Determinação de aflatoxina B1 em rações e aflatoxina M1 no leite de propriedades do Estado de São Paulo

A ocorrência de aflatoxina B1 (AFB1) em rações e aflatoxina M1 (AFM1) no leite cru foi avaliada em propriedades leiteiras situadas na região nordeste do Estado de São Paulo, Brasil, de outubro de 2005 a fevereiro de 2006. A análise de aflatoxinas foi efetuada utilizando-se colunas de imunoafinidade para purificação dos extratos, sendo a quantificação realizada através de cromatografia líquida de alta eficiência. A AFB1 foi detectada em 40% das rações em níveis de 1,0 a 19,5 μg.kg-1. A concentração de AFM1 em 36,7% de amostras de leite positivas variou de 0,010 a 0,645 μg.L-1. Somente uma amostra de leite estava acima do limite de tolerância adotado no Brasil (0,5 μg.L-1) para AFM1. Concluiu-se que as concentrações de aflatoxinas na ração e no leite foram relativamente baixas, embora a alta frequência das aflatoxinas nas amostras analisadas indique a necessidade de contínuo monitoramento a fim de prevenir a contaminação de ingredientes e rações destinadas ao gado leiteiro.

Detección de genotixicidad en cerdos inducida por la ingesta de Aflatoxina B1

En cerdos la micotoxicosis representa uno de los problemas de contaminación ambiental más frecuente. La aflatoxina B1 (AFB1) producida por ciertas cepas de A. flavus y A. parasiticus, es un agente genotóxico, ya que al ingerir alimento contaminado, los metabolitos de AFB1 inducen daño cromosómico. En función de este problema se plantean las siguientes hipótesis de trabajo: 1. La ingesta de alimentos contaminados con AFB1 inducen daño cromosómico en cerdos. 2. La inducción, frecuencia y tipo de daño cromosómico es dependiente del tiempo de ingesta de AFB1. En este trabajo se evalúa el potencial genotóxico in vivo de la AFB1, mediante tres métodos distintos: Análisis de aberraciones cromosómicas, Ensayo de micronúcleos y Electroforesis en gel de células individuales. Se evaluarán dos grupos de cerdos en etapa postdestete, uno control y otro alimentado con pienso ad líbitum, con AFB1 a una determinada concentración. Se tomarán muestras de sangre a los 15, 30, 45 y 60 días. En concordancia con los antecedentes bibliográficos, se espera detectar la ocurrencia de daño cromosómico inducido por la ingesta de AFB1 a una determinada dosis. El efecto genotóxico debería ser detectado desde las tres técnicas elegidas para su estudio. Se espera poder establecer el tipo preponderante de daño inducido por la ingesta de AFB1 en cerdos posdestete, la sensibilidad de las diferentes técnicas empleadas para su detección y determinar si existe relación entre el tipo e intensidad de daño cromosómico y el tiempo de ingesta de AFB1. En virtud que Río Cuarto y la región es una zona agrícola-ganadera, donde la explotación porcina es de interés económico y la ocurrencia reiterada de brotes de micotoxicosis, plantea la necesidad de evaluar el potencial genotóxico de las micotoxinas. Considerando que gran parte de la información publicada sobre la toxicidad se refiere a estudios en animales experimentales de laboratorio, que pueden no reflejar sus efectos en seres humanos y en animales de granja, se considera relevante evaluar la toxicidad, particularmente la genotoxicidad en animales a campo y sus posibles consecuencias para la salud y producción porcina. El abordaje de la evaluación del daño genotóxico inducido por AFB1 desde tres ensayos distintos permitirá establecer cuál de éstos métodos reúne las condiciones más ventajosas en cuento a: sensibilidad, tiempo requerido, validez estadística, sencillez y economía, para ser el método de elección en posteriores estudios.

Determinação de aflatoxina B1 em pimenta (Piper nigrum L.) e orégano (Origanum vulgare L.) por cromatografia em camada delgada e densitometria

An analytical study based on extraction with methanol-water, immunoaffinity cleanup and separation, identification and quantification of aflatoxin B1 by thin-layer chromatography,in ground black and white pepper and oregano was carried out. Validation of the applied methodology was done through accuracy and precision studies. Recoveries of aflatoxin B1 and relative standard deviations, from spice samples spiked at levels from 4.86 to 97.70 µg/kg, were, respectively, higher than 72% and lower than 20%. Application to spice samples available in Minas Gerais state, purchased at popular markets, showed no contamination with aflatoxin B1.

