Disfunção miocárdica e alterações no trânsito de cálcio intracelular em ratos obesos

FUNDAMENTO: Vários mecanismos têm sido propostos contribuir para a disfunção cardíaca em modelos de obesidade, tais como alterações nas proteínas do trânsito de cálcio (Ca+2) e nos receptores beta-adrenérgicos. Todavia, o papel desses fatores no desenvolvimento da disfunção miocárdica induzida pela obesidade ainda não está claro. OBJETIVO: Este estudo pretende investigar se a obesidade induzida por um ciclo de dieta hipercalóricas resulta em disfunção cardíaca. Além disso, foi avaliado se essa alteração funcional em ratos obesos está relacionada com o prejuízo do trânsito de Ca+2 e do sistema beta-adrenérgico. MÉTODOS: Ratos Wistar machos, 30 dias de idade, foram alimentados com ração padrão (C) e um ciclo de cinco dietas hipercalóricas (Ob) por 15 semanas. A obesidade foi definida pelo aumento da porcentagem de gordura corporal dos ratos. A função cardíaca foi avaliada mediante análise isolada do músculo papilar do ventrículo esquerdo em condições basais e após manobras inotrópicas e lusitrópicas. RESULTADOS: Em comparação com o grupo controle, os ratos obesos apresentaram aumento da gordura corporal e intolerância a glicose. Os músculos dos ratos obesos desenvolveram valores basais semelhantes; entretanto, as respostas miocárdicas ao potencial pós-pausa e aumento de Ca+2 extracelular foram comprometidas. Não houve alterações na função cardíaca entre os grupos após a estimulação beta-adrenérgica. CONCLUSÃO: A obesidade promove disfunção cardíaca relacionada com alterações no trânsito de Ca+2 intracelular. Esse prejuízo funcional é provavelmente ocasionado pela redução da atividade da bomba de Ca+2 do retículo sarcoplasmático (SERCA2a) via Ca+2 calmodulina-quinase.

Disfunção miocárdica e alterações no trânsito de cálcio intracelular em ratos obesos

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Disfunção miocárdica e alterações no trânsito de cálcio intracelular em ratos obesos

Abstract Background: Several mechanisms have been proposed to contribute to cardiac dysfunction in obesity models, such as alterations in calcium (Ca2+) handling proteins and β-adrenergic receptors. Nevertheless, the role of these factors in the development of myocardial dysfunction induced by obesity is still not clear. Objective: The purpose of this study was to investigate whether obesity induced by hypercaloric diets results in cardiac dysfunction. Furthermore, it was evaluated whether this functional abnormality in obese rats is related to abnormal Ca2+ handling and the β-adrenoceptor system. Methods: Male 30-day-old Wistar rats were fed with standard food (C) and a cycle of five hypercaloric diets (Ob) for 15 weeks. Obesity was defined as increases in body fat percentage in rats. Cardiac function was evaluated by isolated analysis of the left ventricle papillary muscle under basal conditions and after inotropic and lusitropic maneuvers. Results: Compared with the control group, the obese rats had increased body fat and glucose intolerance. The muscles of obese rats developed similar baseline data, but the myocardial responsiveness to post-rest contraction stimulus and increased extracellular Ca2+ were compromised. There were no changes in cardiac function between groups after β-adrenergic stimulation. Conclusion: Obesity promotes cardiac dysfunction related to changes in intracellular Ca2+ handling. This functional damage is probably caused by reduced cardiac sarcoplasmic reticulum Ca2+ ATPase (SERCA2) activation via Ca2+ calmodulin kinase. (Arq Bras Cardiol 2011; 97(3) : 232-240).

Influência da obesidade sobre a expressão gênica das proteínas reguladoras do trânsito de cálcio miocárdico

Pós-graduação em Fisiopatologia em Clínica Médica - FMB

Modulação da diferenciação neural de células troco embrionárias por transientes de cálcio intracelulares: papéis dos receptores purinérgicos e de canais de cálcio voltagem-dependentes

Receptores purinérgicos e canais de cálcio voltagem-dependentes estão envolvidos em diversos processos biológicos como na gastrulação, durante o desenvolvimento embrionário, e na diferenciação neural. Quando ativados, canais de cálcio voltagem-dependentes e receptores purinérgicos do tipo P2, ativados por nucleotídeos, desencadeiam transientes de cálcio intracelulares controlando diversos processos biológicos. Neste trabalho, nós estudamos a participação de canais de cálcio voltagem-dependentes e receptores do tipo P2 na geração de transientes de cálcio espontâneos e sua regulação na expressão de fatores de transcrição relacionados com a neurogênese utilizando como modelo células tronco (CTE) induzidas à diferenciação em células tronco neurais (NSC) com ácido retinóico. Descrevemos que CTE indiferenciadas podem ter a proliferação acelerada pela ativação de receptores P2X7, enquanto que a expressão e a atividade desse receptor precisam ser inibidas para o progresso da diferenciação em neuroblasto. Além disso, ao longo da diferenciação neural, por análise em tempo real dos níveis de cálcio intracelular livre identificamos 3 padrões de oscilações espontâneas de cálcio (onda, pico e unique), e mostramos que ondas e picos tiveram a frequência e amplitude aumentadas conforme o andamento da diferenciação. Células tratadas com o inibidor do receptor de inositol 1,4,5-trifosfato (IP3R), Xestospongin C, apresentaram picos mas não ondas, indicando que ondas dependem exclusivamente de cálcio oriundo do retículo endoplasmático pela ativação de IP3R. NSC de telencéfalo de embrião de camundongos transgênicos ou pré-diferenciadas de CTE tratadas com Bz-ATP, o agonista do receptor P2X7, e com 2SUTP, agonista de P2Y2 e P2Y4, aumentaram a frequência e a amplitude das oscilações espontâneas de cálcio do tipo pico. Dados, obtidos por microscopia de luminescência, da expressão em tempo real de gene repórter luciferase fusionado à Mash1 e Ngn2 revelou que a ativação dos receptores P2Y2/P2Y4 aumentou a expressão estável de Mash1 enquanto que ativação do receptor P2X7 levou ao aumento de Ngn2. Além disso, células na presença do quelante de cálcio extracelular (EGTA) ou do depletor dos estoques intracelulares de cálcio do retículo endoplasmático (thapsigargin) apresentaram redução na expressão de Mash1 e Ngn2, indicando que ambos são regulados pela sinalização de cálcio. A investigação dos canais de cálcio voltagem-dependentes demonstrou que o influxo de cálcio gerado por despolarização da membrana de NSC diferenciadas de CTE é decorrente da ativação de canais de cálcio voltagem-dependentes do tipo L. Além disso, esse influxo pode controlar o destino celular por estabilizar expressão de Mash1 e induzir a diferenciação neuronal por fosforilação e translocação do fator de transcrição CREB. Esses dados sugerem que os receptores P2X7, P2Y2, P2Y4 e canais de cálcio voltagem-dependentes do tipo L podem modular as oscilações espontâneas de cálcio durante a diferenciação neural e consequentemente alteram o padrão de expressão de Mash1 e Ngn2 favorecendo a decisão do destino celular neuronal.

