pair avec l'optimalisation des paramètres d'encapsulation, ces résultats ont abouti à l'initiation d'une application clinique destinée à des patients en insuffisance rénale terminale.

Effects of fish oil on the neuro-endocrine responses to an endotoxin challenge in healthy volunteers

Résumé Introduction et hypothèse : Certains acides gras polyinsaturés de type n-3 PUFA, qui sont contenus dans l'huile de poisson, exercent des effets non-énergétiques (fluidité des membranes cellulaires, métabolisme énergétique et prostanoïdes, régulation génique de la réponse inflammatoire). Les mécanismes de la modulation de cette dernière sont encore mal connus. L'administration d'endotoxine (LPS) induit chez les volontaires sains une affection inflammatoire aiguë, comparable à un état grippal, associé à des modifications métaboliques et inflammatoires transitoires, similaires au sepsis. Ce modèle est utilisé de longue date pour l'investigation clinique expérimentale. Cette étude examine les effets d'une supplémentation orale d'huile de poisson sur la réponse inflammatoire (systémique et endocrinienne) de sujets sains soumis à une injection d'endotoxine. L'hypothèse était que la supplémentation d'huile de poisson réduirait les réponses physiologiques à l'endotoxine. Méthodes : Quinze volontaires masculins (âge 26.0±3.1 ans) ont participé à une étude randomisée, contrôlée. Les sujets sont désignés au hasard à recevoir ou non une supplémentation orale : 7.2 g d'huile de poisson par jour correspondant à un apport de 1.1 g/jour d'acides gras 20:5 (n-3, acide écosapentaénoïque) et 0.7 g/jour de 22:6 (n-3, acide docosahexaénoïque). Chaque sujet est investigué deux fois dans des conditions identiques : une fois il reçoit une injection de 2 ng par kg poids corporel de LPS intraveineuse, l'autre fois une injection de placebo. Les variables suivantes sont relevées avant l'intervention et durant les 360 min qui suivent l'injection :signes vitaux, dépense énergétique (EE) et utilisation nette des substrats (calorimétrie indirecte, cinétique du glucose (isotopes stables), taux plasmatique des triglycérides et FFA, du glucose, ainsi que des cytokines et hormones de stress (ACTH, cortisol, Adré, Nor-Adré). Analyses et statistiques :moyennes, déviations standards, analyse de variance (one way, test de Scheffé), différences significatives entre les groupes pour une valeur de p < 0.05. Résultats :L'injection de LPS provoque une augmentation de la température, de la fréquence cardiaque, de la dépense d'énergie et de l'oxydation nette des lipides. On observe une élévation des taux plasmatiques de TNF-a et IL-6, de la glycémie, ainsi qu'une élévation transitoire des concentrations plasmatiques des hormones de stress ACTH, cortisol, adrénaline et noradrénaline. L'huile de poisson atténue significativement la fièvre, la réponse neuro-endocrinienne (ACTH et cortisol) et sympathique (baisse de la noradrénaline plasmatique). Par contre, les taux des cytokines ne sont pas influencés par la supplémentation d'huile de poisson. Conclusion : La supplémentation d'huile de poisson atténue la réponse physiologique à l'endotoxine chez le sujet sain, en particulier la fièvre et la réponse endocrinienne, sans influencer la production des cytokines. Ces résultats soutiennent l'hypothèse que les effets bénéfiques de l'huile de poisson sont principalement caractérisés au niveau du système nerveux central, par des mécanismes non-inflammatoires qui restent encore à élucider.

TRANSCRIPTION FACTORS INVOLVED IN PLANT DEFENCE AGAINST INSECT HERBIVORES IN ARABIDOPSIS THALIANA

Afin de pouvoir se défendre contre les insectes nuisibles, les plantes ont développé plusieurs stratégies leur permettant de maximiser leurs chances de survie et de reproduction. Parmi elles, les plantes sont souvent pourvues de barrières physiques telles que les poils urticants, les épines et la cuticule. En plus, les plantes sont capables de produire des protéines anti-digestives et des métabolites secondaires insecticides tels que la nicotine, les tannins ou les glucosinolates (GS). La mise en place de ces barrières physiques et chimiques comporte un coût énergétique au détriment de la croissance et de la reproduction. Par conséquent, en absence d'insectes, la plante investit la majeure partie de son énergie dans le développement et la croissance. A l'inverse, une blessure causée par un insecte provoquera une croissance ralentie, une augmentation de la densité de poils urticants ainsi que la synthèse de défenses chimiques. Au niveau moléculaire, cette défense inductible est régulée par l'hormone végétale acide jamsonique (AJ). En réponse à l'attaque d'un insecte, la plante produit cette hormone en grande quantité, ce qui se traduira par une forte expression de gènes de défense. Pendant ma thèse, j'ai essayé de découvrir quels étaient les facteurs de transcription (FT) responsables de l'expression des gènes de défense dans Arabidopsis thaliana. J'ai ainsi pu démontrer que des plantes mutées dans les FTs comme MYC2, MYC3, MYC4, ZAT10, ZAT12, AZF2, WRKY18, WRKY40, WRKY6, ANAC019, ANAC55, ERF13 et RRTF1 deviennent plus sensibles aux insects de l'espèce Spodoptera littoralis. Par la suite, j'ai également pu montrer que MYC2, MYC3 et MYC4 sont probablement la cible principale de la voie de signalisation du AJ et qu'ils sont nécessaires pour l'expression de la majorité des gènes de défense dont la plupart sont essentiels à la biosynthèse des GS. Une plante mutée simultanément dans ces trois protéines est par conséquent incapable de synthétiser des GS et devient hypersensible aux insectes. J'ai également pu démontrer que les GS sont uniquement efficaces contre les insectes généralistes tels S. littoralis et Heliothis virescens alors que les insectes spécialisés sur les Brassicaceae comme Pieris brassicae et Plutella xylostella se sont adaptés en développant des mécanismes de détoxification. - In response to herbivore insects, plants have evolved several defence strategies to maximize their survival and reproduction. For example, plants are often endowed with trichomes, spines and a thick cuticule. In addition, plants can produce anti-digestive proteins and toxic secondary metabolites like nicotine, tannins and glucosinolates (GS). These physical and chemical barriers have an energetic cost to the detriment of growth and reproduction. As a consequence, in absence of insects, plants allocate their energy to development and growth. On the contrary, an attack by herbivore insects will affect plant growth, increase trichome density and induce the production of anti-digestive proteins and secondary metabolites. At the molecular level, this inducible defence is regulated by the phytohormone jasmonic acid (JA). Thus, an attack by herbivores will be followed by a burst of JA that will induce the expression of defence genes. The aim of my thesis was to characterize which transcription factors (TF) regulate the expression of these defence genes in Arabidopsis thaliana. I could show that plants mutated in various TFs like MYC2, MYC3, MYC4, ZAT10, ZAT12, AZF2, WRKY18, WRKY40, WRKY6, ANAC019, ANAC55, ERF 13 and RRTFl were more susceptible to the herbivore Spodoptera littoralis. Furthermore, I could demonstrate that MYC2, MYC3 and MYC4 are probably the main target of the JA-signalling pathway and that they are necessary for the insect-mediated induction of most defence genes including genes involved in the biosynthesis of GS. A triple mutant myc2myc3myc4 is depleted of GS and consequently hypersensitive to insects. Moreover, I showed that GS are only efficient against generalist herbivores like S. littoralis and Heliothis virescens whereas specialized insects like Pieris brassicae and Plutella xylostella have evolved detoxification mechanisms against GS.

