Etude des propriétés dynamiques de la sécrétion régulée des vésicules glutamatergiques des astrocytes

RESUME GRAND PUBLICLe cerveau est composé de différents types cellulaires, dont les neurones et les astrocytes. Faute de moyens pour les observer, les astrocytes sont très longtemps restés dans l'ombre alors que les neurones, bénéficiant des outils ad hoc pour être stimulés et étudiés, ont fait l'objet de toutes les attentions. Le développement de l'imagerie cellulaire et des outils fluorescents ont permis d'observer ces cellules non électriquement excitables et d'obtenir des informations qui laissent penser que ces cellules sont loin d'être passives et participent activement au fonctionnement cérébral. Cette participation au fonctionnement cérébral se fait en partie par le biais de la libération de substances neuro-actives (appellées gliotransmetteurs) que les astrocytes libèrent à proximité des synapses permettant ainsi de moduler le fonctionnement neuronal. Cette libération de gliotransmetteurs est principalement causée par l'activité neuronale que les astrocytes sont capables de sentir. Néanmoins, nous savons encore peu de chose sur les propriétés précises de la libération des gliotransmetteurs. Comprendre les propriétés spatio-temporelles de cette libération est essentiel pour comprendre le mode de communication de ces cellules et leur implication dans la transmission de l'information cérébrale. En utilisant des outils fluorescents récemment développés et en combinant différentes techniques d'imagerie cellulaire, nous avons pu obtenir des informations très précises sur la libération de ces gliotransmetteurs par les astrocytes. Nous avons ainsi confirmé que cette libération était un processus très rapide et qu'elle était contrôlée par des augmentations de calcium locales et rapides. Nous avons également décrit une organisation complexe de la machinerie supportant la libération des gliotransmetteurs. Cette organisation complexe semble être à la base de la libération extrêmement rapide des gliotransmetteurs. Cette rapidité de libération et cette complexité structurelle semblent indiquer que les astrocytes sont des cellules particulièrement adaptées à une communication rapide et qu'elles peuvent, au même titre que les neurones dont elles seraient les partenaires légitimes, participer à la transmission et à l'intégration de l'information cérébrale.RESUMEDe petites vésicules, les « SLMVs » ou « Synaptic Like MicroVesicles », exprimant des transporteurs vésiculaires du glutamate (VGluTs) et libérant du glutamate par exocytose régulée, ont récemment été décrites dans les astrocytes en culture et in situ. Néanmoins, nous savons peu de chose sur les propriétés précises de la sécrétion de ces SLMVs. Contrairement aux neurones, le couplage stimulussécrétion des astrocytes n'est pas basé sur l'ouverture des canaux calciques membranaires mais nécessite l'intervention de seconds messagers et la libération du calcium par le reticulum endoplasmique (RE). Comprendre les propriétés spatio-temporelles de la sécrétion astrocytaire est essentiel pour comprendre le mode de communication de ces cellules et leur implication dans la transmission de l'information cérébrale. Nous avons utilisé des outils fluorescents récemment développés pour étudier le recyclage des vésicules synaptiques glutamatergiques comme les colorants styryles et la pHluorin afin de pouvoir suivre la sécrétion des SLMVs à l'échelle de la cellule mais également à l'échelle des évènements. L'utilisation combinée de l'épifluorescence et de la fluorescence à onde évanescente nous a permis d'obtenir une résolution temporelle et spatiale sans précédent. Ainsi avons-nous confirmé que la sécrétion régulée des astrocytes était un processus très rapide (de l'ordre de quelques centaines de millisecondes). Nous avons découvert que cette sécrétion est contrôlée par des augmentations de calcium locales et rapides. Nous avons également décrit des compartiments cytosoliques délimités par le RE à proximité de la membrane plasmique et contenant les SLMVs. Cette organisation semble être à la base du couplage rapide entre l'activation des GPCRs et la sécrétion. L'existence de compartiments subcellulaires indépendants permettant de contenir les messagers intracellulaires et de limiter leur diffusion semble compenser de manière efficace la nonexcitabilité électrique des astrocytes. Par ailleurs, l'existence des différents pools de vésicules recrutés séquentiellement et fusionnant selon des modalités distinctes ainsi que l'existence de mécanismes permettant le renouvellement de ces pools lors de la stimulation suggèrent que les astrocytes peuvent faire face à une stimulation soutenue de leur sécrétion. Ces données suggèrent que la libération de gliotransmetteurs par exocytose régulée n'est pas seulement une propriété des astrocytes en culture mais bien le résultat d'une forte spécialisation de ces cellules pour la sécrétion. La rapidité de cette sécrétion donne aux astrocytes toutes les compétences pour pouvoir intervenir de manière active dans la transmission et l'intégration de l'information.ABSTRACTRecently, astrocytic synaptic like microvesicles (SLMVs), that express vesicular glutamate transporters (VGluTs) and are able to release glutamate by Ca2+-dependent regulated exocytosis, have been described both in tissue and in cultured astrocytes. Nevertheless, little is known about the specific properties of regulated secretion in astrocytes. Important differences may exist between astrocytic and neuronal exocytosis, starting from the fact that stimulus-secretion coupling in astrocytes is voltage independent, mediated by G-protein-coupled receptors and the release of Ca2+ from internal stores. Elucidating the spatiotemporal properties of astrocytic exo-endocytosis is, therefore, of primary importance for understanding the mode of communication of these cells and their role in brain signaling. We took advantage of fluorescent tools recently developed for studying recycling of glutamatergic vesicles at synapses like styryl dyes and pHluorin in order to follow exocytosis and endocytosis of SLMVs at the level of the entire cell or at the level of single event. We combined epifluorescence and total internal reflection fluorescence imaging to investigate, with unprecedented temporal and spatial resolution, the events underlying the stimulus-secretion in astrocytes. We confirmed that exo-endocytosis process in astrocytes proceeds with a time course on the millisecond time scale. We discovered that SLMVs exocytosis is controlled by local and fast Ca2+ elevations; indeed submicrometer cytosolic compartments delimited by endoplasmic reticulum (ER) tubuli reaching beneath the plasma membrane and containing SLMVs. Such complex organization seems to support the fast stimulus-secretion coupling reported here. Independent subcellular compartments formed by ER, SLMVs and plasma membrane containing intracellular messengers and limiting their diffusion seem to compensate efficiently the non-electrical excitability of astrocytes. Moreover, the existence of two pools of SLMVs which are sequentially recruited suggests a compensatory mechanisms allowing the refill of SLMVs and supporting exocytosis process over a wide range of multiple stimuli. These data suggest that regulated secretion is not only a feature of cultured astrocytes but results from a strong specialization of these cells. The rapidity of secretion demonstrates that astrocytes are able to actively participate in brain information transmission and processing.

