Caracterização de estirpes de Ralstonia solanacearum isoladas de plantas de batata com murcha bacteriana, por PCR-Rep e RAPD

Considerado como um dos mais sérios patógenos da batata (Solanum tuberosum), em regiões de clima tropical, subtropical, assim como em zonas mais quentes de clima temperado, Ralstonia solanacearum é uma espécie com significativa diversidade genética. Ela é caracterizada em um sistema binário de raças e biovares, com base nas espécies hospedeiras e na capacidade de utilizar diferentes fontes de carbono. A tentativa de utilizar a resistência genética como forma de controle de R. solanacearum não tem demonstrado estabilidade, devido a alterações climáticas nas diferentes regiões e a variabilidade das estirpes do patógeno. Devido às características epidemiológicas diferentes para essas biovares, estirpes da biovar 2 são mais factíveis de serem erradicadas em um sistema de controle integrado. Em um levantamento realizado em quatro regiões produtoras de batata do Rio Grande do Sul, foram obtidos isolados de R. solanacearum de 25 lavouras de dez municípios. Após a análise bioquímica dos isolados verificou-se a presença das biovares 1 e 2, com predominância da última. Os isolados obtidos foram submetidos à avaliação da variabilidade genética por PCR, utilizando seqüências repetitivas ERIC e BOX e oligonucleotídeos aleatórios (RAPD). A PCR-ERIC e BOX puderam diferenciar claramente as biovares 1 e 2. Porém, ambas não detectaram variabilidade entre isolados da biovar 2 e apenas PCR-BOX detectou variabilidade entre isolados da biovar 1. Já através de RAPD demonstrou-se claramente a separação das biovares verificando-se que os mesmos apresentam um perfil característico dependente da região da qual os isolados foram obtidos.

Diversidade patogênica e molecular de Ralstonia solanacearum da região amazônica brasileira

Foi avaliada a diversidade de isolados de Ralstonia solanacearum obtidos de tomateiro e de outras hospedeiras com sintomas de murcha bacteriana na região amazônica. Os isolados foram identificados quanto à biovar e separados em graus de virulência em plantas de tomate, pimentão e chicória da Amazônia (Eryngium foetidum). Dos 70 isolados, 53 pertenciam à biovar 1, quatro à biovar N2 e 13 à biovar 3, confirmando a predominância da biovar 1 em tomateiro no Estado do Amazonas. O agrupamento dos isolados mostrou três classes distintas de virulência em tomate, sendo 44,3% dos isolados altamente virulentos, 37,1% medianamente virulentos e 18,6% fracamente virulentos. O agrupamento em pimentão classificou 20% de isolados como altamente virulentos, 27,1% como medianamente virulentos e 52,9% como fracamente virulentos. Quando inoculados em chicória da Amazônia, somente o isolado de chicória provocou murcha nesta hospedeira, sugerindo uma especificidade pouco comum para R. solanacearum. Na caracterização molecular, 46 isolados de tomateiro e 18 de outras 10 hospedeiras, coletados em áreas de terra-firme e de várzea, foram comparados por BOX-PCR. Os perfis genômicos revelaram alto grau de polimorfismo entre os isolados, divididos em cinco grupos, sem correlação entre hospedeira de origem, biovar, ecossistema ou local de coleta. O isolado de chicória da Amazônia foi o mais divergente, com apenas 6,4% de similaridade em relação aos demais. Os isolados de tomateiro estavam representados em três grupos. Os quatro isolados de tomateiro da biovar N2 formaram um agrupamento distinto dos isolados das demais biovares presentes na Amazônia.

