A phylogenetic analysis of Brycon and Henochilus (Characiformes, Characidae, Bryconinae) based on the mitochondrial gene 16S rRNA

The genus Brycon, the largest subunit of the Bryconinae, has 42 valid species distributed from southern Mexico to the La Plata River in Argentina. Henochilus is a monotypic genus, comprising a single species (H. wheatlandii) found in the upper Rio Doce basin. In the present study, partial sequences of the mitochondrial gene 16S were obtained for fifteen species of Brycon and for Henochilus wheatlandii. The results showed that the genus Brycon is paraphyletic, since Henochilus is the sister-group of B. ferox and B. insignis. The most basal species analyzed were the trans-Andean species B. henni, B. petrosus, and B. chagrensis.

Classificação taxonômica das estirpes de rizóbio recomendadas para as culturas da soja e do feijoeiro baseada no seqüenciamento do gene 16S rRNA

As culturas da soja [Glycine max (L.) Merrill] e do feijoeiro (Phaseolus vulgaris L.) são de grande importância econômica e social para o Brasil e ambas podem ter seu requerimento de nitrogênio suprido pela simbiose com bactérias da ordem Rhizobiales. Para garantir a maximização do processo biológico, deve-se proceder à inoculação de estirpes de rizóbio eficientes e competitivas, recomendadas pela pesquisa. No Brasil, foram comercializados, na safra 2001/2002, 14 milhões de doses de inoculantes, dos quais 99 % para as culturas da soja e do feijoeiro. Neste trabalho, determinou-se a posição taxonômica das estirpes utilizadas em inoculantes comerciais para as duas culturas, pelo seqüenciamento da região do DNA que codifica o gene 16S rRNA, que é suficientemente variável, mas carrega as informações necessárias para permitir a análise filogenética de bactérias. O seqüenciamento permitiu definir que duas das estirpes recomendadas para a cultura da soja, SEMIA 587 e SEMIA 5019 (= 29 w), pertencem à espécie Bradyrhizobium elkanii e as duas outras, SEMIA 5079 (=CPAC 15) e SEMIA 5080 (= CPAC 7), à espécie B. japonicum. Determinou-se, ainda, que a estirpe SEMIA 4080 (=PRF 81), recomendada para o cultura do feijoeiro, pertence à espécie Rhizobium tropici. As seqüências obtidas foram depositadas no banco mundial de genes do National Center for Biotechnology Information.

Identidade molecular dos fitoplasmas associados aos enfezamentos do tomateiro e da berinjela com base na análise do gene 16S rDNA

Doenças de hortaliças de ocorrência no território brasileiro e em outras áreas do mundo têm sido associadas a diversos fitoplasmas. Na região de Piracicaba-SP e Bragança Paulista-SP, em plantas de tomate e berinjela foram observados sintomas típicos de enfezamento caracterizados por porte reduzido, clorose foliar, superbrotamento de ramos, desenvolvimento anormal do cálice, encurtamento de entre-nós, redução no tamanho de folhas, flores e frutos. Através de duplo PCR, utilizando os iniciadores R16 mF1/mR2 e R16 F2n/R2, fragmentos de DNA de 1,2 kb foram amplificados de amostras sintomáticas, demonstrando a presença de fitoplasma nos tecidos das plantas. O uso de iniciadores específicos demonstrou que estes fitoplasmas eram afiliados ao grupo 16SrIII. Análises de RFLP, usando as enzimas de restrição AluI, HpaII, KpnI, MboI, MseI e RsaI confirmaram que os fitoplasmas detectados eram representantes do grupo 16SrIII. Os fragmentos de DNA amplificados foram clonados em Escherichia coli, sequenciados e comparados, por homologia de seqüência, entre si e com outros fitoplasmas do grupo 16SrIII. Um índice de similaridade de seqüência acima de 95% foi encontrado quando seqüências dos fitoplasmas detectados em tomate e berinjela foram comparadas com aquelas de outros representantes do grupo 16SrIII. Um índice de 98-99% foi obtido quando seqüências dos fitoplasmas encontrados em tomate e berinjela foram comparadas entre si. Estes resultados evidenciaram que o enfezamento do tomateiro e da berinjela podem estar associados a um mesmo fitoplasma, com base na análise de seqüências do gene do 16S rDNA.

