Embriogênese somática e regeneração de plantas a partir de embrião maduro de aveia

Calo embriogênico tem sido o tecido-alvo mais utilizado para transformação genética de cereais. O objetivo deste trabalho foi investigar o estabelecimento de calos embriogênicos e a regeneração de plantas in vitro a partir de embriões maduros de genótipos de aveia (Avena sativa L.). Embriões maduros foram retirados das sementes e colocados em meio MS (Murashige & Skoog), contendo 30,0 g L-1 de sacarose e 2,0 mg L-1 de ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D). Após o período de indução de calos, agregados embriogênicos foram isolados e subcultivados a cada 21 dias para meio fresco. Os calos embriogênicos foram então transferidos para meio de indução de parte aérea, e, na seqüência, as partes aéreas foram transferidas para meio de indução de raízes. Houve diferenças entre genótipos quanto à capacidade de embriogênese somática e regeneração de plantas in vitro a partir de embrião maduro. Este explante permitiu a indução de calos embriogênicos, que se multiplicaram, e que regeneraram in vitro um grande número de plantas de genótipos como UFRGS 7 e UFRGS 19, o que o faz passível de ser utilizado na transformação genética da aveia.

Regeneração de plantas de laranja 'Pêra' via organogênese in vitro

O objetivo deste trabalho foi estabelecer um protocolo eficiente de regeneração de plantas in vitro, via organogênese em explante juvenil de laranja 'Pêra' (Citrus sinensis L. Osbeck), para atender futuros trabalhos de transformação genética. Segmentos de epicótilo utilizados como explantes foram introduzidos em meio de cultura MT. A fim de maximizar a regeneração de plantas in vitro, foram realizados experimentos para avaliar as concentrações de BAP no meio de cultivo (0, 1, 2, 3 ou 4 mg L-1), tamanho (0,25, 0,5 ou 1 cm), polaridade (basal, medial e apical), posição (horizontal ou vertical), condições de luminosidade (fotoperíodo de 16 horas e escuro por 30 dias) e seccionamento nas extremidades dos explantes, bem como melhores condições para garantir plantas enraizadas (meio MT, MT/2, com ou sem auxina e microenxertia). A combinação de 3 mg L-1 de BAP com segmentos de 0,25 cm de comprimento foi eficiente na resposta organogenética. Segmentos apicais e mediais apresentaram melhores resultados do que os basais. O cultivo dos segmentos na posição horizontal, em fotoperíodo de 16 horas, foi mais eficiente do que na posição vertical. Não houve melhora na indução da organogênese in vitro, quando foram seccionadas as extremidades dos explantes. A microenxertia assegurou 100% de brotos enraizados.

Otimização de protocolos para regeneração de plantas in vitro de tangerina 'Cleópatra' (Citrus reshni Hort. ex Tan.)

O sucesso de técnicas biotecnológicas no melhoramento in vitro de citros está condicionado à existência prévia de uma metodologia eficiente de regeneração de plantas. O objetivo deste trabalho foi estabelecer um sistema para regeneração de plantas in vitro, via organogênese de tangerina Cleópatra (Citrus reshni Hort. Ex Tan.). Experimentos avaliando concentrações de BAP (benzilaminopurina) e condições de cultivo, posição e polaridade do segmento de epicótilo, no meio de cultura, foram desenvolvidos para maximizar a regeneração. Para a indução das brotações, segmentos de epicótilo (1,0 cm de comprimento) foram cultivados em meio de cultura MT (Murashige & Tucker, 1969). Após 45 dias, foram avaliados: percentual de explantes responsivos e nº. de gemas/ explante responsivo. Para enraizamento, foram utilizados os meios MT e MT/2, com ou sem ANA (ácido naftalenoacético) na concentração 1,0 mg L-1. Após 60 dias, avaliou-se o percentual de brotos que emitiram raízes. A máxima proliferação de gemas foi obtida em condições de escuro, por 30 dias, utilizando-se da concentração 2,0 mg L-1 de BAP. Não houve efeito significativo da posição do explante na resposta organogenética. Os segmentos apicais e mediais mostraram-se mais eficientes que os basais. A concentração de 1,0 mg L-1 de BAP com o cultivo em condições de escuro, por 30 dias, na fase de indução de brotações combinada com ausência de auxina no meio MT/2, na fase de indução de raízes, assegurou melhor índice de enraizamento dos brotos regenerados.