Variabilidade genética em isolados de Curtobacterium flaccumfaciens

A cultura do feijoeiro está sujeita à incidência de várias doenças que acarretam perdas significativas na produção, dentre as quais encontra-se a murcha-de-curtobacterium ou murcha bacteriana, causada por Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens (Cff). Atualmente a murcha-de-curtobacterium tem se constituído em um novo problema para a cultura do feijoeiro em várias regiões brasileiras. A resistência genética tem sido o meio mais eficiente no controle da doença, porém a possibilidade da existência de variabilidade genética presente em isolados de Cff, pode ser uma conseqüência maléfica ao melhoramento visando a obtenção de cultivares de feijoeiro resistentes, especialmente na estabilidade e durabilidade da resistência. Neste sentido, o presente trabalho teve como objetivo o estudo da variabilidade genética de 26 isolados de Curtobacterium flaccumfaciens, 20 dos quais provenientes de feijoeiro (Cff), coletados em diferentes regiões do Brasil, quatro provenientes de coleções internacionais (Cff) e dois endofíticos de citros (C. flaccumfaciens). Foram utilizados dois pares de oligonucleotídeos, CffFOR2-CffREV4 e CF4-CF5, avaliando-se na especificidade em reação de PCR, para a caracterização dos 26 isolados. No estudo da variabilidade genética, utilizou-se da técnica rep-PCR e os iniciadores REP, ERIC e BOX. A partir do padrão eletroforético gerado pela amplificação dessas seqüências repetitivas no DNA genômico dos 26 isolados bacterianos, foram realizadas análises pertinentes (UPGMA SM) e obtenção de um dendograma. Considerando-se um índice de similaridade de 75%, os isolados foram distribuídos em quatro grupos distintos. Os isolados de Cff provenientes do Paraná e DF foram separados em grupos diferentes, enquanto que isolados endofíticos de citros não formaram um grupamento distinto dos de feijoeiro. Os isolados procedentes do Estados de São Paulo mostraram-se geneticamente heterogêneos, alguns se agruparam com o isolado de USA, Santa Catarina e de citros, enquanto outros agruparam-se com isolados provenientes da França e Paraná. A avaliação da especificidade dos dois pares de oligonucleotídeos, mostrou que os oligonucleotídeos CffFOR2-CffREV4 detectaram todos os 26 isolados. Os oligonucleotídeos CF4-CF5 apresentaram menor especificidade não detectando dois isolados de Cff de feijoeiro (2928) e (2936) e os isolados endofíticos de citros. Portanto como ferramenta para detecção de Cff em feijoeiro os oligonucleotídeos CffFOR2-CffREV4 revelaram ser os mais indicados.

Análise das relações taxonômicas e sistemáticas entre espécies de triatomíneos (Hemiptera, Reduviidae) de colônias mantidas pelo Serviço Especial de Saúde de Araraquara, inferida de seqüências do 16S rDNA mitocondrial

Foram analisadas seqüências de nucleotídeos do gene 16S do rDNA mitocondrial em 14 populações de triatomíneos mantidos em colônias no insetário SESA de Araraquara- SP, comparando-as com seqüências do mesmo gene disponíveis no GenBank. Os fragmentos variaram de 311 a 317 pb com baixa variação intra-específica entre as distâncias genéticas (0% a 0,6%), exceto para os relacionamentos entre espécimes de Triatoma sordida (1%) e espécimes de T. brasiliensis (1,3%) atribuídos a populações geográficas diferentes. A parafilia de Rhodniini e do gênero Panstrongylus foi evidenciada pelas analises, confirmando resultados anteriores entre estes e os estreitos relacionamentos de R. prolixus com R. robustus e de T. infestans e T. platensis. O relacionamento entre T. maculata e T. pseudomaculata não foi solucionado, uma vez que, esses táxons apareceram tanto em monofilia quanto em parafilia: T. pseudomaculata (SESA) está agrupado com T. maculata (seqüência do GenBank) e associados a T . brasiliensis (SESA), enquanto T. maculata (SESA) aparece agrupado com T. pseudomaculata do SESA e do GenBank. Os resultados evidenciam a utilidade do gene 16S como marcador de espécies de triatomíneos e sua importância em questões de sistemática e taxonomia. Há necessidade de novos estudos envolvendo outros marcadores associados a caracteres sistemáticos clássicos de morfologia, ecologia e comportamento para decisões sistemáticas adequadas uma vez, que teriam impacto não apenas sistemático mas, para as estratégias de controle.