Remodelamento miocárdico após grandes infartos converte potenciação pós-pausa em decaimento da força em ratos

FUNDAMENTO: A Contração Pós-Repouso (CPR) do músculo cardíaco fornece informações indiretas sobre a manipulação de cálcio intracelular. OBJETIVO: Nosso objetivo foi estudar o comportamento da CPR e seus mecanismos subjacentes em camundongos com infarto do miocárdio. MÉTODOS: Seis semanas após a oclusão coronariana, a contratilidade dos Músculos Papilares (MP) obtidos a partir de camundongos submetidos à cirurgia sham (C, n = 17), com infarto moderado (MMI, n = 10) e grande infarto (LMI, n = 14), foi avaliada após intervalos de repouso de 10 a 60 segundos antes e depois da incubação com cloreto de lítio (Li+) em substituição ao cloreto de sódio ou rianodina (Ry). A expressão proteica de SR Ca(2+)-ATPase (SERCA2), trocador Na+/Ca2+ (NCX), fosfolambam (PLB) e fosfo-Ser (16)-PLB foi analisada por Western blotting. RESULTADOS: Os camundongos MMI apresentaram potenciação de CPR reduzida em comparação aos camundongos C. Em oposição à potenciação normal para camundongos C, foram observadas degradações de força pós-repouso nos músculos de camundongos LMI. Além disso, a Ry bloqueou a degradação ou potenciação de PRC observada em camundongos LMI e C; o Li+ inibiu o NCX e converteu a degradação em potenciação de CPR em camundongos LMI. Embora os camundongos MMI e LMI tenham apresentado diminuição no SERCA2 (72 ± 7% e 47 ± 9% de camundongos controle, respectivamente) e expressão protéica de fosfo-Ser16-PLB (75 ± 5% e 46 ± 11%, respectivamente), a superexpressão do NCX (175 ± 20%) só foi observada nos músculos de camundongos LMI. CONCLUSÃO: Nossos resultados mostraram, pela primeira vez, que a remodelação miocárdica pós-IAM em camundongos pode mudar a potenciação regular para degradação pós-repouso, afetando as proteínas de manipulação de Ca(2+) em miócitos.

Efeito do levosimendan em pacientes com insuficiência cardíaca sistólica severa e agravamento da função renal

FUNDAMENTO: O levosimendan, um sensibilizador de cálcio, aumenta a sensibilidade do coração para o cálcio, aumentando assim a contratilidade miocárdica, sem aumento do cálcio intracelular. Recentemente foi demonstrado que o levosimendan era benéfico na melhoria da função renal. No entanto, fica por determinar que o efeito benéfico esteja relacionado em forma diferencial ao status renal durante o evento-índice. OBJETIVO: O objetivo do presente estudo foi determinar se o levosimendan pode melhorar o resultado renal em pacientes com insuficiência cardíaca aguda descompensada com e sem agravamento da função renal. MÉTODOS: Quarenta e cinco pacientes consecutivos que tiveram uma taxa de filtração glomerular reduzida e pelo menos dois dados consecutivos quanto à função renal, antes da administração de levosimendan, foram incluídos no estudo. Os pacientes foram classificados em dois grupos, com e sem agravamento da função renal com base no aumento da creatinina sérica > 0,3 mg/dL. RESULTADOS: Uma melhoria significativa foi observada na função renal em pacientes com agravamento da função renal (creatinina sérica de 1,4 ± 0,16 a 1,21 ± 0,23 mg/dL, p = 0,001 e taxa de filtração glomerular de 48,9 ± 15 a 59,3 ± 21,8 mL/min/m², p = 0,011), apesar de que não houve melhoria significativa em aqueles sem agravamento da função renal (creatinina sérica de 1,29 ± 0,33 a 1,37 ± 0,66 mg/dL, p = 0,240 e taxa de filtração glomerular de 53,7 ± 17,6 a 52,9 ± 21,4 mL/min/m², p = 0,850). CONCLUSÃO: O levosimendan parece proporcionar um efeito de realce renal em pacientes com severa insuficiência cardíaca sistólica descompensada aguda e agravamento da função renal. Considerar esse efeito diferencial poderia contribuir a obter resultados renais benéficos. (Arq Bras Cardiol. 2012; [online].ahead print, PP.0-0)

Efeito da terapia diurética na capacidade de exercício em pacientes com angina estável e função ventricular esquerda preservada