Déterminants du mécanisme de ciblage de la proprotéine convertase PC5-A vers la voie de sécrétion régulée

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Déterminants du mécanisme de ciblage de la proprotéine convertase PC5-A vers la voie de sécrétion régulée

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Maturation protéolytique et sécrétion de la rénine: importance fonctionnelle de la pro-région

RÉSUMÉ Le système rénine-angiotensine joue un rôle prépondérant dans la régulation de la pression sanguine et de la balance des sels ainsi que dans d'autres processus physiologiques et pathologiques. Lorsque la pression sanguine est trop basse, les cellules juxtaglomérulaires sécrètent la rénine, qui clivera l'angiotensinogène circulant (sécrété majoritairement par le foie) pour libérer l'angiotensine I, qui sera alors transformée en angiotensine II par l'enzyme de conversion de l'angiotensine. Ce système est régulé au niveau de la sécrétion de la rénine par le rein. La rénine est une enzyme de type protéase aspartique. Elle est produite sous la forme d'un précurseur inactif de haut poids moléculaire appelé prorénine, qui peut être transformé en rénine active. Si le rôle de la prorégion de la rénine n'est pas encore connu, plusieurs études ont montré qu'elle pourrait être un auto-inhibiteur. Des travaux menés sur d'autres enzymes protéolytique ont mis en évidence un rôle de chaperon de leurs prorégions. Dans la circulation, la prorénine est majoritaire (90%) et la rénine active ne représente que 10% de la rénine circulante. L'enzyme qui transforme, in vivo, la prorénine en rénine active n'est pas connue. De même, l'endroit précis du clivage n'est pas élucidé. Dans ce travail, nous avons généré plusieurs mutants de la prorénine et les avons exprimés dans deux types cellulaires : les CV1 (modèle constitutif) et AtT-20 (modèle régulé). Nous avons montré que la prorégion joue un rôle important aussi bien dans l'acquisition de l'activité enzymatique que dans la sécrétion de la rénine, mais fonctionne différemment d'un type cellulaire à l'autre. Nous avons montré pour la première fois que la prorégion interagit de façon intermoléculaire à l'intérieur de la cellule. Les expériences de complémentation montre que l'interaction favorable de la rénine avec la prorégion dépend de la taille de cette dernière : prorénine (383 acides aminés) > pro62 (62 acides aminés) > pro43 (43 acides aminés). Par ailleurs nos résultats montrent qu'une faible partie de la rénine est dirigée vers la voie de sécrétion régulée classique tandis que la majorité est dirigée vers les lysosomes. Ceci suggère qu'une internalisation de la rénine circulante via le récepteur mannose-6-phosphate est possible. Cette dernière concernerait essentiellement la prorénine (dont les taux circulants sont 10 fois plus élevés que la rénine active). La suite de ce travail porterait sur la confirmation de cette hypothèse et l'identification de son possible rôle physiologique. SUMMARY The renin-angiotensin system is critical for the control of blood pressure and salt balance and other physiological and pathological processes. When blood pressure is too low, renin is secreted by the juxtaglomerular cells. It will cleave the N-terminus of circulating angiotensinogen (mostly secreted by the liver) to angiotensin-1, which is then transformed in angiotensin-II by the angiotensin-converting-enzyme (ACE). This system is regulated at the level of renin release. Renin, an aspartyl protease, is produced from a larger precursor (called prorenin) which is matured into active renin. Although the role of the renin proregion remains unknown, it has been reported that it could act as an autoinhibitor. Works on other proteolytic enzymes showed that their prorégion can act as chaperones. prorenin is the major circulating form of renin, while active renin represents only 10%. The enzyme which transforms, in vivo, the prorenin into active renin is unknown and the exact cleavage site remains to be elucidated. In this study, we generated some prorenin mutants, which were expressed in CV1 cells (constitutive pathway model) or AtT-20 cells (regulated pathway model). We showed that the proregion plays a pivotal role in the enzymatic activity and secretion of renin in a different manner in the two cell types. For the first time, it has been demonstrated that the proregion acts in an intermolecular way into the cell. Complementation assays showed that interaction between renin and proregion depends on the size of the proregion: prorenin (383 amino acids) > pro62 (62 amino acids) > pro43 (43 amino acids). Furthermore, our results showed that only a small amount of the cellular renin pool is targeted to the "canonical" regulated pathway and that the remaining is targeted to the lysosomes. Those results suggest a possible internalizátion of the circulating renin through the mannose-6-phosphate receptor pathway. This would mostly concern the prorenin (whose levels are ten times higher than active renin). Further studies would confirm or infirm this hypothesis and elucidate a potential physiological role.

Étude de la sécrétion de la prosomatostatine humaine dans les cellules AtT20

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Étude de la sécrétion de la prosomatostatine humaine dans les cellules AtT20

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Defining secretion processes in astrocytes