Estudo sobre a ocorrência de fungos e aflatoxina B1 na dieta de bovinos leiteiros em São Paulo

A qualidade da dieta ofertada às vacas em lactação é uma preocupação dos agentes de saúde devido à possibilidade da detecção de micotoxinas prejudiciais a saúde humana e animal. Os objetivos do trabalho foram avaliar o perfil da micobiota, determinar a atividade de água (Aa) e a ocorrência natural de aflatoxina B1 (AFB1) em dietas ofertadas a vacas em lactação de fazendas leiteiras no estado de São Paulo, Brasil. As amostragens das dietas foram realizadas diretamente dos cochos de lote de 15 vacas, em dois dias consecutivos com intervalos de 24h e a cada 15 dias, perfazendo um período de 45 dias de amostragens por fazenda. A purificação e determinação de AFB1 foram realizadas em colunas de imunoafinidade e Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE). O estudo da micobiota presente nas amostras das dietas (288) revelou que as leveduras foram predominantes em todas as dietas (83,97 a 99,98%). Foram isolados 15 gêneros de fungos filamentosos, com os gêneros Aspergillus spp (20,09%), Fusarium spp (14,16%) e Penicillium spp (11,48%) os mais prevalentes. As contagens de Unidades Formadoras de Colônias por grama de alimento (UFC. g-1) variaram de 102 a 1011. A atividade de água das amostras variou entre 0,91 a 0,98. Foi detectada a presença de AFB1 em 31,44% das amostras com teores entre 1,68 a 194,51μg.kg-1. Medidas de boas práticas de produção, estocagem e utilização devem ser tomadas para diminuir a ocorrência de AFB1 nas dietas ofertadas às vacas em lactação.

Avaliação da eficiência de dois kits comerciais para detecção de aflatoxina B1 em amostras de milho, ração e amendoim e seus produtos

Foi avaliada a eficiência de dois kits ELISA disponíveis no mercado para detecção de aflatoxina B1, que permitem a triagem de milho contaminado com aflatoxina B1 aos níveis de 5 e 20 ppb. Eles foram comparados ao método de Soares & Rodriguez-Amaya que utiliza cromatografia em camada delgada (CCD) e tem como limite de quantificação 4,0μg/kg (ppb). Foram analisadas 53 amostras incluindo milho, ração para peixe e amendoim e produtos. Os resultados mostraram boa concordância entre as duas técnicas quanto à detecção de aflatoxina B1. O método ELISA mostrou-se mais rápido, menos trabalhoso, utilizando menos solventes orgânicos, porém apresentou resultados presuntivos positivos, tornando necessária a sua confirmação.

Resistência de quatro genótipos de amendoim à produção de aflatoxina B1 após inoculação com Aspergillus flavus Link

Avaliou-se a produção de aflatoxina B1 pelo Aspergillus flavus IMI 190443, inoculado em sementes de genótipos de amendoim: Tatu Vermelho, VRR-245, 2117 e 2155, in natura e autoclavado a 1210 C por 20 minutos, previamente cultivados no Centro Experimental do Instituto Agronômico de Campinas, em 1995/96. A aflatoxina B1 foi quantificada por cromatografia em camada delgada, utilizando comparação visual com padrões. Os níveis de aflatoxina B1 das amostras autoclavadas e in natura dos genótipos Tatu Vermelho, VRR-245 e 2155 foram significativamente diferentes (p <0,05, Teste de Duncan) quando comparados aos níveis do genótipo 2117. O genótipo 2117, originário da Índia, apresentou independente do processo com e sem aquecimento os menores níveis de aflatoxina B1 em relação aos dos outros genótipos. Os resultados obtidos mostram perspectivas de exploração da resistência varietal no controle da aflatoxina.