Douleur chronique et mécanismes moléculaires

La douleur est définie par l'International association for the study of pain (IASP) comme une expérience sensorielle et émotionnelle désagréable, associée à une lésion tissulaire réelle ou à une lésion potentielle, ou décrite en des termes évoquant une telle lésion. Sa fonction est de signaler une menace potentielle pour l'intégrité de l'organisme. Mais ce ressenti peut persister ou être présent en l'absence d'une telle menace. Il s'agit dans ce cas d'une douleur pathologique dont les mécanismes étiologiques et physiopathologiques ne sont pas encore bien compris.¦Ce travail de maîtrise a pour objectif l'étude d'une mutation génétique responsable d'un syndrome douloureux chronique. Cette mutation génétique a été décelée chez une famille de patients lausannois atteints de PEPD (paroxysmal extreme pain disorder) et touche le canal sodique Nav1.7. Ce canal est exprimé principalement dans les neurones des ganglions sensitifs et des ganglions sympathiques. Il est considéré comme responsable de la transmission de la douleur vers le SNC car des mutations « perte de fonction » de ce canal sont à l'origine d'une insensibilité congénitale à la douleur. Les mutations « gain de fonction » de ce canal sont à l'origine de syndromes douloureux chroniques tel le syndrome PEPD ou l'érythromélalgie. La mutation présente chez les patients lausannois est située entre les segments transmembranaires S4 et S5 sur le 4ème domaine de la sous-unité α du canal sodique Nav1.7. Cette mutation ne touche qu'un seul acide aminé, en position 1612 où une leucine est remplacée par une proline.¦Les méthodes employées dans ce travail sont la mutagenèse pour générer des plasmides contenant le gène SCN9A muté (T4835C) codant pour le canal Nav1.7 muté (L1612P), l'amplification de ces plasmides dans des bactéries et la transfection de cellules HEK293 avec les plasmides contenant le gène SCN9A muté (T4835C). Nous avons ainsi pu induire l'expression du canal muté dans des cellules HEK293. Ces cellules pourront être utilisées par la suite pour enregistrer les courants ioniques transitant à travers les canaux exprimés à la membrane plasmique. Cela permettra de comparer les propriétés électrophysiologiques du canal Nav1.7 muté L1612P avec celles du canal non muté. Nous avons également recherché l'expression d'ARNm codant pour les composants des canaux sodiques (sous-unités α et β) dans les cellules HEK293 non transfectées par la technique de qRT-PCR. Ceci afin de répertorier les composants des canaux sodiques exprimés constitutivement par les cellules HEK293 qui pourraient avoir une influence sur les mesures électrophysiologiques qui seront effectuées sur ces cellules.¦Ce travail a permis de générer des plasmides contenant le gène SCN9A muté T4835C qui sont des outils nécessaires à la réalisation d'études plus détaillées sur le fonctionnement et les propriétés du canal Nav1.7 muté L1612P. Ce travail a également permis, par la méthode de la qRT-PCR, une analyse de l'expression d'ARNm codant pour la sous-unité α du canal Nav1.7 et des sous-unités β 1 à 4 par les cellules HEK293. Les résultats ainsi obtenus permettent de mieux caractériser le transcriptome des cellules HEK293 et seront utiles pour interpréter avec plus de précisions les expérimentations électrophysiologiques utilisant ces cellules. L'étude électrophysiologique des cellules HEK293 exprimant le canal Nav1.7 muté par la technique du patch clamp est en cours. Elle sera poursuivie dans le cadre d'un travail de recherche dépassant le cadre de ce travail de maîtrise. Les cellules HEK293 exprimant le canal Nav1.7 muté (L1612P) pourront être également utilisées pour tester l'effet de divers médicaments sur ce canal. Ce qui pourrait d'une part permettre d'optimiser le traitement des patients souffrant de PEPD et d'autre part être utile pour tout traitement à but antalgique.

Study of the regulation of antifungal activity in plant-associated pseudomas fluorescens

RésuméEn agriculture d'énormes pertes sont causées par des champignons telluriques pathogènes tels que Thielaviopsis, Fusarium, Gaeumannomyces et Rhizoctonia ou encore l'oomycète Pythium. Certaines bactéries dites bénéfiques, comme Pseudomonas fluorescens, ont la capacité de protéger les plantes de ces pathogènes par la colonisation de leur racines, par la production de métabolites secondaires possédants des propriétés antifongiques et par l'induction des mécanismes de défenses de la plante colonisée. P. fluorescens CHAO, une bactérie biocontrôle isolée d'un champ de tabac à Payerne, a la faculté de produire un large spectre de métabolites antifongiques, en particulier le 2,4- diacétylphloroglucinol (DAPG), la pyolutéorine (PLT), le cyanure d'hydrogène (HCN), la pyrrolnitrine (PRN) ainsi que des chélateurs de fer.La plante, par sécrétion racinaire, produit des rhizodéposites, source de carbone et d'azote, qui profitent aux populations bactériennes vivant dans la rhizosphere. De plus, certains stresses biotiques et abiotiques modifient cette sécrétion racinaire, en terme quantitatif et qualitatif. De leur côté, les bactéries bénéfiques, améliorent, de façon direct et/ou indirect, la croissance de la plante hôte. De nombreux facteurs biotiques et abiotiques sont connus pour réguler la production de métabolites secondaires chez les bactéries. Des études récentes ont démontré l'importance de la communication entre la plante et les bactéries bénéfiques afin que s'établisse une interaction profitant à chacun des deux partis. Il est ainsi vraisemblable que les populations bactériennes associées aux racines soient capables d'intégrer ces signaux et d'adapter spécifiquement leur comportement en conséquence.La première partie de ce travail de thèse a été la mise au point d'outils basés sur la cytométrie permettant de mesurer l'activité antifongique de cellules bactériennes individuelles dans un environnent naturel, les racines des plantes. Nous avons démontré, grâce à un double marquage aux protéines autofluorescentes GFP et mCherry, que les niveaux d'expression des gènes impliqués dans la biosynthèse des substances antifongiques DAPG, PLT, PRN et HCN ne sont pas les mêmes dans des milieux de cultures liquides que sur les racines de céréales. Par exemple, l'expression de pltA (impliqué dans la biosynthèse du PLT) est quasiment abolie sur les racines de blé mais atteint un niveau relativement haut in vitro. De plus cette étude a mis en avant l'influence du génotype céréalien sur l'expression du gène phlA qui est impliqué dans la biosynthèse du DAPG.Une seconde étude a révélé la communication existant entre une céréale (orge) infectée par le pathogène tellurique Pythium ultimum et P. fluorescens CHAO. Un système de partage des racines nous a permis de séparer physiquement le pathogène et la bactérie bénéfique sur la plante. Cette méthode a donné la possibilité d'évaluer l'effet systémique, causé par l'attaque du pathogène, de la plante sur la bactérie biocontrôle. En effet, l'infection par le phytopathogène modifie la concentration de certains composés phénoliques dans les exsudats racinaires stimulant ainsi l'expression de phi A chez P.fluorescens CHAO.Une troisième partie de ce travail focalise sur l'effet des amibes qui sont des micro-prédateurs présents dans la rhizosphere. Leur présence diminue l'expression des gènes impliqués dans la biosynthèse du DAPG, PLT, PRN et HCN chez P.fluorescens CHAO, ceci en culture liquide et sur des racines d'orge. De plus, des molécules provenant du surnageant d'amibes, influencent l'expression des gènes requis pour la biosynthèse de ces antifongiques. Ces résultats illustrent que les amibes et les bactéries de la rhizosphere ont développé des stratégies pour se reconnaître et adapter leur comportement.La dernière section de ce travail est consacrée à l'acide indole-acétique (LA.A), une phytohormone connue pour son effet stimulateur sur phlA. Une étude moléculaire détaillée nous a démontré que cet effet de l'IAA est notamment modulé par une pompe à efflux (FusPl) et de son régulateur transcriptionnel (MarRl). De plus, les gènes fusPl et marRl sont régulés par d'autres composés phénoliques tels que le salicylate (un signal végétal) et l'acide fusarique (une phytotoxine du pathogène Fusarium).En résumé, ce travail de thèse illustre la complexité des interactions entre les eucaryotes et procaryotes de la rhizosphère. La reconnaissance mutuelle et l'instauration d'un dialogue moléculaire entre une plante hôte et ses bactéries bénéfiques associées? sont indispensables à la survie des deux protagonistes et semblent être hautement spécifiques.SummaryIn agriculture important crop losses result from the attack of soil-borne phytopathogenic fungi, including Thielaviopsis, Fusarium, Gaeumannomyces and Rhizoctonia, as well as from the oomycete Pythium. Certain beneficial microorganisms of the rhizosphere, in particular Pseudomonas fluorescens, have the ability to protect plants against phytopathogens by the intense colonisation of roots, by the production of antifungal exoproducts, and by induction of plant host defences. P. fluorescens strain CHAO, isolated from a tobacco field near Payerne, produces a large array of antifungal exoproducts, including 2,4-diacetylphloroglucinol (DAPG), pyoluteorin (PLT), hydrogen cyanide (HCN), pyrrolnitrin (PRN) and iron chelators. Plants produce rhizodeposites via root secretion and these represent a relevant source of carbon and nitrogen for rhizosphere microorganisms. Various biotic and abiotic stresses influence the quantity and the quality of released exudates. One the other hand, beneficial bacteria directly or indirectly promote plant growth. Biotic and abiotic factors regulate exoproduct production in biocontrol microorganisms. Recent studies have highlighted the importance of communication in establishing a fine-tuned mutualist interaction between plants and their associated beneficial bacteria. Bacteria may be able to integrate rhizosphere signals and adapt subsequently their behaviour.In a first part of the thesis, we developed a new method to monitor directly antifungal activity of individual bacterial cells in a natural environment, i.e. on roots of crop plants. We were able to demonstrate, via a dual-labelling system involving green and red fluorescent proteins (GFP, mCherry) and FACS-based flow cytometry, that expression levels of biosynthetic genes for the antifungal compounds DAPG, PLT, PRN, and HCN are highly different in liquid culture and on roots of cereals. For instance, expression of pltA (involved in PLT biosynthesis) was nearly abolished on wheat roots whereas it attained a relatively high level under in vitro conditions. In addition, we established the importance of the cereal genotype in the expression of phi A (involved in DAPG biosynthesis) in P. fluorescens CHAO.A second part of this work highlighted the systemic communication that exists between biocontrol pseudomonads and plants following attack by a root pathogen. A split-root system, allowing physical separation between the soil-borne oomycete pathogen Phytium ultimum and P. fluorescens CHAO on barley roots, was set up. Root infection by the pathogen triggered a modification of the concentration of certain phenolic root exudates in the healthy root part, resulting in an induction ofphlA expression in P. fluorescens CHAO.Amoebas are micro-predators of the rhizosphere that feed notably on bacteria. In the third part of the thesis, co-habitation of Acanthamoeba castellanii with P. fluorescens CHAO in culture media and on barley roots was found to significantly reduce bacterial expression of genes involved in the biosynthesis of DAPG, PLT, HCN and PRN. Interestingly, molecular cues present in supernatant of A. castelanii induced the expression of these antifungal genes. These findings illustrate the strategies of mutual recognition developed by amoeba and rhizosphere bacteria triggering responses that allow specific adaptations of their behaviour.The last section of the work focuses on indole-3-acetic acid (IAA), a phytohormone that stimulates the expression of phi A. A detailed molecular study revealed that the IAA-mediated effect on phi A is notably modulated by an efflux pump (FusPl) and its transcriptional regulator (MarRl). Remarkably, transcription of fusPl and marRl was strongly upregulated in presence of other phenolic compounds such as salicylate (a plant signal) and fusaric acid (a phytotoxin of the pathogenic fungus Fusarium).To sum up, this work illustrates the great complexity of interactions between eukaryotes and prokaryotes taking place in the rhizosphere niche. The mutual recognition and the establishment of a molecular cross-talk between the host plant and its associated beneficial bacteria are essential for the survival of the two partners and these interactions appear to be highly specific.