Regeneração de plantas após fusão de protoplastos de tangelo 'Page' e toranja 'Lau Tau'

Buscou-se a hibridação somática entre tangelo 'Page' e toranja 'Lau Tau' visando à produção de porta-enxerto semelhante à laranja-azeda, por esta espécie ser considerada um provável híbrido entre C. reticulata e C. grandis. Após isolamento, fusão e cultivo de protoplastos, obtiveram-se brotações que foram enxertadas in vitro, em laranja 'Hamlin'. Dezessete plantas foram aclimatizadas em casa de vegetação. A análise de citometria de fluxo confirmou a constituição diplóide dessas plantas. Marcadores moleculares RAPD das plantas regeneradas apresentaram padrão de bandas similar ao de tangelo 'Page'. Entretanto, todas as plantas apresentaram conformação fenotípica diferente dos genitores.

Diluição celular, características do meio de cultura e biorreatores de imersão temporária na diferenciação e regeneração de células em suspensão de bananeira

Altos custos de produção geralmente limitam o uso comercial da micropropagação. O uso de meios de cultura líquidos é considerado uma solução para a automação e redução de custos. Entretanto, dependendo da cultivar de bananeira, esse processo pode mostrar diferentes níveis de dificuldade, e adaptações nos protocolos são necessárias. Neste estudo, experimentos de diferenciação celular e regeneração de plantas foram desenvolvidos em células em suspensão de banana pela avaliação da densidade inicial de células, meios de cultura e sistemas de imersão temporária. Para tanto, uma sequência de três experimentos foi realizada: o primeiro avaliou os efeitos da densidade celular (0,5; 1 e 2 mL), meios de cultura (M1: 1/2MS, 0,1 g.L-1 de ácido ascórbico, 0,1 g.L-1 de L-prolina, 30 g.L-1 de sacarose e 10 µM de 2iP; M2: MS, 30 g.L-1 de sacarose, 2,2 µM de BAP e 11,4 µM de AIA) e períodos de diferenciação celular (40 e 130 dias); o segundo experimento analisou o efeito do tamanho dos propágulos diferenciados em meio líquido (aprox. 2,5; 5 e 10 mm em diâmetro) na formação de embriões somáticos ou na regeneração de plantas; finalmente, um terceiro experimento avaliou o efeito de sistemas de cultivo com papel-filtro cobrindo o meio de cultura semissólido e sistemas de imersão temporários na diferenciação dos propágulos e na regeneração de plantas. Não foram observadas diferenças significativas entre os meios de diferenciação, porém as melhores diluições de células para a diferenciação foram de 1 e 2 mL/30mL de meio de cultura, enquanto diluições de 0,5 mL/30 mL de meio aumentaram a oxidação celular. A extensão do período de diferenciação de 40 para 130 dias foi importante para produzir maior número de calos/propágulos uniformes e com pelo menos de 10 mm de diâmetro, que puderam ser usados em sistemas de imersão temporária (biorreatores) para a diferenciação de embriões somáticos e regeneração de plantas. Considerando todos os sistemas de regeneração, verificou-se que o uso de meios de regeneração de consistência semissólida com papel-filtro na superfície do meio é o mais responsivo para a diferenciação de embriões somáticos e regeneração de plantas.

Regeneração de uma população natural de Araucaria angustifolia (Araucariaceae)

Estudos têm indicado baixa capacidade de regeneração em Araucaria angustifolia (Bertol.) Kuntze, baseados principalmente no baixo número de indivíduos regenerantes, não existindo estudos da dinâmica da regeneração natural. Dessa forma, o objetivo deste trabalho foi estudar a dinâmica da regeneração de plantas de uma população natural conservada de A. angustifolia sob uma floresta desenvolvida. Em uma parcela permanente de 5,1 ha, na Reserva Genética Florestal de Caçador (SC), foram avaliados, em três anos consecutivos, os indivíduos regenerantes (< 5 m de altura) e discutidos os principais fatores responsáveis pela estrutura encontrada, sendo o padrão espacial analisado com a Função K, de Ripley. Foi encontrada variação no número de ingressantes entre os anos avaliados, bem como nos indivíduos mortos. O estágio crítico para a regeneração da espécie se mostrou logo nos primeiros anos de desenvolvimento até os 0,5 m de altura. A agregação predominou nos indivíduos ingressantes e na regeneração natural como um todo. Mas como a espécie é longeva, ela pode manter baixo número de indivíduos regenerantes na população e, mesmo assim, ter sucesso na regeneração.

