Production de vecteurs viraux efficaces pour la transduction de cellules transformées et de cellules primaires

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Production de vecteurs viraux efficaces pour la transduction de cellules transformées et de cellules primaires

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Sensibilité des cellules leucémiques aux immunoconjugués anti-CD33

La leucémie myéloïde aigue (LMA), cancer du sang causé par une prolifération excessive des précurseurs myéloïdes à un stade précoce de maturation, est associée à une survie variant entre 20 et 30% à cinq ans en dépit des traitements de chimiothérapie les plus intensifs. L’antigène CD33 est exprimé chez les cellules malignes dans 90% des LMA ce qui en fait une cible de choix pour le développement d’immunoconjugué (IC). Trois IC composés d’un anticorps monoclonal anti-CD33 couplé à la maytansine, une toxine s’attaquant aux fuseaux mitotiques, ont été créés. Nous avons étudié l’effet de ces IC sur des cellules primaires et des lignées cellulaires LMA et étudier les mécanismes pouvant expliquer différents niveaux de sensibilité. Les études effectuées ont permis de déterminer que le niveau d’expression du CD33 n’explique pas la variation de sensibilité face aux IC. Il a été démontré que les IC anti-CD33 sont internalisés rapidement par la cellule et que le conjugué est retrouvé au niveau de l’endosome en premier lieu. Il a été confirmé que le lysosome est essentiel à l’effet anti-mitotique induit par le conjugué. Aussi, il est proposé que la protéine SOCS3 pourrait jouer un rôle dans la résistance aux IC anti-CD33 en dirigeant le complexe IC-CD33-SOCS3 vers le protéasome et ainsi empêcher la libération du composé toxique par le lysosome. Nous avons aussi conclu que les variations d’agent de liaison et l’augmentation du nombre de molécules toxiques entre les 3 IC n’ont pas été suffisantes pour augmenter leur efficacité à éliminer les cellules LMA. L’évaluation de ces IC ainsi que l’identification des mécanismes de résistance permettra de cibler les patients les plus susceptibles de bénéficier de ce type de traitement et potentiellement d’identifier de nouvelles voies pour améliorer l’efficacité des traitements.

Development of Ewing's sarcoma from primary bone marrow-derived mesenchymal stem cells

SUMMARY : Ewing's sarcoma is a member of Ewing's family tumors (ESPY) and the second most common solid bone and soft tissue malignancy of children and young adults. It is associated in 85% of cases with the t(11;22)(q24:q12) chromosomal translocation that generates fusion of the 5' segment of the EWSR1 gene with the 3' segment of the ETS family gene FLI-1. The EWSR1-FLI-1 fusion protein behaves as an aberrant transcriptional activator and is believed to contribute to ESFT development. However, EWSR1-FLI-1 induces growth arrest and apoptosis in normal fibroblasts, and primary cells that are pemissive for its putative oncogenic properties have not been discovered, hampering basic understanding of ESFT biology. Here, we show that EWSR1-FLI-1 alone can transform mouse primary bone marrow-derived mesenchymal progenitor cells and generate tumors that display hallmarks of Ewing's sarcoma, including a small round cell phenotype, expression of ESFT-associated markers, insulin like growth factor-I dependence, and induction or repression of numerous EWSR1-FLI-1 target genes. Consistent with this finding, we tested the possibility that human mesenchymal stem cells (hMSC) might also provide a permissive cellular environment for EWSR1-FLI-1, and could represent the first adequate primary human cellular background for the oncogenic properties of the fusion protein. Indeed, expression of EWSR1-FLI-1 in human mesenchymal stem cells (hMSC) was not only stably maintained without inhibiting proliferation, but induced a gene expression profile bearing striking similarity to that of ESFT, including genes that are among the highest ESFT discriminators. Expression of EWSR1-FLI-1 in hMSCs may recapitulate the initial steps of Ewing's sarcoma development, allowing identification of genes that play an important role early in its pathogenesis. Among relevant candidate transcripts induced by EWSR1-FL/-1 in hMSC we found the polycomb group gene EZH2 which we show to play a critical role in Ewing's sarcoma growth. These observations provide the first identification of candidate primary cells from which ESFTs originate and suggest that EWSR1-FLI-1 expression may constitute the initiating event in ESFT pathogenesis. Le sarcome d' Ewing est un membre de la famille des tumeurs Ewing (ESFT) et représente la deuxième tumeur maligne solide de l'os et des tissus mous chez les enfants et les jeunes adultes. Cette tumeur est associée dans 85% des cas avec la translocation chromosomique t(11;22)(g24:g12), qui génère la fusion entre le segment 5' du gène EWSR1 avec le segment 3' du gène FLI-1, appartenant à la famille des facteurs de transcription ETS. La protéine de fusion EWSR1-FLI-1 qui en dérive joue le rSle d'un facteur de transcription aberrant, et est supposée contribuer de manière décisive au processus de développement des ESFTs. Néanmoins, l'expression de EWSR1-FLI-1 dans des fibroblastes normaux induit un arrêt de croissance et leur apoptose, et les cellules primaires permissives pour les propriétés oncogéniques attribuées à la translocation n'ont pas encore été identifiées, empêchant la compréhension de la biologie de base du sarcome d'Ewing. Dans ce travail on montre que l'expression de EWSR1-FLI-1 uniquement est capable de transformer des cellules souches mésenchymateuses dérivées de la moelle osseuse de la souris, pour générer des tumeurs qui présentent les caractéristiques du sarcome d' Ewing humain, et notamment une morphologie de petites cellules bleues et rondes, l'expression de marqueurs associés aux ESFTs, une dépendance du facteur de croissance IGF-1, et l'induction ou la répression de nombreux gènes cibles connus de EWSR1-FLI-1. Sur la base de ces observations, on a testé la possibilité que les cellules souches mésenchymateuses humaines (hMSCs) puissent aussi fournir un environnement cellulaire permissif pour EWSR1-FLI-1 ; et représenter le premier background cellulaire humain adéquat pour la manifestation du pouvoir oncogénique de la protéine de fusion. En effet, l'expression de EWSR1-FLI-1 dans des cellules souches mésenchymateuses humaines s'est révélée non seulement maintenue, mais elle a induit un profil d'expression génétique étonnamment similaire à celui des ESFTs humains, incluant les gènes qui ont été rapportés comme étant les plus discriminatifs pour ces tumeurs. L'expression de EWSR1-FLI-1 dans les hMSCs pourrait récapituler les étapes initiales du développement du sarcome d' Ewing, et de ce fait consentir à identifier les gènes qui jouent un rôle crucial dans sa pathogenèse précoce. Parmi les transcrits relevant indults par EWSR1-FL/-9 dans les hMSCs nous avons découvert le gène du groupe des polycomb EZH2, que nous avons par la suite démontré jouer un rôle essentiel dans la croissance du sarcome de Ewing. Ces observations apportent pour la première fois l'identification d'une cellule primaire candidate pour représenter la cellule d'origine des ESFTs, et en même temps suggèrent que l'expression de EWSR1-FLI-1 peut constituer l'événement initial dans la pathogenèse du sarcome d' Ewing.