Identificação de comunidades bacterianas de solo por seqüenciamento do gene 16S rRNA

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Analise microbiológica da flora intestinal do mosquito Aedes Aegypti através do sequenciamento do gene 16S rRNA na plataforma Illumina MiSeq

Dengue é uma arbovirose que afeta cerca de 100 milhões de pessoas anualmente, em mais de 100 países situados nas regiões tropicais e subtropicais. Foi considerada a doença viral que mais cresceu no ultimo ano, repercutindo em impactos sociais e econômicos nas regiões endêmicas devido às altas taxas de morbidade e mortalidade desencadeadas pela infecção. O principal vetor da dengue é o mosquito Aedes aegypti, presente em toda a faixa tropical e subtropical. Por apresentar hematofagia antropofílica, rápido desenvolvimento e características comportamentais especificas, é um excelente transmissor do vírus dengue. Medidas de controle da disseminação da dengue são restritas à eliminação do mosquito vetor, e um tratamento específico ainda não foi desenvolvido, bem como a criação de uma vacina que previna simultaneamente a infecção pelos quatro sorotipos do arbovírus. Uma característica que determina a disseminação de doenças é a alta competência vetorial de seus mosquitos transmissores, que tem sido associada à composição da microbiota intestinal do inseto. As bactérias presente no intestino do mosquito exercem funções relacionadas a sua nutrição, desenvolvimento e reprodução, e são também um importante fator na eliminação de patógenos, por interferirem diretamente na atividade viral, ou indiretamente a partir da ativação das vias antivirais pelos micro-organismos. Dessa forma, este trabalho visa estudar a diversidade microbiana intestinal do mosquito Aedes aegypti em diferentes estágios de vida, através de sequenciamento de última geração com a plataforma MiSeq Illumina

A phylogenetic analysis of Brycon and Henochilus (Characiformes, Characidae, Bryconinae) based on the mitochondrial gene 16S rRNA

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Filogenia molecular dos xenarthra (Mammalia): análise do grupo cingulata a partir de sequências nucleotídicas do gene mitocondrial rRNA 16S

Os Xenarthra são o grupo de mamíferos que inclui os tatus, os tamanduás e as preguiças. A América do Sul serviu de cenário para a história natural do grupo que, somente no fim do Cenozóico, dispersou-se para a América Central e, com uma perda de variedade, chegou à América do Norte e à algu-mas ilhas do Caribe. Trinta e uma espécies estão descritas dentro da linha-gem dos Xenarthra. Elas estão classificadas em 13 gêneros, quatro famílias (Bradypodidae, Megalonychidae, Myrmecophagidae e Dasypodidae) e duas ordens (Cingulata e Pilosa). A filogenia deste grupo tem sido alvo de diver-sas pesquisas que analisaram tanto dados morfológicos, quanto moleculares. Delsuc et al. (2003) analisaram seqüências de genes mitocondriais e nucleares e confirmaram a monofilia das três subfamílias (Dasypodinae, Euphacti-nae e Tolypeutinae) inclusas na família Dasypodidae. Delsuc et al. (2003) geraram a seguinte árvore: (((Bradypus, Choloepus)100, ((Myrmecophaga, Tamandua)100, Cyclopes)100), ((D. kappleri, D. novemcinctus)100, (Toly-pentes, (Priodontes, Cabassous)54)100, (Zaedyus, (Euphractus, Chaetophrac-tus)60)100)). Gaudin (2005) apresentou um trabalho que reviu e ampliou as análises morfológicas apresentadas até então, concluindo que os tatus atu-ais estão divididos em dois grupos, um mais basal (Dasypodinae) e outro mais derivado (Euphractinae), de acordo com o seguinte arranjo: (Bradypus, Tamandua), (Dasypus, (Priodontes, (Cabassous, (Tolypeutes, (Euphractus, Chaetophractus, (Zaedyus, Chlamyphorus)42)36)72)72)40)85). Neste traba-lho utilizou-se parte do gene mitocondrial rRNA 16S de 12 táxons atu-ais de Xenarthra para analisar a filogenia do grupo através do critério de máxima verossimilhança. Nossos resultados são apresentados analisando-se o gene 16S e analisando o banco de dados do 16S mais o de Delsuc et al. (2003). Nas duas situações, as filogenias apresentadas apóiam os resulta-dos de Delsuc et al. (2003): (Bradypus, (Choloepus, ((Cyclopes, (Myrme-cophaga, Tamandua)100)100, (Dasypus, (((Cabassous, Priodontes)68, Toly-peutes)100,((Chaetophractus, Euphractus)65, Zaedyus)100)100)100)100)100). Uma melhora nos valores de bootstrap nos ramos dentro das sub-famílias da família Dasypodidae é percebida em relação ao trabalho de Delsuc et al. (2003). Acreditamos que Elementos de Transposição do tipo (LINES) são os marcadores moleculares mais adequados para confirmar o arranjo obtido com as seqüências de genes mitocondriais e nucleares.