During the last decade, evidence that release of chemical transmitters from astrocytes might modulate neuronal activity (the so-called "gliotransmission") occurs in situ has been extensively provided. Nevertheless, gliotransmission remains a highly debated topic because of the lack of direct morphological and functional evidence. Here we provided new information supporting gliotransmission, by i) deepen knowledge about specific properties of regulated secretion of glutamatergic SLMVs, and ii) investigating the involvement of astrocytes in the transmission of dopamine, a molecule whose interaction with astrocytes is likely to occur, but it's still not proven.¦VGLUT-expressing glutamatergic SLMVs have been previously identified both in situ and in vitro, but description of kinetics of release were still lacking. To elucidate this issue, we took advantage of fluorescent tools (styryl dyes and pHluorin) and adapted experimental paradigms and analysis methods previously developed to study exo-endocytosis and recycling of glutamatergic vesicles at synapses. Parallel use of EPIfluorescence and total internal reflection (TIRF) imaging allowed us to find that exo-endocytosis processes in astrocytes are extremely fast, with kinetics in the order of milliseconds, able to sustain and follow neuronal signalling at synapses. Also, exocytosis of SLMVs is under the control of fast, localized Ca2+ elevations in close proximity of SLMVs and endoplasmatic reticulum (ER) tubules, the intracellular calcium stores. Such complex organization supports the fast stimulus-secretion coupling we described; localized calcium elevations have been recently observed in astrocytes in situ, suggesting that these functional microdomains might be present in the intact tissue. In the second part of the work, we investigated whether astrocytes possess some of the benchmarks of brain dopaminergic cells. It's been known for years that astrocytes are able to metabolize monoamines by the enzymes MAO and COMT, but to date no clear information that glial cells are able to uptake and store monoamines have been provided. Here, we identified a whole apparatus for the storage, degradation and release of monoamines, at the ultrastructural level. Electron microscopy immunohistochemistry allowed us to visualize VMAT2- and dopamine-positive intracellular compartments within astrocytic processes, i.e. dense -core granules and cisterns. These organelles might be responsible for dopamine release and storage, respectively; interestingly, this intracellular distribution is reminiscent of VMAT2 expression in dendrites if neurons, where dopamine release is tonic and plays a role in the regulation of its a basal levels, suggesting that astrocytic VMAT2 is involved in the homeostasis of dopamine in healthy brains of adult mammals.¦Durant cette dernière décennie, de nombreux résultats sur le relâchement des transmetteurs par les astrocytes pouvant modulé l'activité synaptique (gliotransmission) ont été fournis. Néanmoins, la gliotransmission reste un processus encore très débattu, notamment à cause de l'absence de preuves directes, morphologique et fonctionnelle démontrant ce phénomène. Nous présentons dans nos travaux de nombreux résultats confortant l'hypothèse de la gliotransmission, dont i) une étude approfondie sur les propriétés spatiales et temporelles de la sécrétion régulée du glutamate dans les astrocytes, et ii) une étude sur la participation des astrocytes dans la transmission de la dopamine, une neuromodulateur dont l'interaction avec les astrocytes est fortement probable, mais qui n'a encore jamais été prouvée. L'expression des petites vésicules (SLMVs - Synaptic Like Micro Vesicles) glutamatergiques exprimant les transporteurs vésiculaires du glutamate (VGLUTs) dans les astrocytes a déjà été prouvé tant in situ qu'in vitro. Afin de mettre en évidence les propriétés précises de la sécrétion de ces organelles, nous avons adapté à nos études des méthodes expérimentales conçues pour observer les processus de exocytose et endocytose dans les neurones. Les résolutions spatiale et temporelle obtenues, grâce a l'utilisation en parallèle de l'épi fluorescence et de la fluorescence a onde évanescente (TIRF), nous ont permis de montrer que la sécrétion régulée dans les astrocytes est un processus extrêmement rapide (de l'ordre de la milliseconde) et qu'elle est capable de soutenir et de suivre la transmission de signaux entre neurones. Nous avons également découvert que cette sécrétion a lieu dans des compartiments subcellulaires particuliers où nous observons la présence du reticulum endoplasmique (ER) ainsi que des augmentations rapides de calcium. Cette organisation spatiale complexe pourrait être la base morphologique du couplage rapide entre le stimulus et la sécrétion. Par ailleurs, plusieurs études récentes in vivo semblent confirmer l'existence de ces compartiments. Depuis des années nous savons que les astrocytes sont capables de métaboliser les monoamines par les enzymes MAO et COMT. Nous avons donc fourni de nouvelles preuves concernant la présence d'un appareil de stockage dans les astrocytes participant à la dégradation et la libération de monoamines au niveau ultrastructurelle. Grâce à la microscopie électronique, nous avons découvert la présence de compartiments intracellulaires exprimant VMAT2 dans les processus astrocytaires, sous forme de granules et des citernes. Ces organelles pourraient donc être responsables à la fois du relâchement et du stockage de la dopamine. De manière surprenante, cette distribution intracellulaire est similaire aux dendrites des neurones exprimant VMAT2, où la dopamine est libérée de façon tonique permettant d'agir sur la régulation de ses niveaux de base. Ces résultats, suggèrent une certaine participation des VMAT2 présents dans les astrocytes dans le processus d'homéostase de la dopamine dans le cerveau.¦A de nombreuses reprises, dans des émissions scientifiques ou dans des films, il est avancé que les hommes n'utilisent que 10% du potentiel de leur cerveau. Cette légende provient probablement du fait que les premiers chercheurs ayant décrit les cellules du cerveau entre le XIXème et le XXeme siècle, ont montré que les neurones, les cellules les plus connues et étudiées de cet organe, ne représentent seulement que 10% de la totalité des cellules composant du cerveau. Parmi les 90% restantes, les astrocytes sont sans doute les plus nombreuses. Jusqu'au début des années 90, les astrocytes ont été plutôt considérés peu plus que du tissu conjonctif, ayant comme rôles principaux de maintenir certaines propriétés physiques du cerveau et de fournir un support métabolique (énergie, environnement propre) aux neurones. Grace à la découverte que les astrocytes ont la capacité de relâcher des substances neuro-actives, notamment le glutamate, le rôle des astrocytes dans le fonctionnement cérébral a été récemment reconsidérée.¦Le rôle du glutamate provenant des astrocytes et son impact sur la fonctionnalité des neurones n'a pas encore été totalement élucidé, malgré les nombreuses publications démontrant l'importance de ce phénomène en relation avec différentes fonctions cérébrales. Afin de mieux comprendre comment les astrocytes sont impliqués dans la transmission cérébrale, nous avons étudié les propriétés spatio-temporelles de cette libération grâce à l'utilisation des plusieurs marqueurs fluorescents combinée avec différentes techniques d'imagerie cellulaires. Nous avons découvert que la libération du glutamate par les astrocytes (un processus maintenant appelé "gliotransmission") était très rapide et contrôlée par des augmentations locales de calcium. Nous avons relié ces phénomènes à des domaines fonctionnels subcellulaires morphologiquement adaptés pour ce type de transmission. Plus récemment, nous avons concentré nos études sur un autre transmetteur très important dans le fonctionnement du cerveau : la dopamine. Nos résultats morphologiques semblent indiquer que les astrocytes ont la capacité d'interagir avec ce transmetteur, mais d'une manière différente comparée au glutamate, notamment en terme de rapidité de transmission. Ces résultats suggèrent que le astrocytes ont la capacité de modifier leurs caractéristiques et de s'adapter à leur environnement par rapport aux types de transmetteur avec lequel ils doivent interagir.