Canine distemper virus : persistence and pathology in the central nervous system

Résumé : Le virus de la maladie de Carré (en anglais: canine distemper virus, CDV) qui est pathogène pour les chiens et autres carnivores, est très semblable au virus de la rougeole humaine (en anglais MV). Ces deux virus font partie du genre des Morbillivirus qui appartient à la famille des Paramyxoviridae. Ils induisent des complications dans le système nerveux central (SNC). Au stade précoce et aigu de l'infection du SNC, le CDV induit une démyélinisation (1). Ce stade évolue dans certains cas vers une infection chronique avec progression de la démyélinisation. Pendant le stade précoce, qui suit en général de trois semaines les premiers symptômes, le processus de démyélinisation est associé à la réplication du virus et n'est pas considéré comme inflammatoire (1). Par contre, au stade chronique, la progression des plaques de démyélinisation semble être plutôt liée à des processus immunogènes caractéristiques (2), retrouvés également dans la sclérose en plaques (SEP) chez les humains. Pour cette raison, le CDV est considéré comme un modèle pour la SEP humaine et aussi pour l'étude des maladies et complications induites par les Morbillivirus en général (3). Dans notre laboratoire, nous avons utilisé la souche A75/17-CDV, qui est considérée comme le modèle des souches neurovirulentes de CDV. Nous avons cherché en premier lieu à établir un système robuste pour infecter des cultures neuronales avec le CDV. Nous avons choisi les cultures primaires de l'hippocampe du nouveau-né de rat (4), que nous avons ensuite infecté avec une version modifiée du A75/17, appelée rgA75/17-V (5). Dans ces cultures, nous avons prouvé que le CDV infecte des neurones et des astrocytes. Malgré une infection qui se diffuse lentement entre les cellules, cette infection cause une mort massive aussi bien des neurones infectés que non infectés. En parallèle, les astrocytes perdent leur morphologie de type étoilé pour un type polygonal. Finalment, nous avons trouvé une augmentation importante de la concentration en glutamate dans le milieu de culture, qui laisse présumer une sécrétion de glutamate par les cultures infectées (6). Nous avons ensuite étudié le mécanisme des effets cytopathiques induits par le CDV. Nous avons d'abord démontré que les glycoprotéines de surface F et H du CDV s'accumulent massivement dans le réticulum endoplasmique (RE). Cette accumulation déclenche un stress du RE, qui est caractérisé par une forte expression du facteur de transcription proapoptotique CHOP/GADD 153 et de le la calreticuline (CRT). La CRT est une protéine chaperonne localisée dans le RE et impliquée dans l'homéostasie du calcium (Ca2+) et dans le repliement des protéines. En transfectant des cellules de Vero avec des plasmides codant pour plusieurs mutants de la glycoprotéine F de CDV, nous avons démontré une corrélation entre l'accumulation des protéines virales dans le RE et l'augmentation de l'expression de CRT, le stress du RE et la perte de l'homéostasie du Ca2+. Nous avons obtenu des résultats semblables avec des cultures de cellules primaires de cerveau de rat. Ces résultats suggèrent que la CRT joue un rôle crucial dans les phénomènes neurodégénératifs pendant l'infection du SNC, notamment par le relazgage du glutamate via le Ca2+. De manière intéressante, nous démontrons également que l'infection de CDV induit une fragmentation atypique de la CRT. Cette fragmentation induit une re-localisation et une exposition sélective de fragments amino-terminaux de la CRT, connus pour êtres fortement immunogènes à la surface des cellules infectées et non infectées. A partir de ce résultat et des résultats précédents, nous proposons le mécanisme suivant: après l'infection par le CDV, la rétention dans le RE des protéines F et H provoque un stress du RE et une perte de l'homéostasie du Ca2+. Ceci induit la libération du glutamate, qui cause une dégénération rapide du SNC (sur plusieurs jours ou semaines) correspondant à la phase aiguë de la maladie chez le chien. En revanche, les fragments amino-terminaux de la CRT libérés à la surface des cellules infectées peuvent avoir un rôle important dans l'établissement d'une démyélinisation d'origine immunogène, typique de la phase chronique de l'infection de CDV. Summary : The dog pathogen canine distemper virus (CDV), closely related to the human pathogen measles virus (MV), belongs to the Morbillivirus genus of the Paramyxoviridae family. Both CDV and NIV induce complications in the central nervous system (CNS). In the acute early stage of the infection in CNS, the CDV infection induces demyelination. This stage is sometimes followed by a late persistent stage of infection with a progression of the demyelinating lesions (1). The acute early stage occurs around three weeks after the infection and demyelinating processes are associated with active virus replication and are not associated to inflammation (1). In contrast during late persistent stage, the demyelination plaque progression seems to be mainly due to an immunopathological process (2), which characteristics are shared in many aspects with the human disease multiple sclerosis (MS). For these reasons, CDV is considered as a model for human multiple sclerosis, as well as for the study of Morbillivirus-mediated pathogenesis (3). In our laboratory, we used the A75/17-CDV strain that is considered to be the prototype of neurovirulent CDV strain. We first sought to establish a well characterized and robust model for CDV infection of a neuronal culture. We chose primary cultures from newborn rat hippocampes (4) that we infected with a modified version of A75/17, called rgA75/17-V (5). In these cultures, we showed that CDV infects both neurons and astrocytes. While the infection spreads only slowly to neighbouring cells, it causes a massive death of neurons, which includes also non-infected neurons. In parallel, astrocytes undergo morphological changes from the stellate type to the polygonal type. The pharmacological blocking of the glutamate receptors revealed an implication of glutamatergic signalling in the virus-mediated cytopathic effect. Finally, we found a drastic increase concentration of glutamate in the culture medium, suggesting that glutamate was released from the cultured cells (6). We further studied the mechanism of the CDV-induced cytopathic effects. We first demonstrated that the CDV surface glycoprotein F and H markedly accumulate in the endoplasmic reticulum (ER). This accumulation triggers an ER stress, which is characterized by increased expression of the proapoptotic transcription factor CHOP/GADD 153 and calreticulin (CRT). CRT is an ER resident chaperon involved in the Ca2+ homeostasis and in the response to misfolded proteins. Transfections of Vero cells with plasmids encoding various CDV glycoprotein mutants reveal a correlation between accumulation of viral proteins in the ER, CRT overexpression, ER stress and alteration of ER Ca2+ homeostasis. Importantly, similar results are also obtained in primary cell cultures from rat brain. These results suggest that CRT plays a crucial role in CNS infection, particularly due to CRT involvement in Ca2+ mediated glutamate releases, and subsequent neurodegenerative disorders. Very intriguingly, we also demonstrated that CDV infection induces an atypical CRT fragmentation, with relocalisation and selective exposure of the highly immunogenic CRT N-terminal fragments at the surface of infected and neighbouring non-infected cells. Altogether our results combined with previous findings suggest the following scenario. After CDV infection, F and H retention alter Ca2+ homeostasis, and induce glutamate release, which in turn causes rapid CNS degeneration (within days or a week) corresponding to the acute phase of the disease in dogs. In contrast, the CRT N-terminal fragments released at the surface of infected cells may rather have an important role in the establishment of the autoimmune demyelination in the late stage of CDV infection.

