Caractérisation de l'adipogenèse et des voies de la lipolyse dans les cellules adipocytaires normales et déficientes en lipases

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Relations entre la lipolyse adipocytaire, la périlipine et l'obésité dans une perspective de physiopathologie telle le diabète de type II

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Caractérisation de l'adipogenèse et des voies de la lipolyse dans les cellules adipocytaires normales et déficientes en lipases

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Relations entre la lipolyse adipocytaire, la périlipine et l'obésité dans une perspective de physiopathologie telle le diabète de type II

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Nouveaux indices de suppression de la lipolyse par l'insuline déterminés lors de l'hyperglycémie provoquée par voie orale : comparaisons avec le clamp euglycémique-hyperinsulinémique et les paramètres métaboliques chez les femmes

Résumé : Une dysrégulation de la lipolyse des tissus adipeux peut conduire à une surexposition des tissus non-adipeux aux acides gras non-estérifiés (AGNE), qui peut mener à un certain degré de lipotoxicité dans ces tissus. La lipotoxicité constitue, par ailleurs, l’une des causes majeures du développement de la résistance à l’insuline et du diabète de type 2. En plus de ses fonctions glucorégulatrices, l’insuline a pour fonction d’inhiber la lipolyse et donc de diminuer les niveaux d’AGNE en circulation, prévenant ainsi la lipotoxicité. Il n’y a pas d’étalon d’or pour mesurer la sensibilité de la lipolyse à l’insuline. Le clamp euglycémique hyperinsulinémique constitue la méthode étalon d’or pour évaluer la sensibilité du glucose à l’insuline mais il est aussi utilisé pour mesurer la suppression de la lipolyse par l’insuline. Par contre, cette méthode est couteuse et laborieuse, et ne peut pas s’appliquer à de grandes populations. Il existe aussi des indices pour estimer la fonction antilipolytique de l’insuline dérivés de l’hyperglycémie provoquée par voie orale (HGPO), un test moins dispendieux et plus simple à effectuer à grande échelle. Cette étude vise donc à : 1) Étudier la relation entre les indices de suppressibilité des AGNE par l’insuline dérivés du clamp et ceux dérivés de l’HGPO; et 2) Déterminer laquelle de ces mesures corrèle le mieux avec les facteurs connus comme étant reliés à la dysfonction adipeuse : paramètres anthropométriques et indices de dysfonction métabolique. Les résultats montrent que dans le groupe de sujets étudiés (n=29 femmes, 15 témoins saines et 14 femmes avec résistance à l’insuline car atteintes du syndrome des ovaires polykystiques), certains indices de sensibilité à l’insuline pour la lipolyse dérivés de l’HGPO corrèlent bien avec ceux dérivés du clamp euglycémique hyperinsulinémique. Parmi ces indices, celui qui corrèle le mieux avec les indices du clamp et les paramètres anthropométriques et de dysfonction adipeuse est le T50[indice inférieur AGNE] (temps nécessaire pour diminuer de 50% le taux de base – à jeun – des AGNE). Nos résultats suggèrent donc que l’HGPO, facile à réaliser, peut être utilisée pour évaluer la sensibilité de la lipolyse à l’insuline. Nous pensons que la lipo-résistance à l’insuline peut être facilement quantifiée en clinique humaine.

A low-protein, high-carbohydrate diet increases the adipose lipid content without increasing the glycerol-3-phosphate or fatty acid content in growing rats

Le taux de triacylglycerol (TAG) qui s`accumule dans le tissu adipeux depend de 2 mecanismes opposes : la lipogenese et la lipolyse. Nous avons montre anterieurement que le poids des lipides du tissu adipeux de l`epididyme (EPI) de meme que leur taux augmentent chez les rats en croissance soumis a une diete hypoproteique hyperglucidique (HPHG) pendant 15 jours. La presente etude a eu pour but d`examiner les voies impliquees dans la lipogenese et la lipolyse qui regulent l`accumulation des lipides dans le tissu. On a evalue in vivo la synthese de novo des acides gras, qui s`est revelee similaire chez les rats soumis a la diete HPHG ou a une diete temoin; toutefois, chez les rats soumis a la diete HPHG, une diminution de l`activite de la lipoproteine lipase dans le tissus adipeux de l`EPI a ete observee, ce qui laisse croire a une diminution de la capture des acides gras des lipoproteines circulantes. La diete HPHG n`a eu aucun effet sur la synthese du glycerol-3-phosphate (G3P) par la glycolyse ou la glyceroneogenese. L`activite de la glycerokinase, c.-a-d. la phosphorylation du glycerol issu de l`hydrolyse du TAG endogene pour former le GP3, n`a pas ete modifiee non plus par la diete HPHG. A l`oppose, les adipocytes des rats HPHG stimules par la norepinephrine ont eu une plus faible reponse lipolytique, meme si le taux lipolytique basal des adipocytes a ete similaire chez les 2 groupes. Ainsi, les resultats donnent a penser que la diminution de l`activite lipolytique stimulee par la norepinephrine joue un role essentiel dans l`augmentation du TAG observee dans le tissu adipeux de l`EPI des animaux HPHG, probablement en perturbant le processus d`activation de la lipolyse.

