~3H的辐射生物学效应的研究（Ⅳ）HTO对莱哈衣藻（Chlamydomonas reinhardtii Dangeard）核仁纤维区超微结构的影响

利用电子显微镜和银染技术研究ＨＴＯ对莱哈衣藻核仁纤维区的辐射效应。结果显示：分裂间期衣藻核仁纤维区为由细线样结构组成的索状结构；衣藻细胞在含低剂量ＨＴＯ（３７０ｋＢｑ／ｍＬ）培养基培养１４００ｈ以后，间期核仁纤维区索状结构变得膨松，体积增大；经含中剂量ＨＴＯ（３７００ｋＢｑ／ｍＬ）培养１４００ｈ以后，纤维区索状结构明显解体，轮廓变得不清晰；经含高剂量ＨＴＯ（３７０００ｋＢｑ／ｍＬ）培养基培养１４００ｈ后，纤维区索状结构完全解体，呈现出松散的细线样结构，同时参与ｒＲＮＡ合成的一种酸性蛋白明显减少，结果表明，衣藻细胞分裂间期的核仁纤维区对ＨＴＯ的辐射作用是敏感的。

Expression and molecular analysis of phbB gene in Chlamydomonas reinhardtii

The expression vector containing phbB and ble genes was constructed and transformed into cell-wall-deficient strain Chlamydomonas reinhardtii CC-849 by the glass-head method. The transgenic alga was selected and maintained in the TAP agar plates containing 10 mug/mL Zeomycin. Transgenic alga, which could express phbB at the transcriptional level, was obtained and further confirmed with PCR, Southern blot and RT-PCR-DNA hybridization analysis.

Effects of CO2 concentrations on the freshwater microalgae, Chlamydomonas reinhardtii, Chlorella pyrenoidosa and Scenedesmus obliquus (Chlorophyta)

In order to investigate the possible impacts of increased atmospheric CO2 levels on algal growth and photosynthesis, the influence of CO2 concentration was tested on three planktonic algae (Chlamydomonas reinhardtii, Chlorella pyrenoidosa, and Scenedesmus obliquus). Increased CO2 concentration enhanced significantly the growth rate of all three species. Specific growth rates reached maximal values at 30, 100, and 60 muM CO2 in C. reinhardtii, C pyrenoidosa, and S. obliquus, respectively. Such significant enhancement of growth rate with enriched CO2 was also confirmed at different levels of inorganic N and P, being more profound at limiting levels of N in C pyrenoidosa and P in S. obliquus. The maximal rates of net photosynthesis, photosynthetic efficiency and light-saturating point increased significantly (p<0.05) in high-CO2-grown cells. Elevation of the CO2 levels in cultures enhanced the photoinhibition of C. reinhardtii, but reduced that of C pyrenoidosa and S. obliquus when exposed to high photon flux density. The photo-inhibited cells recovered to some extent (from 71% to 99%) when placed under dim light or in darkness, with better recovery in high-CO2-grown C. pyrenoidosa and S. obliquus. Although pH and pCO(2) effects cannot be distinguished from this study, it can be concluded that increased CO2 concentrations with decreased pH could affect the growth rate and photosynthetic physiology of C. reinhardtii, C. pyrenoidosa, and S. obliquus.

Recombination and heterologous expression of allophycocyanin gene in the chloroplast of Chlamydomonas reinhardtii

Heterogeneous expression of multiple genes in the nucleus of transgenic plants requires the introduction of an individual gene and the subsequent backcross to reconstitute multi-subunit proteins or metabolic pathways. In order to accomplish the expression of multiple genes in a single transformation event, we inserted both large and small subunits of allophycocyanin gene (apcA and apcB) into Chlamydomonas reinhardtii chloroplast expression vector, resulting in papc-S. The constructed vector was then introduced into the chloroplast of C. reinhardtii by micro-particle bombardment. Polymerase chain reaction and Southern blot analysis revealed that the two genes had integrated into the chloroplast genome. Western blot and enzyme-linked immunosorbent assay showed that the two genes from the prokaryotic cyanobacteria could be correctly expressed in the chloroplasts of C. reinhardtii. The expressed foreign protein in transformants accounted for about 2%-3% of total soluble proteins. These findings pave the way to the reconstitution of multi-subunit proteins or metabolic pathways in transgenic C. reinhardtii chloroplasts in a single transformation event.