Inhibition cellulaire de la proprotéine convertase 1 et activité des proprotéines convertases dans le réticulum endoplasmique

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Inhibition cellulaire de la proprotéine convertase 1 et activité des proprotéines convertases dans le réticulum endoplasmique

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Impact de la modulation de l’expression de la protéine sécrétogranine III sur les fonctions analgésiques du récepteur NTS2

Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) représentent la famille de récepteurs membranaires la plus étendue. Présentement, 30% des médicaments disponibles sur le marché agissent sur plus ou moins 4% des RCPG connus. Cela indique qu’il existe encore une multitude de RCPG à explorer, qui pourraient démontrer un potentiel thérapeutique intéressant pour des pathologies encore sans traitement disponible. La douleur chronique, qui affecte 1 canadien sur 5, fait partie de ces affections pour lesquelles les thérapies sont faiblement efficaces. Dans le but éventuel de pallier à ce problème, le projet de ce mémoire consistait à mieux comprendre les mécanismes régissant l’adressage membranaire du récepteur de la neurotensine de type 2 (NTS2), un RCPG dont l’activation induit des effets analgésiques puissants de type non opioïdergique. Des données du laboratoire ayant révélé une interaction entre la 3e boucle intracellulaire de NTS2 et la sécrétogranine III (SgIII), une protéine résidente de la voie de sécrétion régulée, notre objectif était de caractériser le rôle de SgIII dans la fonctionnalité du récepteur NTS2. Pour ce faire, l’interaction entre les deux protéines a d’abord été vérifiée par co-immunoprécipitation, GST pull down, essais de colocalisation subcellulaire et par FRET. Nous avons également utilisé un outil d’interférence à l’ARN (DsiRNA) pour invalider la protéine SgIII dans un modèle cellulaire neuronal et chez l’animal. Des essais de radioliaison sur le modèle cellulaire ont révélé une diminution de l’adressage de NTS2 à la membrane plasmique lorsque SgIII était supprimée. De la même façon, une invalidation de SgIII chez le rat inhibe les effets analgésiques d’un agoniste NTS2-sélectif (JMV-431), qui sont normalement observés dans le test de retrait de la queue (douleur aiguë). Nous avons cependant identifié que des stimulations au KCl, à la capsaïcine et à la neurotensine induisaient plutôt une insertion du récepteur à la membrane dans les cellules neuronales. Puisque l’interaction entre SgIII et la 3e boucle intracellulaire du récepteur NTS2 est peu probable selon un système de sécrétion classique, un modèle hypothétique de transition dans les corps multi-vésiculaires a été vérifié. Ainsi, la présence de NTS2 et de SgIII a été révélée dans des préparations exosomales de DRG F11, en plus d’une transférabilité du récepteur par le milieu extracellulaire. En somme, ces résultats démontrent la dépendance du récepteur NTS2 envers SgIII et la voie de sécrétion régulée, en plus d’identifier certains facteurs pouvant augmenter son expression à la surface cellulaire. Le projet contribue ainsi à ouvrir la voie vers des approches pour potentialiser les propriétés de NTS2 in vivo¸ en plus d’une piste d’explication concernant le trafic intracellulaire du récepteur.

Mécanismes moléculaires de la sécrétion d'insuline : implication de Slac2c/MyRIP, protéine effectrice de Rab27a, et rôle des phosphoinositides dans le processus d'exocytose

Résumé : La sécrétion de l'insuline en réponse au glucose circulant dans le sang est la fonction principale de la cellule β. La perte de cette fonction est une des caractéristiques du diabète de type 2. L'exocytose est une fonction cellulaire indispensable au renouvellement des composants lipidiques et protéiques de la membrane cellulaire, à la communication entre les cellules et au maintien d'un environnement adéquat. On peut distinguer deux types d'exocytose : l'exocytose constitutive et l'exocytose régulée. Cette dernière est déclenchée par des stimuli externes. L'exocytose régulée est contrôlée au niveau de la fusion des vésicules de sécrétion avec la membrane plasmique. Certains composants moléculaires impliqués dans ce processus font partie de la famille des GTPases Rab. Les deux membres de cette famille impliqués sont Rab3 et Rab27. Nous avons étudié le rôle de la GTPase Rab27 dans les cellules INS-1E, une lignée cellulaire pancréatique β qui sécrète de l'insuline de façon régulée. Nous avons trouvé que la diminution d'expression de la protéine en utilisant le technique de « RNA interference » diminue la sécrétion stimulée, mais que la distribution des granules n'est nullement affectées par ce changement d'activité intrinsèque. Un des effecteurs identifiés de cette GTPase est Slac2c/MyRIP. Cette protéine possède plusieurs domaines fonctionnels dont un qui lui permet de se lier à l'actine, constituant du cytosquelette cellulaire. L'ensemble de nos résultats suggèrent que Rab27 et MyRIP font partie d'un complexe permettant l'interaction de la granule de sécrétion avec le cytosquelette d'actine corticale et participent à la régulation des dernières étapes de l'exocytose d'insuline. Ensuite, nous avons étudié les phosphoinositides (PI). Les phosphoinositides sont d'importantes molécules impliquées dans le régulation du trafic vésiculaire. Nous avons trouvé que le phosphatidylinosito1-4-phosphate (PI4P) et le phosphatidylinositol-4,5-biphosphate (PI(4,5)P2) augmentent la sécrétion sous l'action de 10µM de Ca2+ dans les cellules INS-1E perméabilisées avec la streptolysine-O. En plus, nous avons démontré que l'exocytose est diminuée dans les cellules intactes exprimant une protéine qui séquestre le PI(4,5)P2. Une diminution similaire est observée en diminuant l'expression de deux enzymes impliquées dans la production du PI(4,5)P2, la PI4Kinase β type III et la PIP5Kinase γ type I. Pour clarifier le mécanisme d'action des PI, nous avons investigué l'implication de trois cibles potentielles des PI, la PLD1, CAPS1 et Mint1. Pour ce faire, nous avons réduit le niveau d'expression endogène de ces protéines, ce qui inhibe la libération d'hormones provoquée par le glucose. Tout ceci indique donc que la production du PI(4,5)P2 est nécessaire pour le contrôle de la sécrétion et suggère qu'une partie de l'effet du PI sur la sécrétion pourrait être exercé par l'activation de la PLD1, CAPS1 et Mint1. Abstract Insulin release from pancreatic β-cells plays an essential role in the achievement of blood glucose homeostasis and defects in the regulation of this process lead to profound metabolic disorders and hyperglycaemia (eg. type 2 diabetes). Almost every cell in our organism releases proteins and other biological compounds using a fundamental cellular process known as constitutive exocytosis. In exocrine and endocrine glands, the cells are endowed with an additional and more refined release mechanism directly tuned by extracellular signals. This process, referred to as regulated exocytosis, ensures the timely delivery of molecules such as peptide hormones and digestive enzymes to match the moment¬-to-moment requirements of the organism. Some of the molecular components involved in this process have been identified, including Rab3 and Rab27, two GTPases that regulate the final steps of secretion in many cells. We investigated the involvement of Rab27 GTPase in the secretory process of the insulin-secreting cell line INS-1E. We found that selective reduction of Rab27 expression by RNA interference did not alter granule distribution but impaired exocytosis triggered by insulin secretagogues. Screening for potential effectors revealed that Slac2c/MyRIP is associated with granules and attenuation of Slac2c expression severely impaired hormone release. This protein contains several functional domains, including, a binding domain for the cellular cytoskeleton constituent actin. Taken together our data suggest the Rab27 and MyRIP are part of a complex mediating the interaction of secretory granules with cortical cytoskeleton and participate to the regulation of the final steps in insulin exoctytosis. In the second part of the thesis, we studied phosphoinositides (PI). Phosphoinositides are important molecules involved in the regulation of vesicular trafficking. We found that phosphatidylinosito1-4-phosphate (PI4P) and phosphatidylinosito1-4,5-biphosphate (PI(4,5)P2) increase the secretory response triggered by 10µM Ca2+ in streptolysin-O permeabilized insulin-secreting INS-1E cells. In addition, nutrient-induced exocytosis was diminished in intact cells expressing constructs that sequester PI(4,5)P2. A similar decrease was observed after silencing of two enzymes involved in PI(4,5)P2 production, type III PI4Kinase β and type I PIP5Kinase γ, by RNA interference. To clarify the mechanism of action of PI, we investigated the involvement in the regulation of exocytosis of three potential PI targets, PLD1, CAPS1 and Mint1. Transfection of cells with silencers capable of reducing the endogenous levels of these proteins inhibited hormone release elicited by glucose. Our data indicate that the production PI(4,5)P2 is necessary for proper control of p-cell secretion and suggest that at least part of the effects of PI on insulin exocytosis could be exerted through the activation of PLD1, CAPS1 and Mint1.