Estudo comparativo das seqüências rápidas ponderadas em T2, utilizando-se sincronização respiratória, apnéia, supressão de gordura, bobina de corpo e bobina de sinergia para a avaliação do fígado pela ressonância magnética

OBJETIVO: Comparar, qualitativa e quantitativamente, as imagens de ressonância magnética do fígado, ponderadas em T2, utilizando-se seqüências rápidas, diferenciadas pela técnica de controle respiratório, pela utilização de supressão de gordura e pelo tipo de bobina de radiofreqüência. MATERIAIS E MÉTODOS: Estudo prospectivo em 71 pacientes consecutivos, sendo realizadas seis seqüências para comparação: 1) supressão de gordura com sincronização respiratória e bobina de corpo; 2) supressão de gordura em apnéia e bobina de corpo; 3) sem supressão de gordura com sincronização respiratória e bobina de corpo; 4) sem supressão de gordura em apnéia e bobina de corpo; 5) com supressão de gordura com sincronização respiratória e bobina de sinergia; 6) com supressão de gordura em apnéia e bobina de sinergia. A avaliação qualitativa foi baseada em três critérios: detecção de determinadas estruturas anatômicas do fígado, definição dos contornos hepáticos, e presença de artefatos de respiração. A análise quantitativa foi obtida através da relação das intensidades de sinal do fígado e do ruído de fundo. RESULTADOS: O valor médio dos índices globais de qualidade de imagem para cada uma das seis seqüências supracitadas foi de 7,8, 4,6, 7,9, 5,2, 6,7 e 4,6, respectivamente. As seqüências obtidas com sincronização respiratória apresentaram melhor qualidade de imagem e relação sinal/ruído superiores às seqüências com apnéia (p < 0,001). As seqüências realizadas com e sem supressão de gordura apresentaram qualidade de imagem e relação sinal/ruído semelhantes (p > 0,05). As seqüências obtidas com bobina de sinergia apresentaram qualidade de imagem semelhante (p > 0,05) e relação sinal/ruído inferior àquelas com bobina de corpo (p < 0,001). CONCLUSÃO: Associando-se as análises qualitativa e quantitativa das imagens, as melhores seqüências foram aquelas obtidas com sincronização respiratória e bobina de corpo, utilizando-se ou não supressão de gordura.

Prevalência de artefatos em exames de ressonância magnética do abdome utilizando a seqüência GRASE: comparável com as melhores seqüências rápidas?

OBJETIVO: Determinar a freqüência global de artefatos na seqüência "gradient and spin echo" (GRASE), por tipo e grau do artefato, em exames de ressonância magnética de abdome; realizar comparação entre as seqüências GRASE e duas seqüências TSE previamente selecionadas como aquelas com melhor relação sinal-ruído e menor incidência de artefatos. MATERIAIS E MÉTODOS: Foi realizado estudo prospectivo, autopareado, em 86 pacientes submetidos a ressonância magnética de abdome superior, sendo adquiridas a seqüência GRASE com sincronizador respiratório e supressão de gordura e seis seqüências TSE ponderadas em T2. Dentre as seis seqüências TSE, foram previamente selecionadas aquelas com melhor relação sinal-ruído e menor número de artefatos, que foram as realizadas com supressão de gordura e com sincronizador respiratório, sendo uma com bobina de corpo (seqüência 1) e outra com bobina de sinergia (seqüência 2). A análise das imagens foi realizada por dois observadores em consenso, quanto a presença, grau e tipo de artefato. Posteriormente os dados foram analisados estatisticamente, através do teste de Friedman e do qui-quadrado. RESULTADOS: A freqüência absoluta de artefatos nas seqüências utilizadas foi de 65,02%. Os artefatos mais encontrados nas três seqüências estudadas foram os de respiração (30%) e de pulsação (33%). Apenas 3% dos casos apresentaram algum tipo de artefato que dificultava a análise das imagens. As freqüências de artefatos nas diversas seqüências foram: GRASE, 67,2%; seqüência TSE 1, 62,2%; seqüência TSE 2, 65,5%. Não houve diferença estatisticamente significante na freqüência de artefatos encontrados nas seqüências GRASE e nas seqüências TSE (p = 0,845; NS). CONCLUSÃO: As seqüências GRASE e TSE ponderadas em T2 com sincronizador respiratório e com supressão de gordura, independentemente da bobina utilizada, apresentam freqüentemente artefatos, porém com incidência semelhante e geralmente sem interferência na avaliação das imagens.