Determinação de aflatoxina B1 em rações e aflatoxina M1 no leite de propriedades do Estado de São Paulo

A ocorrência de aflatoxina B1 (AFB1) em rações e aflatoxina M1 (AFM1) no leite cru foi avaliada em propriedades leiteiras situadas na região nordeste do Estado de São Paulo, Brasil, de outubro de 2005 a fevereiro de 2006. A análise de aflatoxinas foi efetuada utilizando-se colunas de imunoafinidade para purificação dos extratos, sendo a quantificação realizada através de cromatografia líquida de alta eficiência. A AFB1 foi detectada em 40% das rações em níveis de 1,0 a 19,5 μg.kg-1. A concentração de AFM1 em 36,7% de amostras de leite positivas variou de 0,010 a 0,645 μg.L-1. Somente uma amostra de leite estava acima do limite de tolerância adotado no Brasil (0,5 μg.L-1) para AFM1. Concluiu-se que as concentrações de aflatoxinas na ração e no leite foram relativamente baixas, embora a alta frequência das aflatoxinas nas amostras analisadas indique a necessidade de contínuo monitoramento a fim de prevenir a contaminação de ingredientes e rações destinadas ao gado leiteiro.

Desenvolvimento de imunossensores para aflatoxina B1

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Determinação de biomarcadores de aflatoxina B1 e aplicabilidade na avaliação da eficiência de adsorventes em frangos de corte

As aflatoxinas são metabólitos secundários produzidos por fungos toxigênicos das espécies Aspergillus flavus, A. parasiticus e A. nomius. São amplamente encontradas em matérias-primas de rações animais, em especial o milho, e têm a capacidade de levar a quadros clínicos agudos ou crônicos de aflatoxicose, caracterizados por, desde a morte por hepatite aguda até a diminuição do desempenho zootécnico por diminuição de peso ou consumo de ração. A aflatoxina B1 tem sido considerada o metabólito mais perigoso, uma vez que possui alto poder hepatotóxico, além de ser mutagênica e carcinogênica. Atualmente a ciência trabalha rumo à descoberta de substâncias que sejam indicadoras confiáveis de contaminação por componentes tóxicos em homens e em animais, os chamados biomarcadores, que medem uma mudança celular, biológica ou molecular em um meio biológico (tecidos humanos, células ou fluídos) que fornecem informação a respeito de uma doença ou exposição a uma determinada substância. Sua detecção pode auxiliar na identificação, no diagnóstico e no tratamento de indivíduos afetados que podem estar sob risco, mas ainda não exibem os sintomas. Sendo assim, com o auxílio de análises que confirmem a patogenicidade da aflatoxina B1 (determinação da atividade de enzimas hepáticas, da avaliação da função renal, de hematologia, da dosagem de minerais séricos e da avaliação de desempenho zootécnico), o objetivo deste trabalho foi avaliar a aplicabilidade da determinação de resíduos hepáticos de aflatoxinas e do aduto sérico AFB1-lisina na avaliação da eficiência de adsorventes em frangos de corte. Utilizou-se 240 pintos de 1 dia, machos, de linhagem Cobb 500®, distribuídos aleatoriamente em 4 dietas experimentais: Controle Negativo: Ração Basal (RB); RB + 0,5% de adsorvente ((aluminosilicato de cálcio e sódio hidratado/HSCAS); RB + 0,5% de adsorvente + 500 µg de AFB1/kg de ração e; RB + 500 µg de AFB1/kg de ração.Os resultados experimentais mostram que o efeito deletério da AFB1, na concentração utilizada, é mais pronunciado que os efeitos protetores do HSCAS sobre os parâmetros de saúde dos animais. Não houve ação efetiva do adsorvente utilizado sobre quase nenhuma variável estudada, apenas para a redução das lesões histopatológicas em fígado, na redução da concentração de gama-glutamiltransferase (GGT), fósforo e aumento da contagem de hemáceas aos 21 dias de idade. Porém, influenciou positivamente a redução de resíduos hepáticos de aflatoxina G1 aos 21 dias e as concentrações de AFB1-lisina sérica aos 21 e aos 42 dias de idade. Estes dados são importantes porque permite concluir que, embora sintomatologicamente o HSCAS não tenha exercido função efetiva, molecularmente foi capaz de mostrar de eficácia sobre os alguns biomarcadores de aflatoxinas no organismo das aves

Avaliação da interação entre aflatoxina M1 e B1 com a fração proteica do leite

Dissertação composta por 02 artigos.