Étude de l'implication des navettes du pyruvate découlant du métabolisme mitochondrial du glucose dans la régulation de la sécrétion d'insuline par les cellules bêta pancréatiques

Le diabète est une maladie métabolique qui se caractérise par une résistance à l’insuline des tissus périphériques et par une incapacité des cellules β pancréatiques à sécréter les niveaux d’insuline appropriés afin de compenser pour cette résistance. Pour mieux comprendre les mécanismes déficients dans les cellules β des patients diabétiques, il est nécessaire de comprendre et de définir les mécanismes impliqués dans le contrôle de la sécrétion d’insuline en réponse au glucose. Dans les cellules β pancréatiques, le métabolisme du glucose conduit à la production de facteurs de couplage métabolique, comme l’ATP, nécessaires à la régulation de l’exocytose des vésicules d’insuline. Le mécanisme par lequel la production de l’ATP par le métabolisme oxydatif du glucose déclenche l’exocytose des vésicules d’insuline est bien décrit dans la littérature. Cependant, il ne peut à lui seul réguler adéquatement la sécrétion d’insuline. Le malonyl-CoA et le NADPH sont deux autres facteurs de couplage métaboliques qui ont été suggérés afin de relier le métabolisme du glucose à la régulation de la sécrétion d’insuline. Les mécanismes impliqués demeurent cependant à être caractérisés. Le but de la présente thèse était de déterminer l’implication des navettes du pyruvate, découlant du métabolisme mitochondrial du glucose, dans la régulation de la sécrétion d’insuline. Dans les cellules β, les navettes du pyruvate découlent de la combinaison des processus d’anaplérose et de cataplérose et permettent la transduction des signaux métaboliques provenant du métabolisme du glucose. Dans une première étude, nous nous sommes intéressés au rôle de la navette pyruvate/citrate dans la régulation de la sécrétion d’insuline en réponse au glucose, puisque cette navette conduit à la production dans le cytoplasme de deux facteurs de couplage métabolique, soit le malonyl-CoA et le NADPH. De plus, la navette pyruvate/citrate favorise le flux métabolique à travers la glycolyse en réoxydation le NADH. Une étude effectuée précédemment dans notre laboratoire avait suggéré la présence de cette navette dans les cellules β pancréatique. Afin de tester notre hypothèse, nous avons ciblé trois étapes de cette navette dans la lignée cellulaire β pancréatique INS 832/13, soit la sortie du citrate de la mitochondrie et l’activité de l’ATP-citrate lyase (ACL) et l’enzyme malique (MEc), deux enzymes clés de la navette pyruvate/citrate. L’inhibition de chacune de ces étapes par l’utilisation d’un inhibiteur pharmacologique ou de la technologie des ARN interférant a corrélé avec une réduction significative de la sécrétion d’insuline en réponse au glucose. Les résultats obtenus suggèrent que la navette pyruvate/citrate joue un rôle critique dans la régulation de la sécrétion d’insuline en réponse au glucose. Parallèlement à notre étude, deux autres groupes de recherche ont suggéré que les navettes pyruvate/malate et pyruvate/isocitrate/α-cétoglutarate étaient aussi importantes pour la sécrétion d’insuline en réponse au glucose. Ainsi, trois navettes découlant du métabolisme mitochondrial du glucose pourraient être impliquées dans le contrôle de la sécrétion d’insuline. Le point commun de ces trois navettes est la production dans le cytoplasme du NADPH, un facteur de couplage métabolique possiblement très important pour la sécrétion d’insuline. Dans les navettes pyruvate/malate et pyruvate/citrate, le NADPH est formé par MEc, alors que l’isocitrate déshydrogénase (IDHc) est responsable de la production du NADPH dans la navette pyruvate/isocitrate/α-cétoglutarate. Dans notre première étude, nous avions démontré l’importance de l’expression de ME pour la sécrétion adéquate d’insuline en réponse au glucose. Dans notre deuxième étude, nous avons testé l’implication de IDHc dans les mécanismes de régulation de la sécrétion d’insuline en réponse au glucose. La diminution de l’expression de IDHc dans les INS 832/13 a stimulé la sécrétion d’insuline en réponse au glucose par un mécanisme indépendant de la production de l’ATP par le métabolisme oxydatif du glucose. Ce résultat a ensuite été confirmé dans les cellules dispersées des îlots pancréatiques de rat. Nous avons aussi observé dans notre modèle que l’incorporation du glucose en acides gras était augmentée, suggérant que la diminution de l’activité de IDHc favorise la redirection du métabolisme de l’isocitrate à travers la navette pyruvate/citrate. Un mécanisme de compensation à travers la navette pyruvate/citrate pourrait ainsi expliquer la stimulation de la sécrétion d’insuline observée en réponse à la diminution de l’expression de IDHc. Les travaux effectués dans cette deuxième étude remettent en question l’implication de l’activité de IDHc, et de la navette pyruvate/isocitrate/α-cétoglutarate, dans la transduction des signaux métaboliques reliant le métabolisme du glucose à la sécrétion d’insuline. La navette pyruvate/citrate est la seule des navettes du pyruvate à conduire à la production du malonyl-CoA dans le cytoplasme des cellules β. Le malonyl-CoA régule le métabolisme des acides gras en inhibant la carnitine palmitoyl transférase 1, l’enzyme limitante dans l’oxydation des acides gras. Ainsi, l’élévation des niveaux de malonyl-CoA en réponse au glucose entraîne une redirection du métabolisme des acides gras vers les processus d’estérification puis de lipolyse. Plus précisément, les acides gras sont métabolisés à travers le cycle des triglycérides/acides gras libres (qui combinent les voies métaboliques d’estérification et de lipolyse), afin de produire des molécules lipidiques signalétiques nécessaires à la modulation de la sécrétion d’insuline. Des études effectuées précédemment dans notre laboratoire ont démontré que l’activité lipolytique de HSL (de l’anglais hormone-sensitive lipase) était importante, mais non suffisante, pour la régulation de la sécrétion d’insuline. Dans une étude complémentaire, nous nous sommes intéressés au rôle d’une autre lipase, soit ATGL (de l’anglais adipose triglyceride lipase), dans la régulation de la sécrétion d’insuline en réponse au glucose et aux acides gras. Nous avons démontré que ATGL est exprimé dans les cellules β pancréatiques et que son activité contribue significativement à la lipolyse. Une réduction de son expression dans les cellules INS 832/13 par RNA interférant ou son absence dans les îlots pancréatiques de souris déficientes en ATGL a conduit à une réduction de la sécrétion d’insuline en réponse au glucose en présence ou en absence d’acides gras. Ces résultats appuient l’hypothèse que la lipolyse est une composante importante de la régulation de la sécrétion d’insuline dans les cellules β pancréatiques. En conclusion, les résultats obtenus dans cette thèse suggèrent que la navette pyruvate/citrate est importante pour la régulation de la sécrétion d’insuline en réponse au glucose. Ce mécanisme impliquerait la production du NADPH et du malonyl-CoA dans le cytoplasme en fonction du métabolisme du glucose. Cependant, nos travaux remettent en question l’implication de la navette pyruvate/isocitrate/α-cétoglutarate dans la régulation de la sécrétion d’insuline. Le rôle exact de IDHc dans ce processus demeure cependant à être déterminé. Finalement, nos travaux ont aussi démontré un rôle pour ATGL et la lipolyse dans les mécanismes de couplage métabolique régulant la sécrétion d’insuline.