Avaliação da função cardíaca por ressonância magnética com seqüências em equilíbrio estável: segmentadas × tempo real

OBJETIVO: Comparar os índices de função sistólica ventricular obtidos entre as seqüências de cine-ressonância magnética em equilíbrio estável, em tempo real e acoplada ao eletrocardiograma, em pacientes com ritmo regular ou não. MATERIAIS E MÉTODOS: Foram comparados a fração de ejeção e os volumes diastólico e sistólico finais, em 31 pacientes, 11 com ritmo cardíaco irregular e 20 com ritmo cardíaco sinusal regular, utilizando-se seqüências segmentadas acopladas ao eletrocardiograma e em tempo real. O tratamento estatístico foi feito através da correlação de Pearson e a concordância de Bland-Altman, com p < 0,01. RESULTADOS: As aquisições em tempo real demonstraram borramento dos contornos endocárdicos, mas ambas as seqüências tiveram forte correlação positiva entre os valores obtidos: fração de ejeção, r = 0,94; volume diastólico final, r = 0,93; volume sistólico final, r = 0,98. A análise dos 11 pacientes com ritmo irregular não demonstrou diferença estatisticamente significativa, apesar da menor relação de contraste sangue-miocárdio. CONCLUSÃO: Seqüências em tempo real podem ser utilizadas para a análise da função cardíaca, independente do ritmo cardíaco dos pacientes.

Avaliação da variabilidade do Grapevine leafroll-associated virus 1 e 3 por análise de seqüências de nucleotídeos e polimorfismo conformacional de fita simples

As principais espécies de vírus envolvidas na etiologia do enrolamento da folha da videira (Vitis spp.) são Grapevine leafroll-associated virus 1 e 3 (GLRaV-1 e -3). Neste estudo da variabilidade desses vírus, foram amplificados dois fragmentos de DNA (396 bp do GLRaV-1 e 602 bp do GLRaV-3) por RT-PCR, a partir de RNA total extraído de nervuras e pecíolos de videiras infetadas, utilizando-se dois pares de oligonucleotídeos. Os DNAs amplificados foram clonados e reamplificados, a partir dos clones recombinantes, e comparados quanto às diferenças conformacionais das fitas simples desnaturadas (SSCP). Foram observados dois padrões distintos de perfis eletroforéticos para cada vírus, tendo sido seqüenciado pelo menos um clone viral correspondente a cada padrão. As duas seqüências de nucleotídeos obtidas para o GLRaV-1 apresentaram maior homologia (79,8% e 87,4%) com um isolado australiano e as duas seqüências relativas ao GLRaV-3 exibiram maior homologia (75,1% e 81,8%) com um isolado norte-americano. Os resultados demonstraram a ocorrência de seqüências variantes destes vírus nas videiras analisadas.