As alternativas terapêuticas, atualmente oferecidas para o tratamento da cardiopatia isquêmica, concentram-se na abordagem das propriedades da vasculatura coronariana e seus elementos circulatórios. Dentre essas, incluem-se drogas que inibem o desenvolvimento da aterosclerose, estabilizam as lesões pré-existentes, drogas que reduzem a trombose intracoronaria, diminuem o consumo de oxigênio pelo miocárdio e intervenções que restabelecem o fluxo coronariano. No entanto, esse arsenal terapêutico se torna deficiente, em relação aos agentes cardioprotetores diretos, que têm como alvo o metabolismo das células miocárdicas. Novas terapias têm sido propostas, para diminuir a repercussão celular da isquemia, protegendo as células miocárdica das conseqüências prejudiciais do fenômeno da reperfusão, ou lesão de reperfusão, desencadeada principalmente pela ativação da glicoproteina trocadora de Na+/H+ (NHE). Essa glicoproteína tem como principal função manter a estabilidade do pH das células miocárdicas durante a isquemia, podendo de forma paradoxal precipitar necrose celular durante a reperfusão, através do acúmulo de cálcio intracelular. Dos agentes cardioprotetores com capacidade de inibir a NHE, a amilorida foi a primeira droga que mostrou essa propriedade. Recentemente, outras mais potentes surgiram, como cariporide, eniporide e zoniporide, atualmente sendo avaliadas através de ensaios clínicos. Nesta revisão, analisaremos os mecanismos envolvidos na lesão de reperfusão a nível celular e a participação da inibição NHE na proteção miocárdica. Também, revisaremos os principais estudos clínicos envolvendo os inibidores da NHE-1 e sua aplicabilidade potencial.

Parâmetros bioquímicos de alterações do citoesqueleto no modelo experimental da doença do Xarope do Bordo

A Doença do Xarope do Bordo (DXB) é um erro inato do metabolismo causado pela deficiência na atividade do complexo desidrogenase dos cetoácidos de cadeia ramificada, levando ao acúmulo de concentrações milimolares dos seguintes α-cetoácidos de cadeia ramificada (CACR): ácidos α-cetoisocapróico (CIC), α-ceto-β-metilvalérico (CMV), α-cetoisovalérico (CIV) e dos seus aminoácidos precursores, leucina, isoleucina e valina em tecidos de pacientes afetados. Essa doença é caracterizada por severos sintomas neurológicos que incluem edema e atrofia cerebral, entretanto, os mecanismos envolvidos na neuropatologia da DXB ainda não são bem estabelecidos. Neste trabalho utilizamos um modelo experimental de DXB com o objetivo de verificar os efeitos dos CACR que se acumulam nessa desordem neurodegenerativa sobre o citoesqueleto de células neurais de ratos. Nesse modelo fatias de córtex cerebral de ratos de diferentes idades, ou culturas de células neurais foram incubados com concentrações variando de 0,1 a 10 mM de cada metabólito. Inicialmente demonstramos que o CIC, CMV e CIV inibiram a captação de glutamato em fatias de córtex cerebral de ratos durante o desenvolvimento. O CIC inibiu a captação de glutamato em ratos de 9, 21 e 60 dias de idade, enquanto o CMV e o CIV inibiram a captação de glutamato em animais de 21 e 60 dias. Observamos que o CIC alterou a fosforilação de proteínas do citoesqueleto de um modo dependente do desenvolvimento através de receptores glutamatérgicos ionotrópicos em fatias de córtex cerebral de ratos. O metabólito causou diminuição da fosforilação dos filamentos intermediários (FI) em ratos de 9 dias de idade e aumento dessa fosforilação em animais de 21 dias de vida. Também demonstramos que em animais de 9 dias de idade o efeito do CIC foi mediado pelas proteínas fosfatases PP2A e principalmente pela PP2B, uma proteína fosfatase dependente de cálcio, enquanto que em animais de 21 dias de idade o efeito deste metabólito foi mediado pela proteína quinase dependente de AMP cíclico (PKA) e pela proteína quinase dependente de cálcio e calmodulina (PKCaMII). Além disso, verificamos que o CIC promoveu um aumento nos níveis intracelulares dos segundos mensageiros AMPc e Ca2+. O aumento do Ca2+ intracelular provocado pelo CIC foi demonstrado pelo uso de bloqueadores específicos de canais de cálcio dependentes de voltagem tipo L, por exemplo, nifedipina, canais de cálcio dependentes de ligantes, por exemplo, NMDA e de quelantes de cálcio intracelular, por exemplo, BAPTA-AM. Por outro lado, o CMV aumentou a fosforilação de FI somente em ratos de 12 dias de idade, sendo esse efeito mediado por receptores GABAérgicos do tipo A e B, desencadeando a ativação das proteínas quinases PKA e PKCaMII. É importante salientar que o CIV não alterou a atividade do sistema fosforilante em nenhuma das idades estudadas. Além dos efeitos causados pelos CACR que se acumulam na DXB sobre a atividade do sistema fosforilante associado aos FI em fatias de córtex cerebral de ratos, demonstramos que esses metabólitos foram capazes de alterar a fosforilação da proteína glial fibrilar ácida (GFAP) na linhagem de glioma C6. Essa alteração de fosforilação causou uma reorganização do citoesqueleto de GFAP e um aumento no imunoconteúdo da GFAP na fração citoesquelética. Também verificamos que o CIC, o CMV e o CIV, em concentrações encontradas em pacientes portadores de DXB, levaram a uma reorganização dos filamentos de GFAP e do citoesqueleto de actina de astrócitos em cultura, causando uma importante alteração na morfologia destas células. As alterações do citoesqueleto levaram a morte celular progressiva quando os astrócitos foram expostos por várias horas aos metabólitos. Demonstramos também que os efeitos dos CACR sobre a morfologia dos astrócitos foram desencadeados por mecanismos de membrana que diminuíram a atividade da Rho GTPase. Esse mecanismo foi evidenciado utilizando-se ácido lisofosfatídico (LPA), um ativador específico da RhoA, o qual preveniu os efeitos causados pelos CACR em culturas de astrócitos. É importante salientar que as alterações morfológicas e a morte celular induzida pelos CACR em culturas de astrócitos foram totalmente evitadas com a suplementação de creatina às culturas. Também verificamos que a atividade da creatina quinase foi inibida pelos metabólitos, indicando que a homeostase energética provavelmente estaria envolvida nos efeitos causados pelos CACR. XI Sabe-se que as alterações do citoesqueleto estão relacionadas com inúmeras doenças neurodegenerativas. Portanto, é provável que as alterações causadas pelos CACR nos mecanismos de membrana que regulam níveis de segundos mensageiros intracelulares e cascatas de sinalização celular, na perda do equilíbrio fisiológico do sistema fosforilante associado ao citoesqueleto e conseqüentemente na sua reorganização, possam ter importantes conseqüências para a função neural. Com base nos presentes resultados demonstramos que os CACR que se acumulam na DXB levam à desorganização do citoesqueleto em um modelo experimental podendo ser uma contribuição importante para o estudo da patogênese do sistema nervoso central característica dos pacientes portadores de DXB.