Ewing sarcoma cancer stem cells : from mechanisms to therapeutic targeting

Le sarcome d'Ewing (SE) est la 2ème tumeur des os la plus fréquente chez les enfants, et le pronostic est sombre au stade métastatique. La pathogenèse du SE repose sur une translocation, provocant la fusion du domaine activateur du facteur de transcription EWS, avec la partie liant l'ADN de la protéine FLI-1. Les cellules souches cancéreuses (CSC) sont supposées être les moteurs de la croissance tumorale, et représente de ce fait des cibles thérapeutiques préférentielles. Dans ce travail nous nous sommes efforcés de comprendre, ainsi que de cibler les mécanismes liés à l'émergence des CSC dans le sarcome d'Ewing. La formation des CSC du ES est liée à un défaut de maturation des miRNAs provoqué par une sous-expression d'un gène, TARBP2, dans les CSC. Ce défaut de maturation peut être corrigé par un traitement des cellules avec de l'enoxacine, une fluoroquinolone utilisée pour traiter les infections urinaires. L'enoxacine seule n'étant pas suffisante pour éradiquer les tumeurs in vivo, nous avons testé la combinaison d'une thérapie ciblée sur les CSC avec une chimiothérapie classique, la doxorubicine, ciblant les cellules différentiées. In vitro l'enoxacine induit l'apoptose dans les CCS sans affecter les cellules différentiées, alors que à l'inverse, la doxorubicine n'affecte que les cellules de la « masse » tumorale. In vivo la combinaison de ces deux drogues inhibe la croissance de tumeurs provenant de cellules primaires xenotranplantées et éradique les CSCs. Nos résultats mettent en lumière une nouvelle approche thérapeutique directement applicable pour le sarcome d'Ewing, et pourraient ainsi rapidement déboucher sur des essais cliniques. Dans la deuxième partie de ce travail nous avons essayé de comprendre comment EWS-FLI1, la protéine de fusion issue de la translocation chromosomique du sarcome d'Ewing conduit à la génération des CSC. Pour cela nous avons effectué des ChIPseq (immunoprecipitation de la chromatine suivi de séquençage) pour EWS-FLI1 ainsi que pour certaines modifications histoniques. -- Ewing sarcoma family tumors (ESFT) are the second most frequent bone tumors in children and have a high rate of recurrence when metastatic at presentation. The pathogenesis of Ewing sarcoma is underlayed by a translocation, leading to the fusion of the trans-activating domain of EWS with the FLU DNA binding domain. Cancer stem cells (CSCs) are thought to be the driving force of tumor growth. In this work we focused on understanding the mechanisms underlying ESFT CSC emergence as well as defining targeted therapeutic strategies. Emergence of CSCs in ESFT has been shown to arise from a defect in TARBP2-dependent microRNA maturation, which can be corrected by exposure to the fluoroquinolone enoxacin. As enoxacin alone is not sufficient to reverse tumor growth in vivo, we assessed the effect of combining a drug that abrogates CSC properties with doxorubicin, a standard-of-care therapy in ESFT. Primary ESFT CSCs and bulk tumor cells were treated with different concentration of drugs and displayed divergent responses to doxorubicin and enoxacin. Doxorubicin, which targets the tumor bulk, displayed toxicity toward primary adherent ESFT cells in culture but not to CSC-enriched ESFT spheres. Conversely, enoxacin induced apoptosis but only in ESFT spheres and specifically on the CD133+ population. In combination, the two drugs markedly depleted CSC and strongly reduced primary growth in xenograft assays of two primary ESFT. Our results identify a potentially attractive therapeutic strategy for ESFT that combines mechanism-based targeting of CSC using a low toxicity antibiotic with a standard-of-care cytotoxic drug, offering immediate applications for clinical evaluation. In the second part of this work we performed chromatin immunopercipitation on CSCs and bulk cells for EWS-FLI1 binding as well as some chromatin modifications, and concluded that EWS-FLI1 shows cell context dependent binding.

Identification of novel HIV restriction factors