Étude dans la cellule bêta pancréatique de voies inhibitrices de la sécrétion d'insuline liées au métabolisme des lipides

Le diabète de type 2 (DT2) est une maladie métabolique complexe causée par des facteurs génétiques mais aussi environnementaux, tels la sédentarité et le surpoids. La dysfonction de la cellule β pancréatique est maintenant reconnue comme l’élément déterminant dans le développement du DT2. Notre laboratoire s’intéresse à la sécrétion d’insuline par la cellule β en réponse aux nutriments calorigéniques et aux mécanismes qui la contrôle. Alors que la connaissance des mécanismes responsables de l’induction de la sécrétion d’insuline en réponse aux glucose et acides gras est assez avancée, les procédés d’inhibition de la sécrétion dans des contextes normaux ou pathologiques sont moins bien compris. L’objectif de la présente thèse était d’identifier quelques-uns de ces mécanismes de régulation négative de la sécrétion d’insuline dans la cellule β pancréatique, et ce en situation normale ou pathologique en lien avec le DT2. La première hypothèse testée était que l’enzyme mitochondriale hydroxyacyl-CoA déshydrogénase spécifique pour les molécules à chaîne courte (short-chain hydroxyacyl-CoA dehydrogenase, SCHAD) régule la sécrétion d’insuline induite par le glucose (SIIG) par la modulation des concentrations d’acides gras ou leur dérivés tels les acyl-CoA ou acyl-carnitine dans la cellule β. Pour ce faire, nous avons utilisé la technologie des ARN interférants (ARNi) afin de diminuer l’expression de SCHAD dans la lignée cellulaire β pancréatique INS832/13. Nous avons par la suite vérifié chez la souris DIO (diet-induced obesity) si une exposition prolongée à une diète riche en gras activerait certaines voies métaboliques et signalétiques assurant une régulation négative de la sécrétion d’insuline et contribuerait au développement du DT2. Pour ce faire, nous avons mesuré la SIIG, le métabolisme intracellulaire des lipides, la fonction mitochondriale et l’activation de certaines voies signalétiques dans les îlots de Langerhans isolés des souris normales (ND, normal diet) ou nourries à la dière riche en gras (DIO) Nos résultats suggèrent que l’enzyme SCHAD est importante dans l’atténuation de la sécrétion d’insuline induite par le glucose et les acides aminés. En effet, l’oxydation des acides gras par la protéine SCHAD préviendrait l’accumulation d’acyl-CoA ou de leurs dérivés carnitine à chaîne courtes potentialisatrices de la sécrétion d’insuline. De plus, SCHAD régule le métabolisme du glutamate par l’inhibition allostérique de l’enzyme glutamate déshydrogénase (GDH), prévenant ainsi une hyperinsulinémie causée par une sur-activité de GDH. L’étude de la dysfonction de la cellule β dans le modèle de souris DIO a démontré qu’il existe une grande hétérogénéité dans l’obésité et l’hyperglycémie développées suite à la diète riche en gras. L’orginialité de notre étude réside dans la stratification des souris DIO en deux groupes : les faibles et forts répondants à la diète (low diet responders (LDR) et high diet responder (HDR)) sur la base de leur gain de poids corporel. Nous avons mis en lumières divers mécanismes liés au métabolisme des acides gras impliqués dans la diminution de la SIIG. Une diminution du flux à travers le cycle TG/FFA accompagnée d’une augmentation de l’oxydation des acides gras et d’une accumulation intracellulaire de cholestérol contribuent à la diminution de la SIIG chez les souris DIO-HDR. De plus, l’altération de la signalisation par les voies AMPK (AMP-activated protein kinase) et PKC epsilon (protéine kinase C epsilon) pourrait expliquer certaines de ces modifications du métabolisme des îlots DIO et causer le défaut de sécrétion d’insuline. En résumé, nous avons mis en lumière des mécanismes importants pour la régulation négative de la sécrétion d’insuline dans la cellule β pancréatique saine ou en situation pathologique. Ces mécanismes pourraient permettre d’une part de limiter l’amplitude ou la durée de la sécrétion d’insuline suite à un repas chez la cellule saine, et d’autre part de préserver la fonction de la cellule β en retardant l’épuisement de celle-ci en situation pathologique. Certaines de ces voies peuvent expliquer l’altération de la sécrétion d’insuline dans le cadre du DT2 lié à l’obésité. À la lumière de nos recherches, le développement de thérapies ayant pour cible les mécanismes de régulation négative de la sécrétion d’insuline pourrait être bénéfique pour le traitement de patients diabétiques.