Efeito da apocinina na hipertensão, disfunção endotelial e hipertrofia ventricular esquerda em Ratos Espontaneamente Hipertensos (SHR)

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Obesity does not lead to imbalance between myocardial phospholamban phosphorylation and dephosphorylation

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Remodelamento miocárdico após grandes infartos converte potenciação pós-pausa em decaimento da força em ratos

FUNDAMENTO: A Contração Pós-Repouso (CPR) do músculo cardíaco fornece informações indiretas sobre a manipulação de cálcio intracelular. OBJETIVO: Nosso objetivo foi estudar o comportamento da CPR e seus mecanismos subjacentes em camundongos com infarto do miocárdio. MÉTODOS: Seis semanas após a oclusão coronariana, a contratilidade dos Músculos Papilares (MP) obtidos a partir de camundongos submetidos à cirurgia sham (C, n = 17), com infarto moderado (MMI, n = 10) e grande infarto (LMI, n = 14), foi avaliada após intervalos de repouso de 10 a 60 segundos antes e depois da incubação com cloreto de lítio (Li+) em substituição ao cloreto de sódio ou rianodina (Ry). A expressão proteica de SR Ca(2+)-ATPase (SERCA2), trocador Na+/Ca2+ (NCX), fosfolambam (PLB) e fosfo-Ser (16)-PLB foi analisada por Western blotting. RESULTADOS: Os camundongos MMI apresentaram potenciação de CPR reduzida em comparação aos camundongos C. Em oposição à potenciação normal para camundongos C, foram observadas degradações de força pós-repouso nos músculos de camundongos LMI. Além disso, a Ry bloqueou a degradação ou potenciação de PRC observada em camundongos LMI e C; o Li+ inibiu o NCX e converteu a degradação em potenciação de CPR em camundongos LMI. Embora os camundongos MMI e LMI tenham apresentado diminuição no SERCA2 (72 ± 7% e 47 ± 9% de camundongos controle, respectivamente) e expressão protéica de fosfo-Ser16-PLB (75 ± 5% e 46 ± 11%, respectivamente), a superexpressão do NCX (175 ± 20%) só foi observada nos músculos de camundongos LMI. CONCLUSÃO: Nossos resultados mostraram, pela primeira vez, que a remodelação miocárdica pós-IAM em camundongos pode mudar a potenciação regular para degradação pós-repouso, afetando as proteínas de manipulação de Ca(2+) em miócitos.