Estudo da aflatoxina no amendoim, da colheita à industrialização, na região de Matão, S.P.

Neste trabalho foi investigada, na região de Matão, a incidência de aflatoxina no amendoim (Arachis hypogaea L.) em três estágios de seu ciclo de industrialização: a) ao ser entregue à fábrica: Épocas I e II; b) durante seu armazenamento: Épocas III e IV, e c) após a extração do óleo (farelo): Épocas V e VI. Em cada Estágio foram feitas duas coletas de 10 amostras cada, num total de 40 amostras de amendoim e 20 de farelo. Dos resultados concluiu-se que: a) a maioria das amostras, representando 85% do total, continha aflatoxina; b) o nível nas amostras, em termos de aflatoxina B1, elevou-se continuamente da Época I para a Época VI: médias de 0,06 até 1,22 ppm com média geral de 0,44 ppm; c) as boas práticas de secagem e adequado armazenamento concorrem decisivamente para manter um nível baixo de aflatoxina, e d) o lavrador entrega amendoim já tóxico à fábrica.

Estudos da aflatoxina no amendoim, da colheita à industrialização, na região de Monte Alto, S. P.

Neste trabalho foi investigada, na região de Monte Alto, S.P., a incidência de aflatoxina no amendoim (Arachis hypogaea L.) em três Estágios de seu ciclo de industrialização: a) ao ser entregue à fábrica, Épocas I e II; b) durante seu armazenamento, Épocas III e IV e c) após a extração do óleo (farelo), Épocas V e VI. Em cada Estágio foram feitas duas coletas de 10 amostras cada, num total de 40 amostras de amendoim e 20 de farelo. Dos resultados pôde-se concluir que: 1) a maioria das amostras, representando 90% do total, continha aflatoxina; 2) o nível, em termos de aflatoxina B1, foi elevado, com 60% das amostras ultrapassando 1,00 ppm., na categoria "Muito Alta"; 3) os níveis subiram da Época I até a Época IV; médias de 0,10 a 2,49 ppm, decrescendo nas Épocas V e VI: 1,02 e 1,25 ppm, com média geral de 1,23 ppm; 4) o lavrador entrega amendoim já tóxico à fábrica; 5) o armazenamento na fábrica parece contribuir para o aumento do nível de aflatoxina.

Estudo da aflatoxina no amendoim, da colheita à industrialização, na região de Santa Adélia, S.P.

Neste trabalho foi investigada, na Região de Santa Adélia, SP, a incidência de aflatoxina no amendoim (Arachis hypogaea L.) em três estágios de seu ciclo de industrialização: a) ao ser entregue à fábrica, Épocas I e II; b) durante o armazenamento, Épocas III e IV e c) após a extração do óleo (farelo), Épocas V e VI. Em cada estágio foram feitas duas coletas de 10 amostras cada, num total de 40 amostras de amendoim e 20 de farelo. Dos resultados pôde-se concluir que: 1) das 60 amostras apenas uma não continha aflatoxina; 2) o nível, em termos de aflatoxina B1, foi elevado, com 55% das amostras na categoria de toxidez "Alta" e 31,6% na categoria "Muito Alta"; 3) os níveis foram mais elevados nos Estágios 1 e 2 (amendoim) decrescendo no Estágio 3 (farelo) ; 4) cinco amostras estavam excessivamente tóxicas, com mais de 10,00 ppm; 5) o amendoim chega à fábrica já com elevado teor de aflatoxina, não tendo sido possível detectar, nesta região, influência do armazenamento.

Estudo da aflatoxina no amendoim, da colheita à industrialização, na região de Fernandópolis, S.P.

Neste trabalho foi investigada, na região de Fernandópolis, SP, a incidência de aflatoxina no amendoim (Arachis hypogaea L.) em três estágios de seu ciclo de industrialização: a) ao ser entregue à fábrica, Épocas I e II; b) durante o seu armazenamento, Épocas III e IV e c) após a extração do óleo (farelo), Épocas V e VI. Em cada estágio foram feitas duas coletas de 10 amostras cada, num total de 40 amostras de amendoim e 20 de farelo. Dos resultados pôde-se concluir que: 1) De todas as amostras apenas uma estava livre de aflatoxina; 2) o nível, em termos de aflatoxina B1, foi elevado, com 51,7% na categoria de toxidez "Alta" e 38,3% na categoria "Muito Alta"; 3) Os níveis cresceram da Época I até a Época IV, média de 0,54 até 2,14 ppm, decrescendo nas Épocas V e VI (farelo), média de 1,04 ppm; 4) Cinco amostras estavam excessivamente tóxicas, com mais de 10,00 ppm; 5) o lavrador entrega amendoim já tóxico e com elevada umidade à fábrica; 6) A indústria, por não promover secagem da matéria-prima com elevada umidade, contribui para a elevação dos níveis de aflatoxina.

Intoxicação experimental por aflatoxina em bezerros

Foram realizados dois experimentos para determinar os efeitos tóxicos de diferentes doses de aflatoxinas em bezerros, considerando-se aspectos clínicos, produtivos e patológicos. No primeiro experimento, nove bezerros, Holandês, com 2-4 meses de idade, receberam ração contendo 500±100 ppb de aflatoxina, na quantidade equivalente a 1,5% do peso vivo/dia, durante dois meses. Três bezerros de idade e peso semelhantes foram usados como controle e, exceto por terem recebido ração livre de aflatoxinas, foram mantidos nas mesmas condições. No segundo experimento, três bezerros, Holandês, com 4-5 meses de idade, receberam, por via oral, pequenas porções diárias de um concentrado de aflatoxinas, diluídas em 500ml de água, correspondendo a doses de 1.250, 2.500 e 5.000 ppb de aflatoxina B1 (AFB1). Um bezerro, Holandês, 4 meses, macho, foi usado como controle. No primeiro experimento, o ganho de peso dos bezerros recebendo AFB1 foi equivalente ao do grupo controle durante todo período experimental. Nesse experimento não foram observadas alterações na atividade sérica da enzima aspartato transaminase (AST), nos níveis da albumina sérica (AS), da proteína total (PT) e no hematócrito, quando comparados os resultados semanais do grupo tratamento e controle. No entanto, observou-se diferença significativa nas atividades séricas das enzimas fosfatase alcalina (FA) e gama glutamil transferase (GGT) entre o grupo tratamento e o grupo controle, na coleta do 63º dia do experimento. Durante o período experimental, e três semanas após o término desse período, não foram observados sinais clínicos e alterações histopatológicas associadas ao consumo de aflatoxinas, em qualquer dos bezerros do grupo tratamento do primeiro experimento. No segundo experimento, sinais clínicos observados nos três bezerros intoxicados incluíram perda de apetite, diminuição do ganho de peso e emagrecimento. Icterícia, diarreia intermitente, tenesmo e apatia severa, foram observadas apenas no bezerro que recebia 5.000 ppb de AFB1. Esses sinais clínicos foram a razão para eutanásia desse bezerro. Níveis alterados da atividade sérica de FA e GGT foram observados em todos os bezerros do grupo tratamento durante grande parte do período experimental. Queda acentuada do nível da AS sérica foi observada na coleta do 49º dia do experimento no bezerro que recebia a maior dose de aflatoxina. Não foram observadas variações no hematócrito e na atividade sérica da AST, nem nos níveis séricos de proteína total, bilirrubina total e bilirrubina direta em qualquer dos bezerros desse experimento. Alterações histopatológicas nos bezerros intoxicados incluíram proliferação de ductos biliares, degeneração citoplasmática vacuolar consistente com acumulação hepatocelular de lipídios, fibrose periportal, ou em ponte, megalocitose, fibrose subendotelial das veias hepáticas terminais e edema. Achados de necropsia do bezerro recebendo a maior dose de AFB1 incluíram fígado levemente aumentado de tamanho, difusamente amarelo-claro e firme, discreta ascite, edema de mesentério e submucosa do abomaso. Os dados obtidos nesses experimentos permitem afirmar que doses de 500±100 ppb de AFB1 não causam alterações patológicas e produtivas em bezerros em condições experimentais, mas podem estar associadas à mínimas alterações bioquímicas, enquanto doses de 1.250, 2.500 e 5.000 ppb de aflatoxina B1 causam doença hepática crônica em bezerros em condições experimentais.