Formação de calos e regeneração de segmentos apicais de Hypnea musciformis (Wulfen) Lamouroux (Gigartinales, Rhodophyta): obtenção de culturas axênicas e efeitos da concentração do ágar

Culturas axênicas de Hypnea musciformis (Wulfen) Lamouroux foram estabelecidas em meio de Provasoli (PES) sólido com diferentes concentrações de ágar (0,4%, 0,6%, 0,8% e 1,0%) para avaliar o seu efeito na formação de calos e na regeneração de plantas. O cultivo em meio sólido induziu a formação de quatro tipos de calos (apical - CApi, lateral 1 - CLat1, lateral 2 - CLat2 e basal - CBas), os quais são constituídos internamente por proliferações unisseriadas pigmentadas. O tipo CApi foi o mais freqüente (taxa de 5,3 calos por explante em 1,0% de ágar). A maior biomassa das plântulas regeneradas (7,4 g) foi alcançada a partir de calos cultivados a 1,0% de ágar. A formação dos quatro tipos de calos é um dado inédito e indica que as diferentes concentrações de ágar no meio apresentam efeitos morfogenéticos no crescimento dos calos e na regeneração de segmentos apicais em H. musciformis

Método de obtenção de híbridos interespecíficos entre Lycopersicon esculentum e L. peruvianum

A transferência de genes da espécie silvestre Lycopersicon peruvianum para a espécie L. esculentum por processo convencional de hibridação é limitada por incompatibilidade. O objetivo deste trabalho foi desenvolver um método de obtenção de híbridos entre essas duas espécies, mediante a técnica de cultura de óvulos, tendo em vista o interesse em transferir genes presentes em acessos de L. peruvianum que conferem resistência a Septoria lycopersici. Foram utilizados os acessos CNPH 946, CNPH 947 e CNPH 948 de L. peruvianum e as cultivares Floradade e Ipa-5 de L. esculentum. Sementes híbridas de frutos com 25-68 dias após a polinização foram colocadas para germinar inicialmente em meio de cultura Murashige & Skoog (MS), e posteriormente em meio HLH. As sementes foram incubadas no escuro a 25°C. Só foram regenerados os híbridos provenientes das sementes colocadas para germinar em meio HLH. Dezesseis híbridos foram obtidos de 1.573 óvulos, sendo de 1% a taxa de regeneração de plantas híbridas. As características morfológicas dos híbridos F1 quando comparadas com os dois genitores indicaram que as plantas eram realmente resultado da hibridação entre L. esculentum e L. peruvianum.

Variantes somaclonais da cultivar de arroz Bluebelle resistentes à brusone

A brusone, causada por Pyricularia grisea, constitui fator limitante da produtividade do arroz irrigado, principalmente no Estado do Tocantins. A detecção de variabilidade genética quanto à resistência à brusone em cultivares suscetíveis, como a Bluebelle, considerada uma das cultivares-padrões quanto à qualidade dos grãos, foi o principal objetivo deste trabalho. O procedimento adotado incluiu a indução de calos provenientes de panículas imaturas, regeneração, avaliação e seleção das plantas R2 resistentes à doença. O mesmo procedimento foi utilizado para nova indução de calos e regeneração de plantas a partir de três plantas R2 selecionadas. Foi realizada a avaliação e a seleção de plantas resistentes nas gerações R2 e R4 em viveiro de brusone. Nos testes realizados em casa de vegetação com três isolados coletados da cultivar Metica1, pertencentes aos patótipos IB41 e IB45 de P. grisea, todos os 47 somaclones R6 foram resistentes. Por outro lado, os somaclones apresentaram reações diferenciais frente a cinco isolados provenientes de somaclones da cultivar Bluebelle, e resistência a um isolado proveniente da cultivar Bluebelle, enquanto a cultivar Bluebelle foi suscetível a todos os isolados. Estes resultados indicaram variação genética no que diz respeito à resistência à brusone, na segunda fase de indução de calos e na regeneração de plantas. Dos 47 somaclones R6, 22 apresentaram alto grau de resistência vertical nos testes conduzidos nos viveiros de brusone em quatro locais, e poderão ser utilizados como novas fontes de resistência.

Indução de variabilidade na cultivar de arroz Metica-1 para resistência a Pyricularia grisea

A brusone é um dos fatores limitantes da produtividade da cultivar Metica-1, no Estado do Tocantins. Objetivando obter somaclones resistentes, foi realizada a indução de calos e a regeneração de plantas a partir de panículas imaturas da cultivar Metica-1. Duzentas e oitenta plantas R2 foram submetidas a inoculação inóculo de patótipos de Pyricularia grisea, ID-14 e II-1, provenientes das cultivares Metica-1 e Cica-8, respectivamente. Enquanto todas as 280 plantas R2 de Metica-1 foram resistentes em relação ao patótipo II-1, as progênies de duas plantas R1 mostraram resistência ao patótipo ID14, indicando a indução de variação genética com relação à resistência à brusone na cultivar suscetível, nas gerações iniciais. A geração R3 foi avançada e entre 280 somaclones R4 foram selecionados 51, incluindo dois somaclones, CNAI10390 e CNAI10393, que mostraram resistência vertical no viveiro de brusone. Nas gerações avançadas de R5 e R6, estes dois somaclones apresentaram resistência no viveiro e nas inoculações com cinco isolados, provenientes das cultivares Metica-1, Cica-8 e Epagri 108, e poderão ser usados como novas fontes de resistência à brusone nos programas de melhoramento de arroz.

Embriogênese somática em híbridos de Pennisetum sp. e avaliação de estabilidade genômica por citometria

Os objetivos deste trabalho foram estabelecer um protocolo eficiente de embriogênese somática, em híbridos triploides entre capim elefante (Pennisetum purpureum Schumach.) e milheto (P. glaucum (L.) R. Br.), e avaliar por citometria de fluxo a estabilidade genômica das plantas obtidas in vitro. A embriogênese somática e a regeneração das plantas foram estabelecidas a partir de embriões zigóticos maduros de híbridos entre capim elefante e milheto. Foram testados quatro tratamentos com 2,4 ácido diclorofenoxiacético (2,4 D), nas concentrações 0, 1, 2 e 3 mg L-1, para indução de calos embriogênicos, e dois tratamentos com inositol a 1 e 2 g L-1, para regeneração das plantas. Os tratamentos foram dispostos em delineamento inteiramente ao acaso. A combinação ótima de hormônios foi de 2 mg L-1 de 2,4 D, para indução de calos embriogênicos, e de 1 g L-1 de inositol, para conversão de embriões e regeneração de plantas. A análise de quantidade de DNA, por citometria de fluxo das plantas regeneradas, indicou a não ocorrência de alterações em ploidia durante a embriogênese somática e a regeneração das plantas. A quantidade de DNA nuclear e a ploidia das plantas regeneradas foram estáveis e homogêneas em comparação às das plantas controle. Não ocorreu instabilidade cariotípica no sistema de regeneração usado para híbridos de Pennisetum.

ORGANOGÊNESE IN VITRO DE Citrus EM FUNÇÃO DE CONCENTRAÇÕES DE BAP E SECCIONAMENTO DO EXPLANTE

O sucesso de técnicas biotecnológicas no melhoramento in vitro de Citrus depende diretamente do desenvolvimento de protocolos eficientes para regeneração de plantas. Objetivou-se avaliar o efeito de concentrações de 6-benzilaminopuria (BAP) na organogênese in vitro de limão-'Cravo' e laranja-'Pêra', bem como o efeito do seccionamento do explante em laranja-'Valência'. Para o limão-'Cravo', foram utilizados como explante, segmentos internodais de plântulas germinadas in vitro, cultivados em meio MT e variando-se as concentrações de BAP em 0; 2,5; 5; 7,5 e 10 mg.L-1. Nas laranjas-'Pêra' e 'Valência' os explantes foram segmentos do epicótilo de plântulas germinadas in vitro. Os explantes de laranja-'Pêra' foram cultivados em meio MT variando-se as concentrações de BAP em 0; 1; 2; 3 e 4 mg.L-1. Para a laranja-'Valência', metade dos explantes foram seccionados e cultivados em meio MT acrescido de 1,0 mg.L-1 de BAP. Todas as brotações obtidas foram alongadas no meio de cultura MT + 25 g.L-1 de sacarose + 1 mg.L-1 de ácido giberélico (GA3) e enraizadas no meio MT + 25 g.L-1 de sacarose + 0,5 g.L-1 de carvão ativado + 1 mg.L-1 de ácido naftaleno acético (ANA). O melhor resultado para o número de brotações adventícias foi obtido na concentração 2,5 mg.L-1 de BAP para limão-'Cravo', e nas concentrações 1,0 e 2,0 mg.L-1 de BAP para laranja-'Pêra'. O seccionamento dos explantes favoreceu a organogênese in vitro da laranja-'Valência', porém as brotações apresentaram menor índice de enraizamento.

Organogênese in vitro a partir de diferentes regiões do epicótilo de Citrus sp

O estabelecimento de protocolos para regeneração de plantas in vitro é essencial para o uso de técnicas de transformação genética no melhoramento de citros. Visando à obtenção de um protocolo eficiente de regeneração in vitro para laranja-azeda (Citrus aurantium), laranjas 'Natal' e 'Pêra' (C. sinensis), limão 'Volkameriano' (C. volkameriana) e citrange 'Carrizo' (Poncirus trifoliata x C. sinensis), avaliou-se a resposta morfogênica de diferentes regiões do epicótilo (basal, mediana e apical) em relação a distância do nó cotiledonar, na presença (1,0 mg/L-1) ou ausência de 6-BAP, em meio de cultura MT. Após 60 dias, avaliaram-se a porcentagem de explantes responsivos e o número de gemas adventícias por explante. A resposta morfogênica em função da região do epicótilo e da presença ou ausência da citocinina (6-BAP) foi influenciada pelo genótipo. A presença de 6-BAP no meio de cultura promoveu aumento na porcentagem de explantes responsivos para citrange 'Carrizo'. A suplementação do meio de cultura com a citocinina 6-BAP proporcionou aumento no número de brotos por explante para citrange 'Carrizo', laranja 'Natal' e limão 'Volkameriano'.

Enraizamento in vitro e aclimatização de genótipos de jenipapeiro (Genipa americana L.)

A rizogênese é considerada uma fase crítica na regeneração de plantas in vitro, pois determina a sobrevivência das mesmas durante a aclimatização. Dentre os fatores determinantes na indução e na formação de raízes in vitro, destacam-se o genótipo e as auxinas. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito de diferentes concentrações do ácido 4-indol-3-butírico (AIB) no enraizamento in vitro de dois genótipos de jenipapeiro (Genipa americana L.) JRB59 e JRB69, bem como no processo de aclimatização das microplantas utilizando diferentes substratos. Para o enraizamento, brotos com aproximadamente 2,0 cm de comprimento, provenientes do cultivo em meio de cultura com 6-benzilaminopurina (BAP), nas concentrações de 2,22; 8,87; 17,74 e 26,76 µM mais a testemunha com ausência do BAP, foram introduzidos em meio de cultura MS, suplementados com 4,9; 9,8 e 14,7 µM de AIB mais a testemunha com ausência de AIB. Quanto ao processo de aclimatização, utilizaram-se como substratos areia lavada, Plantmax® HT e Ecoterra®. As variáveis analisadas foram: porcentagem de enraizamento, número de raízes adventícias, comprimento da maior raiz, porcentagem de sobrevivência e altura das plantas na fase de aclimatização. Os resultados mostraram que a auxina AIB, na concentração de 9,8 mM, foi mais eficiente para indução do enraizamento, com percentual acima de 70%, para o genótipo JRB69, e 43,3% para o genótipo JRB59. O substrato Ecoterra® influenciou significativamente na qualidade do sistema radicial e qualidade da parte aérea.

Eficiência de transformação genética de citrange 'carrizo' com duas construções gênicas

Transformação genética é considerada uma importante ferramenta auxiliar no melhoramento genético de plantas cítricas. Entretanto, a eficiência de transformação pode variar em função de diversos fatores, incluindo a própria construção gênica utilizada. Este trabalho buscou avaliar a eficiência de transformação genética de plantas de citrange 'Carrizo' [Poncirus trifoliata (L.) Raf. x Citrus sinensis (L.) Osbeck] com duas construções gênicas diferentes contendo o gene uidA (GUS) sob o controle dos promotores Arabidopsis thaliana phloem protein 2 (AtPhP2) e Arabidopsis thaliana sucrose transporter 2 (AtSuT2). Segmentos de epicótilo de plântulas germinadas in vitro foram utilizados como explantes. O gene nptII, que confere resistência ao antibiótico canamicina, foi utilizado nas construções gênicas como agente de seleção para regeneração de plantas transgênicas. O ensaio histoquímico com X-GLUC foi realizado em todas as brotações regeneradas para verificar a expressão do gene uidA. Dos 4.790 segmentos de epicótilo utilizados, registrou-se a regeneração de 366 brotações com reação positiva no ensaio histoquímico, as quais foram enxertadas em porta-enxertos cultivados in vitro. Cinco dessas brotações, de cada construção gênica, foram selecionadas para análise da PCR, com primers específicos para amplificação da sequência do gene uidA. A inserção do transgene foi confirmada por PCR em todas as brotações selecionadas. A eficiência de transformação e o número de brotos escapes, avaliada pelo teste histoquímico, variaram em função das construções gênicas utilizadas.