A regulação endócrina dos balanços de cálcio

RESUMO: As concentrações circulantes de cálcio são notavelmente constantes a despeito das variações diárias na absorção intestinal e na eliminação renal deste elemento. A regulação da calcémia é um sistema complexo que compreende vários factores controladores (a calcémia, a fosforémia, as concentrações circulantes de paratormona (PTH) e calcitriol além de muitos outros factores como hormonas esteróides em geral, outros iões como o magnésio e outros factores hormonais) e vários órgãos alvo (glândulas paratiroideias, osso, rim e intestino). As respostas dos órgãos alvo também são muito variadas. No caso mais simples, a cristalização de sais de cálcio corresponde a uma mudança de fase em que participam moléculas orgânicas que a iniciam, aceleram ou inibem. Em geral a combinação de um factor controlador com o respectivo receptor de membrana (para polipeptídeos ou iões) ou intracelular (hormonas esteróides) é apenas o primeiro passo de uma cadeia bioquímica que introduz uma enorme amplificação na resposta. A esta variedade de mecanismos de resposta correspondem grandes diferenças nos tempos de resposta que podem ser de minutos a semanas. É hoje possível “observar” (medir) com apreciável rigor nos líquidos biológicos (sangue, urina, fezes, etc.) os factores mais importantes do sistema de regulação da calcémia (cálcio, fósforo, paratormona e calcitriol) assim como administrar estes factores em experiências agudas. Esta possibilidade reflecte – se na literatura neste campo que tem vindo a crescer. O advento das técnicas da biologia molecular tem permitido a caracterização molecular de algumas das disfunções da homeostase do cálcio e é de esperar um diagnóstico fisiopatológico cada vez mais rigoroso dessas disfunções. Com o avanço dos conhecimentos nesta área que não cessa de aumentar temos cada vez maiores capacidades para fazer diagnósticos e é cada vez mais difícil interpretar com rigor os correspondentes quadros metabólicos. A análise ou síntese de sistemas complexos é a actividade mais nobre dos engenheiros que lhes permite desenhar pontes, diques, barcos, aviões ou automóveis. Com o aparecimento de computadores de médio ou grande porte foi – lhes possível utilizar descrições matemáticas não só para desenhar sistemas como ainda para interpretar eventuais falhas na sua operação. Essas descrições matemáticas consistem numa sequência de operações realizadas num computador segundo um “programa informático” que receberam a designação genérica de modelos, por analogia com as famosas leis (equações) da física que foram deduzidas a partir de um certo número de postulados e que permitem representar matematicamente processos físicos. As famosas leis de Newton são talvez os exemplos mais famosos de “modelos” de sistemas físicos. A introdução de modelos matemáticos em biologia e particularmente em medicina só se deu recentemente.MÉTODOS No trabalho que aqui se apresenta construiu - se um modelo simplificado da homeostase do cálcio destinado ao cálculo de variáveis observáveis (concentrações de cálcio, fósforo, PTH e calcitriol) de modo a poderem comparar-se valores calculados com valores observados. A escolha dos componentes do modelo foi determinada pela nossa experiência clínica e pela informação fisiopatológica e clínica publicada. Houve a preocupação de construir o modelo de forma modular de modo a ser possível a sua expansão sem grandes transformações na descrição matemática (e informática) já existente. Na sua fase actual o modelo não pode ser usado como instrumento de diagnóstico. É antes uma ferramenta destinada a esclarecer “em princípio” mecanismos fisiopatológicos. Usou – se o modelo para simular um certo número de observações publicadas e para exemplificar a sua eventual aplicação clínica na simulação de situações hipotéticas e na análise de possíveis mecanismos fisiopatológicos responsáveis por situações de hipo ou hipercalcémias. Simultaneamente fez – se uma análise dos dados acumulados relativos a doentes vistos no Serviço de Endocrinologia do Instituto Português de Oncologia de Francisco Gentil – Centro Regional Oncológico de Lisboa, S.A. CONCLUSÕES Numa população de 894 doentes com patologias variadas do Instituto Português de Oncologia de Lisboa os valores da calcémia tiveram uma distribuição normal unimodal com uma média de 9.56 mg/dl, e um erro padrão de 0.41 mg/dl. Estas observações sugerem que a calcémia está sujeita a regulação. A partir dos resultados publicados em que o metabolismo do cálcio foi perturbado por infusões de cálcio, calcitriol ou PTH, de estudos bioquímicos e fisiológicos sobre os mecanismos de acção de factores controladores da calcémia e do estudo do comportamento de órgãos alvo (paratiroideias, intestino, osso e rim) foi possível construir um modelo matemático de parâmetros concentrados do sistema de regulação da calcémia. As expressões analíticas usadas foram baseadas na cinética enzimática de modo a que os seus parâmetros tivessem um significado físico ou fisiológico simples. O modelo revelou apreciável robustez e flexibilidade. É estável quando não perturbado e transita entre estados estacionários quando perturbado. Na sua forma actual gera simulações que reproduzem satisfatoriamente um número apreciável de dados experimentais colhidos em doentes. Isto não significa que possa ser usado como instrumento de diagnóstico aplicável a doentes individuais. O desenho do modelo comporta a adição posterior de novas relações quando surgirem situações para as quais se revele insuficiente. A utilização exaustiva do modelo permitiu explicitar aspectos do metabolismo do cálcio que ou não estão contidas na sua formulação actual – o aparecimento de hipertrofia ou de adenomas das paratiroideias e as alterações na estrutura óssea , a participação de outros factores controladores – magnésio, ou estão insuficientemente descritas – alterações do metabolismo do fósforo nos hipoparatiroidismos. A análise dos dados relativos aos doentes do Serviço de Endocrinologia do IPO permitiu o início da caracterização dos tipos de patologia que representam e de possíveis mecanismos fisiopatológicos subjacentes. Estas observações são o ponto de partida para análises futuras. São exemplos das relações encontradas: a distribuição dos doentes por dois grandes grupos conforme a calcémia é determinada pelas concentrações circulantes de PTH ou estas são determinadas pela calcémia; a distribuição sazonal das concentrações de Vit. D25. no sangue; a correlação negativa entre estas e as concentrações de PTH no sangue. Também foi possível extrair a cinética do controlo da PTH sobre a síntese de calcitriol. O estudo dos níveis circulantes de PTH no pós-operatório imediato de doentes paratiroidectomizados permitiu determinar as suas taxas de degradação metabólica. O modelo permitiu simular as relações Ca/PTH no sangue, Ca/Fracção excretada da carga tubular, Ca/P no sangue para valores normais ou altos de Ca. Foram feitas simulações de situações fisiopatológicas (em “doentes virtuais”): infusões crónicas de cálcio, PTH e calcitriol; alterações no comportamento de receptores. Estas simulações correspondem a experiências que não podem ser realizadas em humanos. São exemplos da utilização do modelo na exploração de possíveis mecanismos fisiopatológicos através da observação de resultados quantitativos inacessíveis à intuição. O modelo foi útil em duas fases do trabalho: Primeiro, durante a sua síntese implicou uma escolha criticamente selectiva de informação, sua análise quantitativa e processamento, uma explicitação rigorosa (analítica) das relações funcionais entre os controladores e as variáveis e da sua integração numa estrutura global; Segundo, a simulação de situações experimentais ou clínicas (dados do Serviço de Endocrinologia do IPO) em doentes obrigou a explicitar raciocínios fisiopatológicos habitualmente formulados em bases puramente intuitivas. Esta prática revelou comportamentos óbvios após as simulações – acção reduzida das infusões PTH (simulação de hiperparatiroidismos primários) enquanto não há inibição total da respectiva secreção, necessidade de aumento da massa secretora da paratiroideia nas insuficiências renais avançadas, etc. A