Role of the c-Jun N-terminal Kinase signaling in pancreatic β-cells

L'insuline est une hormone qui diminue la concentration de sucre dans le sang et qui est produite par la cellule β du pancréas. Un défaut de production de cette hormone est une des causes principales du diabète. Cette perte de production d'insuline est la conséquence à la fois, de la réduction du nombre de cellules β et du mauvais fonctionnement des cellules β restantes. L'inflammation, en activant la voie de signalisation «c-Jun N-terminal Kinase» (JNK) contribue au déclin de ces cellules. Cette voie de signalisation est activée par des protéines telles que des kinases qui reçoivent le signal de stress. Dans ce travail de thèse nous nous sommes intéressés à étudier le rôle de «Dual leucine zipper bearing kinase» (DLK) comme protéine capable de relayer le stress inflammatoire vers l'activation de la voie JNK dans les cellules β-pancréatiques. Nous montrons que DLK est présente dans les cellules β-pancréatiques et qu'elle agit effectivement comme un activateur de la voie de signalisation de JNK. En outre, DLK joue un rôle clé dans le contrôle de l'expression de l'insuline, de la sécrétion de l'insuline en réponse au glucose et au maintien de la survie des cellules β. Si l'expression de cette protéine diminue, la cellule produit moins d'insuline et sera plus sensible à la mort en réponse au stress inflammatoire. A l'inverse si l'expression de DLK est augmentée, la cellule β produit et secrète plus d'insuline. Des variations de l'expression de DLK sont par ailleurs, associées à l'état de santé de la cellule β. Chez la ratte en gestation ou la souris obèse, dans lesquelles la cellule β produit plus d'insuline, l'expression de DLK est augmentée. En revanche dans les cellules β des patients diabétiques, l'expression de DLK est diminuée par rapport aux cellules non malades. En résumé, DLK est nécessaire pour le bon fonctionnement de la cellule β-pancréatique et son expression corrèle avec le degré de santé des cellules, faisant que cette protéine pourrait être une cible thérapeutique potentiel. Les cellules β-pancréatiques ont la capacité de réguler la sécrétion d'insuline en s'adaptant précisément au stimulus et à la glycémie. La fonction de la cellule β est cruciale dans l'homéostasie du glucose puisque sa dysfonction et sa mort mènent au développement des diabètes de type 1 et 2. De nombreuses études suggèrent que l'inflammation pourrait avoir un rôle dans la dysfonction et la destruction de ces cellules dans le diabète de type 2. L'excès chronique de cytokines proinflammatoires accélère le dysfonctionnement de la cellule β pancréatique par un mécanisme qui implique la voie de signalisation «c-Jun N-terminal Kinase» (JNK). L'activation de cette voie est organisée par des protéines d'échafaudages. Elle se fait par trois étapes successives de phosphorylation impliquant une «Mitogen Activated Protein Kinase Kinase Kinase» (MAP3K), une MAP2K et JNK. Dans ce travail de thèse nous montrons l'expression abondante et spécifique de la MAP3K «Dual Leucine Zipper Bearing Kinase» (DLK) dans les cellules β pancréatiques. Cela est la conséquence de l'absence du répresseur transcriptionnel «Repressor Element 1 Silencing Transcription». Nous montrons également que DLK régule l'activation de JNK et qu'il s'avère nécessaire pour la fonction et la survie de la cellule β pancréatique par un mécanisme impliquant le facteur de transcription PDX-1. L'invalidation de l'expression de DLK diminue l'expression de l'insuline et potentialise l'apoptose induite par des cytokines proinflammatoires. A l'inverse, la surexpression de DLK augmente l'expression et la sécrétion d'insuline induites par le glucose. Par conséquent des niveaux d'expression appropriés de DLK sont déterminants pour la fonction et la survie de la cellule β pancréatique. L'obésité et la grossesse sont caractérisées par une hyperinsulinémie qui résulte d'une augmentation de la production et de la sécrétion de l'insuline. L'expression de DLK est augmentée dans des îlots de rattes gestantes et des souris obèses comparés à leurs contrôles respectifs. A l'inverse, dans des sujets diabétiques, l'expression de DLK est diminuée. Ensemble ces résultats montrent l'importance de DLK dans l'adaptation des îlots par un mécanisme qui pourrait impliquer la voie de signalisation de JNK. Des défauts dans cette voie régulée par DLK pourraient contribuer au dysfonctionnement et la mort de la cellule β pancréatique et par conséquent au développement du diabète. L'étude détaillée du mécanisme par lequel DLK active la voie de signalisation JNK et régule la fonction de la cellule β pancréatique pourrait ouvrir la voie des nouvelles thérapies ciblant l'amélioration de la fonction de la cellule β dans le diabète. - Pancreatic β-cells are evidently plastic in their ability to regulate insulin secretion. The quantity of insulin released by these cells varies according to the stimulus, and the prevailing glucose concentration, β-cell function is pivotal in glucose homeostasis, as their dysfunction, and death can lead to development of type 1 and type 2 diabetes. There are numerous reports so far underlying the role of inflammation in dysfunction, and destruction of β-cells, in both type 1 and type 2 diabetes. Chronic excess of pro¬inflammatory cytokines promotes a β-cell decline, via induction of the c-Jun N-terminal Kinase (JNK) pathway. The activation of the JNK pathway is organized by a scaffold protein-mediated module in which, a three-step phosphorylation cascade occurs. The latter includes, Mitogen activated protein kinase kinase kinase (MAP3K), MAP2K and JNK. In this thesis, we unveil that the MAP3K Dual Leucine Zipper Bearing Kinase (DLK) is selectively, and highly expressed in pancreatic β-cells, as the result from the absence of the transcriptional repressor named, Repressor Element 1 Silencing Transcription (REST). We show that DLK regulates activation of JNK, and is required for β-cell function and survival by modulating the PDX-1 transcription factor. Silencing of DLK expression diminishes insulin expression, and potentiated cytokine-mediated apoptosis. Conversely, overexpression of DLK increased insulin expression, and glucose-induced insulin secretion. Therefore, an appropriate level of DLK is critical for β-cell function and survival. Obesity and pregnancy are characterized by hyperinsulinemia resulting from an increased production and secretion of insulin. In isolated islets of pregnant rats, and obese mice, the expression of DLK was elevated when compared to their respective controls. However, decreased expression of DLK was observed in islets of individuals with diabetes. Taken together, we highlight the importance of DLK in islet adaptation, and describe a mechanism that may involve the JNK signaling. Deficiency in the JNK pathway regulated by DLK may contribute to β-cell failure and death, and thereby development of diabetes. Unraveling the mechanism whereby DLK activates the JNK pathway, and β-cell function, may pave the way for the design of novel therapies, aiming to improve β-cell function and survival in diabetes in general.