The role of fungi in the precipitation of calcite : relationships between fungal filaments, nanofibres, and needle fibre calcite

RésuméLes champignons sont impliqués dans les cycles biogéochimiques de différentes manières. En particulier, ils sont reconnus en tant qu'acteurs clés dans la dégradation de la matière organique, comme fournisseurs d'éléments nutritifs via l'altération des minéraux mais aussi comme grands producteurs d'acide oxalique et de complexes oxalo-métalliques. Toutefois, peu de choses sont connues quant à leur contribution à la genèse d'autres types de minéraux, tel que le carbonate de calcium (CaCO3). Le CaCO3 est un minéral ubiquiste dans de nombreux écosystèmes et il joue un rôle essentiel dans les cycles biogéochimiques du carbone (C) et du calcium (Ca). Le CaCO3 peut être d'origine physico-chimique ou biogénique et de nombreux organismes sont connus pour contrôler ou induire sa biominéralisation. Les champignons ont souvent été soupçonnés d'être impliqué dans ce processus, cependant il existe très peu d'informations pour étayer cette hypothèse.Cette thèse a eu pour but l'étude de cet aspect négligé de l'impact des champignons dans les cycles biogéochimiques, par l'exploration de leur implication potentielle dans la formation d'un type particulier de CaCO3 secondaires observés dans les sols et dans les grottes des environnements calcaires. Dans les grottes, ces dépôts sont appelés moonmilk, alors que dans les sols on les appelle calcite en aiguilles. Cependant ces deux descriptions correspondent en fait au même assemblage microscopique de deux habitus particulier de la calcite: la calcite en aiguilles (au sens strict du terme cette fois-ci) et les nanofibres. Ces deux éléments sont des habitus aciculaires de la calcite, mais présentent des dimensions différentes. Leur origine, physico-chimique ou biologique, est l'objet de débats intenses depuis plusieurs années déjà.L'observation d'échantillons environnementaux avec des techniques de microscopie (microscopie électronique et micromorphologie), ainsi que de la microanalyse EDX, ont démontré plusieurs relations intéressantes entre la calcite en aiguilles, les nanofibres et des éléments organiques. Premièrement, il est montré que les nanofibres peuvent être organiques ou minérales. Deuxièmement, la calcite en aiguilles et les nanofibres présentent de fortes analogies avec des structures hyphales, ce qui permet de confirmer l'hypothèse de leur origine fongique. En outre, des expériences en laboratoire ont confirmé l'origine fongique des nanofibres, par des digestions enzymatiques d'hyphes fongiques. En effet, des structures à base de nanofibres, similaires à celles observées dans des échantillons naturels, ont pu être produites par cette approche. Finalement, des enrichissements en calcium ont été mesurés dans les parois des hyphes et dans des inclusions intrahyphales provenant d'échantillons naturels de rhizomorphes. Ces résultats suggèrent une implication de la séquestration de calcium dans la formation de la calcite en aiguilles et/ou des nanofibres.Plusieurs aspects restent à élucider, en particulier la compréhension des processus physiologiques impliqués dans la nucléation de calcite dans les hyphes fongiques. Cependant, les résultats obtenus dans cette thèse ont permis de confirmer l'implication des champignons dans la formation de la calcite en aiguilles et des nanofibres. Ces découvertes sont d'une grande importance dans les cycles biogéochimiques puisqu'ils apportent de nouveaux éléments dans le cycle couplé C-Ca. Classiquement, les champignons sont considérés comme étant impliqués principalement dans la minéralisation de la matière organique et dans l'altération minérale. Cette étude démontre que les champignons doivent aussi être pris en compte en tant qu'agents majeurs de la genèse de minéraux, en particulier de CaCO3. Ceci représente une toute nouvelle perspective en géomycologie quant à la participation des champignons au cycle biologique du C. En effet, la présence de ces précipitations de CaCO3 secondaires représente un court-circuit dans le cycle biologique du C puisque du C inorganique du sol se retrouve piégé dans de la calcite plutôt que d'être retourné dans l'atmosphère.AbstractFungi are known to be involved in biogeochemical cycles in numerous ways. In particular, they are recognized as key players in organic matter recycling, as nutrient suppliers via mineral weathering, as well as large producers of oxalic acid and metal-oxalate. However, little is known about their contribution to the genesis of other types of minerals such as calcium carbonate (CaCO3). Yet, CaC03 are ubiquitous minerals in many ecosystems and play an essential role in the biogeochemical cycles of both carbon (C) and calcium (Ca). CaC03 may be physicochemical or biogenic in origin and numerous organisms have been recognized to control or induce calcite biomineralization. While fungi have often been suspected to be involved in this process, only scarce information support this hypothesis.This Ph.D. thesis aims at investigating this disregarded aspect of fungal impact on biogeochemical cycles by exploring their possible implication in the formation of a particular type of secondary CaC03 deposit ubiquitously observed in soils and caves from calcareous environments. In caves, these deposits are known as moonmilk, whereas in soils, they are known as Needle Fibre Calcite (NFC - sensu lato). However, they both correspond to the same microscopic assemblage of two distinct and unusual habits of calcite: NFC {sensu stricto) and nanofibres. Both features are acicular habits of calcite displaying different dimensions. Whether these habits are physicochemical or biogenic in origin has been under discussion for a long time.Observations of natural samples using microscopic techniques (electron microscopy and micromorphology) and EDX microanalyses have demonstrated several interesting relationships between NFC, nanofibres, and organic features. First, it has shown that nanofibres can be either organic or minera! in nature. Second, both nanofibres and NFC display strong structural analogies with fungal hyphal features, supporting their fungal origin. Furthermore, laboratory experiments have confirmed the fungal origin of nanofibres through an enzymatic digestion of fungal hyphae. Indeed, structures made of nanofibres with similar features as those observed in natural samples have been produced. Finally, calcium enrichments have been measured in both cell walls and intrahyphal inclusions of hyphae from rhizomorphs sampled in the natural environment. These results point out an involvement of calcium sequestration in nanofibres and/or NFC genesis.Several aspects need further investigation, in particular the understanding of the physiological processes involved in hyphal calcite nucleation. However, the results obtained during this study have allowed the confirmation of the implication of fungi in the formation of both NFC and nanofibres. These findings are of great importance regarding global biogeochemical cycles as they bring new insights into the coupled C and Ca cycles. Conventionally, fungi are considered to be involved in organic matter mineralization and mineral weathering. In this study, we demonstrate that they must also be considered as major agents in mineral genesis, in particular CaC03. This is a completely new perspective in geomycology regarding the role of fungi in the short-term (or biological) C cycle. Indeed, the presence of these secondary CaC03 precipitations represents a bypass in the short- term carbon cycle, as soil inorganic C is not readily returned to the atmosphere.