To efficiently replicate within mammalian cells, viruses have to manoeuvre through complex host mechanisms, hijacking a network of host proteins to achieve successful propagation. To prevent this invasion, cells have evolved over time to efficiently block the incursing pathogen by direct or indirect targeting. Human immunodeficiency virus (HIV) is a retrovirus of major global public health issue. In the last decade, extensive focus on innate immune proteins has been given, and particularly restriction factors, proteins inhibiting HIV replication by affecting various stages of the viral cycle. Because of the importance of developing new HIV therapies that are associated with reduced side effects and resistances, there is an urge to understand the antiviral response against HIV. Using common features of known restriction factors as a signature to identify new anti-HIV factors, candidates were identified. Particularly multiple members of the apolipoproteins L (APOL) family were found. Cotransfection experiments confirmed very potent inhibitory effects on HIV-1 expression. Further characterization of APOL6, the best candidate, was carried out. APOL6 was not able to inhibit HIV specifically but rather inhibited any gene-encoded DNA that was cotransfected and therefore APOL6 does not classify as a bona fide restriction factor. In addition, we were able to map the activity of APOL6 to the MAD domain and mainly to residue 174. We also found that other members of the family identified in the screen, APOL1 and 3, could have similar mechanism of action as APOL6. Finally, although the complete mechanism of action of APOL6 has yet to be elucidated, it might be blocked during transfections, potentially improving transfection of primary cells. -- Pour se répliquer efficacement dans les cellules de mammifères, les virus doivent manoeuvrer à travers des mécanismes cellulaires complexes et détourner un réseau de protéines de l'hôte. Pour empêcher cette invasion, les gènes de l'hôte ont évolué dans le temps pour cibler efficacement, directement ou indirectement, l'agent pathogène. Le virus de l'immunodéficience humaine (VIH) est un rétrovirus de problème majeur de santé publique mondiale, mais le faible risque de transmission du virus pourrait être expliqué par la présence d'un système antiviral de l'hôte qui, en cas d'échec, conduit à une infection productive. Durant la dernière décennie, il y a eu un intérêt spécial porté sur les protéines immunitaires innées appelé facteurs de restriction présentant des effets inhibiteurs puissants sur la réplication du VIH en affectant différentes étapes du cycle viral. En raison de l'importance de la recherche de nouvelles thérapies anti-VIH associées à des effets secondaires et des résistances réduites comparé aux traitements actuels, il existe un besoin de comprendre la réponse antivirale innée contre le VIH. Basé sur des caractéristiques communes des facteurs de restriction connus, nous avons proposé d'identifier de nouveaux facteurs anti-VIH. Nous avons trouvé une famille de protéines, les apolipoprotéines L (APOL) montrant les effets inhibiteurs très puissants contre l'expression du VIH-1 dans des expériences de co-transfection. Nous avons décidé d'approfondir le rôle de ces protéines dans l'immunité innée et de se concentrer sur le meilleur candidat APOL6. Nous avons en outre établi qu'APOL6 n'a pas d'activité anti-virale spécifique et donc pas classé comme un facteur de bonne foi de restriction. Par ailleurs, APOL6 est capable d'inhiber fortement l'expression de tout Plasmide cotransfecté. En outre, nous avons été en mesure de cartographier l'activité d'APOL6 au domaine MAD et principalement au résidu 174. Nous avons également constaté que d'autres membres de la famille identifiés dans l'étude, APOL1 et 3, pourraient avoir le même mécanisme d'action qu'APOL6. Enfin, bien que le mécanisme d'action complet d'APOL6 reste à être élucidé, il pourrait être d'une importance biotechnologique car il pourrait potentiellement faciliter la transfection de cellules primaires après l'inhibition d'APOL6.