síntese e utilização do modelo não implicaram uma preparação matemática avançada e foram possíveis mercê da disponibilidade de “software” interactivo especificamente desenhado para a simulação de sistemas dinâmicos em que os programas se escrevem em inglês usando a simbologia simples da álgebra elementar. A função nobre de modelos desta natureza é semelhante à dos modelos usados pelos físicos desde o século XVII: permitir explicações de carácter geral funcionando como uma ferramenta intelectual para manipulação de conceitos e para a realização de “experiências pensadas” (“thought experiments”) respeitando certos princípios físicos (princípios de conservação) que estabelecem as fronteiras da realidade. -------ABSTRACT: Calcium blood levels are remarkably constant despite great variations in calcium daily intake, intestinal absorption and renal excretion. The regulation of the calcium concentration in the blood is achieved by a complex system that includes several controller factors (mainly the serum levels of calcium, phosphorus, parathyroid hormone (PTH) and calcitriol but also of steroid hormones, ions such as magnesium and other hormonal factors) and several target organs (parathyroid glands, bone, kidney and intestine). The functional response to the controlling factors obeys a variety of kinetics. The precipitation of calcium salts is a simple phase transition in which organic molecules may provide nucleation centres or inhibit the process. The combination of a controller factor with its receptor located in the cell membrane (for peptides or ions) or in the nucleus (for steroid hormones) is only the first step of a biochemical chain that introduces a huge amplification in the response. To this great variability of response we have to add the times of response that vary from minutes to weeks. It is possible to “observe” (measure) with great accuracy in biological fluids (blood, urine, faeces, etc.) the most important factors intervening in the calcium regulation (calcium, phosphorus, PTH and calcitriol). The response of the system to acute infusions of the controlling factors has also been studied. Using molecular biology techniques it has been possible to characterize some calcium homeostasis dysfunctions and better physiopathological diagnosis are expected. With the increasingly new knowledge in this area we have better capacity to diagnose but it is harder to explain correctly the underlying metabolic mechanisms. The analysis or synthesis of complex systems is the noble activity of engineers that enables them to draw bridges, dams, boats, airplanes or cars. With the availability of medium-large frame computers it was possible to use mathematical descriptions not only to draw systems but also to explain flaws in its operations. These mathematical descriptions are generally known as models by analogy with the laws (equations) of physics that allow the mathematical description of physical processes. In practice it is not possible to find general solutions for the mathematical descriptions of complex systems but (numeric) computations for specific situations can be obtained with digital computers. The introduction of mathematical models in biology and particularly in medicine is a recent event. METHODS In this thesis a simplified model of calcium homeostasis was built that enables the computation of observable variables (concentrations of calcium, phosphorus, PTH and calcitriol) and allows the comparison between the simulation values and observed values. The choice of the model’s components was made according to our clinical experience and to the published clinical and physiopathological data. The model has a modular design that allows future expansions with minor alterations in its structure. In its present form the model cannot be used for diagnosis. It is a tool designed to enlighten physiopathological processes. To exemplify its possible clinical application in the simulation of hypothetical situations and in the analysis of possible mechanisms responsible for hypo or hypercalcemias the model was used to simulate a certain number of published observations. An analysis of clinical and laboratory data from the Endocrinology Department of the Portuguese Cancer Institute (I.P.O.F.G.-C.R.O.L.,S.A.) is also presented. CONCLUSIONS In a population of 188 patients without an identifiable disease of the calcium metabolism at the Portuguese Cancer Institute the calcemia levels had a unimodal distribution with an average of 9.56 mg/dL and a S.E.M of 0.41 mg/dL. This observation confirms that serum calcium is regulated. Using published data; in which calcium metabolism was disrupted by calcium, PTH or calcitriol infusions; from biochemical and physiological studies of the action of controller factors on the calcemia; in which the response of target organs (parathyroid glands, intestine, bone, kidney) was studied it was possible to build a mathematical model of concentrated parameters of the calcium homeostasis. Analytical expressions used were based on enzymatic kinetics. The model is flexible and robust. It is stable when not disturbed and changes between steady states when disturbed. In its present form it provides simulations that reproduce closely a number of experimental clinical data. This does not mean that it can be used as a diagnostic tool for individual patients. The exhaustive utilisation of the model revealed the need of future expansions to include aspects of the calcium metabolism not included in its present form –hypertrophy or adenomas of the parathyroid glands, bone structure changes, participation of other controller factors such as magnesium – or insufficiently described – phosphate metabolism in hypoparathyroidism. The analysis of the data collected from the I.P.O.’s Endocrinology Department allowed the initial characterization of the different pathologies represented and of their possible physiopathological mechanisms. These observations are a starting point for future analysis. As examples of the relations found were: the distribution of patients in two groups according to the dependency of calcium by PTH levels or PTH levels by calcium concentration; the seasonal distribution of the serum concentrations of D25; its negative correlation with PTH concentration. It was also possible to extract the kinetics of the control of the synthesis of calcitriol by PTH. The analysis of immediate post-surgical levels of PTH in parathyroidectomized patients allowed the determination of its metabolic clearance. The model also allowed the simulation of the relations between Ca/PTH in blood, serum Ca/Fraction of tubular load excreted and Ca/P in blood for normal and high values of calcium. Simulations were made of pathological situations (in “virtual patients”): chronic infusions of calcium, PTH and calcitriol; changes in the characteristics of receptors. These simulations are not possible in real persons. They are an example of the use of this model in exploring possible mechanisms of disease through the observation of quantitative results not accessible to simple intuition. This model was useful in two phases: Firstly, its construction required a careful choice of data, its quantitative analysis and processing, an analytical description of the relations between controller factors and variables and their integration in a global structure. Secondly, the simulation of experimental or clinical (I.P.O.’s Endocrinology Department) data implied testing physiopathological explanations that previously were based on intuition. The construction and utilisation of the model didn’t demand an advanced mathematical preparation since user-friendly interactive software was used. This software was specifically designed for the simulation of dynamic systems. The programs are written in English using elementary algebra symbols. The essential function of this type of models is identical to that of those used by physicists since the XVII century which describe quantitatively natural processes and are an intellectual tool for the manipulation of concepts and the performance of “thought experiments” based in certain physical principles (conservation principles) that are the frontiers of reality.