Evaluation of DNA extraction protocols for Brucella abortus pcr detection in aborted fetuses or calves born from cows experimentally infected with strain 2308

The objective of the present study was to improve the detection of B. abortus by PCR in organs of aborted fetuses from infected cows, an important mechanism to find infected herds on the eradication phase of the program. So, different DNA extraction protocols were compared, focusing the PCR detection of B. abortus in clinical samples collected from aborted fetuses or calves born from cows challenged with the 2308 B. abortus strain. Therefore, two gold standard groups were built based on classical bacteriology, formed from: 32 lungs (17 positives), 26 spleens (11 positives), 23 livers (8 positives) and 22 bronchial lymph nodes (7 positives). All samples were submitted to three DNA extraction protocols, followed by the same amplification process with the primers B4 and B5. From the accumulated results for organ, the proportion of positives for the lungs was higher than the livers (p=0.04) or bronchial lymph nodes (p=0.004) and equal to the spleens (p=0.18). From the accumulated results for DNA extraction protocol, the proportion of positives for the Boom protocol was bigger than the PK (p<0.0001) and GT (p=0.0004). There was no difference between the PK and GT protocols (p=0.5). Some positive samples from the classical bacteriology were negative to the PCR and viceversa. Therefore, the best strategy for B. abortus detection in the organs of aborted fetuses or calves born from infected cows is the use, in parallel, of isolation by classical bacteriology and the PCR, with the DNA extraction performed by the Boom protocol.

Anticorpos anti Brucella abortus, anti Brucella canis e anti Leptospira spp. em raposas (Pseudalopex vetulus) do semiárido paraibano, Nordeste do Brasil

O objetivo do presente trabalho foi determinar a ocorrência de anticorpos anti Brucella abortus, anti Brucella canis e anti Leptospira spp. em raposas (Pseudalopex vetulus). Para tanto, foram utilizadas 60 raposas atropeladas em rodovias no semiárido da Paraíba, Nordeste do Brasil. Para a detecção de anticorpos anti Brucella abortus, o teste do antígeno acidificado tamponado (AAT) foi empregado como teste de triagem, e a prova do 2-mercaptoetanol foi empregada como método confirmatório. Para o diagnóstico sorológico das infecções por Brucella canis e Leptospira spp., foram utilizados os testes de imunodifusão em gel de agar (IDGA) e soroaglutinação microscópica, respectivamente. Todas as amostras foram negativas na pesquisa de anticorpos anti Brucella canis e anti Leptospira spp. Das 60 raposas testadas, 16 (26,6%) foram positivas para anticorpos anti Brucella abortus no teste de AAT, e quatro (6,7%) amostras foram confirmadas no teste de 2-mercaptoetanol, sendo duas amostras com título 100 e duas com título 50.

DETECTION OF Leptospira spp. AND Brucella abortus ANTIBODIES IN FREE-LIVING JAGUARS (Panthera onca) IN TWO PROTECTED AREAS OF NORTHERN PANTANAL, BRAZIL

 This study aimed to assess the exposure of free-living jaguars (Panthera onca) to Leptospira spp. and Brucella abortus in two conservation units in the Pantanal of Mato Grosso, Brazil. The presence of antibodies in blood samples of eleven jaguars was investigated using autochthonous antigens isolated in Brazil added to reference antigen collection applied to diagnosis of leptospirosis by Microscopic Agglutination Test (MAT). The Rose Bengal test was applied for B. abortus antibodies. Two (18.2%) jaguars were seroreactive for the Leptospira spp. antigen and the serovar considered as most infective in both animals was a Brazilian isolate of serovar Canicola (L01). All jaguars were seronegative for B. abortus. These data indicate that the inclusion of autochthonous antigens in serological studies can significantly increase the number of reactive animals, as well as modify the epidemiological profile of Leptospira spp. infection.

Abscesso esplênico por Brucella abortus

É relatado caso de um homem de 23 anos de idade com febre prolongada por Brucella abortus. O incomum neste caso foi a presença de abscesso esplênico, identificado através de tomografia computadorizada de abdômen. A evolução foi favorável com a introdução apenas de antibióticos, havendo regressão completa das lesões.

Outbreak of laboratory-acquired Brucella abortus in Brazil: a case report

Human brucellosis is an occupational disease affecting workers in slaughterhouses, butcher shops and the milk and dairy product industry as well as individuals who work in clinical or research laboratories. We report the first outbreak of a Brucella abortus infection in a Brazilian laboratory and compare the data obtained with reports available in the literature. Exposure was a result of damage to a biological safety cabinet and failure of the unidirectional airflow ventilation system. An epidemiological investigation identified 3 seroconverted individuals, 1 of whom had clinical manifestations and laboratory results compatible with infection at the time of exposure (n=11; attack rate=9.1%).

Seroprevalence of Coxiella burnetii and Brucella abortus among pregnant women.

Coxiella burnetii and Brucella abortus are two intracellular bacteria implicated in zoonotic miscarriage. In the present study, C. burnetii and B. abortus seroprevalence was compared among women from London with and without miscarriage. Coxiella burnetii seroprevalence was high (4.6%, 95% CI 2.8-7.1) despite the rare apparent exposure of this urban population. Only two patients exhibited anti-B. abortus antibodies. As a result of the risk of chronic Q fever with endocarditis and/or hepatitis, the mode of Coxiella burnetii infection in this population merits further investigation.

Evolução de títulos sorológicos, nas provas de soroaglutinação em placa, antígeno acidificado tamponado e fixação de complemento, em bezerras Nelore vacinadas aos 18 meses de idade com Brucella abortus amostra B 19

Com o objetivo de estudar a persistência da resposta sorológica, através das provas de soroaglutinação em placa, rosa Bengala e fixação de complemento, 108 bezerras, com idade ao redor de 18 meses, foram vacinadas com uma dose padrão da vacina preparada com Brucella abortus amostra B 19. Foram obtidas amostras de soro sangüíneo antes da vacinação e após 45 dias, 6, 12 e 18 meses. Antes da vacinação, todas as bezerras apresentaram resultados negativos nos três testes. Após 45 dias, todas apresentaram título a partir de 1/100 na prova de soroaglutinação em placa e todas apresentaram resultado positivo no teste rosa Bengala, ao passo que dois animais apresentaram título 1/2 e os demais apresentaram título a partir de 1/4 na reação de fixação de complemento. Após um ano de vacinação, a grande maioria das bezerras já não apresentava título sorológico significativo. Considerando o risco a que estão sujeitos animais que vivem em áreas endêmicas e em propriedades onde a doença ocorre, e considerando a acentuada redução de título sorológico observada na grande maioria dos animais, pode-se concluir que, no caso bezerras de raças zebuínas em áreas endêmicas e que não tenham sido vacinadas na idade regulamentar, é mais vantajoso vaciná-las com a amostra B 19 aos 18 meses de idade do que deixá-las expostas a um elevado risco de infecção por Brucella.

Diagnóstico sorológico da brucelose bovina em animais adultos vacinados com dose reduzida da cepa 19 de Brucella abortus

Com o presente trabalho avaliou-se o uso de dose reduzida da vacina produzida com a amostra 19 de Brucella abortus, em rebanho adulto negativo para a enfermidade, por meio de técnicas de diagnóstico sorológico preconizadas pelo Programa Nacional de Controle e Erradicação da Brucelose e Tuberculose Animal e por um ensaio indireto de imunoadsorção enzimática (ELISA ID). A prova de fixação de complemento detectou 46,77% de positivos, o antígeno acidificado tamponado 67,74%, o 2-mercaptoetanol com soroaglutinação lenta 87,09% e o ELISA ID 100%. A dose reduzida interferiu no diagnóstico sorológico. Nenhuma das técnicas apresentou especificidade adequada para uso em rebanho nestas condições, até 3 meses após a vacinação.

Estabilidade do antígeno de célula total de Brucella abortus para uso no diagnóstico sorológico da brucelose bovina pela reação de fixação de complemento

A reação de fixação de complemento é um dos testes usados no diagnóstico confirmatório da brucelose bovina, e para sua realização emprega-se o mesmo antígeno usado na prova de soroaglutinação lenta, porém não foi possível encontrar na literatura estudos sobre a estabilidade desse antígeno para uso na prova de fixação de complemento, de modo a estabelecer um prazo de validade para o mesmo. Por isso, esta investigação teve por objetivo avaliar a estabilidade do antígeno de célula total de Brucella conservado sob refrigeração, para uso na reação de fixação de complemento. Analisaram-se 14 partidas de antígeno, preparado com Brucella abortus amostra 1119/3 e padronizado para uso na prova de soroaglutinação lenta, com tempo de fabricação variando de 9 meses a 23 anos e 11 meses. Testaram-se 167 soros bovinos com títulos variáveis de anticorpos contra Brucella, adotando-se a técnica com incubação a 37ºC nas duas fases da reação e 5 unidades hemolíticas 50% de complemento. Considerou-se como positivo o soro com pelo menos 25% de fixação de complemento na diluição 1:4. Compararam-se os resultados obtidos com as 13 partidas de antígeno com aqueles obtidos com a partida com 9 meses de fabricação, usando o teste de chi2 de McNemar e o coeficiente kappa. A grande maioria dos soros apresentou resultados muito próximos quando testados com as diversas partidas de antígeno, e não se observou relação entre tempo de fabricação do antígeno e diferenças nos resultados obtidos.

Desenvolvimento e avaliação de uma cepa knockout de Brucella abortus obtida pela deleção do gene virB10

Brucella spp. são bactérias gram-negativas, intracelulares facultativas que são patogênicas para muitas espécies de mamíferos causando a brucelose, uma zoonose difundida mundialmente. Por isso a busca de alternativas de controle mais eficientes se faz necessário como o desenvolvimento de novas cepas que possam ser testadas como potenciais imunógenos. Neste estudo realizou-se a deleção do gene virB10 da cepa S2308 de Brucella abortus gerando uma cepa knockout provavelmente incapaz de produzir a proteína nativa correspondente. O gene virB10 faz parte de um operon que codifica para um sistema de secreção do tipo IV, essencial para a sobrevivência intracelular e multiplicação da bactéria em células hospedeiras. A deleção foi realizada pela construção do plasmídeo suicida pBlue:virB10:kan e eletroporação deste em células eletrocompetentes de B. abortus S2308, ocorrendo a troca do gene selvagem pelo gene interrompido, com o gene de resistência a canamicina, por recombinação homóloga dupla. Camundongos BALB/c foram inoculados com as cepas S19, RB-51, ΔvirB10 de B. abortus e B. abortus S2308 selvagem; os resultados demonstraram que camundongos BALB/c inoculados com S19 e camundongos BALB/c inoculados com S2308 apresentaram queda mais rápida de linha de tendência, quando comparadas aos demais grupos, para recuperação bacteriana (RB) e peso esplênico (PE) respectivamente. Os grupos que receberam ΔvirB10 S2308 de B. abortus e RB-51 demonstraram comportamento semelhante para ambas as características. Na sexta semana após a inoculação, os resultados para RB (log de UFC ± desvio padrão) e PE (peso esplênico ± desvio padrão), respectivamente, mostraram: grupos inoculados com as cepas S2308 (4,44±1,97 e 0,44±0,11), S19 (1,83±2,54 e 0,31±0,04), RB-51 (0,00±0,00 e 0,20±0,01) e ΔvirB10 S2308 (1,43±1,25 e 0,19±0,03). Considerado o clearance bacteriano, todos os grupos diferiram estatisticamente do grupo que recebeu S2308 (p<0,0001), o grupo inoculado com ΔvirB10 S2308 de B. abortus foi semelhante ao grupo S19 (p=0,4302) e diferente do grupo RB-51 (p=0,0063). A avaliação da persistência revelou que o gene virB10 é essencial para a manutenção da virulência da bactéria. Os resultados obtidos possibilitarão que outras pesquisas sejam realizadas avaliando o potencial imunogênico desta cepa mutante.

Detecção de Brucella abortus em tecidos bovinos utilizando ensaios de PCR e qPCR¹

Objetivou-se no presente estudo avaliar as técnicas reação em cadeia da polimerase (PCR) e PCR em Tempo Real (qPCR) para detectar Brucella abortus, a partir de tecidos bovinos com lesões sugestivas de brucelose. Para isto, 21 fragmentos de tecidos bovinos coletados em abatedouros de Mato Grosso do Sul foram processados e submetidos ao cultivo microbiológico e extração do DNA genômico para realização das reações de PCR e qPCR. No cultivo microbiológico, oito amostras apresentaram crescimento bacteriano e cinco foram confirmadas como B. abortus por PCR. Diretamente das amostras de tecido, DNA do gênero Brucella (oligonucleotídeos IS711) foi detectado em 13 (61,9%) amostras de tecido e 17 (81%) amostras de homogeneizado. Já com os oligonucleotídeos espécie-específicos BruAb2_0168F e BruAb2_0168R, 14 (66%) amostras de tecido e 18 (85,7%) amostras de homogeneizado foram amplificadas. Seis amostras positivas na PCR espécie-específica foram sequenciadas e o best hit na análise BLASTn foi B. abortus. Na qPCR, 21 (100%) amostras de tecidos e 19 (90,5%) amostras de homogeneizado foram positivas para B. abortus. Dez amostras de DNA de sangue bovino de rebanho certificado livre foram utilizadas como controle negativo nas análises de PCR e qPCR utilizando-se os oligonucleotídeos BruAb2_0168F e BruAb2_0168R. Na PCR nenhuma amostra amplificou, enquanto que na qPCR 2 (20%) amplificaram. Conclui-se que as duas técnicas detectam a presença de B. abortus diretamente de tecidos e homogeneizados, porém a qPCR apresentou maior sensibilidade. Os resultados obtidos indicam que a qPCR pode representar uma alternativa rápida e precisa para a detecção de B. abortus diretamente de tecidos, e ser utilizada em programas de vigilância sanitária, por apresentar sensibilidade e especificidade satisfatórias.