Detecção e análise da variabilidade de seqüências do Banana streak virus (BSV) em bananeiras no Brasil

A técnica de PCR utilizando-se "primers" degenerados para o gênero Badnavirus foi utilizada para a detecção e análise da variabilidade de seqüências do Banana streak virus (BSV) provenientes de bananeiras. A partir desta metodologia seqüências do vírus puderam ser detectadas em cultivares diplóides (AA), triplóides (AAA; AAB) e tetraplóides (AAAB). Foram encontrados quatro padrões de seqüência do BSV (estirpes BSVBR-1, BSVBR-2, BSVBR-3 e BSVBR-4), diferenciadas através da análise do perfil eletroforético das amostras amplificadas. A estirpe BSVBR-1 prevalece nos estados do Acre, Amazonas, Bahia, Ceará, Goiás, Minas Gerais, Piauí, Rio de Janeiro, Rondônia, Santa Catarina, e São Paulo, enquanto que, a estirpe BSVBR-2 foi encontrada em amostras oriundas do Amazonas e do Ceará. As estirpes BSVBR-3 e BSVBR-4 foram encontradas apenas no Ceará. Este trabalho revela a presença de diferentes estirpes do BSV no Brasil, bem como a existência de cultivares de bananeiras sadias e livres de seqüências virais do BSV integradas ao seu genoma.

Diversidade de Phytophthora parasitica isolados de Citrus usando seqüências de nucleotídeos da região ITS-5.8S rDNA

Realizou-se estudo para caracterização e verificação da diversidade genética de Phytophthora parasitica, agente causador da gomose dos citros. Quatorze isolados de Phytophthora parasitica, provenientes do Estado de São Paulo, foram seqüenciados a partir das regiões internas transcritas (ITS1 e ITS2) do gene 5.8S. Obtiveram-se seqüências de 812 pb a 860 pb que foram comparadas com seqüências de outras espécies de Phytophthora spp depositadas no NCBI. Foram feitos estudos filogenéticos, utilizando-se o método "neighbor-joining" com 1000 "bootstrap" e construído o dendrograma mais representativo. Obtiveram-se os resultados de 98,88% a 100% de similaridade genética entre os 14 isolados paulistas, e 99,5% a 98,8% entre estes e a seqüência de P. nicotianae (gi| 8927482) obtida do GenBank NCBI.

Estudo da diversidade genética de Podosphaera xanthii através de marcadores AFLP e seqüências ITS

O meloeiro (Cucumis melo L.) é uma frutífera largamente cultivada no Brasil, principalmente no nordeste brasileiro, onde é produzida principalmente para a exportação. Plantas da família do meloeiro, como pepino e abóbora, podem ser severamente afetadas pelo oídio, causado por Podosphaera xanthii.. Este fungo apresenta diversas raças fisiológicas cuja correta identificação é importante para o manejo da doença, já que o uso de variedades resistentes é o método mais eficaz de seu controle. No entanto, a identificação destas raças por meio da prática tradicional de inoculações em uma série diferenciadora de variedades de meloeiro é laboriosa e passível de erros. Devido a isso, um método alternativo seria o uso de marcadores moleculares para determinar de forma rápida a identidade das raças. O objetivo deste estudo foi o de analisar a variabilidade entre isolados de P. xanthii previamente classificados em raças através da técnica de AFLP e do seqüenciamento da região ITS 5.8S do rDNA. A partir dos marcadores AFLP obteve-se um dendrograma no qual não houve separação dos isolados quanto às suas raças, origem geográfica ou hospedeiro de origem. Com esta técnica verificou-se alta variabilidade entre isolados, com similaridade genética máxima de 69% e similaridade mínima de 23%. Ao contrário da informação gerada por AFLP, não foi observada variação na sequência da região ITS 5.8S entre isolados. Desta forma, a análise por AFLP indicou que os isolados tem composição genética heterogênea muito embora este fato não tenha sido evidenciado pelo sequenciamento da região ITS.

Avaliação do processamento auditivo de sons não-verbais em indivíduos com doença de Parkinson

Entendemos que o processamento auditivo é o processo de como o indivíduo gerencia as informações recebidas auditivamente. É reconhecida a importância da percepção auditiva de seqüências e padrões temporais de sons na aquisição e compreensão dos componentes simbólicos da linguagem, sendo que as propriedades acústicas da fala poderiam ser reduzidas aos componentes básicos de duração e freqüência. Entre os eventos que percebemos por meio da audição, a fala é o mais importante, sendo que esta pode apresentar-se alterada na Doença de Parkinson. OBJETIVO: Avaliar o desempenho de portadores de doença de Parkinson nos Testes de Padrão de Freqüência e de Duração. FORMA DE ESTUDO: Clínico prospectivo. MATERIAL E MÉTODO: Avaliou-se a identificação de estímulos sonoros não-verbais, por meio de três tipos de respostas: humming, nomeação e apontar. Os estímulos eram constituídos por dez seqüências de três e quatro sons, variando em freqüência e duração. RESULTADOS: Mostraram-se que não houve diferença quanto ao tipo de resposta; houve um melhor desempenho utilizando o parâmetro três estímulos em oposição a quatro e o aspecto da duração em oposição ao de freqüência. Ressalta-se ainda que o desempenho da população avaliada foi inferior aos indivíduos normais. CONCLUSÃO: A capacidade de ordenação temporal de sons é uma importante função do sistema auditivo nervoso central. Essa habilidade permite que o ouvinte faça discriminações baseadas na ordenação ou seqüenciação de estímulos auditivos. Sendo assim, a contribuição desse estudo é significativa, uma vez que inicia a reflexão do processo de análise e interpretação de sons pelos indivíduos com doença de Parkinson.

Aplicação da ressonância magnética no acompanhamento da cirurgia do colesteatoma

A tomografia computadorizada e ressonância magnética (RM) com seqüências convencionais têm baixa especificidade para a diferenciação entre tecido de granulação e recidiva de colesteatoma. OBJETIVO: Avaliar a aplicação da RM com sequência de difusão e pós-contraste T1 tardio na detecção de recidiva de colesteatoma. MATERIAL E MÉTODO: Realizado estudo transversal prospectivo de dezessete pacientes estudados no pós-operatório de colesteatoma utilizando RM de 1.5 T com seqüência difusão, T1, T2 e pós-contraste T1 tardio nos planos coronal e axial. Dois radiologistas avaliaram e decidiram em consenso a presença de foco de hipersinal na difusão e T2, iso/hipossinal em T1 e ausência de impregnação pelo contraste como suspeitos de recidiva de colesteatoma. Os achados da revisão cirúrgica foram comparados com o resultado da RM. RESULTADOS: Onze dos doze casos de recidiva de colesteatoma apresentaram hipersinal na difusão. Todos os pacientes com tecido de granulação na cavidade cirúrgica não apresentaram alteração de sinal na difusão. Um paciente com abscesso no conduto auditivo interno também apresentou hipersinal na difusão. A sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo e negativo foram respectivamente 91,6%, 60%, 84,6% e 75%. CONCLUSÃO: A seqüência de difusão combinada com pós-contraste tardio pode ser útil na diferenciação entre tecido de granulação e recidiva de colesteatoma.

Estudo da adequação da "Escala de Maturidade Mental Columbia" na avaliação de pré-escolares de baixo nível sócio-econômico

A Escala da Maturidade Mental Colúmbia (EMMC) foi aplicada a 93 crianças pré-escolares de 4 a 6 anos, da cidade de Leme, SP (Brasil). Estas crianças eram originárias de famílias de baixo nível sócio-econômico e não freqüentavam nenhum tipo de creche ou pré-escola. Os dados obtidos mostraram que a EMMC apresentou diversas limitações, entre elas, uma diminuição sistemática nos valores do QI de razão, em função do aumento da idade da criança. A ocorrência generalizada de seqüências de respostas com perseveração de posição sugeriu que a situação de teste pode induzir uma queda na motivação e atenção da criança. Dessa forma, os baixos resultados obtidos com a EMMC podem não refletir necessariamente "deficiências cognitivas", mas um baixo interesse da criança em relação às tarefas exigidas pelo teste.