The role of the microRNAs in the age-associated oancreatic β-cell dysfunction

Le corps humain emploie le glucose comme source principale d'énergie. L'insuline, sécrétée par les cellules ß-pancreatiques situées dans les îlots de Langerhans, est l'hormone principale assurant un maintien constant du taux de glucose sanguin (glycémie). Les prédispositions génétiques, le manque d'activité physique et un régime déséquilibré peuvent entraîner une perte de sensibilité à l'insuline et des taux de glucose dans le sang élevé (hyperglycémie), une condition nommée diabète de type 2. Cette maladie est initiée par une sensibilité diminuée à l'insuline dans les tissus périphériques, entraînant une demande accrue en insuline. Cette pression continue finie par épuiser les cellules ß-pancreatiques, qui sécrètent alors des niveaux d'insuline insuffisant en trainant l'apparition du diabète. Le vieillissement est un facteur de risque important pour les maladies métaboliques dont le diabète de type 2 faits partis. En effet la majeure partie des diabétiques de type 2 ont plus de 45 ans. Il est connu que le vieillissement entraine une perte de sensibilité à l'insuline, une sécrétion altérée d'insuline, une baisse de réplication et une plus grande mort des ß-cellules pancréatiques. Le but de ma thèse était de mieux comprendre les mécanismes contribuante au dysfonctionnement des cellules ß- pancréatiques lors du vieillissement. Les travaux du « Human Genome Project » ont révélés que seulement 2% de notre génome code pour des protéines. Le reste non-codant fut alors désigné sous le nom de « ADN déchets ». Cependant, l'étude approfondie de cet ADN non-codant ces dernières deux décennies a démontré qu'une grande partie code pour des «MicroARNs », des ARNs courts (20-22 nucleotides) découverts en 1997 chez le vers C.elegans. Depuis lors ces molécules ont été intensivement étudiées, révélant un rôle crucial de ces molécules dans la fonction et la survie des cellules en conditions normales et pathologiques. Le but de cette thèse était d'étudier le rôle des microARNs dans le dysfonctionnement des cellules ß lors du vieillissement. Nos données suggèrent qu'ils peuvent jouer un rôle tantôt salutaire, tantôt nocif sur les cellules ß. Par exemple, certains microARNs réduisent la capacité des cellules ß à se multiplier ou réduisent leur survie, alors que d'autres protègent ces cellules contre la mort. Pour conclure, nous avons démontré les microARNs jouent un rôle important dans le dysfonctionnement des cellules ß lors du vieillissement. Ces nouvelles découvertes préparent le terrain pour la conception de futures stratégies visant à améliorer la résistance des cellules ß pancréatiques afin de trouver de nouveaux traitements du diabète de type 2. -- Le diabète de type 2 est une maladie métabolique due à la résistance à l'action de l'insuline des tissus cibles combinée à l'incapacité des cellules ß pancréatiques à sécréter les niveaux adéquats d'insuline. Le vieillissement est associé à un déclin global des fonctions de l'organisme incluant une diminution de la fonction et du renouvellement des cellules ß pancréatiques. Il constitue ainsi un risque majeur de développement des maladies métaboliques dont le diabète de type 2. Le but de cette thèse était d'étudier le rôle des microARNs (une classe d'ARN non- codants) dans le dysfonctionnement lié au vieillissement des cellules ß. L'analyse par microarray des niveaux d'expression des microARN dans les îlots pancréatiques de rats Wistar mâles âgés de 3 et 12 mois nous a permis d'identifier de nombreux changements d'expression de microARNs associés au vieillissement. Afin d'étudier les liens entre ces modifications et le déclin des cellules ß, les changements observés lors du vieillissement ont été reproduits spécifiquement dans une lignée cellulaire, dans des cellules ß primaires de jeune rats ou de donneurs humains sains. La diminution du miR-181a réduit la prolifération des cellules ß, tandis que la diminution du miR-130b ou l'augmentation du miR-383 protège contre l'apoptose induite par les cytokines. L'augmentation du miR-34a induit l'apoptose et inhibe la prolifération des cellules ß en réponse aux hormones Exendin-4 et prolactine et au facteur de croissance PDGF-AA. Cette perte de capacité réplicative est similaire à celle observée dans des cellules ß de rats âgés de 12 mois. Dans la littérature, la perte du récepteur au PDGF-r-a est associée à la diminution de la capacité proliférative des cellules ß observée lors du vieillissement. Nous avons pu démontrer que PDGF-r-a est une cible directe de miR- 34a, suggérant que l'effet néfaste de miR-34a sur la prolifération des cellules ß est, du moins en partie, lié à l'inhibition de l'expression de PDGF-r-a. L'expression de ce miR est aussi plus élevée dans le foie et le cerveau des animaux de 1 an et augmente avec l'âge dans les ilôts de donneurs non-diabétiques. Ces résultats suggèrent que miR-34a pourrait être non seulement impliqué dans l'affaiblissement des fonctions pancréatiques associé à l'âge, mais également jouer un rôle dans les tissus cibles de l'insuline et ainsi contribuer au vieillissement de l'organisme en général. Pour conclure, les travaux obtenus durant cette thèse suggèrent que des microARNs sont impliqués dans le dysfonctionnement des cellules ß pancréatiques durant le vieillissement. -- Type 2 diabetes is a metabolic disease characterized by impaired glucose tolerance, of the insulin sensitive tissues and insufficient insulin secretion from the pancreatic ß-cells to sustain the organism demand. Aging is a risk factor for the majority of the metabolic diseases including type 2 diabetes. With aging is observed a decline in all body function, due to decrease both in cell efficiency and renewal. The aim of this thesis was to investigate the potential role of microRNAs (short non- coding RNAs) in the pancreatic ß-cell dysfunction associated with aging. Microarray analysis of microRNA expression profile in pancreatic islets from 3 and 12 month old Wistar male rats revealed important changes in several microRNAs. To further study the link between those alterations and the decline of ß-cells, the changes observed in old rats were mimicked in immortalized ß-cell lines, primary young rat and human islets. Downregulation of miR-181a inhibited pancreatic ß-cell proliferation in response to proliferative drugs, whereas downregulation of miR-130b and upregulation of miR-383 protected pancreatic ß-cells from cytokine stimulated apoptosis. Interestingly, miR-34a augmented pancreatic ß-cell apoptosis and inhibited ß-cell proliferation in response to the proliferative chemicals Exendin-4, prolactin and PDGF-AA. This loss of replicative capacity is reminiscent of what we observed in pancreatic ß-cells isolated from 12 month old rats. We further observed a correlation between the inhibitory effect of miR-34a on pancreatic ß-cell proliferation and its direct interfering effect of this microRNA on PDGF-r-a, which was previously reported to be involved in the age-associated decline of pancreatic ß-cell proliferation. Interestingly miR-34a was upregulated in the liver and brain of 1 year old animals and positively correlated with age in pancreatic islets of normoglycemic human donors. These results suggest that miR-34a might be not only involved in the age-associated impairment of the pancreatic ß-cell functions, but also play a role in insulin target tissues and contribute to the aging phenotype on the organism level. To conclude, we have demonstrated that microRNAs are indeed involved in the age-associated pancreatic ß-cell dysfunction and they can play both beneficial and harmful roles in the context of pancreatic ß-cell aging.