Enantio-pyochelin: a novel siderophore produced by Pseudomonas fluorescens CHA0

RESUME Pour favoriser sa croissance en condition limitante de fer, le pathogène opportunistePseudomonas aeruginosa PAO1 sécrète un sidérophore nommé pyochéline. Celui-ci estproduit par un mécanisme de "thiotemplate", à partir de l'acide salicylique et de deuxmolécules de cystéine, et existe sous forme d'une paire de diastéréoisomèresinterconvertibles: pyochéline I (4'R, 2?R, 4?R) et pyochéline II (4'R, 2?S, 4?R). Deprécédentes études ont montré que la pyochéline induit l'expression de ses propres gènes debiosynthèse via le régulateur transcriptionnel PchR qui appartient à la famille AraC/XylS. Lapyochéline est donc non seulement un sidérophore mais également une molécule signale.Nous avons découvert que Pseudomonas fluorescens CHA0 sécrète une pyochélinestéréochimiquement distincte de celle produite par P. aeruginosa. Ce nouveau sidérophorefavorise la croissance de P. fluorescens en condition limitante en fer et induit l'expression deses propres gènes de biosynthèse. Cependant, cette molécule n'est pas reconnue commesidérophore ou molécule signale par P. aeruginosa. Réciproquement, la pyochéline estincapable de stimuler la croissance et la signalisation chez P. fluorescens. La structure dusiderophore de P. fluorescens CHA0 a été déterminée comme étant un antipode optique de lapyochéline et nommé énantio-pyochéline.La stéréospécificité de l'induction des gènes de biosynthèse de la pyochéline/énantiopyochélineest basée sur la stéréospécificité des protéines PchR de P. aeruginosa et P.fluorescens envers leur sidérophores-ligands respectifs. PchR est fonctionnel chez l'espècehétérologue, mais uniquement en présence de son propre ligand. Les récepteurs spécifiquesdes sidérophores pyochéline/enantio-pyochéline ne sont pas indispensables à la signalisationmais sont essentiels à l'incorporation du fer et à la croissance en carence de fer. Laconstruction de protéines hybrides et tronquées a révélé que le domaine N-terminal de PchRest l'élément déterminant pour la spécificité de la protéine vis-à-vis de son ligand. SUMMARY : The siderophore pyochelin is produced by the opportunistic pathogen Pseudomonas aeruginosa PAO1 and promotes growth under iron limitation. Pyochelin is made by a thiotemplate mechanism from salicylate and two molecules of cysteine and exists as a pair of interconvertible diastereoisomers: pyochelin I (4'R, 2"R, 4"R) and pyochelin II (4'R, 2"S, 4"R). Pyochelin induces the expression of its biosynthesis and uptake genes via the transcriptional AraC/Xy1S family regulator PchR in a process termed pyochelin signaling. Pseudomonas fluorescens CHAO was found to make a stereochemically distinct pyochelin to P. aeruginosa. This siderophore promoted the growth of P. fluorescens under iron limitation and induced the expression of its biosynthesis genes but was not recognised as a siderophore or signaling molecule by P. aeruginosa. Reciprocally, pyochelin was unable to promote growth or signaling in P. fluorescens. The structure of the P. fluorescens CHAO siderophore was determined and found to be enantio-pyochelin, the optical antipode of pyochelin. Stereospecificity in induction of pyochelin/enantio-pyochelin biosynthesis genes was found to be due to stereospecificity of the homologous PchR proteins of P. aeruginosa and P. fluorescens towards their respective siderophore ligands. PchR was able to function in the heterologous species, but only if supplied with its native ligand. The pyochelin/enantiopyochelin receptors were not essential for signaling although both receptors are essential for iron uptake and growth under iron limitation. Construction of hybrid and truncated PchR proteins revealed that the N-terminal domain of PchR is responsible for siderophore recognition/stereospecificity.

Consommation de cannabis : quels sont les risques ?