------------------RESUMÉE: Les concentrations circulantes de calcium sont constantes même pendant des variations de l’absorption intestinale et de l’élimination rénale de cet élément. La régulation de la calcémie est un système complexe qui comprend plusieurs éléments contrôleurs (la calcémie, la phosphorémie, les concentrations circulantes de l’hormone parathyroïdienne (PTH) e du calcitriol et d’autres comme les hormones stéroïdes ou des ions comme le magnésium) et plusieurs organes (glandes parathyroïdiennes, l’os, le rein et l’intestin). Les réponses de ces organes sont variées. Dans le cas plus simple, la cristallisation des sels de calcium correspond à un changement de phase dans lequel y participent des molécules organiques que la débutent, l’accélèrent ou l’inhibent. Généralement la combinaison d’un élément contrôleur avec leur récepteur de membrane (pour les peptides ou les ions) ou intracellulaire (pour les hormones stéroïdes) n’est que le premier pas d’une chaîne biochimique qu’introduit une grande amplification de la réponse. A cette variété de réponses correspondent des grandes différences des temps de réponses qu’y vont des minuits a semaines. Il est possible « observer » (mesurer) dans les fluides biologiques (sang, urine, fèces, etc.) les éléments plus importants du système de régulation de la calcémie (calcium, phosphate, PTH et le calcitriol) et les administrer en expérimentes aigus. Cette possibilité est visible dans la littérature publiée dans ce domaine qui est en croissance permanente. L’avenir des techniques de biologie moléculaire a permis caractériser des nombreuses dysfonctions de la régulation de la calcémie et on attend un diagnostique physiopathologique de ces dysfonctions chaque fois plus rigoureuses. Les connaissances dans ce domaine s’agrandissent et on a de plus de capacités pour faire des diagnostiques et il est chaque fois plus difficile les interpréter. L’analyse ou synthèse de systèmes complexes est l’activité plus noble des ingénieurs qui les permit dessiner des ponts, bateaux, avions ou automobiles. Avec des ordinateurs de médium ou grand port il les est possible utiliser descriptions mathématiques pour dessiner les systèmes et interpréter des éventuelles fautes d’opération. Ces descriptions mathématiques sont une séquence d’opérations réalisées dans un ordinateur selon « un programme informatique » qui ont reçu la désignation générique de modèles, pour analogie avec les équations de la physique qui ont été déduits d’un nombre de postulées et qu’ont permit représenter des processus physiques en équations mathématiques. Les fameuses équations de Newton sont peut-être les exemples plus connus des systèmes physiques. L’introduction des modèles mathématiques en biologie et en particulier en médecine est un évènement récent. Dans ce travaille, on a construit un modèle simplifié de l’homéostasie du calcium pour calculer les variables observables (concentrations de calcium, phosphate, PTH et calcitriol) pour les comparer. Les choix des components a été déterminés par notre expérience clinique et par l’information physiopathologique et clinique publiée. Le modèle a été construit de façon modulaire ce que permit leur postérieur expansion sans des grandes altérations dans la description mathématique et informatique déjà existante. Dans cette forme le modèle ne peut être utilisé comme un instrument de diagnostique. Il est un outil pour éclairer la physiopathologie. Le modèle a été utilisé pour simuler un certain nombre d’observations publiées et pour exemplifier leur possible utilisation clinique dans la simulation des hypothèses et de la physiopathologie des situations d’hypo ou hypercalcémie. On a fait une analyse des éléments des procès cliniques des malades observées dans le Service d’Endocrinologie de l’IPOFG-CROL, SA. Dans une population de 894 malades avec des différentes pathologies les valeurs de calcémie on une distribution uni modale avec une Médie de 9.56 mg/dL et une erreur standard de 0.41 mg/dL. Ces observations suggèrent que la calcémie soit sujette de régulation. En utilisant des résultats de travaux publiés dans lesquels le métabolisme du calcium a été changé par des infusions de calcium, calcitriol ou PTH, des études biochimiques et physiologiques sur des mécanismes d’action des éléments contrôleurs de la calcémie et de l’étude du comportement des organes cible (parathyroïdes, intestin, rein, os), il a été possible de construire un modèle mathématique de paramètres concentrés du système de régulation de la calcémie. Les expressions analytiques utilisées ont été basées sur la cinétique enzymatique de façon à que les paramètres aient eu une signification physique ou biologique. Le modèle est stable quand il n’est pas perturbé et transit entre états stationnaires quand il est sujet a des perturbations. A ce moment il fait des simulations qui reproduisent de façon satisfaisant un nombre d’observations expérimentales. La construction du modèle permit l’addiction de nouvelles relations dans les cas ou il est insuffisant. L’utilisation exhaustive du modèle a permit expliciter des aspects du métabolisme du calcium qui y ne sont pas compris – l’hyperplasie ou la formation des adénomes des parathyroïdes, les altérations de la structure des os, la participation d’outres éléments régulateurs (magnésium), ou sont insuffisamment décrites – les altérations du métabolisme des phosphates dans l’hypoparathyroidism. L’analyse de l’information des malades du Service d’Endocrinologie a permit caractériser les pathologies représentées et leurs possibles mécanismes physiopathologiques. Ces observations sont le point de départ pour les analyses futures. Sont des exemples des relations trouvées: la distribution des malades par deux groupes: ceux dans lequel la calcémie est déterminée par la PTH ou ceux dans lesquels la PTH est déterminée par la calcémie; la distribution sazonale de la concentration de la vitamine D; la corrélation négative entre la vitamine D et la PTH. On a eu la possibilité de déduire la cinétique de control de la PTH sur la synthèse du calcitriol. L’étude des niveaux circulants de PTH sur des sujets parathyroidectomisées a permit déduire leur taux de dégradation métabolique. Le modèle a permit simuler les relations Ca/PTH dans le sang, Ca/fraction éliminée par le rein, Ca/P dans le sang pour des valeurs normales ou hautes de calcium. On a fait des simulations de situations physiopathologiques (dans “malades virtuelles”): Infusions chroniques de calcium, PTH ou calcitriol; altérations des récepteurs. Ces simulations ne peuvent pas être réalisées dans les humains. Sont des exemples d’utilisation du modèle dans l’exploration des possibles mécanismes de la physiopathologie en observant des résultats quantitatifs inaccessibles à l’intuition. Le modèle a été utile pendant deux étapes des travaux: La première, dans sa construction on a choisi l’information disponible, son analyse quantitative, l’explicitation rigoureuse (analytique) des relations fonctionnelles entre les contrôleurs et les variables et sa intégration dans une structure globale. La deuxième, la simulation de situations expérimentales ou cliniques (du Service d’Endocrinologie) a obligé d’expliciter des raisonnements physiopathologiques généralement formulés utilisant l’intuition. Cette pratique a montré des comportements – action réduite des infusions de PTH (jusqu’à l’inhibition totale de leur respective sécrétion), nécessité d’augmenter la masse sécréteuse de la parathyroïde dans les insuffisants rénales, etc. La synthèse et utilisation du modèle n’ont pas besoin d’une formation avancée en mathématique et sont possibles grâce à un programme interactif qui a été conçu pour la simulation des systèmes dynamiques dans lesquels le programme se construit en anglais en utilisant la symbolique élémentaire de l’algèbre. La fonction noble de ces modèles est semblable à celles des physiques du XVII siècle: Permettre établir explications générales en fonctionnant comme un outil intellectuel pour manipuler des concepts et pour la réalisation d’expérimentes pensées en respectant certains principes de la physique (principe de la conservation) qu’établissent les frontières de la réalité.