Étude de Necdin par un modèle de carcinogénèse lié à l’antigène grand T du Virus du polyome

Les virus sont utilisés depuis longtemps dans la recherche sur le cancer et ont grandement contribué à l’avancement des connaissances de même qu’à l’établissement de préceptes importants encore valables aujourd’hui dans le domaine. L’un des défis actuels est de mieux définir les étapes menant à la transition d’une cellule normale à une cellule transformée et c’est sur cette problématique que nous nous sommes penchés. Pour ce faire, nous avons tiré profit de l’utilisation de l’antigène grand-T du virus de polyome (PyLT), un virus capable d’induire des tumeurs chez les rongeurs. Cet oncogène viral à lui seul possède des propriétés intéressantes qui suggèrent que, en plus de l’immortalisation, il peut également contribuer aux événements précoces de la carcinogénèse. Ceci repose principalement sur la capacité de PyLT à induire des tumeurs en souris transgéniques et ce, avec une certaine latence ce qui suggère que des événements supplémentaires sont nécessaires. Ainsi, l’utilisation de PyLT dans un modèle de culture cellulaire permet de disséquer les changements qui lui sont attribuables. Dans un premier temps, l’établissement du profil d'expression génique associé à l'expression de PyLT dans un modèle murin nous a permis de sélectionner un bon nombre de gènes, parmi lesquels figurait Necdin. Nous avons choisi d’étudier Necdin plus en détail puisque peu d’attention était accordée à cette protéine dans le domaine du cancer, malgré que différentes données de la littérature lui suggèrent à la fois des fonctions suppresseurs de tumeur et oncogéniques. Nous avons démontré que, malgré sa fonction proposée de suppresseur de croissance, l’expression de Necdin n’est pas incompatible avec la prolifération dans la lignée cellulaire de souris NIH 3T3 et les cellules primaires humaines (IMR90), bien que l’inhibition de son expression par shARN confère un avantage prolifératif. Nous avons confirmé que Necdin est un gène cible de p53 induit par différents agents génotoxiques, toutefois son expression peut également être régulée de façon p53-indépendante. De plus, Necdin agit négativement sur l’arrêt du cycle cellulaire en réponse à l’activation de p53. Ceci suggère que Necdin est impliqué dans une boucle de régulation négative de la voie de p53 et que l’augmentation anormale de l’expression de Necdin pourrait contribuer à la perturbation la voie du suppresseur de tumeur p53. L’activation de p53 permet l’arrêt transitoire du cycle cellulaire en condition de stress, mais est aussi impliquée dans l’établissement d’un arrêt permanent nommé sénescence. La sénescence est un mécanisme de protection contre l’accumulation de mutations qui peut contribuer à l’initiation du cancer. Vu l’intéressante implication de Necdin dans la régulation de l’activité de p53, nous avons transposé les connaissances acquises du modèle murin à un modèle humain, plus adapté pour l’étude de la sénescence. La caractérisation de l’expression de Necdin dans des fibroblastes primaires humains à différents passages montre que les jeunes cellules en prolifération active expriment Necdin et que son niveau diminue avec l’établissement de la sénescence réplicative. Le même phénomène est observé lors de la sénescence prématurée provoquée par l’expression d’un oncogène et par l’exposition aux radiations ionisantes. De plus, dans des conditions normales de prolifération, la modulation de Necdin par des essais de gain et de perte de fonction n’affecte pas la durée de vie des cellules primaires. Toutefois, en condition de stress génotoxique dû à l’exposition aux irradiations, les cellules surexprimant Necdin présentent une radiorésistance accrue de la même façon que lorsque p53 est inactivé directement. Ce résultat en cellules humaines vient appuyer l’effet observé dans les cellules de souris sur l’impact qu’aura le niveau de Necdin sur la réponse de p53 en condition de stress. Un bref survol a été fait pour aborder de quelle façon nos résultats en culture cellulaire pouvaient se traduire dans des modèles de cancer chez l’humain. Nous avons caractérisé l’expression de Necdin dans deux types différents de cancer. D’abord, dans le cancer de l’ovaire, le niveau élevé de Necdin dans les tumeurs à faible potentiel de malignité (LMP) en comparaison aux cancers agressifs de l’ovaire de type séreux suggère que l’expression de Necdin se limite aux cellules de cancer LMP, qui présente généralement un p53 de type sauvage. Son expression est aussi retrouvée dans deux lignées cellulaires du cancer de l’ovaire non-tumorigéniques en xénogreffe de souris, dont l’une possède un p53 fonctionnel. De plus, la caractérisation de Necdin dans les lignées cellulaires du cancer de la prostate suggère une relation entre son expression et la présence de p53 fonctionnel. Dans le cancer de la prostate, tout comme pour le cancer de l’ovaire, Necdin semble être présent dans les lignées représentant un stade moins avancé de la maladie. L’utilisation de l’oncoprotéine virale PyLT nous a permis de révéler des propriétés intéressantes de Necdin. Nous proposons que dans certains contextes, l’expression constitutive de Necdin pourrait contribuer au cancer en retardant une réponse par p53 appropriée et possiblement en participant à l’augmentation de l’instabilité génomique. La fonction potentiellement oncogénique de Necdin quant à sa relation avec p53 que nous avons révélée requiert davantage d’investigation et les cancers caractérisés ici pourraient constituer de bons modèles à cette fin.