Abstract - Cannabis: what are the risks ? Cannabinoids from cannabis have a dual use and display often opposite pharmacological properties depending on the circumstances of use and the administered dose. Cannabinoids constitute mainly a recreative or addictive substance, but also a therapeutic drug. They can be either neurotoxic or neuroprotector, carcinogenic or an anti-cancer drug, hyperemetic or antiemetic, pro-inflammatory or anti-inflammatory... Improvement in in-door cultivation techniques and selection of high yield strains have resulted in a steadily increase of THC content. Cannabis is the most frequently prohibited drug used in Switzerland and Western countries. About half of teenagers have already experimented cannabis consumption. About 10% of cannabis users smoke it daily and can be considered as cannabis-dependant. About one third of these cannabis smokers are chronically intoxicated. THC, the main psychoactive drug interacts with the endocannnabinoid system which is made of cellular receptors, endogenous ligands and a complex intra-cellular biosynthetic, degradation and intra-cellular messengers machinery. The endocannabinoid system plays a major role in the fine tuning of the nervous system. It is thought to be important in memory, motor learning, and synaptic plasticity. At psychoactive dose, THC impairs psychomotor and neurocognitive performances. Learning and memory abilities are diminished. The risk to be responsible of a traffic car accident is slightly increased after administration of cannabis alone and strongly increased after combined use of alcohol and cannabis. With the exception of young children, cannabis intake does not lead to potentially fatal intoxication. However, cannabis exposure can act as trigger for cardiovascular accidents in rare vulnerable people. Young or vulnerable people are more at risk to develop a psychosis at adulthood and/or to become cannabis-dependant. Epidemiological studies have shown that the risk to develop a schizophrenia at adulthood is increased for cannabis smokers, especially for those who are early consumers. Likewise for the risk of depression and suicide attempt. Respiratory disease can be worsen after cannabis smoking. Pregnant and breast-feeding mothers should not take cannabis because THC gets into placenta and concentrates in breast milk. The most sensitive time-period to adverse side-effects of cannabis starts from foetus and extends to adolescence. The reason could be that the endocannabinoid system, the main target of THC, plays a major role in the setup of neuronal networks in the immature brain. The concomitant use of other psychoactive drugs such as alcohol, benzodiazepines or cocaine should be avoided because of possible mutual interactions. Furthermore, it has been demonstrated that a cross-sensitisation exists between most addictive drugs at the level of the brain reward system. Chronic use of cannabis leads to tolerance and withdrawals symptoms in case of cannabis intake interruption. Apart from the aforementioned unwanted side effects, cannabis displays useful and original medicinal properties which are currently under scientific evaluation. At the moment the benefit/risk ratio is not yet well assessed. Several minor phytocannabinoids or synthetic cannabinoids devoid of psychoactive properties could find their way in the modern pharmacopoeia (e.g. ajulemic acid). For therapeutic purposes, special cannabis varieties with unique cannabinoids composition (e.g. a high cannabidiol content) are preferred over those which are currently used for recreative smoking. The administration mode also differs in such a way that inhalation of carcinogenic pyrolytic compounds resulting from cannabis smoking is avoided. This can be achieved by inhaling cannabis vapors at low temperature with a vaporizer device. Résumé Les cannabinoïdes contenus dans la plante de cannabis ont un double usage et possèdent des propriétés opposées suivant les circonstances et les doses employées. Les cannabinoïdes, essentiellement drogue récréative ou d'abus pourraient, pour certains d'entre eux, devenir des médicaments. Selon les conditions d'utilisation, ils peuvent être neurotoxiques ou neuroprotecteurs, carcinogènes ou anticancéreux, hyper-émétiques ou antiémétiques, pro-inflammatoires ou anti-inflammatoires... Les techniques de culture sous serre indoor ainsi que la sélection de variétés de cannabis à fort potentiel de production ont conduit à un accroissement notable des taux de THC. Le cannabis est la drogue illégale la plus fréquemment consommée en Suisse et ailleurs dans le monde occidental. Environ la moitié des jeunes ont déjà expérimenté le cannabis. Environ 10 % des consommateurs le fument quotidiennement et en sont devenus dépendants. Un tiers de ces usagers peut être considéré comme chroniquement intoxiqué. Le THC, la principale substance psychoactive du cannabis, interagit avec le "système endocannabinoïde". Ce système est composé de récepteurs cellulaires, de ligands endogènes et d'un dispositif complexe de synthèse, de dégradation, de régulation et de messagers intra-cellulaires. Le système endocannabinoïde joue un rôle clé dans le réglage fin du système nerveux. Les endocannabinoïdes régulent la mémorisation, l'apprentissage moteur et la plasticité des liaisons nerveuses. À dose psychoactive, le THC réduit les performances psychomotrices et neurocognitives. Les facultés d'apprentissage et de mémorisation sont diminuées. Le risque d'être responsable d'un accident de circulation est augmenté après prise de cannabis, et ceci d'autant plus que de l'alcool aura été consommé parallèlement. À l'exception des jeunes enfants, la consommation de cannabis n'entraîne pas de risque potentiel d'intoxication mortelle. Toutefois, le cannabis pourrait agir comme facteur déclenchant d'accident cardiovasculaire chez de rares individus prédisposés. Les individus jeunes, et/ou vulnérables ont un risque significativement plus élevé de développer une psychose à l'âge adulte ou de devenir dépendant au cannabis. Des études épidémiologiques ont montré que le risque de développer une schizophrénie à l'âge adulte était augmenté pour les consommateurs de cannabis et ceci d'autant plus que l'âge de début de consommation était précoce. Il en va de même pour le risque de dépression. Les troubles respiratoires pourraient être exacerbés par la prise de cannabis. Les femmes enceintes et celles qui allaitent ne devraient pas consommer de cannabis car le THC traverse la barrière hémato-placentaire, en outre, il se concentre dans le lait maternel. La période de la vie la plus sensible aux effets néfastes du cannabis correspond à celle allant du foetus à l'adolescent. Le système endocannabinoïde sur lequel agit le THC serait en effet un acteur majeur orchestrant le développement des réseaux neuronaux dans le cerveau immature. La prise concomitante d'autres psychotropes comme l'alcool, les benzodiazépines ou la cocaïne conduit à des renforcements mutuels de leurs effets délétères. De plus, il a été montré l'existence d'une sensibilité croisée pour la majorité des psychotropes qui agissent sur le système de la récompense, le cannabis y compris, ce qui augmente ainsi le risque de pharmacodépendance. La prise régulière de doses élevées de cannabis entraîne l'apparition d'une tolérance et de symptômes de sevrage discrets à l'arrêt de la consommation. À part les effets négatifs mentionnés auparavant, le cannabis possède des propriétés médicales originales qui sont l'objet d'études attentives. Plusieurs cannabinoïdes mineurs naturels ou synthétiques, comme l'acide ajulémique, pourraient trouver un jour une place dans la pharmacopée. En usage thérapeutique, des variétés particulières de cannabis sont préférées, par exemple celles riches en cannabidiol non psychoactif. Le mode d'administration diffère de celui utilisé en mode récréatif. Par exemple, la vaporisation des cannabinoïdes à basse température est préférée à l'inhalation du "joint".

" Arabidopsis Thaliana " response to insect feeding : new components controlling defense gene expression and plant resistance

Abstract: Plants cannot run away to escape attacking herbivores, but they defend themselves by producing anti-digestive proteins and toxic compounds (for example glucosinolates). The first goal of this thesis was to study changes in gene expression after insect attack using microarrays. The responses of Arabidopsis thaliana to feeding by the specialist Pieris rapae and the generalist Spodoptera liffora is were compared. We found that the transcript profiles after feeding by the two chewing insects were remarkably similar, although the generalist induced a slightly stronger response. The second goal was to evaluate the implication of the four signals jasmonic acid (JA), salicylic acid (SA), ethylene (ET), and abscisic acid (ABA) in the control of insect-regulated gene expression. Using signaling mutants, we observed that JA was the predominant signal and that ABA modulated defense gene expression. In contrast, SA and ET appeared to control slightly gene expression, but only after feeding by S. litforalis. The third goal was to establish whether plant responses are really effective against insects. In accordance with the transcript profile, both insects were affected by the JA-dependent defenses, as they performed better on the JA-insensitive mutant. S. littoralis also performed better on ABA-deficient mutants, providing evidence for the role of ABA in defense against insects. When testing indole or aliphatic glucosinolate deficient mutants, we found that they were also more susceptible to insect feeding, providing some of the first genetic evidence for the defensive role of glucosinolates in planta. Finally, a glutathione-deficient mutant, pad2-1, was also more susceptible to insect feeding and we could attribute this phenotype to a lowered accumulation of the major indole glucosinolate. In this thesis, we provide a comprehensive list of insect-regulated genes, including many transcription factors that constitute interesting candidate genes for the further study of insect-induced expression changes. Understanding how the plant responses to insects are regulated will provide tools for a better management of insect pest in the field. Résumé: Les plantes ne peuvent s'échapper pour fuir les insectes qui les attaquent, mais elles se défendent en produisant des protéines anti-digestives et des composés toxiques (par exemple des glucosinolates). Le premier but de cette thèse était d'étudier les changements de l'expression génétique lors d'attaque par des insectes en utilisant des puces à ADN. Nous avons comparé la réponse d'Arabidopsis thaliana à deux espèces d'insectes avec des habitudes alimentaires différentes : le spécialiste Pieris rapae et le généraliste Spodoptera littoralis. Nous avons trouvé que les profils de transcription après l'attaque par les deux insectes sont remarquablement similaires, bien que le généraliste induise une réponse légèrement plus forte. Le deuxième but était de déterminer l'implication de quatre signaux dans le contrôle de la réponse :l'acide jasmonique (JA), l'acide salicylique (SA), l'éthylène (ET), et l'acide abscissique (ABA). En utilisant de mutants de signalisation, nous avons montré que l'acide jasmonique était le signal prédominant et que l'acide abscissique modulait l'expression génétique. D'autre part, l'acide salicylique et l'éthylène contrôlent à un degré moindre l'expression génétique, mais seulement après l'attaque par S. littoralís. Le troisième but était d'établir si les réponses des plantes sont efficaces contre les insectes. En accord avec le profil de transcription, les deux espèces d'insectes se sont mieux développées sur un mutant insensible au JA, indiquant que les défenses contrôlées par ce signal sont cruciales pour la plante. De plus, les larves de S. littorales se sont mieux développées sur des mutants déficients en ABA, ce qui fournit une preuve du rôle de l'acide abscissique dans la défense contre les insectes. En testant des mutants déficients en glucosinolates de type indole ou aliphatique, nous avons trouvé qu'ils étaient plus sensibles aux insectes, démontrant ainsi le rôle défensif des glucosinolates in planta. Finalement, le mutant déficient en glutathion pad2-1 était aussi plus sensible à l'attaque des insectes, et nous avons pu attribuer ce phénotype à une plus faible augmentation d'un indole glucosinolate dans ce mutant. Dans cette thèse, nous avons mis en évidence un nombre important de gènes contrôlés par les insectes, comprenant de nombreux facteurs de transcription qui constituent des candidats intéressants pour`étudier plus en détail les changements d'expression génétique induits par les insectes. Une meilleure compréhension de la réponse des plantes contre l'attaque des insectes devrait nous permettre de développer de nouvelles stratégies pour mieux gérer les ravageurs des cultures.