Papel das reservas intracelulares de cálcio no efeito de aminoácidos excitatórios sobre a fosforilação da proteína ácida fibrilar glial (GFAP) em hipocampo de ratos jovens

A proteína ácida fibrilar glial (GFAP) é uma proteína da classe dos filamentos intermediários, exclusivamente expressa em astrócitos no sistema nervoso central (SNC). A função específica da fosforilação desta proteína é ainda desconhecida. No entanto, tem sido demonstrado que o equilíbrio dinâmico entre o estado fosforilado e desfosforilado de sítios específicos da GFAP pode regular a polimerização e despolimerização dos filamentos intermediários durante eventos de estruturação do citoesqueleto glial. Nosso grupo de pesquisa demonstrou que a fosforilação da GFAP em hipocampo de ratos jovens (P12-P16) é estimulada no mesmo nível por glutamato, via um receptor glutamatérgico metabotrópico do grupo II (mGluR II), e pela ausência de Ca2+ externo (presença de EGTA). Entretanto, o tratamento simultâneo com glutamato e EGTA não resulta em efeito sinergístico, sugerindo um mesmo mecanismo de ação para estas duas situações estimulatórias da fosforilação da GFAP (WofchuK & Rodnight, 1994; Kommers et al., 1999; Rodnight et al., 1997). Este mecanismo provavelmente não envolve reservas intracelulares de Ca2+ associadas a receptores de IP3, uma vez que mGluRs II estão envolvidos com o mecanismo de transdução de sinal via adenilato ciclase e não via hidrólise de fosfoinositídios. Uma hipótese proposta é de que o glutamato, via mGluR, bloqueia canais de Ca2+ tipo L, inibindo uma cascata de desfosforilação dependente de Ca2+, associada a GFAP (Rodnight et al., 1997). Interessantemente, os receptores rianodina (RyRs) presentes nas reservas intracelulares de Ca2+ reguladas por tais receptores estão associados com canais de Ca2+ tipo L (Chavis et al., 1996). Com base nestes dados, buscou-se neste trabalho avaliar se a modulação glutamatérgica da fosforilação da GFAP em fatias de hipocampo de ratos jovens envolve as reservas intracelulares de Ca2+ reguladas por RyRs e se o Ca2+ proveniente destas reservas atua de maneira semelhante ao Ca2+ oriundo do espaço extracelular. Nossos resultados mostraram que há uma evidente participação do Ca2+ proveniente das reservas intracelulares reguladas por RyRs no mecanismo modulatório da fosforilação da GFAP via ativação de mGluRs em fatias de hipocampo de ratos jovens, uma vez que a cafeína e a rianodina (agonistas de RyRs) revertem totalmente o efeito estimulatório do agonista glutamatérgico metabotrópico 1S,3R-ACPD sobre a fosforilação da proteína e este efeito da cafeína é inibido por dantrolene (antagonista de RyRs). Talvez o Ca2+ oriundo das reservas reguladas por RyRs tenha o mesmo papel do Ca2+ proveniente do espaço extracelular, ou seja, desencadeia uma cascata de desfosforilação associada à GFAP mediada pela calcineurina, uma vez que quelando o Ca2+ intracelular livre com BAPTA-AM, após a mobilização destas reservas, tal efeito não ocorre. A participação de receptores adenosina (AdoRs) e do AMP cíclico (AMPc) ainda permanece a ser estudada. Entretanto, é sabido que em ratos jovens a ativação de mGluRs aumenta a formação de AMPc potenciando o efeito de outros tipos de receptores, como os AdoRs e, provavelmente, isto é mediado por um mGluR II (Schoepp & Johnson, 1993; Winder & Conn, 1996). Neste trabalho mostrou-se justamente o possível envolvimento de tais mecanismos de transdução de sinal na modulação da fosforilação da GFAP, pois a adenosina deaminase (enzima que metaboliza adenosina endógena) e a forscolina (agente que estimula a enzima adenilato ciclase) alteraram o nível de fosforilação da GFAP. Estes resultados evidenciam o envolvimento das reservas intracelulares de Ca2+ reguladas por RyRs no mecanismo de transdução de sinal que modula o estado de fosforilação GFAP mediado pela ativação de mGluRs.

Expressão de genes relacionados a cálcio e glutamato no hipocampo de pacientes com epilepsia do lobo temporal

A epilepsia do lobo temporal (ELT) é a principal forma de epilepsia, e a principal lesão desenvolvida por pacientes com ELT é a esclerose mesial temporal (EMT) apresentando perda neuronal, gliose e atrofia da região do hipocampo. Os íons cálcio são fundamentais para o funcionamento de inúmeras vias metabólicas em todos os níveis fisiológicos e desempenham papel fundamental nas respostas de despolarização neuronal. Foi comprovado que a ativação tanto de receptores ionotrópicos quanto metabotrópicos de glutamato promove o influxo anormal de Ca2+ para o meio intracelular, potencializando o efeito de excitação associado à EMT. O cálcio atua tanto como mensageiro celular secundário, quanto primário através da interação com um receptor específico na superfície celular, o Receptor Sensor de Cálcio (CASR). O CASR é expresso em diversas regiões do cérebro, incluindo o hipocampo, no entanto são desconhecidas muitas das possíveis funções desempenhadas por este receptor no cérebro. Ele pertence à família de receptores acoplados a proteína-G, e exibe homologia significativa com os receptores metabotrópicos de glutamato (mGluRs). Ademais, os mGluRs regulam a expressão da família de proteínas ligantes de cálcio neuronal, da qual faz parte a proteína VILIP-1, associada especificamente com o fenômeno da plasticidade sináptica no cérebro. O objetivo deste projeto foi determinar a expressão das proteínas CASR, mGluR1 e VILIP-1 em tecidos de hipocampo de pacientes com epilepsia do lobo temporal comparando com a expressão de tecidos de indivíduos normais. Os três genes encontraram-se subexpressos nos tecidos de pacientes com ELT, sendo que os tecidos dos pacientes, em grau crônico da doença, justificam tais graus de expressão. Sugere-se uma possível interação entre CASR e mGluR1 e...(Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo)