The broad spectrum of bioactive properties of phenolic extracts: a prospective study in three different plants

Natural resources like plants are currently used all over developed and under developed countries of the world as traditional home remedies and are promising agents for drug discovery as they play crucial role in traditional medicine. The use of plants for medicinal purpose usually varies from country to country and region to region because their use depends on the history, culture, philosophy and personal attitudes of the users (Ahmad et al., 2015). The use of plants and plant products as drugs predates the written human history (Hayta et al., 2014). Plants are a very important resource for traditional drugs and around 80% of the population of the planet use plants for the treatment of many diseases and traditional herbal medicine accounts for 30-50% of the total medicinal consumption in China. In North America, Europe and other well-developed regions over 50% of the population have used traditional preparations at least once (Dos Santos Reinaldo et al., 2015). Medicinal plants have been used over years for multiple purposes, and have increasingly attract the interest of researchers in order to evaluate their contribution to health maintenance and disease’s prevention (Murray, 2004). Recently between 50,000 and 70,000 species of plants are known and are being used in the development of modern drugs. Plants were the main therapeutic agents used by humans from the 19th century, and their role in medicine is always topical (Hayta et al., 2014). The studies of medicinal plants are rapidly increasing due to the search for new active molecules, and to improve the production of plants or bioactive molecules for the pharmaceutical industries (Rates, 2001). Several studies have been reported, but numerous active compounds directly responsible for the observed bioactive properties remain unknown, while in other cases the mechanism of action is not fully understood. According to the WHO 25% of all modern medicines including both western and traditional medicine have been extracted from plants, while 75% of new drugs against infective diseases that have arrived between 1981 and 2002 originated from natural sources, it was reported that the world market for herbal medicines stood at over US $60 billion per year and is growing steadily (Bedoya et al., 2009). Traditional medicine has an important economic impact in the 21st century as it is used worldwide, taking advantage on the low cost, accessibility, flexibility and diversity of medicinal plants (Balunas & Kinghorn, 2005).

Obtenção de extratos de agaricus bisporus com ergosterol para incorporação em iogurtes e procedimentos de microencapsulação

Além de ser o cogumelo mais consumido no mundo, Agaricus bisporus é um dos cogumelos mais ricos em ergosterol, representando esta molécula quase 90% da sua fração de esteróis. Vários estudos têm atribuído ao ergosterol diferentes bioatividades, incluindo efeitos hipocolesterolémicos semelhantes aos exibidos pelos fitoesteróis. Isto torna o ergosterol uma molécula interessante para ser estudada como composto nutracêutico. Assim, este trabalho teve como objetivo avaliar o potencial de utilização dos extratos de A. bisporus ricos em ergosterol na produção de bebidas lácteas funcionais. Para o efeito, foram realizados testes de incorporação do extrato e do ergosterol puro em iogurtes que se compararam com bebidas lácteas funcionais comerciais (aditivadas com fitoesteróis). As amostras de A. bisporus foram submetidas a uma extração assistida por ultrassons e os extratos obtidos (IEXT), bem como a molécula de ergosterol em diferentes concentrações (IERG1 e IERG2), foram incorporados em iogurtes, e comparadas com amostras controlo (amostras de iogurte sem aditivos) (ICN) e iogurtes comerciais contendo fitoesteróis (ICP). Todas as amostras foram analisadas imediatamente após a incorporação (T0), e após sete dias de armazenagem a 4°C (T1), em relação aos parâmetros nutricionais, atividade antioxidante e propriedades citotóxicas em linhas celulares tumorais humanas e numa cultura primária de células de fígado de porco (não tumoral) para avaliação da toxicidade. O teor de ergosterol incorporado na forma pura, ou presente nos extratos, foi monitorizado por HPLC-UV. Adicionalmente, foi realizado um estudo de microencapsulação utilizando a técnica de coacervação, tendo o quitosano e o isolado proteico de soro como materiais encapsulantes. Num ensaio preliminar determinou-se o pH conducente a um maior rendimento de encapsulação e, seguidamente, verificou-se a influência da razão proteína:quitosano (P/Q) e da temperatura utilizada, no rendimento de encapsulação (Y1), na eficiência de encapsulação (Y2) e na carga (teor de ergosterol nas microesferas) (Y3). Posteriormente, o estudo foi realizado baseando-se nas melhores condições para encapsular ergosterol, sendo também avaliadas as respostas Y1, Y2 e Y3. Além de ser o cogumelo mais consumido no mundo, Agaricus bisporus é um dos cogumelos mais ricos em ergosterol, representando esta molécula quase 90% da sua fração de esteróis. Vários estudos têm atribuído ao ergosterol diferentes bioatividades, incluindo efeitos hipocolesterolémicos semelhantes aos exibidos pelos fitoesteróis. Isto torna o ergosterol uma molécula interessante para ser estudada como composto nutracêutico. Assim, este trabalho teve como objetivo avaliar o potencial de utilização dos extratos de A. bisporus ricos em ergosterol na produção de bebidas lácteas funcionais. Para o efeito, foram realizados testes de incorporação do extrato e do ergosterol puro em iogurtes que se compararam com bebidas lácteas funcionais comerciais (aditivadas com fitoesteróis). As amostras de A. bisporus foram submetidas a uma extração assistida por ultrassons e os extratos obtidos (IEXT), bem como a molécula de ergosterol em diferentes concentrações (IERG1 e IERG2), foram incorporados em iogurtes, e comparadas com amostras controlo (amostras de iogurte sem aditivos) (ICN) e iogurtes comerciais contendo fitoesteróis (ICP). Todas as amostras foram analisadas imediatamente após a incorporação (T0), e após sete dias de armazenagem a 4°C (T1), em relação aos parâmetros nutricionais, atividade antioxidante e propriedades citotóxicas em linhas celulares tumorais humanas e numa cultura primária de células de fígado de porco (não tumoral) para avaliação da toxicidade. O teor de ergosterol incorporado na forma pura, ou presente nos extratos, foi monitorizado por HPLC-UV. Adicionalmente, foi realizado um estudo de microencapsulação utilizando a técnica de coacervação, tendo o quitosano e o isolado proteico de soro como materiais encapsulantes. Num ensaio preliminar determinou-se o pH conducente a um maior rendimento de encapsulação e, seguidamente, verificou-se a influência da razão proteína:quitosano (P/Q) e da temperatura utilizada, no rendimento de encapsulação (Y1), na eficiência de encapsulação (Y2) e na carga (teor de ergosterol nas microesferas) (Y3). Posteriormente, o estudo foi realizado baseando-se nas melhores condições para encapsular ergosterol, sendo também avaliadas as respostas Y1, Y2 e Y3. As bebidas funcionalizadas com o extrato (IEXT) e com ergosterol na mesma concentração existente no extrato (IERG1) revelaram uma atividade antioxidante similar às bebidas comerciais com fitoesteróis. No entanto, as bebidas com ergosterol na mesma concentração do extrato de A. bisporus e de fitoesteróis (IERG2) revelaram uma atividade antioxidante superior. Além disso, apenas IEXT, IERG1 e IERG2 apresentaram um aumento na atividade antioxidante de T0 para T1, com destaque para a atividade exibida por IERG2, significando que o ergosterol e os extratos foram capazes de proteger a bebida láctea da oxidação, aumentando a vida de prateleira do produto. IERG2 foi a amostra que revelou a maior citotoxicidade para as linhas celulares tumorais, enquanto as bebidas com fitoesteróis mostraram a menor atividade, sem diferenças significativas entre T0 e T1. Os estudos de microencapsulação revelaram ainda que a técnica de coacervação permite obter cápsulas de distintos tamanhos e que as condições ótimas do processo ocorrem a pH 5,5, com temperatura de 55ºC e razão P/Q de 0,5, com um menor rendimento de encapsulação, mas com uma maior carga em ergosterol. Este trabalho contribuiu para o estudo do potencial da utilização de extratos de A. bisporus com ergosterol no desenvolvimento de novas bebidas funcionais. Constituiu um primeiro passo que necessita de estudos subsequentes relacionados com a avaliação da viabilidade da sua utilização ao nível industrial e demonstração clara da sua bioatividade in vivo.

A prospective study on bioactive properties of wild mushrooms mycelium grown in vitro under different conditions

Wild mushrooms have been extensively studied for their value as sources of high quality nutrients and of powerful physiologically bioactive compounds [1,2]. The present study was designed to evaluate the in vitro development of two wild edible mushroom species: Pleurotus eryngii (DC.) Quél. and Suillus belinii (Inzenga) Watling, by testing different solid (Potato Dextrose Agar medium –PDA and Melin-Norkans medium- MMN) and liquid culture media (Potato dextrose broth- PDB and Melin-Norkans medium- MMN). Each strain of mushroom produces a special type of mycelium and this range of characteristics varies in form, color and growth rate. S. bellinii presents a pigmented and rhizomorphic mycelia, whereas, P. eryngii has depigmented and cottony mycelia. The mycelium isolated and grown in PDA showed a faster radial growth compared to the mycelium isolated and grown in both solid and liquid incomplete MMN medium. P. eryngii exhibited a rapid growth and a higher mycelia biomass in both medium compared to S. belinii. Moreover, the obtained mycelia will be characterized in terms of well-recognized bioactive compounds namely, phenolic acids and mycosterols (mainly ergosterol), by using high performance liquid chromatography coupled to diode array and ultraviolet detectors, respectively. These compounds will be correlated to mycelia bioactivity: i) antioxidant activity, evaluated through free radicals scavenging activity, reducing power and lipid peroxidation inhibition in vitro assays; ii) anti-inflammatory activity, assessed through nitric oxide production inhibition in murine macrophages (RAW 264.7 cell line); iii) cytotoxic activity, evaluated either in human tumor cell lines (MCF-7- breast adenocarcinoma, NCIH460- non-small cell lung cancer, HeLa- cervical carcinoma and HepG2- hepatocellular carcinoma) as also in a non-tumor porcine primary liver cells culture established in-house (PLP2). Overall, our expectation is that the bioactive formulations obtained by in vitro culture can be applied as nutraceuticals or incorporated in functional foods.

HPLC-DAD-ESI/MS phenolic characterization and biological activity of Equisetum giganteum L.

Naturally-occurring phytochemicals have received a pivotal attention in the last years, due to the increasing evidences of biological activities. Equisetum giganteum L., commonly known as “giant horsetail”, is a native plant from Central and South America, being largely used in dietary supplements as diuretic, hemostatic, antiinflammatory and anti-rheumatic agents [1,2]. The aim of the present study was to evaluate the antioxidant (scavenging effects on 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl radicals- RSA, reducing power- RP, β-carotene bleaching inhibition- CBI and lipid peroxidation inhibition- LPI), anti-inflammatory (inhibition of NO production in lipopolysaccharidestimulated RAW 264.7 macrophages) and cytotoxic (in a panel of four human tumor cell lines: MCF-7- breast adenocarcinoma, NCI-H460- non-small cell lung cancer, HeLa- cervical carcinoma and HepG2- hepatocellular carcinoma; and in non-tumor porcine liver primary cells- PLP2) properties of E. giganteum, providing a phytochemical characterization of its extract (ethanol/water, 80:20, v/v), by using highperformance liquid chromatography coupled to diode array detection and electrospray ionisation mass spectrometry (HPLC-DAD–ESI/MS). E. giganteum presented fourteen phenolic compounds, two phenolic acids and twelve flavonol glycoside derivatives, mainly kaempferol derivatives, accounting to 81% of the total phenolic content, being kaempferol-O-glucoside-O-rutinoside, the most abundant molecule (7.6 mg/g extract). The extract exhibited antioxidant (EC50 values = 123, 136, 202 and 57.4 μg/mL for RSA, RP, CBI and LPI, respectively), anti-inflammatory (EC50 value = 239 μg/mL) and cytotoxic (GI50 values = 250, 258, 268 and 239 μg/mL for MCF-7, NCI-H460, HeLa and HepG2, respectively) properties, which were positively correlated with its concentration in phenolic compounds. Furthermore, up to 400 μg/mL, it did not revealed toxicity in non-tumor liver cells. Thus, this study highlights the potential of E. giganteum extracts as rich sources of phenolic compounds that can be used in the food, pharmaceutical and cosmetic fields.

The impact of gamma irradiation on the cytotoxic properties and phenolic composition of Thymus vulgaris L. and Menta x piperita L.

Irradiation has been increasingly recognized as an effective decontamination technique, also ensuring the chemical and organoleptic quality of medicinal and aromatic plants 1 . The use of medicinal plants in the prevention and or treatment of several diseases has revealed satisfactory results as anti-inflammatory, antimutagenic, anti-cancer and antioxidant agents 2 . The aim of the present study was to evaluate the effects of gamma irradiation on the cytotoxic properties and phenolic composition of Thymus vulgaris L. and Menta x piperita L. (methanolic extracts). Phenolic compounds were analyzed by HPLC-DAD-ESI MS, while the cytotoxicity of the samples was assessed in MCF-7 (breast adenocarcinoma), NCI-H460 (non-small cell lung cancer), HeLa (cervical carcinoma), HepG2 (hepatocellular carcinoma) cell lines, as also in non-tumor cells (PLP2). Thirteen and fourteen phenolic compounds were detected in T. vulgaris and M. piperita, respectively, but none of them was affected by the irradiation up to a dose of 10 kGy. However, despite there were no changes in the cytotoxic properties of irradiated peppermint samples in tumor cell lines, the thyme samples irradiated with 10 kGy showed higher cytotoxicity in comparison with the samples submitted to other doses (2 and 5 kGy). This highlights that 10 kGy can be a suitable dose to ensure the sanitary treatment, without modifying the bioactive composition and properties of these aromatic plants.