Fatty acid biosynthesis in eukaryotic photosynthetic microalgae: Identification of a microsomal delta 12 desaturase in Chlamydomonas reinhardtii

Polyunsaturated fatty acids (PUFAs) are important components of infant and adult nutrition because they serve as structural elements of cell membranes. Fatty acid desaturases are responsible for the insertion of double bonds into pre-formed fatty acid chains in reactions that require oxygen and reducing equivalents. In this study, the genome-wide characterization of the fatty acid desaturases from seven eukaryotic photosynthetic microalgae was undertaken according to the conserved histidine-rich motifs and phylogenetic profiles. Analysis of these genomes provided insight into the origin and evolution of the pathway of fatty acid biosynthesis in eukaryotic plants. In addition, the candidate enzyme from Chlamydomonas reinhardtii with the highest similarity to the microsomal Delta 12 desaturase of Chlorella vulgaris was isolated, and its function was verified by heterologous expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae).

The recombination and expression of the allophycocyanin beta subunit gene in the chloroplast of Chlamydomonas reinhardtii

A Chlamydomonas reinhardtii (C. reinhardtii) chloroplast expression vector, papc-B, containing the apc-B gene that encodes the beta subunit of the light-harvesting antenna protein allophycocyanin (APC) of cyanobacteria, was constructed and transferred to the chloroplast genome of C. reinhardtii by the biolistic method. The transformants were identified by Southern blot, Western blot and ELISA assays after selection on resistant medium. The recombinant APC beta subunit was expressed in the C. reinhardtii chloroplast and accounted for up to 2-3% (w/w) of the total soluble protein (TSP), suggesting a promising prospect of using C. reinhardtii chloroplasts to produce functional plant-derived proteins.

Expression of beta-carotene hydroxylase gene (crtR-B) from the green alga Haematococcus pluvialis in chloroplasts of Chlamydomonas reinhardtii

A carotenoid gene (crtR-B) from the green alga Haematococcus pluvialis, encoding beta-carotene hydroxylase that was able to catalyze the conversion of beta-carotene to zeaxanthin and canthaxanthin to astaxanthin, was cloned into Chlamydomonas reinhardtii chloroplast expression vector p64D to yield plasmid p64DcrtR-B. The vector p64DcrtR-B was transferred to the chloroplast genome of C. reinhardtii using micro-particle bombardment. PCR and Southern blot analyses indicated that crtR-B was integrated into the chloroplast genome of the transformants. RTPCR assays showed that the H. pluvialis crt R-B gene was expressed in C. reinhardtii transformants. The transformants rapidly synthesized carotenoids in larger quantities than the wild-type upon being transferred from moderate to high-intensity white light. This research provides a foundation for further study to elucidate the possible mechanism of photo-protection by xanthophylls and other carotenoids in high light conditions or through exposure to UV radiation.

Cloning and structure analysis of hydrogenase gene from Chlamydomonas reinhardtii SE

The cDNA of Chlamydomonas reinhardtii SE encoding hydrogenase (HydA2) was obtained from the total RNA of C reinhardtii SE by RT-PCR. The DNA of hydrogenase was amplified by PCR from the genomic DNA of C reinhardtii SE. The cDNA and DNA of hydrogenase were sequenced, respectively. The structure of hydrogenase gene was analyzed by biology software. The open reading frame predicts that the hydrogenase is composed of 3584 bp encoding 505 amino acids in length with a predicted M.W. of 53.69 kDa. Ten exons (including 1518 bp) and nine introns (including 2066 bp) have been found in the hydrogenase, and there were two potential N-glycosylate sites, eight protein kinase C phosphorylation site, eight casein kinase H phosphorylation site and one sulphorylation in the sequence. The theory pI was 6.15. Total number of negatively charged residues (Asp + Glu) and positively charged residues (Arg + Lys) were 55 and 61, respectively. (c) 2005 Elsevier Ltd. All rights reserved.

Effet du calcium, plomb et cuivre sur la bioaccumulation du cadmium et la production des phytochélatines par Chlamydomonas reinhardtii

Dans les milieux contaminés par les métaux, les organismes vivants sont exposés à plusieurs d’entre eux en même temps. Les modèles courants de prédiction des effets biologiques des métaux sur les organismes (p. ex., modèle du ligand biotique, BLM ; modèle de l’ion libre, FIAM), sont des modèles d’équilibre chimique qui prévoient, en présence d'un deuxième métal, une diminution de la bioaccumulation du métal d’intérêt et par la suite une atténuation de ses effets. Les biomarqueurs de toxicité, tels que les phytochélatines (PCs), ont été utilisés comme étant un moyen alternatif pour l’évaluation des effets biologiques. Les phytochélatines sont des polypeptides riches en cystéine dont la structure générale est (γ-glu-cys)n-Gly où n varie de 2 à 11. Leur synthèse semble dépendante de la concentration des ions métalliques ainsi que de la durée de l’ exposition de l’organisme, aux métaux. L'objectif de cette étude était donc de déterminer, dans les mélanges binaires de métaux, la possibilité de prédiction de la synthèse des phytochélatines par les modèles d’équilibres chimiques, tel que le BLM. Pour cela, la quantité de phytochélatines produites en réponse d’une exposition aux mélanges binaires : Cd-Ca, Cd-Cu et Cd-Pb a été mesurée tout en surveillant l’effet direct de la compétition par le biais des concentrations de métaux internalisés. En effet, après six heures d’exposition, la bioaccumulation de Cd diminue en présence du Ca et de très fortes concentrations de Pb et de Cu (de l’ordre de 5×10-6 M). Par contre, avec des concentrations modérées de ces deux métaux, le Cd augmente en présence de Cu et ne semble pas affecté par la présence de Pb. Dans le cas de la compétition Cd-Cu, une bonne corrélation a été observée entre la production de PC2, PC3 et PC4 et la quantité des métaux bioaccumulés. Pour la synthèse des phytochélatines et la bioaccumulation, les effets étaient considérés comme synergiques. Dans le cas du Cd-Ca, les quantités de PC3 et PC4 ont diminué avec le métal internalisé (effet antagoniste), mais ce qui était remarquable était la grande quantité de cystéine (GSH) et PC2 qui ont été produites à de fortes concentrations du Ca. Le Pb seul n’a pas induit les PCs. Par conséquent, il n’y avait pas de variation de la quantité de PCs avec la concentration de Pb à laquelle les algues ont été exposées. La détection et la quantification des PCs ont été faites par chromatographie à haute performance couplée d’un détecteur de fluorescence (HPLC-FL). Tandis que les concentrations métalliques intracellulaires ont été analysées par spectroscopie d’absorption atomique (AAS) ou par spectrométrie de masse à source plasma à couplage inductif (ICP-MS).

La bioaccumulation d’une nanoparticule d’argent (nAg) par l’algue verte Chlamydomonas reinhardtii : distinguer la contribution de la particule de celle de l’ion Ag+

L’explosion de la nanotechnologie a permis l’intégration d’une multitude de nanoparticules dans des produits de consommation. Les nanoparticules d’argent (nAg) sont les plus utilisées à ces fins, selon les derniers recensements disponibles. La plupart des études toxicologiques, à ce jour, ont fait état de l’implication très évidente de l’ion Ag+ dans la toxicité aigüe des nAg; cependant, quelques études ont mis en évidence des effets toxicologiques dus aux nAg. Il y a un certain consensus à propos d’un risque de contamination des eaux douces via leur rejet par les effluents des réseaux d’aqueducs. Puisque les concentrations en Ag+ sont généralement très faibles dans les eaux douces (de l’ordre du pg L-1), de par la formation de complexes non-labiles avec des thiols (organiques et inorganiques) et des sulfures, la toxicité inhérente aux nAg pourrait ne pas être négligeable- comparativement aux tests en laboratoires. Cette étude s’intéressait donc aux mécanismes de bioaccumulation d’argent par l’algue verte C. reinhardtii suite à l’exposition à des nAg de 5 nm (enrobage d’acide polyacrylique). La bioaccumulation d’argent pour l’exposition à Ag+ servait de point de comparaison; également, les abondances de l’ARNm de l’isocitrate lyase 1 (ICL1) et de l’ARNm de Copper Transporter 2 (CTR2) étaient mesurées comme témoins biologiques de la bioaccumulation de Ag+. Les expériences ont été menées en présence d’un tampon organique (NaHEPES, 2 x 10-2 M; Ca2+, 5x 10-5 M) à pH de 7,00. Pour des expositions à temps fixe de 2 heures, la bioaccumulation d’argent pour nAg était supérieure à ce qui était prédit par sa concentration initiale en Ag+; cependant, il n’y avait pas de différence d’abondance des ARNm de ICL1 et de CTR2 entre nAg et Ag+. D’un autre côté, pour une exposition à temps variables, la bioaccumulation d’argent pour nAg était supérieure à ce qui était prédit par sa concentration initiale en Ag+ et une augmentation de l’abondance de l’ARNm de ICL1 était notée pour nAg. Cependant, il n’y avait aucune différence significative au niveau de l’abondance de l’ARNm de CTR2 entre nAg et une solution équivalente en Ag+. L’ajout d’un fort ligand organique (L-Cystéine; log K= 11,5) à une solution de nAg en diminuait radicalement la bioaccumulation d’argent par rapport à nAg-sans ajout de ligand. Par contre, l’abondance des ARNm de ICL1 et de CTR2 étaient stimulées significativement par rapport à une solution contrôle non-exposée à nAg, ni à Ag+. Les résultats suggéraient fortement que les nAg généraient des ions Ag+ au contact de C. reinhardtii.