Mechanisms of HCF protein proteolytic maturation

Abstract : Post-translational modifications such as proteolytic processing, phosphorylation, and glycosylation, add extra layers of complexity to proteomes and allow a finely tuned regulation of the activity of many proteins. The evolutionarily conserved cell-cycle and transcriptional regulator HCP-] is regulated by proteolytic maturation via which a stable heterodirneric complex of two cleaved subunits is formed from a single precursor protein. The human HCF-1 precursor is cleaved at six nearly identical 26 amino acid sequence repeats, called HCF-1pro repeats, which represent uncommon protease recognition sites dedicated to human HCF-1 proteolysis. This proteolytic maturation process is conserved in vertebrate HCF-1 homologues and is essential for the functions of the human protein in cell-cycle regulation; the mechanisms that execute and control HCF-1 proteolysis, however, remain poorly understood. In this dissertation I investigate the mechanisms of proteolytic maturation of HCF-1 proteins in different species. I show that the Drosophila homolog of human HCF-1, called dHCP, is proteolytically cleaved via a different mechanism than human HCF-1. dHCP is processed by the same protease, called Taspase], which cleaves one of the key developmental regulators in flies, the Trithorax protein. Maturation of HCP proteins via Taspase] cleavage is probably not particular to dHCP as many invertebrate HCP proteins, particularly insects and flatworms, possess Taspase] recognition sites. In contrast, the vertebrate HCF-1 proteins lack Taspase] recognition sites and the HCF-1pro repeats are not Taspase1 substrates, suggesting that multiple mechanisms for HCF-1 proteolytic maturation have appeared during evolution. I also show that the proteolytic activity responsible for the cleavage of the HCP- 1pro repeats is very difficult to characterize, being resistant to most protease inhibitors and very sensitive to biochemical fractionation. Moreover, the HCF-1pro repeats represent complex protease recognition sites and I demonstrate that, in addition to be the HCF-1 cleavage sites, these repeated sequences, also recruit the OG1cNAc transferase OGT. The OGT protein and the OG1cNAc modification of HCF-1 are both important for HCF-1pro repeat proteolysis. Interestingly, a human recombinant OGT purified from insect cells is able to induce cleavage of a HCF-1pro-repeat precursor in vitro, indicating that OGT either (i) induces HCF-1 autoproteolysis,(ii) is the HCF-1pro- repeat proteolytic activity itself, or (iii) physically associates with a proteolytic activity that is conserved in insect cells. In any case, OGT plays an important role in HCF-1 proteolytic maturation and perhaps a broader role in HCF-1 biological function. Résumé : Les modifications post-traductionelles pomme le clivage protéolytique, la phosphorylation, et la glycosylation, augmentent significativement la complexité des protéomes et permettent une régulation fine de l'activité de beaucoup de protéines. La protéine HCF-1, qui est un régulateur du cycle cellulaire et de la transcription, est elle- même régulée par clivage protéolytique. La protéine HCF-1 est en effet coupée en deux sous-unités qui s'associent l'une a l'autre pour former la protéine mature. Le précurseur de la protéine HCF-1 humaine est clivé à six sites correspondant à six séquences répétées nommées les HCF-1pro repeats, chacune composée de 26 acide aminés. Les HCF-1pro- repeats ne ressemblent ai aucune séquence de clivage protéolytique connue et sont présentes seulement dans les protéines HCF-1 chez les vertébrés. Bien que la maturation protéolytique d'HCF-1 soit essentielle pour les activités de cette protéine pendant le cycle cellulaire, les mécanismes qui la contrôlent restent inconnus. Au cours de mon travail de thèse, j'ai analysé les mécanismes de clivage protéolytique des protéines HCF dans différentes espèces. J'ai montré que la protéine de Drosophile homologue d'HCF-1 humaine nommée dHCF est clivée par une protéase nommée Taspase1. Ainsi, dHCF est clivé par la même protéase que celle qui induit la maturation protéolytique d'un des principaux facteurs du développement chez la mouche, la protéine Trithorax. La maturation de dHCF via le clivage par la Taspase1 n'est pas spécifique à la mouche, mais est probablement étendu à plusieurs protéines HCF chez les invertébrés, surtout dans les familles des insectes et des plathehninthes, car ces protéines HCF présentent des sites de reconnaissance pour la Taspasel. Par contre, les protéines HCF-1 chez les vertébrés n'ont pas de sites de reconnaissance pour la Taspasel et cela suggère que différents mécanismes de maturation des protéines HCF- ls ont apparu au cours de l'évolution. J'ai montré aussi que les HCF-1pro-repeats sont clivés par une activité protéolytique très difficile a identifier, car elle est résistante à la plupart des inhibiteurs de protéases, mais elle est très sensible au fractionnement biochimique. En plus, les HCF-1pro-repeats sont un site de protéolyse complexe qui ne sert pas seulement au clivage des protéines HCF- chez les vertébrés mais aussi à recruter l'enzyme responsable de la O- GlcNAcylation nommée OGT. La protéine OGT et la O-GlcNAcylatio d'HCF-1 sont toutes les deux importantes pour le clivage protéolytique des HCF1pro-repeats. Curieusement, la protéine OGT humaine produite dans des cellules d'insectes est capable de cliver les HCF-1pro repeats in vitro et cela suggère que OGT soit (i) induit le clivage autocatalytique cl'HCF-1, soit (ii) est elle-même l'activité protéolytique qui clive HCF4, soit (iii) est associée à une activité protéolytique conservée dans les cellules d'insectes qui a été co-purifiée avec OGT. En conclusion, OGT joue un rôle important dans la maturation protéolytique d'HCF-1 et peut-être aussi un rôle plus large dans les fonctions biologiques de la protéine HCF-1.

Atorvastatin-loaded hydrogel affects the smooth muscle cells of human veins

L'hyperplasie intimale est la cause majeure de sténoses de pontages veineux. Différents médicaments tels que les statines permettent de prévenir les sténoses mais leur administration systémique n'a que peu d'effet. Nous avons développé une matrice d'hydrogel d'acide hyaluronique qui permet d'avoir un relargage contrôlé d'atorvastatine sur un site désiré. L'enjeu de ce projet de recherche est de démontrer que l'atorvastatine relarguée par l'hydrogel a un effet similaire sur les cellules musculaires lisses de veines saphènes humaines comparé à l'atorvastatine directement diluée dans le milieu de culture. La recherche a été conduite conjointement par le laboratoire de médecine expérimentale du département de chirurgie thoracique et vasculaire du Centre Hospitalier Universitaire Vaudois et de l'Ecole de sciences pharmaceutiques des Universités de Lausanne et de Genève. On a incorporé de l'atorvastatine calcium (Chemos GmbH, Regenstauf Allemagne) dans des gels d'acide hyaluronique (Fortelis extra) à des concentrations déterminées afin de pouvoir analyser le relargage de l'Atovastatine dans le milieu de culture cellulaire par rapport aux concentrations d'atorvastatine directement ajoutées dans le milieu. Des cellules musculaires lisses primaires ont été cultivées à partir d'expiants de veines saphènes humaines. Elles ont été identifiées grâce à l'immunohistochimie par des anticorps contre la desmine et l'alpha-smooth muscle actine. La prolifération et la viabilité de ces cellules ont été analysées à l'aide du test MTT, leur transmigration avec le test de la chambre de Boyden et leur migration avec le principe de cicatrisation de plaies (wound healing assey). L'expression de gènes connus pour participer au développement de l'hyperplasie intimale, tels que la gap junction protein Connexin43 (Cx43), l'inhibiteur du plasminogène PAI-1, Thème oxygénase HO-1, la métalloproteinase-9 et l'inhibiteur de l'activateur du plasminogène tissulaire tPA, a été déterminée par niveau de mRNA exprimé en PCR. Leur expression en protéines a été analysée en utilisant la méthode par Western blots ainsi que l'immunohistochimie. Les expériences ont été effectuées à triple reprise en duplicats en parallèles avec de l'atorvastatine calcium directement ajoutée dans le milieu de culture et avec l'atorvastatine relarguée par l'hydrogel d'acide hyaluronique. Conclusions L'atorvastatine est relarguée par l'hydrogel de façon contrôlée. L'hydrogel contenant l'atorvastatine diminue la viabilité et la transmigration des cellules musculaires lisses de veines saphènes humaines de façon similaire à l'atorvastatine directement introduite dans le milieu de culture. L'hydrogel contenant l'atorvastatine module de façon sélective l'expression de marqueurs de la différentiation cellulaire de cellules musculaires lisses de veines saphènes humaines avec un retard de 24 heures comparé avec les effets de l'atorvastatine directement ajoutée au milieu de culture, sans néanmoins changer la distribution intra-cellulaire des protéines Cx43, HO-1 et PAI-1. Perspectives Il s'agit d'un projet d'importance clinique majeure permettant de réaliser des améliorations du traitement des artériopathies occlusives, ainsi que de relevance pharmacologique permettant de réaliser des dépôts de molécules avec un relargage stable et contrôlé à un site spécifique.

IRM hépatique avec produit de contraste hépato-spécifique dans l'exploration des tumeurs hépatiques.

Messages à retenir: Connaître la pharmacocinétique du produit de contraste hépato spécifique Gd-EOB-DTPA.Apprendre la valeur diagnostique supplémentaire du Gd-EOB-DTPA comparée à celle des produits de contraste purement intravasculaires pour l'exploration destumeurs hépatiques.Connaître les situations cliniques typiques dans lesquelles l 'utilisation du Gd-EOB-DTPA est recommandée. Résumé: Le produit de contraste Gd-EOB-DTPA, un sel de l'acide gadoxétique, est un agent de contraste intra vasculaire et hépato-spécifique. Environ 50% de la doseinjectée par voie intraveineuse (IV) sont captés par les hépatocytes en phase veineuse, suivie d'une excrétion biliaire à environ 20 minutes après l'injection IV enbolus. En phase tardive, il en résulte donc un renforcement de contraste entre le parenchyme hépatique et toutes les lésions intra-hépatiques focales qui sontcomposées d'autres cellules que d'hépatocytes sains. La détection de métastases hépatiques est ainsi rendue plus facile, notamment celles de petite taille,même infra-centimétrique, en permettant de connaître exactement leur nombre total, ce qui est essentiel en cas de bilan pré-opératoire. La caractérisation destumeurs bénignes, telle que de l'hyperplasie nodulaire focale et de l'adénome hépatique, est également améliorée, en raison de leur contenu cellulaire différent.En cas de remaniement fibrotique ou cirrhotique sous-jacent, le Gd-EOB-DTPA s'est révélé supérieur que d'autres agents de contraste hépato-spécifiques enraison d'une meilleure imprégnation du parenchyme hépatique.

Lipoxygenase 2 and the early steps of jasmonic acid biosynthesis in "Arabidopsis thaliana"

Résumé Les oxylipines, telles que l'acide jasmonique (AJ ou jasmonate), jouent un rôle central en réponse à la blessure et à la pathogenèse. De nombreuses études ont montré l'importance de la voie canonique du jasmonate lors de la défense des plantes. De plus, un précurseur cyclopentenone de l'AJ, l'acide oxo-phyto-dienoic (OPDA), a été impliqué comme jouant le rôle d'une molécule signal lors de la défense contre certains pathogènes. En utilisant des mutants bloqués dans la biosynthèse de l'acide jasmonique (aos) ou dans sa perception (coi1-1), nous avons cherché à définir dans quelle mesure l'OPDA joue un rôle de signal induisant l'expression génétique en réponse à la blessure chez Arabidopsis. A l'aide de puces à ADN (microarray), nous avons montré que les transcriptomes d'aos et de coi1-1 sont très semblables après blessure, ce qui suggère que les produits d'AOS sont tous perçus via COI1. Pourtant, lorsqu'on analyse les métabolites présents chez ces mutants, une différence est visible, puisque aos n'accumule pas d'AJ, alors que coi1-1 en accumule encore rapidement après blessure. Nous avons étudié la possibilité qu'un mécanisme de régulation post-traductionnelle sur la voie de biosynthèse du jasmonate explique l'accumulation d'AJ chez coi1-1 après blessure. La lipoxygenase 2 (LOX2) est la première enzyme impliquée dans la biosynthèse de l'AJ et est donc une cible potentielle d'un tel mécanisme. Un indice sur la manière dont l'activité LOX pourrait être régulée vient du mutant fou2 (pour fatty acid oxygenation upregcilated 2) dans lequel l'activité LOX ainsi que le niveau d'AJ sont constitutivement élevés. Cette mutation implique un flux de cation dans la régulation de la production de l'AJ. De plus, il a été montré que plusieurs LOXs, dans des organismes autres que des plantes, peuvent lier le calcium. Nous montrons que l'activité LOX requiert l'addition de cations divalents pour être maximale in vitro, et que non seulement le calcium mais aussi le magnésium joue ce rôle. De plus, nous caractérisons un mutant récessif de LOX2 chez Arabidopsis (lox2-1). Ces plantes sont fertiles, et une analyse quantitative montre qu'elles accumulent toujours un peu d'AJ après blessure. Ceci suggère que LOX2 n'est pas la seule LOX impliquée dans la synthèse d'AJ. Aussi les plantes lox2-1 ne sont pas plus sensibles que les plantes de type sauvage lorsqu'elles sont infectées par la moisissure Botrytis cinerea ou lorsqu'elles sont exposées à un détritivore, néanmoins elles sont plus sensibles lorsqu'elles sont offertes en nourriture à un insecte herbivore. Les insectes et les plantes ont co-évolué conjointement, ainsi une plante ne contenant qu'un niveau réduit d'AJ favorise l'insecte. La disponibilité d'un mutant avec un niveau intermédiaire d'AJ va permettre de mieux comprendre pourquoi les plantes produisent autant de jasmonate. Abstract Oxylipins such as jasmonic acid (JA) play central roles in the wound response and during pathogenesis and many studies have confirmed the important role of the canonical jasmonate pathway in plant defense. Moreover, the cyclopentenone precursor of JA, oxo-phytodienoic acid (OPDA), is also thought to function as a signaling molecule in defense towards some pathogens. Its action was reported to depend on a different signal pathway to JA. By using mutants blocked in the biosynthesis (aos) or perception (coil-1) of JA, we investigated to which extend OPDA works as signaling molecule to trigger gene expression in the wound response of Arabidopsis. Using microarrays, we showed that aos and coil-1 transcriptome are similar in response to wounding, suggesting that products of AOS are all perceived by COI1. However, we found a difference between the two mutants at the metobolomic level, since aos is devoid of JA, but coil-1 can still rapidly accumulate JA upon wounding. We investigated the possibility that the post-translational activation of JA biosynthesis could explain the fast accumulation of JA in coil-1 plants upon wounding. Lipoxygenase (LOX) 2 is the first enzyme implicated in JA synthesis and was thus chosen as a potential target for posttranslational regulation. A clue as to how LOX activity might be regulated came from the fatty acid oxygenation upregulated 2 (foul) mutant in which LOX activity and JA levels are elevated. The foul mutant implicates cations flux in the regulation of JA production, and several LOXs in organisms other than plants have been shown to bind calcium. We showed that Arabidopsis LOX requires divalent cations for full activity in vitro, and that not only calcium but also magnesium can play this role. Moreover, a single recessive mutant of AtLOX2 was characterized. These plants are fully fertile. Quantitative oxylipin analysis showed that lox2-1 can still accumulate some JA after wounding, which suggests that LOX2 is not the only LOX involved in JA biosynthesis. lox2-1 plants do not show altered susceptibility to the fungus Botrytis cinerea or to a detritivore, however, they are more susceptible to an insect herbivore. The insect and plants are closely co-evolved and a reduced ability to synthesize JA favors the insect. The availability of a lox2-1 mutant with intermediate JA levels will further help understanding why plants produce elevated JA levels.