Role and regulation of islet-Brain 1 in pancreatic β-cells

Résumé : L'insuline est produite et sécrétée par la cellule ß-pancréatique. Son rôle est de régler le taux de sucre dans le sang. Si ces cellules meurent ou échouent à produire suffisamment de l'insuline, les sujets développent le diabète de type 2 (DT2), une des maladies les plus communes dans les pays développés. L'excès chronique des lipoprotéines LDL oxydés (oxLDL) et/ou des cytokines pro-inflammatoires comme l'interleukine-1ß (IL-1ß) participent au dérèglement et à la mort des cellules ß. Nous avons montré qu'une chute des niveaux d'expression de la protéine nommée «mitogen activated protein kinase 8 interacting protein 1» ou «islet brain 1 (IB 1)» est en partie responsable des effets provoqués par les oxLDL ou IL-1ß. IB1 régule l'expression de l'insuline et la survie cellulaire en inhibant la voie de signalisation « c-jun N-terminal Kinase (JNK)». La réduction des niveaux d'expression d'IB1 provoque l'activation de la voie JNK en réponse aux facteurs environnementaux, et ainsi initie la réduction de l'expression de l'insuline et l'induction du programme de mort cellulaire. Les mimétiques de l'hormone "Glucagon-like peptide 1", tel que l'exendin-4 (ex-4), sont une nouvelle classe d'agents hypoglycémiants utilisés dans le traitement du DT2. Les effets bénéfiques de l'ex-4 sont en partie accomplis en préservant l'expression de l'insuline et la survie des cellules ß contre les stress associés au DT2. La restauration des niveaux d'expression d'IB1 est un des mécanismes par lequel l'ex-4 prodigue son effet sur la cellule. En effet, cette molécule stimule l'activité du promoteur du gène et ainsi compense la réduction du contenu en IB1 causée par le stress. Outre ce rôle anti-apoptotique, dans ce travail de thèse nous avons mis en évidence une autre fonction d'IB1 dans la cellule ß. La réduction de l'activité ou des niveaux d'expression d'IB1 induisent une réduction importante de la sécrétion de l'insuline en réponse au glucose. Le mécanisme par lequel IB1 régule la sécrétion de l'insuline implique à la fois le métabolisme du glucose et éventuellement le transport vésiculaire en contrôlant l'expression de la protéine annexin A2. En résumé, IB 1 est une molécule clé à travers laquelle l'environnement du diabétique pourrait exercer un effet délétère sur la cellule ß. L'amélioration de l'activité d'IB1 et/ou de son expression devrait être considérée dans les approches thérapeutiques futures visant à limiter la perte des cellules ß dans le diabète. Abstract : ß-cells of the pancreatic islets of Langerhans produce and secrete insulin when blood glucose rises. In turn, insulin ensures that plasma glucose concentrations return within a relatively narrow physiological range. If ß-cells die or fail to produce enough insulin, individuals develop one of the most common diseases in Western countries, namely type 2 diabetes (T2D). Chronic excess of oxidized low density lipoproteins (oxLDL) and/or pro-inflammatory cytokines such as interleukin 1-ß (IL-1ß) contribute to decline of ß-cells and thereby are thought to accelerate progression of the disease overtime. We showed that profound reduction in the levels of the mitogen activated protein kinase 8 interacting protein 1 also called islet brain 1 (IB1) causes ß-cell failure accomplished by oxLDL or IL-1 ß. IB1 regulates insulin expression and cell survivals by inhibiting the c-Jun N-terminal Kinase pathway. Diminution in IB 1 levels leads to an increase in activation of the JNK pathway induced by environmental stressors, and thus initiates loss of insulin expression and programmed cell death. The mimetic agents of the glucoincretin glucagon-like peptide 1 such as exendin-4 (ex-4) are new class of hypoglycaemic medicines for treatment of T2D. The beneficial property is in part achieved by preserving insulin expression and ß-cell survival against stressors related to diabetes. Restored levels in IB 1 account for the cytoprotective effect of the ex-4. In fact, the latter molecule .stimulates the promoter activity of the gene and thus compensates loss of IB1 content triggered by stress. Beside of the anti-apoptotic role, an additional leading function for IB 1 in ß-cells was highlighted in this thesis. Impairment in IB1 activity or silencing of the gene in ß-cells revealed a major reduction in insulin secretion elicited by glucose. The mechanisms whereby IB 1 couples glucose to insulin release involve glucose metabolism and potentially, vesicles trafficking by maintaining the levels of annexin A2. IB 1 is therefore a key molecule through which environmental factors related to diabetes may exert harmful effects on ß-cells. Improvement in IB 1 activity and/or expression should be considered as a target for therapeutic purpose.