Infecção transplacentária e intrauterina por Brucella abortus em búfalos (Bubalus bubalis)

RESUMO: O objetivo deste trabalho foi verificar a presença de Brucella abortus e as lesões causadas por esse agente nos anexos fetais e nos fetos de búfalas. Para isso, 20 búfalas em diversos meses de gestação, sorologicamente positivas para brucelose, foram submetidas ao abate sanitário. A idade fetal foi determinada através de exames ultrassonográficos associados à mensuração dos fetos durante a necropsia. Do útero fechado desses animais foram coletadas amostras para histopatologia e qPCR. A partir do segundo mês de gestação foi possível detectar a presença de DNA de B. abortus em líquido amniótico, líquido alantoide e em útero e, a partir do quinto mês, na placenta, coração, baço, rim, pulmão, intestino, fígado e linfonodos dos fetos. Os principais achados anatomopatológicos foram placentite fibrinopurulenta necrótica e endometrite supurativa crônica.

Detecção de Brucella abortus em linfonodos de búfalas (Bubalus bubalis) em diferentes fases da gestação

Resumo: O objetivo do presente trabalho foi verificar a presença do DNA de Brucella abortus e caracterizar as lesões causadas por esse agente em linfonodos de búfalas. Foram utilizadas 19 búfalas em diversos estágios de gestação, sorologicamente positivas para brucelose, submetidas ao abate sanitário, das quais se coletou fragmentos de diversos linfonodos. A idade fetal foi determinada através de exames ultrassonográficos associados à mensuração dos fetos durante a necropsia. Amostras foram coletadas e submetidas à qPCR e histopatologia. A detecção de DNA de B. abortus nos linfonodos das búfalas avaliadas foi verificada a partir do quarto mês de gestação em sete búfalas e em uma búfala pós-parição. Os achados histológicos foram linfadenite aguda a crônica. A presença de DNA de B. abortus foi detectada em todos os grupos de linfonodos avaliados, sendo que os linfonodos mais acometidos foram os mamários.

Inactivation of formyltransferase (wbkC) gene generates a Brucella abortus rough strain that is attenuated in macrophages and in mice

Rough mutants of Brucella abortus were generated by disruption of wbkC gene which encodes the formyltransferase enzyme involved in LPS biosynthesis. In bone marrow-derived macrophages the B. abortus Delta wbkC mutants were attenuated, could not reach a replicative niche and induced higher levels of IL-12 and TNF-alpha when compared to parental smooth strains. Additionally, mutants exhibited attenuation in vivo in C57BL/6 and interferon regulatory factor-1 knockout mice. Delta wbkC mutant strains induced lower protective immunity in C56BL/6 than smooth vaccine S19 but similar to rough vaccine RB51. Finally, we demonstrated that Brucella wbkC is critical for LPS biosynthesis and full bacterial virulence. (C) 2010 Elsevier Ltd. All rights reserved.

Serosurvey for antibodies against Brucella abortus and Leptospira interrogans in pampas deer from Brazil

A survey for antibodies against Brucella abortus, and Leptospira interrogans was conducted on 17 pampas deer (Ozotocerus bezoarticus) from Pantanal Matogrossense (State of Mato Grosso do Sul, Brazil) and on 24 pampas deer from Parque Nacional de Emas (State of Goias, Brazil). Antibodies against B. abortus were detected by plate ag glutination, rose Bengal, and complement fixation tests, antibodies against Leptospira interrogans were detected by the microscopic agglutination test. All sera were negative for B. abortus antibodies and all deer sera from Parque Nacional de Emas were negative for L. interrogans antibodies. Four (24%) of 17 sera from Pantanal Matogrossense were positive for L. interrogans serovar (n = 2) hardjo, wolffi (n = 1) and mini (n = 1). While these diseases do not appear to be of major importance to the health status of Pampas deer, it appears that deer are reservoir for leptospirosis in one of the study areas.