Análise das relações taxonômicas e sistemáticas entre espécies de triatomíneos (Hemiptera, Reduviidae) de colônias mantidas pelo Serviço Especial de Saúde de Araraquara, inferida de seqüências do 16S rDNA mitocondrial

Foram analisadas seqüências de nucleotídeos do gene 16S do rDNA mitocondrial em 14 populações de triatomíneos mantidos em colônias no insetário SESA de Araraquara- SP, comparando-as com seqüências do mesmo gene disponíveis no GenBank. Os fragmentos variaram de 311 a 317 pb com baixa variação intra-específica entre as distâncias genéticas (0% a 0,6%), exceto para os relacionamentos entre espécimes de Triatoma sordida (1%) e espécimes de T. brasiliensis (1,3%) atribuídos a populações geográficas diferentes. A parafilia de Rhodniini e do gênero Panstrongylus foi evidenciada pelas analises, confirmando resultados anteriores entre estes e os estreitos relacionamentos de R. prolixus com R. robustus e de T. infestans e T. platensis. O relacionamento entre T. maculata e T. pseudomaculata não foi solucionado, uma vez que, esses táxons apareceram tanto em monofilia quanto em parafilia: T. pseudomaculata (SESA) está agrupado com T. maculata (seqüência do GenBank) e associados a T . brasiliensis (SESA), enquanto T. maculata (SESA) aparece agrupado com T. pseudomaculata do SESA e do GenBank. Os resultados evidenciam a utilidade do gene 16S como marcador de espécies de triatomíneos e sua importância em questões de sistemática e taxonomia. Há necessidade de novos estudos envolvendo outros marcadores associados a caracteres sistemáticos clássicos de morfologia, ecologia e comportamento para decisões sistemáticas adequadas uma vez, que teriam impacto não apenas sistemático mas, para as estratégias de controle.

Sensitivity evaluation of a single-step PCR assay using Ehrlichia canis p28 gene as a target and its application in diagnosis of canine ehrlichiosis

The aim of this study was to optimize a PCR assay that amplifies an 843 pb fragment from the p28 gene of Ehrlichia canis and compare it with two other PCR methods used to amplify portions of the 16S rRNA and dsb genes of Ehrlichia. Blood samples were collected from dogs suspected of having a positive diagnosis for canine ehrlichiosis. Amplification of the p28 gene by PCR produced an 843-bp fragment and this assay could detect DNA from one gene copy among 1 billion cells. All positive samples detected by the p28-based PCR were also positive by the 16S rRNA nested-PCR and also by the dsb-based PCR. Among the p28-based PCR negative samples, 55.3% were co-negatives, but 27.6% were positive in 16S rRNA and dsb based PCR assays. The p28-based PCR seems to be a useful test for the molecular detection of E. canis, however improvements in this PCR sensitivity are desired, so that it can become an important alternative in the diagnosis of canine ehrlichiosis.

A multiple-outgroup approach to resolving division-level phylogenetic relationships using 16S rDNA data

The 16S rRNA gene (16S rDNA) is currently the most widely used gene for estimating the evolutionary history of prokaryotes, To date, there are more than 30 000 16S rDNA sequences available from the core databases, GenBank, EMBL and DDBJ, This great number may cause a dilemma when composing datasets for phylogenetic analysis, since the choice and number of reference organisms are known to affect the resulting tree topology. A group of sequences appearing monophyletic in one dataset may not be so in another. This can be especially problematic when establishing the relationships of distantly related sequences at the division (phylum) level. In this study, a multiple-outgroup approach to resolving division-level phylogenetic relationships is suggested using 16S rDNA data. The approach is illustrated by two case studies concerning the monophyly of two recently proposed bacterial divisions, OP9 and OP10.

Análise das relações taxonômicas e sistemáticas entre espécies de triatomíneos (Hemiptera, Reduviidae) de colônias mantidas pelo Serviço Especial de Saúde de Araraquara, inferida de seqüências do 16S rDNA mitocondrial

Foram analisadas seqüências de nucleotídeos do gene 16S do rDNA mitocondrial em 14 populações de triatomíneos mantidos em colônias no insetário SESA de Araraquara- SP, comparando-as com seqüências do mesmo gene disponíveis no GenBank. Os fragmentos variaram de 311 a 317 pb com baixa variação intra-específica entre as distâncias genéticas (0% a 0,6%), exceto para os relacionamentos entre espécimes de Triatoma sordida (1%) e espécimes de T. brasiliensis (1,3%) atribuídos a populações geográficas diferentes. A parafilia de Rhodniini e do gênero Panstrongylus foi evidenciada pelas analises, confirmando resultados anteriores entre estes e os estreitos relacionamentos de R. prolixus com R. robustus e de T. infestans e T. platensis. O relacionamento entre T. maculata e T. pseudomaculata não foi solucionado, uma vez que, esses táxons apareceram tanto em monofilia quanto em parafilia: T. pseudomaculata (SESA) está agrupado com T. maculata (seqüência do GenBank) e associados a T . brasiliensis (SESA), enquanto T. maculata (SESA) aparece agrupado com T. pseudomaculata do SESA e do GenBank. Os resultados evidenciam a utilidade do gene 16S como marcador de espécies de triatomíneos e sua importância em questões de sistemática e taxonomia. Há necessidade de novos estudos envolvendo outros marcadores associados a caracteres sistemáticos clássicos de morfologia, ecologia e comportamento para decisões sistemáticas adequadas uma vez, que teriam impacto não apenas sistemático mas, para as estratégias de controle.

Caracterização de rizóbios indicados para produção de inoculantes por meio de sequenciamento parcial do 16S rRNA

O objetivo deste trabalho foi confrontar as sequências parciais do gene 16S rRNA de estirpes padrão de rizóbios com as de estirpes recomendadas para a produção de inoculantes no Brasil, com vistas à verificação da confiabilidade do sequenciamento parcial desse gene para a identificação rápida de estirpes. Foram realizados sequenciamentos através de reação em cadeia da polimerase (PCR) com iniciadores relativos à região codificadora do gene 16S rRNA entre as bactérias estudadas. Os resultados foram analisados pela consulta de similaridade de nucleotídeos aos do "Basic Local Alignment Search Tool" (Blastn) e por meio da interpretação de árvores filogenéticas geradas usando ferramentas de bioinformática. A classificação taxonômica das estirpes Semia recomendadas para inoculação de leguminosas com base em propriedades morfológicas e especificidade hospedeira não foi confirmada em todas as estirpes. A maioria das estirpes estudadas, consultadas no Blastn, é consistente com a classificação proposta pela construção de árvores filogenéticas das sequências destas estirpes, com base na similaridade pelo sequenciamento parcial do gene considerado.

A study on the phylogeny and the ecology of ammonia-oxidizing bacteria using a new molecular marker based on the gene amoB

L'agricultura i la industrialització han causat un augment significatiu del nombre d'ambients rics en amoni. La presència de compostos nitrogenats redueix la qualitat de l'aigua, causant problemes de toxicitat, deteriorant el medi ambient i fins i tot afectant la salut humana. En conseqüència, la nitrificació s'ha convertit en un procés global que afecta al cicle del nitrogen a la biosfera. Els bacteris oxidadors d'amoni (AOB) són els responsables de l'oxidació de l'amoni a nitrit, i juguen un paper essencial en el cicle del nitrogen. Els primers oxidadors d'amoni foren aïllats a finals del segle XIX, però la lentitud del seu creixement i les dificultats per cultivar-los feren que fins als anys 80, amb els primers estudis emprant el gen 16SrDNA, no s'assolís un coneixement complert d'aquest grup bacterià. Actualment les bases de dades contenen multitud d'entrades amb seqüències corresponents a AOB. L'objectiu d'aquest treball era trobar, desenvolupar i avaluar eines útils i fiables per a l'estudi dels AOB en mostres ambientals. En aquest treball primer descrivim la utilització de la hibridació in situ amb fluorescència (FISH), mitjançant l'aplicació de sondes amb diana en el 16SrRNA dels AOB. La FISH ens va permetre detectar i recomptar aquest grup bacterià; no obstant, aquest mètode no permetia la detecció de noves seqüències, pel que es necessitava una nova eina. Amb aquesta intenció vam aplicar la seqüència de la sonda Nso1225 en una PCR. El fet d'amplificar específicament un fragment del 16SrDNA dels AOB va suposar el desenvolupament d'una nova eina molecular que permetia detectar la presència i diversitat d'aquests bacteris en ambients naturals. Malgrat tot, algunes seqüències pertanyents a bacteris no oxidadors d'amoni del subgrup β dels proteobacteris, eren també obtingudes amb aquesta tècnica. Així mateix, un dels inconvenients de l'ús del 16SrDNA com a marcador és la impossibilitat de detectar simultàniament els AOB que pertanyen als subgrups β i γ dels proteobacteris. El gen amoA, que codifica per la subunitat A de l'enzim amoni monooxigenasa (AMO), era aleshores àmpliament utilitzat com a marcador per a la detecció dels AOB. En aquest treball també descrivim la utilització d'aquest marcador en mostres procedents d'un reactor SBR. Aquest marcador ens va permetre identificar seqüències de AOB en la mostra, però la necessitat de detectar amoA mitjançant clonatge fa que l'ús d'aquest marcador requereixi massa temps per a la seva utilització com a eina en estudis d'ecologia microbiana amb moltes mostres. Per altra banda, alguns autors han assenyalat l'obtenció de seqüències de no AOB en utilitzar amoA en un protocol de PCR-DGGE. Amb la finalitat d'obtenir una eina ràpida i rigorosa per detectar i identificar els AOB, vam desenvolupar un joc nou d'oligonucleòtids amb diana en el gen amoB, que codifica per a la subunitat transmembrana de l'enzim AMO. Aquest gen ha demostrat ser un bon marcador molecular pels AOB, oferint, sense tenir en compte afiliacions filogenètiques, una elevada especificitat, sensibilitat i fiabilitat. En aquest treball també presentem una anàlisi de RT-PCR basada en la detecció del gen amoB per a la quantificació del gènere Nitrosococcus. El nou joc d'oligonucleòtids dissenyat permet una enumeració altament específica i sensible de tots els γ-Nitrosococcus coneguts. Finalment, vam realitzar un estudi poligènic, comparant i avaluant els marcadors amoA, amoB i 16SrDNA, i vàrem construir un arbre filogenètic combinat. Com a resultat concloem que amoB és un marcador adequat per a la detecció i identificació dels AOB en mostres ambientals, proporcionant alhora agrupacions consistents en fer inferències filogenètiques. Per altra banda, la seqüència sencera del gen 16S rDNA és indicada com a marcador en estudis amb finalitats taxonòmiques i filogenètiques en treballar amb cultius purs de AOB.

Analysis of 16S rDNA sequences from pathogenic Leptospira serovars and use of single nucleotide polymorphisms for rapid speciation by D-HPLC

Leptospira have a worldwide distribution and include important zoonotic pathogens yet diagnosis and differentiation still tend to rely on traditional bacteriological and serological approaches. In this study a 1.3 kb fragment of the rrs gene (16S rDNA) was sequenced from a panel of 22 control strains, representing serovars within the pathogenic species Leptospira interrogans, Leptospira borgpetersenii, and Leptospira kirschneri, to identify single nucleotide polymorphisms (SNPs). These were identified in the 5' variable region of the 16S sequence and a 181 bp PCR fragment encompassing this region was used for speciation by Denaturing High Performance Liquid Chromatography (D-HPLC). This method was applied to eleven additional species, representing pathogenic, non-pathogenic and intermediate species and was demonstrated to rapidly differentiate all but 2 of the non-pathogenic Leptospira species. The method was applied successfully to infected tissues from field samples proving its value for diagnosing leptospiral infections found in animals in the UK. Crown Copyright (C) 2010 Published by Elsevier Ltd. All rights reserved.