Effect of acute and chronic exercise on fat oxidation and hormonal and plasma metabolite kinetics in obese and severely obese men

Acute exercise increases energy expenditure (EE) during exercise and post-exercise recovery [excess post-exercise oxygen consumption (EPOC)] and therefore may be recommended as part of the multidisciplinary management of obesity. Moreover, chronic exercise (training) effectively promotes an increase in insulin sensitivity, which seems to be associated with increased fat oxidation rates (FORs). The main purpose of this thesis is to investigate 1) FORs and extra-muscular factors (hormones and plasma metabolites) that regulate fat metabolism during acute and chronic exercise; and 2) EPOC during acute post-exercise recovery in obese and severely obese men (class II and III). In the first study, we showed that obese and severely obese men present a lower exercise intensity (Fatmax) eliciting maximal fat oxidation and a lower reliance on fat oxidation at high, but not at low and moderate, exercise intensities compared to lean men. This was most likely related to an impaired muscular capacity to oxidize non-esterified fatty acids (NEFA) rather than decreased plasma NEFA availability or a change in the hormonal milieu during exercise. In the second study, we developed an accurate maximal incremental test to correctly and simultaneously evaluate aerobic fitness and fat oxidation kinetics during exercise in this population. This test may be used for the prescription of an appropriate exercise training intensity. In the third study, we demonstrated that only 2 wk of exercise training [continuous training at Fatmax and adapted high-intensity interval training (HIIT)], matched with respect to mechanical work, may be effective to improve aerobic fitness, FORs during exercise and insulin sensitivity, which suggest that FORs might be rapidly improved and that adapted HIIT is feasible in this population. The increased FORs concomitant with the lack of changes in lipolysis during exercise suggest an improvement in the mismatching between NEFA availability and oxidation, highlighting the importance of muscular (oxidative capacity) rather than extra-muscular (hormones and plasma metabolites) factors in the regulation of fat metabolism after a training program. In the fourth study, we observed a positive correlation between EE during exercise and EPOC, suggesting that a chronic increase in the volume or intensity of exercise may increase EE during exercise and during recovery. This may have an impact in weight management in obesity. In conclusion, these findings might have practical implications for exercise training prescriptions in order to improve the therapeutic approaches in obesity and severe obesity. -- L'exercice aigu augmente la dépense énergétique (DE) pendant l'exercice et la récupération post-exercice [excès de consommation d'oxygène post-exercise (EPOC)] et peut être utilisé dans la gestion multidisciplinaire de l'obésité. Quant à l'exercice chronique (entraînement), il est efficace pour augmenter la sensibilité à l'insuline, ce qui semble être associé à une amélioration du débit d'oxydation lipidique (DOL). Le but de cette thèse est d'étudier 1) le DOL et les facteurs extra-musculaires (hormones et métabolites plasmatiques) qui régulent le métabolisme lipidique pendant l'exercice aigu et chronique et 2) l'EPOC lors de la récupération aiguë post-exercice chez des hommes obèses et sévèrement obèses (classe II et III). Dans la première étude nous avons montré que les hommes obèses et sévèrement obèses présentent une plus basse intensité d'exercice (Fatmax) correspondant au débit d'oxydation lipidique maximale et un plus bas DOL à hautes, mais pas à faibles et modérées, intensités d'exercice comparé aux sujets normo-poids, ce qui est probablement lié à une incapacité musculaire à oxyder les acides gras non-estérifiés (AGNE) plutôt qu'à une diminution de leur disponibilité ou à un changement du milieu hormonal pendant l'exercice. Dans la deuxième étude nous avons développé un test maximal incrémental pour évaluer simultanément l'aptitude physique aérobie et la cinétique d'oxydation des lipides pendant l'exercice chez cette population. Dans la troisième étude nous avons montré que seulement deux semaines d'entraînement (continu à Fatmax et intermittent à haute intensité), appariés par la charge de travail, sont efficaces pour améliorer l'aptitude physique aérobie, le DOL pendant l'exercice et la sensibilité à l'insuline, ce qui suggère que le DOL peut être rapidement amélioré chez cette population. Ceci, en absence de changements de la lipolyse pendant l'exercice, suggère une amélioration de la balance entre la disponibilité et l'oxydation des AGNE, ce qui souligne l'importance des facteurs musculaires (capacité oxydative) plutôt que extra-musculaires (hormones et métabolites plasmatiques) dans la régulation du métabolisme lipidique après un entraînement. Dans la quatrième étude nous avons observé une corrélation positive entre la DE pendant l'exercice et l'EPOC, ce qui suggère qu'une augmentation chronique du volume ou de l'intensité de l'exercice pourrait augmenter la DE lors de l'exercice et lors de la récupération post-exercice. Ceci pourrait avoir un impact sur la gestion du poids chez cette population. En conclusion, ces résultats pourraient avoir des implications pratiques lors de la prescription des entraînements dans le but d'améliorer les approches thérapeutiques de l'obésité et de l'obésité sévère.

A high-fructose diet impairs basal and stress-mediated lipid metabolism in healthy male subjects

Rapport de synthèse : La consommation de boissons sucrées contenant du fructose a remarquablement augmenté ces dernières décennies et, on pense qu'elle joue un rôle important dans l'épidémie actuelle d'obésité et de troubles métaboliques. Des études faites sur des rats ont montré qu'une alimentation riche en sucre ou fructose induisait une obésité, une résistance à l'insuline, diabète, dyslipidémie et une hypertension artérielle, tandis que chez l'homme, une alimentation riche en fructose conduit, après quelques jours, au développement d'une hypertryglycémie et une résistance hépatique à l'insuline. Nous avons entrepris une étude de 7 jours d'alimentation riche en fructose ou d'une alimentation contrôlée chez six hommes en bonne santé. Les NEFA plasmatiques et la beta-hydroxybutyrate, l'oxydation nette de lipide (calorimétrie indirecte) et l'oxydation exogène de lipide (13 CO2) ont été surveillés dans des conditions basales, et après un chargement en lipide (huile d'olive marqué au 13C-trioléine), puis durant un stress mental standardisé. La clearance de lactate et les effets métaboliques de la perfusion de lactate exogène ont également été évalués. Nos résultats ont montré que l'alimentation riche en fructose diminue la concentration plasmatique de NEFA, de beta-hydroxybutyrate de même que l'oxydation des lipides dans les conditions de bases et après surcharge en lipides. De plus, l'alimentation riche en fructose amortie l'augmentation des NEFA plasmatique et l'oxydation des lipides exogènes durant le stress mental. Elle augmente également la concentration basale de lactate et la production de lactate de respectivement 31.8% et 53.8%, tandis que la clearance du lactate reste inchangée. L'injection de lactate diminue le taux des NEFA lors de l'alimentation de contrôle et l'alimentation de base, et l'oxydation nette de lipide lors de l'alimentation de contrôle et l'alimentation riche en fructose. Ces résultats indiquent que 7 jours d'alimentation riche en fructose inhibent remarquablement la lipolyse et l'oxydation des lipides. L'alimentation riche en fructose augmente aussi la production de lactate, et l'augmentation de l'utilisation de lactate peut contribuer à supprimer l'oxydation des lipides. Abstact : The effects of a 7 d high-fructose diet (HFrD) or control diet on lipid metabolism were studied in a group of six healthy lean males. Plasma NEFA and β-hydroxybutyrate concentrations, net lipid oxidation (indirect calorimetry) and exogenous lipid oxidation (13CO2 production) were monitored in basal conditions, after lipid loading (olive oil labelled with [13C] triolein) and during a standardised mental stress. Lactate clearance and the metabolic effects of an exogenous lactate infusion were also monitored. The HFrD lowered plasma concentrations of NEFA and (β-hydroxybutyrate as well as lipid oxidation in both basal and after lipid-loading conditions. In addition, the HFrD blunted the increase in plasma NEFA and exogenous lipid oxidation during mental stress. The HFrD also increased basal lactate concentrations by 31.8%, and lactate production by 53.8 %, while lactate clearance remained unchanged. Lactate infusion lowered plasma NEFA with the control diet, and net lipid oxidation with both the HFrD and control diet. These results indicate that a 7 d HFrD markedly inhibits lipolysis and lipid oxidation. The HFrD also increases lactate production, and the ensuing increased lactate utilisation may contribute to suppress lipid oxidation.

Étude de l'implication des navettes du pyruvate découlant du métabolisme mitochondrial du glucose dans la régulation de la sécrétion d'insuline par les cellules bêta pancréatiques

Le diabète est une maladie métabolique qui se caractérise par une résistance à l’insuline des tissus périphériques et par une incapacité des cellules β pancréatiques à sécréter les niveaux d’insuline appropriés afin de compenser pour cette résistance. Pour mieux comprendre les mécanismes déficients dans les cellules β des patients diabétiques, il est nécessaire de comprendre et de définir les mécanismes impliqués dans le contrôle de la sécrétion d’insuline en réponse au glucose. Dans les cellules β pancréatiques, le métabolisme du glucose conduit à la production de facteurs de couplage métabolique, comme l’ATP, nécessaires à la régulation de l’exocytose des vésicules d’insuline. Le mécanisme par lequel la production de l’ATP par le métabolisme oxydatif du glucose déclenche l’exocytose des vésicules d’insuline est bien décrit dans la littérature. Cependant, il ne peut à lui seul réguler adéquatement la sécrétion d’insuline. Le malonyl-CoA et le NADPH sont deux autres facteurs de couplage métaboliques qui ont été suggérés afin de relier le métabolisme du glucose à la régulation de la sécrétion d’insuline. Les mécanismes impliqués demeurent cependant à être caractérisés. Le but de la présente thèse était de déterminer l’implication des navettes du pyruvate, découlant du métabolisme mitochondrial du glucose, dans la régulation de la sécrétion d’insuline. Dans les cellules β, les navettes du pyruvate découlent de la combinaison des processus d’anaplérose et de cataplérose et permettent la transduction des signaux métaboliques provenant du métabolisme du glucose. Dans une première étude, nous nous sommes intéressés au rôle de la navette pyruvate/citrate dans la régulation de la sécrétion d’insuline en réponse au glucose, puisque cette navette conduit à la production dans le cytoplasme de deux facteurs de couplage métabolique, soit le malonyl-CoA et le NADPH. De plus, la navette pyruvate/citrate favorise le flux métabolique à travers la glycolyse en réoxydation le NADH. Une étude effectuée précédemment dans notre laboratoire avait suggéré la présence de cette navette dans les cellules β pancréatique. Afin de tester notre hypothèse, nous avons ciblé trois étapes de cette navette dans la lignée cellulaire β pancréatique INS 832/13, soit la sortie du citrate de la mitochondrie et l’activité de l’ATP-citrate lyase (ACL) et l’enzyme malique (MEc), deux enzymes clés de la navette pyruvate/citrate. L’inhibition de chacune de ces étapes par l’utilisation d’un inhibiteur pharmacologique ou de la technologie des ARN interférant a corrélé avec une réduction significative de la sécrétion d’insuline en réponse au glucose. Les résultats obtenus suggèrent que la navette pyruvate/citrate joue un rôle critique dans la régulation de la sécrétion d’insuline en réponse au glucose. Parallèlement à notre étude, deux autres groupes de recherche ont suggéré que les navettes pyruvate/malate et pyruvate/isocitrate/α-cétoglutarate étaient aussi importantes pour la sécrétion d’insuline en réponse au glucose. Ainsi, trois navettes découlant du métabolisme mitochondrial du glucose pourraient être impliquées dans le contrôle de la sécrétion d’insuline. Le point commun de ces trois navettes est la production dans le cytoplasme du NADPH, un facteur de couplage métabolique possiblement très important pour la sécrétion d’insuline. Dans les navettes pyruvate/malate et pyruvate/citrate, le NADPH est formé par MEc, alors que l’isocitrate déshydrogénase (IDHc) est responsable de la production du NADPH dans la navette pyruvate/isocitrate/α-cétoglutarate. Dans notre première étude, nous avions démontré l’importance de l’expression de ME pour la sécrétion adéquate d’insuline en réponse au glucose. Dans notre deuxième étude, nous avons testé l’implication de IDHc dans les mécanismes de régulation de la sécrétion d’insuline en réponse au glucose. La diminution de l’expression de IDHc dans les INS 832/13 a stimulé la sécrétion d’insuline en réponse au glucose par un mécanisme indépendant de la production de l’ATP par le métabolisme oxydatif du glucose. Ce résultat a ensuite été confirmé dans les cellules dispersées des îlots pancréatiques de rat. Nous avons aussi observé dans notre modèle que l’incorporation du glucose en acides gras était augmentée, suggérant que la diminution de l’activité de IDHc favorise la redirection du métabolisme de l’isocitrate à travers la navette pyruvate/citrate. Un mécanisme de compensation à travers la navette pyruvate/citrate pourrait ainsi expliquer la stimulation de la sécrétion d’insuline observée en réponse à la diminution de l’expression de IDHc. Les travaux effectués dans cette deuxième étude remettent en question l’implication de l’activité de IDHc, et de la navette pyruvate/isocitrate/α-cétoglutarate, dans la transduction des signaux métaboliques reliant le métabolisme du glucose à la sécrétion d’insuline. La navette pyruvate/citrate est la seule des navettes du pyruvate à conduire à la production du malonyl-CoA dans le cytoplasme des cellules β. Le malonyl-CoA régule le métabolisme des acides gras en inhibant la carnitine palmitoyl transférase 1, l’enzyme limitante dans l’oxydation des acides gras. Ainsi, l’élévation des niveaux de malonyl-CoA en réponse au glucose entraîne une redirection du métabolisme des acides gras vers les processus d’estérification puis de lipolyse. Plus précisément, les acides gras sont métabolisés à travers le cycle des triglycérides/acides gras libres (qui combinent les voies métaboliques d’estérification et de lipolyse), afin de produire des molécules lipidiques signalétiques nécessaires à la modulation de la sécrétion d’insuline. Des études effectuées précédemment dans notre laboratoire ont démontré que l’activité lipolytique de HSL (de l’anglais hormone-sensitive lipase) était importante, mais non suffisante, pour la régulation de la sécrétion d’insuline. Dans une étude complémentaire, nous nous sommes intéressés au rôle d’une autre lipase, soit ATGL (de l’anglais adipose triglyceride lipase), dans la régulation de la sécrétion d’insuline en réponse au glucose et aux acides gras. Nous avons démontré que ATGL est exprimé dans les cellules β pancréatiques et que son activité contribue significativement à la lipolyse. Une réduction de son expression dans les cellules INS 832/13 par RNA interférant ou son absence dans les îlots pancréatiques de souris déficientes en ATGL a conduit à une réduction de la sécrétion d’insuline en réponse au glucose en présence ou en absence d’acides gras. Ces résultats appuient l’hypothèse que la lipolyse est une composante importante de la régulation de la sécrétion d’insuline dans les cellules β pancréatiques. En conclusion, les résultats obtenus dans cette thèse suggèrent que la navette pyruvate/citrate est importante pour la régulation de la sécrétion d’insuline en réponse au glucose. Ce mécanisme impliquerait la production du NADPH et du malonyl-CoA dans le cytoplasme en fonction du métabolisme du glucose. Cependant, nos travaux remettent en question l’implication de la navette pyruvate/isocitrate/α-cétoglutarate dans la régulation de la sécrétion d’insuline. Le rôle exact de IDHc dans ce processus demeure cependant à être déterminé. Finalement, nos travaux ont aussi démontré un rôle pour ATGL et la lipolyse dans les mécanismes de couplage métabolique régulant la sécrétion d’insuline.

Mécanismes moléculaires d’activation du récepteur A des peptides natriurétiques

Le récepteur A des peptides natriurétiques (NPRA) fait partie de la famille des guanylates cyclases membranaires. L’activation du NPRA par ses agonistes naturels, ANP et BNP, induit une production de GMPc qui est responsable de leur rôle dans l’homéostasie cardiovasculaire, l’inhibition de l’hypertrophie et de la fibrose cardiaques et la régulation de la lipolyse. Le NPRA est un homodimère non covalent composé d’un domaine extracellulaire de liaison du ligand (ECD), d’un unique domaine transmembranaire (TM), d’un domaine d’homologie aux kinases et d’un domaine guanylate cyclase. Bien que le NPRA ait un rôle physiologique important, les mécanismes moléculaires régissant son processus d’activation restent inconnus. Nous avons donc analysé les premières étapes du processus d’activation du NPRA. Nous avons d'abord étudié le rôle de la dimérisation des ECD dans l’activation du récepteur. Nous avons utilisé les techniques de liaison de radioligand, de FRET et de modélisation moléculaire, pour caractériser la liaison à l’ECD des agonistes naturels, d’un superagoniste et d’un antagoniste. L’ANP se lie à un dimère d’ECD préformé et la dimérisation spontanée est l’étape limitante du processus de liaison. De plus, comme le démontrent nos études de FRET, tous les peptides, incluant l’antagoniste, stabilisent le récepteur sous sa forme dimérique. Cependant, l’antagoniste A71915 stabilise le dimère d’ECD dans une conformation différente de celle induite par l’ANP. La dimérisation du NPRA semble donc nécessaire, mais non suffisante à l’activation du récepteur. L’état d’activation du NPRA dépend plutôt de l’orientation des sous unités dans le dimère. Nous avons ensuite étudié le mécanisme moléculaire de transduction du signal à travers la membrane. Plusieurs études ont suggéré que l’activation du NPRA implique un changement de conformation du domaine juxtamembranaire (JM). Cependant, les études de cristallographie de l’ECD soluble de NPRA n’ont pas permis de documenter la structure du JM et le changement de conformation impliqué dans la transduction du signal reste inconnu. Pour analyser ce changement de conformation, nous avons d’abord séquentiellement substitué les neuf acides aminés du JM par une cystéine. En étudiant la capacité des mutants à former des dimères covalents de façon constitutive ou induite par l’ANP, nous avons pu évaluer la proximité relative des résidus du JM, avant et après activation du NPRA. Ces résultats ont démontré la proximité élevée de certains résidus spécifiques et sont en contradiction avec les données cristallographiques. Nous avons également démontré que le domaine intracellulaire impose une contrainte conformationnelle au JM à l’état de base, qui est levée après liaison de l’ANP. En introduisant de 1 à 5 alanines dans l’hélice-α transmembranaire, nous avons montré qu’une rotation des TM de 40° induit une activation constitutive du NPRA. Le signal d’activation pourrait donc être transmis à travers la membrane par un mécanisme de rotation des TM. En utilisant nos données expérimentales, nous avons généré le premier modèle moléculaire illustrant la conformation active du NPRA, où les domaines JM et TM sont représentés. Dans son ensemble, cette étude apporte une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires régissant les premières étapes du processus complexe d’activation du NPRA.

Mécanismes contributifs au développement de la stéatose hépatique non alcoolique (SHNA) : effets de l'entraînement

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Rôle de l'estérification des acides gras dans la régulation de la sécrétion d'insuline et le stress métabolique induits par le glucose

Le diabète est une maladie chronique de l’homéostasie du glucose caractérisée par une hyperglycémie non contrôlée qui est le résultat d’une défaillance de la sécrétion d’insuline en combinaison ou non avec une altération de l’action de l’insuline. La surnutrition et le manque d’activité physique chez des individus qui ont des prédispositions génétiques donnent lieu à la résistance à l’insuline. Pendant cette période dite de compensation où la concentration d’acides gras plasmatiques est élevée, l’hyperinsulinémie compense pleinement pour la résistance à l’insuline des tissus cibles et la glycémie est normale. Le métabolisme du glucose par la cellule pancréatique bêta entraîne la sécrétion d’insuline. Selon le modèle classique de la sécrétion d’insuline induite par le glucose, l’augmentation du ratio ATP/ADP résultant de la glycolyse et de l’oxydation du glucose, induit la fermeture des canaux KATP-dépendant modifiant ainsi le potentiel membranaire suivi d’un influx de Ca2+. Cet influx de Ca2+ permet l’exocytose des granules de sécrétion contenant l’insuline. Plusieurs nutriments comme les acides gras sont capables de potentialiser la sécrétion d’insuline. Cependant, le modèle classique ne permet pas d’expliquer cette potentialisation de la sécrétion d’insuline par les acides gras. Pour expliquer l’effet potentialisateur des acides gras, notre laboratoire a proposé un modèle complémentaire où le malonyl-CoA dérivé du métabolisme anaplérotique du glucose inhibe la carnitine palmitoyltransférase-1, l’enzyme qui constitue l’étape limitante de l’oxydation des acides gras favorisant ainsi leur estérification et donc la formation de dérivés lipidiques signalétiques. Le modèle anaplérotique/lipidique de la sécrétion d'insuline induite par le glucose prédit que le malonyl-CoA dérivé du métabolisme du glucose inhibe la bêta-oxydation des acides gras et augmente la disponibilité des acyl-CoA ou des acides gras non-estérifiés. Les molécules lipidiques agissant comme facteurs de couplage du métabolisme des acides gras à l'exocytose d'insuline sont encore inconnus. Des travaux réalisés par notre laboratoire ont démontré qu’en augmentant la répartition des acides gras vers la bêta-oxydation, la sécrétion d’insuline induite par le glucose était réduite suggérant qu’un des dérivés de l’estérification des acides gras est important pour la potentialisation sur la sécrétion d’insuline. En effet, à des concentrations élevées de glucose, les acides gras peuvent être estérifiés d’abord en acide lysophosphatidique (LPA), en acide phosphatidique (PA) et en diacylglycérol (DAG) et subséquemment en triglycérides (TG). La présente étude a établi l’importance relative du processus d’estérification des acides gras dans la production de facteurs potentialisant la sécrétion d’insuline. Nous avions émis l’hypothèse que des molécules dérivées des processus d’estérification des acides gras (ex : l’acide lysophosphatidique (LPA) et le diacylglycerol (DAG)) agissent comme signaux métaboliques et sont responsables de la modulation de la sécrétion d’insuline en présence d’acides gras. Afin de vérifier celle-ci, nous avons modifié le niveau d’expression des enzymes clés contrôlant le processus d’estérification par des approches de biologie moléculaire afin de changer la répartition des acides gras dans la cellule bêta. L’expression des différents isoformes de la glycérol-3-phosphate acyltransférase (GPAT), qui catalyse la première étape d’estérification des acides gras a été augmenté et inhibé. Les effets de la modulation de l’expression des isoenzymes de GPAT sur les processus d’estérifications, sur la bêta-oxydation et sur la sécrétion d’insuline induite par le glucose ont été étudiés. Les différentes approches que nous avons utilisées ont changé les niveaux de DAG et de TG sans toutefois altérer la sécrétion d’insuline induite par le glucose. Ainsi, les résultats de cette étude n’ont pas associé de rôle pour l’estérification de novo des acides gras dans leur potentialisation de la sécrétion d’insuline. Cependant, l’estérification des acides gras fait partie intégrante d’un cycle de TG/acides gras avec sa contrepartie lipolytique. D’ailleurs, des études parallèles à la mienne menées par des collègues du laboratoire ont démontré un rôle pour la lipolyse et un cycle TG/acides gras dans la potentialisation de la sécrétion d’insuline par les acides gras. Parallèlement à nos études des mécanismes de la sécrétion d’insuline impliquant les acides gras, notre laboratoire s’intéresse aussi aux effets négatifs des acides gras sur la cellule bêta. La glucolipotoxicité, résultant d’une exposition chronique aux acides gras saturés en présence d’une concentration élevée de glucose, est d’un intérêt particulier vu la prépondérance de l’obésité. L’isoforme microsomal de GPAT a aussi utilisé comme outil moléculaire dans le contexte de la glucolipotoxicité afin d’étudier le rôle de la synthèse de novo de lipides complexes dans le contexte de décompensation où la fonction des cellules bêta diminue. La surexpression de l’isoforme microsomal de la GPAT, menant à l’augmentation de l’estérification des acides gras et à une diminution de la bêta-oxydation, nous permet de conclure que cette modification métabolique est instrumentale dans la glucolipotoxicité.

Monoacylglycerol as a metabolic coupling factor in glucose-stimulated insulin secretion

Les cellules beta pancréatiques sécrètent l’insuline lors d’une augmentation post-prandiale du glucose dans le sang. Ce processus essentiel est contrôlé par des facteurs physiologiques, nutritionnels et pathologiques. D’autres sources d’énergie, comme les acides aminés (leucine et glutamine) ou les acides gras potentialisent la sécrétion d’insuline. Une sécrétion d’insuline insuffisante au besoin du corps déclanche le diabète. Le rôle que joue l’augmentation du calcium intracellulaire et les canaux K+/ATP dans la sécrétion d’insuline est bien connu. Bien que le mécanisme exact de la potentialisation de la sécrétion d’insuline par les lipides est inconnu, le cycle Glycérolipides/Acides gras (GL/FFA) et son segment lipolytique ont été reconnu comme un composant essentiel de la potentialisation lipidique de la sécrétion d’insuline. Le diacylglycérol, provenant de la lipolyse, a été proposé comme un signal lipidique important d’amplification. Cependant, l’hydrolyse des triglycérides et des diacylglycérides a été démontrée essentielle pour la sécrétion d’insuline stimulée par le glucose, en suggérant un rôle du monoacylglycérol (MAG) dans ce processus. Dans cette étude, on démontre que la réduction de la sécrétion d’insuline stimulée par le glucose, lors d’une inhibition de la lipolyse, est restaurée par l’addition de MAG. Dans les cellules beta pancréatiques, le niveau de MAG augmente en présence des concentrations élevées du glucose, et également lorsqu’on inhibe l’enzyme MAG hydrolase abhydrolase-6 (ABHD6) avec l’inhibiteur spécifique WWL70. L’analyse lipidomique a démontré qu’après la stimulation des cellules beta pancréatiques avec le glucose et aussi avec le WWL70, l’espèce la plus accumulée de MAG était le 1-stearoylglycérol (1-SG). L’addition de 1-SG, de 1-palmitoylglycérol (1-PG) ou de WWL70 augmente la sécrétion d’insuline stimulée par le glucose, et cette augmentation est indépendante de la génération de acides gras à partir de MAG. Cela suggère que le MAG est un signal lipidique pour la potentialisation de la sécrétion d’insuline stimulée par le glucose. De plus, la surexpression du gène d’ABHD6 dans les cellules INS832/13 cause une réduction de la sécrétion d’insuline, due probablement à la diminution des niveaux intracellulaire de MAG. Avec le but de comprendre le mécanisme moléculaire impliqué dans la potentialisation de la sécrétion d’insuline par le MAG, on a bloqué l’action du récepteur vanilloid-1 (TRPV1) liant le MAG par l’agent pharmacologiste, AMG9810. Le traitement des cellules beta pancréatique par AMG9810 entraîne une diminution de la potentialisation de la sécrétion de l’insuline induite par le MAG. Il est a noter que le MAG pourrait activer TRPV1 par une liaison physique dans la membrane cellulaire interne; ce qui entraînerai l’entrée du calcium dans la cellule, et ensuite la stimulation de l’exocytose des granules à insuline. En soutien de cette hypothèse, on a trouvé une diminution du calcium intracellulaire lorsqu’on traite au AMG9810 des cellules beta pancréatique de rat (provenant des îlots dispersés) stimulées au glucose et au WWL70. L’ensemble des résultats suggère que le MAG est un médiateur de la potentialisation lipidique de la sécrétion d’insuline stimulée par le glucose. Vu que l’inhibition pharmacologique d’ABHD6 augmente la sécrétion d’insuline, on pourra conclure que cette enzyme représente une cible thérapeutique potentielle dans le développement des médicaments anti-diabétiques, visant une augmentation de la sécrétion d’insuline.

Les mécanismes de régulation du métabolisme lipidique par les peptides QRFP (pyroglutamylated RF-amide peptides)

Plusieurs cibles thérapeutiques dans le développement de médicaments contre l’obésité visent une diminution de l’appétit et de la masse adipeuse et à augmenter la dépense énergétique. L’appétit et le métabolisme énergétique sont régulés par certains neuropeptides qui agissent au niveau du système nerveux central, notamment dans l’hypothalamus. Parmi ces neuropeptides, les peptides RF-amide ou QRFP (pyroglutamylated RF-amide peptides), ainsi nommés par la présence du motif conservé Arg-Phe-NH2 dans le domaine C-terminal, induisent une hyperphagie et une augmentation de la masse adipeuse lorsqu’administrés par voie centrale. Les formes bioactives de ces peptides comprennent principalement 43 (QRFP-43) et 26 (QRFP-26) acides aminés. Outre les peptides QRFP, leurs récepteurs, les GPR103 de la famille des récepteurs à 7 passages transmembranaires couplés aux protéines G, sont exprimés dans l’hypothalamus. Plus récemment, des études ont montré la sécrétion de ces neuropeptides, et la présence du GPR103, dans le tissu adipeux. Cependant, le rôle de la voie signalétique (QRFP/GPR103) dans la régulation du métabolisme lipidique au niveau périphérique est peu connu. Les travaux de cette thèse ont porté sur la caractérisation des effets adipogéniques périphériques des neuropeptides QRFP. En premier lieu, nos travaux ont montré que les adipocytes 3T3-L1 et les adipocytes murins isolés des dépôts adipeux blancs expriment le prépro-QRFP et uniquement le récepteur GPR103B, un des deux sous-types de récepteurs présents chez la souris. De plus, nous avons montré que l’expression du récepteur est régulée par une diète riche en lipides réduisant l’expression du prépro-QRFP, mais augmentant celle du GPR103B dans les dépôts lipidiques. Chez l’humain, les adipocytes de l’omentum expriment autant le GPR103 que le prépro-QRFP. Nous avons de plus étudié la fonctionnalité du GPR103B dans les adipocytes 3T3-L1 par l’utilisation d’ARN interférents. Nous avons observé que ce récepteur médie les effets adipogéniques des QRFPs en augmentant l’expression du récepteur nucléaire PPAR-gamma (peroxisome proliferator-activated receptor gamma) et le facteur de transcription C/EBP-alpha (CCAAT-enhancer binding protein alpha) résultant en une accumulation des triglycérides. Nous avons aussi mis en évidence les effets anti-lipolytiques des QRFPs. En effet, les QRFP inhibent fortement la lipolyse induite avec l’isoprotérénol. L’étude des mécanismes moléculaires à l’origine des effets anti-lipolytiques du QRFP-43 a montré l’activation de la voie de signalisation PI3-K/PKB (phosphatidylinositol 3-kinase/protéine kinase B) en réponse à la stimulation du GPR103B. La réponse anti-lipolytique induite par le QRFP-43 est associée à une diminution de la phosphorylation de la périlipine A (PLIN1a) et de la lipase hormono-sensible (HSL). Nos études ont élucidé les mécanismes conduisant à l’inhibition de la phosphorylation de la PLIN1a en réponse à l’activation du GPR103B, impliquant l’inhibition de la migration de la cavéoline 1 et de la sous unité catalytique de la protéine kinase A (PKA) au niveau des gouttelettes lipidiques, ainsi que l’inhibition de l’activité des Src kinases et de la protéine kinase C (PKC). En conclusion, nos travaux ont montré que les QRFP-43 et -26 exercent un effet adipogénique et anti-lipolytique dans les adipocytes, mettant ainsi en évidence le rôle des neuropeptides QRFPs dans la régulation du métabolisme lipidique au niveau adipocytaire.

Évaluation du rôle du récepteur CD36 comme cible thérapeutique potentielle dans le traitement de la maladie cardiaque ischémique

La maladie cardiaque ischémique, la plus commune des maladies qui affectent le cœur, est encore aujourd’hui une importante cause de décès dans les pays industrialisés. Une réponse cardio-métabolique inflammatoire à un changement aigu initié par une modification du métabolisme énergétique du cœur ischémique est accentuée après que l’apport en oxygène ait été rétabli. Parmi les altérations délétères dans le myocarde qui en résultent, sont inclus l’accumulation d’acides gras non estérifiés (AGNE) ainsi que leur oxydation au détriment de l’utilisation du glucose, ce qui amplifie la génération d’espèces réactives de l’oxygène (ROS). Les tissus en périphérie du cœur tel que le tissu adipeux peuvent affecter l’étendue des blessures au myocarde par la relâche en circulation de substances bioactives comme les AGNE et l’adiponectine. Le CD36 est le principal facilitateur de l’entrée d’AGNE dans le cœur et les adipocytes et constitue une importante cible métabolique spécialement lors d’un stress d’ischémie-reperfusion (I/R). Il a été rapporté précédemment par notre groupe qu’un ligand synthétique et sélectif envers le CD36 exerce un effet protecteur puissant sur le système vasculaire. Cependant, aucune étude in vivo n’a rapporté d’effet cardioprotecteur de ligands sélectifs envers le CD36. Ainsi, ce projet visait à évaluer le rôle et possiblement l’effet cardioprotecteur de ligands sélectifs du récepteur CD36 sur la blessure au myocarde en I/R. Des souris CD36+/+ et CD36-/- ont été traitées quotidiennement avec le EP 80317, le CP-3(iv) ou le véhicule pendant 14 jours avant de subir la ligature temporaire de l’artère coronaire antérieure descendante gauche (LAD). Notre première étude a montré que le EP 80317 exerce un effet cardioprotecteur puissant tel que montré par la réduction de la surface des lésions et l’amélioration de la fonction cardiaque in vivo suivant la blessure au myocarde en I/R. De plus, le EP 80317 a réduit l’internalisation totale d’AGNE dans le myocarde, mesurée in vivo par l’imagerie métabolique cardiaque, en accord avec la diminution du niveau circulant d’AGNE. Une réduction de la lipolyse révélée par une perfusion de radiotraceur de palmitate et une augmentation du niveau d’expression de gènes adipogéniques et anti-lipolytiques appuient davantage l’effet du EP 80317 dans la prévention de la mobilisation délétère d’acides gras du tissu adipeux. Notre deuxième étude a investigué le mécanisme cardioprotecteur d’une nouvelle génération de ligands dotés d’une plus grande affinité de liaison envers le CD36. Cette étude a montré que le CP-3(iv) est aussi pourvu d’un puissant effet cardioprotecteur comme le montre la réduction de la taille de l’infarctus et l’amélioration de la fonction cardiaque post-I/R du myocarde qui est fonction d’une signalisation métabolique et anti-oxydante de l’adiponectine. En effet, l’augmentation des principales voies de signalisation régulant la sécrétion de l’adiponectine et des gènes antioxydants a été démontrée dans le tissu adipeux suivant l’I/R du myocarde et un traitement avec le CP-3(iv). L’activation de la protéine kinase B ou Akt dans le myocarde avec la diminution de la génération de ROS et de la signalisation de mort cellulaire appuient davantage le rôle cardioprotecteur du CP-3(iv) dans l’I/R du myocarde. En conclusion, le travail présenté dans cette thèse soutient qu’une signalisation du CD36 par le EP 80317 et le CP-3(iv) pourrait s’avérer être une nouvelle approche thérapeutique dans le traitement de la maladie cardiaque ischémique. Ces ligands synthétiques sélectifs envers le CD36 provoquent un effet salutaire sur le myocarde ischémique par le biais d’une amélioration du profil métabolique dans les premières heures de la reperfusion. Le EP 80317 réduit le niveau délétère d’AGNE et leur internalisation dans le cœur en situation d’excès, tandis que le CP-3(iv) augmente le niveau bénéfique d’adiponectine et son effet cardioprotecteur.