Caractérisation moléculaire d’un récent modèle d’étude de la leucémie myéloïde aigüe à caryotype normal :la lignée cellulaire CG-SH

La leucémie myéloïde aigüe (LMA) est la forme de leucémie la plus fréquente chez l’adulte au Canada. Bien que de nombreux réarrangements chromosomiques récurrents aient été identifiés chez les patients LMA, près de la moitié des cas présentent un caryotype normal (LMA-CN). L’étude de la LMA-CN in vitro est rendue difficile par le fait que la survie des cellules primaires de patients est défectueuse sur le long terme et que les lignées cellulaires leucémiques ont un caryotype hautement anormal. En 2009, Munker et son équipe ont établi une nouvelle lignée cellulaire, CG-SH, ayant la particularité d’avoir un caryotype normal. L’objectif principal de ce projet d’étude est de caractériser plus en détail ce nouveau modèle d’étude. Nous avons identifié l’ensemble des variants génétiques présents dans CG-SH grâce au séquençage du génome entier. Les variants susceptibles de participer à la leucémogénèse ont été isolés, tels que des insertions détectées dans EZH2 et GATA2, et de nombreux variants faux-sens détectés dans des gènes pertinents pour la LMA. Nous avons montré que les cellules CG-SH sont sensibles à l’effet prolifératif d’une combinaison de cytokines, qui agissent sur le comportement des cellules en modifiant l’expression des gènes associés à la régulation de la prolifération, de l’apoptose et de la différentiation. De plus, les cytokines diminuent le taux de nécrose des cellules en culture sur le court terme. La présente étude a permis d’approfondir notre connaissance sur les caractéristiques moléculaires de la lignée cellulaire CG-SH, un nouveau modèle d’étude in vitro de la LMA-CN.

Étude de la voie HOX-Flt3 dans les leucémies de type pré-B induites par E2A-Pbx1

Introduction: Notre laboratoire a précédemment établi que Hoxa9 accélérait l’apparition de leucémie de type B induite par E2A-PBX1. Une analyse par qRT-PCR a montré que les niveaux d’ARN de Flt3, une cible de Hoxa9, étaient 32 fois plus élevés dans les leucémies Hoxa9/E2A-PBX1 par rapport que dans les leucémies E2A-PBX1. Il est important de noter que l’expression aberrante de Flt3 est retrouvée dans les leucémies ALL de type B et les AML. De plus, l’activation constitutive de Flt3 est associée à un faible pronostic. Nous avons posé l’hypothèse que la maintenance/ré-initiation des leucémies de type pré-B induites par E2A-Pbx1 est associée à la présence du récepteur Flt3. Méthodes et Résultats: Premièrement, nous avons analysé par FACS la présence de Flt3 et mesuré l’expression de Flt3 par qRT-PCR des cellules E2A-PBX1 leucémiques pré-B. Nous avons montré que les cellules leucémiques E2A-PBX1 expriment l’ARNm du gène Flt3. Cependant, le récepteur n’était détectable à la surface cellulaire que dans des proportions variant de 0.3 à 28%. Deuxièmement, nous avons évalué le potentiel leucémique des fractions positive et négative pour Flt3. Toutes deux ont été capables de ré-initier la leucémie environ 20 jours après transplantation. Des analyses par FACS ont montré qu’une proportion de cellules leucémiques exprimaient Flt3, incluant même celles provenant de la fraction Flt3-. Troisièmement, une stratégie de perte de fonction de Flt3 par shARN a été mise en œuvre afin d’examiner le rôle de la voie de signalisation de Flt3 dans les cellules leucémiques E2A-PBX1. Pour ce faire, des cellules primaires leucémiques ont été infectées, soit par le shARN anti-Flt3 soit shARN contrôle, et transplantées dans des souris receveuses. Les cellules leucémiques contenant le shARN ont été capables de régénérer la leucémie. Cependant, une proportion des cellules exprimaient toujours Flt3, ce qui indique que l’efficacité des shARn n’était pas suffisante. Conclusion et Perspectives: Nos shARN ne sont pas suffisamment efficaces sur les cellules leucémiques choisies. De ce fait, nous proposons d’utiliser des cellules leucémiques moins agressives tout en réalisant le même set-up expérimental. Des transplantations dans des receveurs KO Flt3-/- seraient également requises afin de réellement étudier l’impact de la voie de signalisation Flt3 dans la ré-initiation leucémique.

Rôle de l’enzyme PAS kinase dans la régulation du facteur de transcription PDX-1 dans la cellule bêta pancréatique.

Le diabète de type 2 (DT2) se caractérise par une production insuffisante d'insuline par le pancréas ainsi qu'une résistance des tissus périphériques à l'action de l'insuline. Dans les cellules bêta pancréatiques, le glucose stimule la production de l'insuline en induisant la transcription de son gène et la traduction ainsi que la sécrétion de sa protéine. Paradoxalement, une exposition prolongée et simultanée de ces cellules à de hautes concentrations de glucose en présence d'acides gras conduit à la détérioration de la fonction bêta pancréatique et au développement du DT2. Toutefois, les mécanismes moléculaires responsables de ces effets du glucose ne sont que partiellement connus. L'objectif du travail décrit dans cette thèse est d'identifier les mécanismes responsables de la régulation de la transcription du gène de l'insuline. PDX-1 (de l’anglais pour pancreatic and duodenal homeobox 1) est un facteur de transcription majeur et essentiel tant pour le développement du pancréas que pour le maintien de sa fonction à l'état adulte. En réponse au glucose, PDX-1 se lie au promoteur du gène de l'insuline et induit sa transcription. Ceci est inhibé par l'acide gras palmitate. Dans la première partie des travaux effectués dans le cadre de cette thèse, nous avons identifié deux mécanismes de régulation de la transcription du gène de l'insuline: le premier via ERK1/2 (de l'anglais pour extracellular-signal-regulated protein kinases 1 and 2) et le second par l’enzyme PASK (pour per-arnt-sim kinase). Nous avons également mis en évidence l'existence d'un troisième mécanisme impliquant l'inhibition de l'expression du facteur de transcription MafA par le palmitate. Nos travaux indiquent que la contribution de la signalisation via PASK est majeure. L'expression de PASK est augmentée par le glucose et inhibée par le palmitate. Sa surexpression dans les cellules MIN6 et les îlots isolés de rats, mime les effets du glucose sur l'expression du gène de l'insuline ainsi que sur l'expression de PDX-1 et prévient les effets délétères du palmitate. Dans la deuxième partie de la thèse, nous avons identifié un nouveau mécanisme par lequel PASK augmente la stabilité protéique de PDX-1, soit via la phosphorylation et l'inactivation de la protéine kinase GSK3 bêta (de l'anglais pour glycogen synthase kinase 3 beta). Le glucose induit la translocation de PDX-1 du cytoplasme vers le noyau, ce qui est essentiel à sa liaison au promoteur de ses gènes cibles. L'exclusion nucléaire de PDX-1 a été observée dans plusieurs modèles ex vivo et in vivo de dysfonction de la cellule bêta pancréatique. Dans le dernier volet de cette thèse, nous avons démontré l'importance de l'utilisation de cellules primaires (îlots isolés et dispersés) pour étudier la translocation nucléaire de PDX-1 endogène étant donné que ce mode de régulation est absent dans les lignées insulino-sécrétrices MIN6 et HIT-T15. Ces études nous ont permis d'identifier et de mieux comprendre les mécanismes régulant la transcription du gène de l'insuline via le facteur de transcription PDX-1. Les cibles moléculaires ainsi identifiées pourraient contribuer au développement de nouvelles approches thérapeutiques pour le traitement du diabète de type 2. Mots-clés : Diabète, îlots de Langerhans, cellule bêta pancréatique, gène de l'insuline, PDX-1, PASK, GSK3 bêta, ERK1/2, PKB, glucose, palmitate.

Étude du rôle de nef dans l'altération de la transduction du signal chez les souris transgéniques CD4C/HIV NEF

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Étude du rôle de nef dans l'altération de la transduction du signal chez les souris transgéniques CD4C/HIV���

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.