Les fluides de coupes : état des connaissances sur les usages, les expositions et les pratiques de gestion en France : rapport d'étude

Les fluides de coupe sont principalement utilisés pour leurs propriétés lubrifiantes et/ou pour leur qualité de refroidissement des pièces en métallurgie. Ils sont utilisés pour faciliter l'opération d'usinage et contribue à améliorer la durée de vie de l'outil utilisé. Ils permettent d'éloigner les copeaux de la zone de coupe, ce qui contribue à l'obtention d'un état de surface de qualité, et de refroidir le copeau et la pièce usinée afin de contribuer à la précision dimensionnelle de la pièce finie. Les usages des fluides de coupe sont en évolution depuis les années 2000. Il y a environ 15-30 ans, seules les huiles entières étaient utilisées. Aujourd'hui, l'utilisation des huiles varie selon le type d'application mais il est à noter toutefois que l'usage des huiles entières est en pleine décroissance depuis 2001, contrairement à celui des fluides aqueux (émulsions) en pleine expansion. Les fluides de coupe exposeraient selon l'étude SUMER plus de 1 million de travailleurs. Il existe deux grands secteurs principaux utilisateurs de ces fluides : le travail des métaux (qui expose selon l'INRS le plus grand nombre de salariés) et l'automobile (plus grand secteur utilisateur selon la CSNIL, Chambre Syndical Nationale de l'Industrie des Lubrifiants). De nombreux éléments existent autour de la prévention des risques liés à l'utilisation des fluides de coupe mais comme le rappelait l'INRS dans son rapport publié en 2002, la plupart des méthodes de prévention, collectives ou individuelles, bien que déjà connues, ne sont pas toujours appliquées, et notamment dans les petites entreprises. De plus les moyens de surveillance, bien que largement détaillés dans de nombreux guides, sont rarement mis en oeuvre. Néanmoins, des substances dangereuses peuvent se retrouver soit au sein de la formulation des fluides de coupe (comme certains additifs, biocides..), soit se former au cours du stockage (comme c'est le cas de pour la NDELA, N-nitroso diéthanolamine). Certaines substances ont déjà vu leur usage en tant que biocide être interdit en France, tel que le formaldéhyde ou encore l'acide borique. Des solutions de substitution existent déjà, telles que la micro-lubrification ou l'usinage à sec. Mais la mise en place ou la recherche de substituts s'accompagne souvent de difficultés en ce qui concerne l'adaptation du processus industriel. La mise en oeuvre des collaborations avec les fournisseurs doit donc être fortement encouragée. Enfin, il existe des zones d'ombre concernant les risques associés au développement microbiologique intervenant lors du vieillissement des fluides. L'utilisation grandissante de ces fluides de type aqueux est en lien avec ces problèmes de contamination microbienne des fluides ainsi que les pathologies respiratoires qui semblent y être associées. Cependant l'absence de référentiel exclut toute interprétation des résultats relatifs à ces agents microbiologiques retrouvés à la fois dans les fluides et les aérosols. Conclusions : En raison de la complexité de la formulation des fluides de coupe, il n'existe pas aujourd'hui de méthode de mesure fiable pour évaluer l'exposition à ces produits. Ainsi la mise en place d'une évaluation quantitative des risques sanitaires complète semble prématurée voire impossible. Il apparaît cependant nécessaire d'aller plus loin en matière de prévention : - une valeur limite pourrait être imposée concernant les quantités en amines secondaires précurseurs de nitrosamines, telle que développée dans le modèle allemand, le respect de cette réglementation allemande est déjà un argument mis en place par certains fournisseurs français ; - La micro-lubrification et la recherche de substitution doivent être encouragées ; - L'élaboration d'un référentiel microbiologique qui puisse tenir compte de la qualité des fluides et de la protection des travailleurs devrait être soutenue. [Auteurs]

Atrovastatin-loaded hydrogel affects the smooth muscle cells of human veins

Les pontages veineux restent actuellement un traitement de choix dans les pathologies vasculaires occlusives. Cependant, plusieurs problèmes sont liés à ce type de revascularisation. Premièrement, l'hyperplasie intimale (HI) qui cause une resténose dans 20 à 50% des pontages, conduisant à un échec de la revascularisation. Ce processus est dû à la prolifération et à la migration des cellules musculaires lisses vasculaires vers l'intima, ainsi qu'à une sécrétion de protéines de la matrice extracellulaire conduisant à un épaississement de l'intima, principalement au niveau des anastomoses. Deuxièmement, bien qu'il existe des substances connues pour inhiber l'HI, leur administration systémique répétée est associée à une augmentation de leurs effets secondaires. Aucun dispositif ne permet actuellement la libération d'une telle substance localement au site d'une anastomose vasculaire. Nous avons donc développé un hydrogel d'acide hyaluronique compatible avec une application locale au niveau des anastomoses vasculaires et pouvant être chargé en atorvastatine (ATV) (inhibiteur de la 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA réductase), substance connue pour inhiber l'HI, dans le but de diminuer le fléau de la resténose. Nous avons tout d'abord testé l'effet de ce gel chargé en ATV sur la prolifération, la migration et la transmigration de cellules musculaires lisses primaires en culture provenant de veines saphènes humaines. Ensuite, nous avons étudié son effet sur différents gènes impliqués dans l'HI. Ceci a permis de montrer que l'ATV diminue la prolifération, la migration et la transmigration des cellules musculaires lisses humaines de façon similaire qu'elle soit ajoutée directement au milieu de culture ou qu'elle soit libérée par l'hydrogel chargé. De même, l'ATV régule de manière simultanée mais différentielle les gènes, en interférant avec le développement de l'HI. Nos expériences montrent que l'HI peut être diminuée in vitro grâce à cet hydrogel d'acide hyaluronique chargé en ATV. Ceci ouvre la porte au développement de futur dispositif permettant de relâcher des substances antisténotiques de façon continue, sur une durée prolongée, et in vivo.